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"Nouvelle substance génératrice de la vitamine D2 ou calciférol".
Il a été annoncé dans deux publications récentes faites avec le concours des inventeurs (C.R.Acad.Sc.1948, t.226, p. 1287; Bull.
Soc.Chim.,1948, t.15, p.1115), que la teneur en vitamine D2 de so- lutions fraîches d'ergostérol irradié augmentait en fonction du temps, même en l'absence de lumière. Le fait n'avait pas encore été signalé. On admettait, au contraire, que la formation de la vitamine D2 était purement liée à l'apport d'énergie lumineuse.
Ce résultat a suggéré l'existence d'une nouvelle substance généra- trice du calciférol et qui pourrait donner naissance au calciférol
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par une transformation exigeant un faible apport d'énergie et ne faisant pas intervenir la lumière à titre obligatoire, contrairement aux données classiques.
L'objet de la présente invention est cette nouvelle substance qui vient d'être isolée et à laquelle la Société demanderesse donne le nom de précalciférol. Son utilisation est prévue comme corps générateur pour la préparation industrielle de la Vitamine D2, de même que pour l'application à la thérapeutique humaine ou à l'art vétérinaire.
Un premier procédé pour obtenir cette substance consiste à préparer de la façon usuelle la résine d'irradiation à partir de l'ergostérol, puis à l'estérifier, par exemple par le chlorure de dinitro-3,5-benzoyle, en évitant avec soin de dépasser la tempéra- ture de 25 à tous les stades de la préparation. On procède alors à une séparation chromatographique sur alumine neutre. De la frac- tion la moins fortement adsorbée on sépare une huile ambrée qui cristallise peu à peu sous ligroine. On isole ainsi le précalcifé- rol sous forme de dinitrobenzoate avec un rendement de l'ordre de 50% par rapport à la résine mise en oeuvre.
Ainsi que le montrent l'analyse centésimale et la cryoscopie, ce dinitrobenzoate de précalciférol, C35H46O6N2, est un -isomère du dinitràbenzoate de calciférol.
Analyse : Calculé 0% 71,2 H% 7,85 N% 4,7 M. 590
Trouvé 70,9 7,8 4,7 560
La nouvelle substance se distingue sans équivoque du dinitro- benzoate de calciférol étudié par WINDAUS, de même qu'elle ne peut être confondue avec aucun des dérivés déjà décrits dans la genèse photochimique du calciférol. Le tableau ci-dessous donne les con- stantes physiques publiées dans la littérature et celles détermi- nées par la demanderesse pour permettre une comparaison avec celles du dinitrobenzoate de précalciférol.
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EMI3.1
Lrgostérol Lumistérol Tachy- :Précalciférol:Calciférol:Suprastérol:upra-
EMI3.2
<tb> (dinitro- <SEP> :(dinitro- <SEP> :stérol <SEP> (dinitroben¯ <SEP> :(dinitro--: <SEP> I. <SEP> stérol
<tb>
<tb> benzoate) <SEP> :benzoate) <SEP> (subst <SEP> zoate) <SEP> :benzoate) <SEP> :(dinitro- <SEP> : <SEP> II
<tb>
<tb> amorphe <SEP> :benzoate) <SEP> (dini-
<tb>
<tb> :troben
<tb>
<tb> :zoate)
<tb>
EMI3.3
F(inst) 203 :140-141 103-104 :158-1590 154 z0- 1810 (oc) -50 (CHC33):+2. (C6H6):-70 . +30 (C6Hb) :+57 (6H6): 101 3 (essence) +32 (CHGLJ -11 U : : # #* : : # b : :(ess#ce): +45 (CHClJ :+$ ( CHC1: . (CHOU) * :(CHC13 ) Le dinitrobenzoate de précalciférol cristallise en fines aiguilles jaune très pâle, tandis que le dinitrobenzoate de calciférol est en cristaux massifs, jaune vif.
Jusqu'ici le meilleur solvant qui a permis de les séparer a été la méthyléthylcétone.
La saponification alcaline à 10-15 du dinitrobenzoate con- duit au précalciférol à l'état amorphe. Le pouvoir rotatoire spéci- fique de cette substance pour la raie D est voisin de + 43 (c = 1% dans le benzène), tandis qu'il est de + 85% pour le calciférol.
Soumis à l'action de chlorures ou d'anhydrides d'acides, le précalciférol fournit des esters dont le plus intéressant paraît être le dinitrobenzoate déjà cité. Le précalciférol ne précipite pas par la digitonine.
Cette nouvelle substance, obtenue par saponification de son dinitrobenzoate, offre une évolution de son pouvoir rotatoire sous l'influence du chauffage en solvant. Elle donne ainsi naissance à la vitamine D2 ou calciférol sans nécessiter l'apport d'énergie lu- mineuse.
La demanderesse a constaté d'autre part qu'on pouvait égale- ment obtenir la même substance par un deuxième procédé basé sur l'observation suivante : la transformation du précalciférol en cal- ciférol offre un caractère de réversibilité.
En conséquence, si l'on chauffe modérément, par exemple à 60 pendant 20 heures, une solution benzénique de dinitrobenzoate de calciférol, le pouvoir rotatoire évolue dans le sens d'une lé- gère diminution, de +57 à +51 . Les cristallisations fraction- nées et la chromatographie fournissent du dinitrobenzoate de
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précalciférol lequel, par saponification, conduit à son tour au pré- calciférol.
Toutefois, dans ce cas l'équilibre des deux substances étant toujours fortement déplacé en faveur du calciférol, le rendement en précalciférol est évidemment inférieur à celui du procédé direct.
Il est donné, ci-après, à titre d'exemples, mais sans carac- tère limitatif, divers modes de préparation du précalciférol: Exemple 1. Procédé direct (préparation du précalciférol à partir de la résine d'irradiation de l'ergostérol.
55 g. d'ergostérol dissous dans 4.000 cc. d'éther sulfurique sont irradiés pendant 2 heures sous atmosphère d'azote à une tempé- rature de 30 par la lumière de l'étincelle au magnésium. Après distillation de l'éther sous vide à 10-15 , on élimine l'ergostérol non transformé (65% de la quantité mise en jeu) par reprise au mé- thanol dans lequel il est très peu soluble. Après évaporation du méthanol sous vide à 30 , l'huile résiduelle est débarrassée des dernières traces de méthanol par plusieurs reprises au benzène. La résine obtenue (19 g. ) est estérifiée en 1 heure à 15 en solution benzénique par du chlorure de dinitro-3,5-benzoyle en présence de pyridine.
Après lavages de la solution benzénique avec une solution de bicarbonate de sodium à 10%, à l'eau, puis à l'acide chlorhydri- que dilué, on chasse le benzène sous pression réduite à 10-15 .
Le dinitrobenzoate brut huileux obtenu (30 g. ) est dissous dans un mélange de 40 cc. de benzène et 400 ce. d'éther de pétrole. On sé- pare par filtration un léger insoluble, puis on chromatographie sur une colonne de 300 g. d'alumine neutre. On développe le chro- matogramme par lavage avec de l'éther de pétrole à 10% de benzène jusqu'à ce que la coloration jaune atteigne le bas de la colonne.
La moitié inférieure de la colonne d'alumine, après séparation de la moitié supérieure, est lavée à l'éther ce qui provoque l'élu- tion de 13 g. de dinitrobenzoate de précalciférol brut qui cristal- lise par reprise par un peu d'éther de pétrole. Après recristalli-
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sation par dissolution à 20 dans 3 volumes de méthyl-éthyl-cétone et addition de 5 volumes d'alcool absolu, on obtient 10 g. de di- nitrobenzoate de précalciférol pur, en fines aiguilles jaune pâle.
F. 103-104 .
Le rendement est donc d'environ 50% en poids par rapport à. la résine débarrassée d'ergostérol et non estérifiée.
On obtient le précalciférol à partir de son dinitrobenzoate par saponification alcaline, selon les méthodes usuelles, mais en ayant soin de toujours maintenir la température au-dessous de 15 .
E x e m p 1 e 2. Procédé indirect. (Obtention du précalciférol à partir du dinitrobenzoate de calciférol).
100 g. de dinitrobenzoate de calciférol sont dissous dans 100 cc. de benzène et chauffés à léger reflux pendant 8 heures. Le benzène est chassé sous pression réduite à température inférieure. à 20 . Le résidu concret est repris par 100 cc. de méthyl-éthyl- cétone et laissé une nuit en glacière, le dinitrobenzoate de calci- férol non transformé est essoré, lavé avec un peu de méthyl-éthyl- cétone et séché à 50 (76,5 g.)
La méthyl-éthyl-cétone mère est chassée sous vide à tempé- rature inférieure à 20 . Le résidu huileux est dissous dans 100 cc. d'éther de pétrole. Après séjour d'une nuit en glacière, on essore 6,5 g. de dinitrobenzoate de précalciférol.
La solution est diluée à 200 cc. par addition d'éther de pé- trole et chromatographiée sur 100 g. d'alumine neutre. On lave à l'éther de pétrole. Le filtrat est concentré sous vide à tempéra- ture inférieure à 20 . On amorce la cristallisation et laisse une nuit en glacière. On recueille encore 4,5 g. de dinitrobenzoate de précalciférol.
Au total on a séparé : g. de dinitrobenzoate de précalci- férol, F. 103-104 (bloc), (Ó)D= +30 (Benzène c=1%) +45 (CHCl, c=1%), et récupéré 76,5 g. de dinitrobenzoate de calciférol, F.
1580 (bloc), (Ó)D= +57 (Benzène 1%), +88 (CHC13' c=l%)
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Exemple 3. Préparation de la vitamine D2 ou calciférol à partir du précalciférol sans apport d'énergie lumineuse et sous la seule influence d'un chauf- fage modéré.
On chauffe, à 60 par exemple, pendant 20 heures et à l'abri de la lumière, une solution benzénique à 1% de dinitrobenzoate de précalciférol. On peut aussi procéder, sur cette solution, à d'au- tres types de chauffage, à 40 par exemple pendant 2 jours ou à 80 pendant 2 à 3 heures. Plus la température est élevée et plus courte est la durée de la transformation que l'on recherche. En pratique il semble préférable de ne pas dépasser 80 pour éviter une résini- fication trop notable.
Au début de l'expérience, le pouvoir rotatoire spécifique est celui du dinitrobenzoate de précalciférol en benzène, soit +30 .
Peu à peu, ce pouvoir rotatoire évolue dans le sens d'une augmenta- tion et à la fin de l'essai il atteint une valeur assez proche de celle du dinitrobenzoate de calciférol pur, en général + 50 . Il suffit de distiller le benzène sous pression réduite, puis de recris talliser de la manière usuelle pour séparer le dinitrobenzoate de calciférol pur, F. 158-159 , (Ó)D= +57 (C6H6). On obtient fina- lement la vitamine D2 en saponifiant de la manière usuelle son di- nitrobenzoate.
Dans l'expérience ci-dessus, la matière de départ était le dinitrobenzoate de précalciférol. On peut aussi réaliser la prépa- ration également par simple chauffage en partant du précalciférol libre, obtenu par saponification de son dinitrobenzoate. Le pou- voir rotatoire du précalciférol en solution benzénique est inférieur de prèsque moitié à celui du calciférol: +43 au lieu de +85 . En réalisant l'essai de chauffage comme il vient d'être indiqué, l'évo- lution du pouvoir rotatoire conduit, en fin d'essai, à une valeur de l'ordre de +70 . Les concentrations et recristallisations usuel- les permettent alors de séparer le calciférol.
On peut également procéder à l'estérification directe du produit chauffé, par le
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chlorure de dinitrobenzoyle et recueillir avec un excellent rende- ment le dinitrobenzoate de calciférol pur d'où on libère le calci- férol par saponification.
Dans les deux cas, le nouveau générateur de vitamine D2 qui fait l'objet de la présente invention a donc bien fourni la vitami- ne D2 sous l'influence d'un chauffage modéré et en l'absence de lu- mière. De nombreuses variantes peuvent être adoptées sans que le principe même de la préparation du calciférol à partir du nouveau générateur, le précalciférol, soit mis en cause.
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"New substance generating vitamin D2 or calciferol".
It was announced in two recent publications made with the assistance of inventors (C.R. Acad. Sc. 1948, t.226, p. 1287; Bull.
Soc. Chim., 1948, t.15, p.1115), that the vitamin D2 content of fresh solutions of irradiated ergosterol increased with time, even in the absence of light. The fact had not yet been reported. On the contrary, it was admitted that the formation of vitamin D2 was purely linked to the supply of light energy.
This result suggested the existence of a new substance which generates calciferol and which could give rise to calciferol.
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by a transformation requiring a low input of energy and not involving compulsory light, unlike conventional data.
The subject of the present invention is this new substance which has just been isolated and to which the Applicant Company gives the name of precalciferol. Its use is intended as a generator body for the industrial preparation of Vitamin D2, as well as for application to human therapy or to the veterinary art.
A first process for obtaining this substance consists in preparing the irradiation resin from ergosterol in the usual way, then in esterifying it, for example with 3,5-dinitro-benzoyl chloride, carefully avoiding to exceed the temperature of 25 at all stages of the preparation. A chromatographic separation is then carried out on neutral alumina. From the less strongly adsorbed fraction an amber oil is separated which gradually crystallizes under ligroin. The precalciferol is thus isolated in the form of dinitrobenzoate with a yield of the order of 50% relative to the resin used.
As shown by centesimal analysis and cryoscopy, this precalciferol dinitrobenzoate, C35H46O6N2, is an -isomer of calciferol dinitrobenzoate.
Analysis: Calculated 0% 71.2 H% 7.85 N% 4.7 M. 590
Found 70.9 7.8 4.7 560
The new substance is unequivocally distinguished from the calciferol dinitro-benzoate studied by WINDAUS, just as it cannot be confused with any of the derivatives already described in the photochemical genesis of calciferol. The table below gives the physical constants published in the literature and those determined by the Applicant to allow comparison with those of precalciferol dinitrobenzoate.
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EMI3.1
Lrgosterol Lumisterol Tachy-: Precalciferol: Calciferol: Suprasterol: upra-
EMI3.2
<tb> (dinitro- <SEP>: (dinitro- <SEP>: sterol <SEP> (dinitroben¯ <SEP>: (dinitro--: <SEP> I. <SEP> sterol
<tb>
<tb> benzoate) <SEP>: benzoate) <SEP> (subst <SEP> zoate) <SEP>: benzoate) <SEP>: (dinitro- <SEP>: <SEP> II
<tb>
<tb> amorphous <SEP>: benzoate) <SEP> (dini-
<tb>
<tb>: troben
<tb>
<tb>: zoate)
<tb>
EMI3.3
F (inst) 203: 140-141 103-104: 158-1590 154 z0- 1810 (oc) -50 (CHC33): + 2. (C6H6): - 70. +30 (C6Hb): +57 (6H6): 101 3 (gasoline) +32 (CHGLJ -11 U:: # # *:: # b:: (ess # ce): +45 (CHClJ: + $ (CHC1 :. (CHOU) *: (CHC13) Precalciferol dinitrobenzoate crystallizes in fine, very pale yellow needles, while calciferol dinitrobenzoate is in massive, bright yellow crystals.
So far the best solvent which has made it possible to separate them has been methyl ethyl ketone.
The 10-15 alkaline saponification of the dinitrobenzoate results in precalciferol in an amorphous state. The specific optical rotation of this substance for the D line is close to + 43 (c = 1% in benzene), while it is + 85% for calciferol.
Subjected to the action of chlorides or acid anhydrides, precalciferol provides esters, the most interesting of which appears to be the dinitrobenzoate already mentioned. Precalciferol does not precipitate with digitonin.
This new substance, obtained by saponification of its dinitrobenzoate, offers an evolution of its optical rotation under the influence of heating in solvent. It thus gives rise to vitamin D2 or calciferol without requiring the supply of light energy.
The Applicant has further observed that the same substance could also be obtained by a second process based on the following observation: the conversion of precalciferol into calciferol offers a reversibility character.
Consequently, if one moderately heated, for example at 60 for 20 hours, a benzene solution of calciferol dinitrobenzoate, the optical rotation changes in the direction of a slight decrease, from +57 to +51. Fractional crystallizations and chromatography provide dinitrobenzoate
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precalciferol which, by saponification, in turn leads to precalciferol.
However, in this case the balance of the two substances still being strongly shifted in favor of calciferol, the yield of precalciferol is obviously lower than that of the direct process.
Various methods of preparing precalciferol are given below by way of examples, but without limitation: Example 1. Direct process (preparation of precalciferol from the resin for irradiating ergosterol.
55 g. of ergosterol dissolved in 4,000 cc. Sulfuric ether are irradiated for 2 hours under a nitrogen atmosphere at a temperature of 30 by the light of the magnesium spark. After distillation of the ether under vacuum at 10-15, the unconverted ergosterol (65% of the amount involved) is removed by taking up in methanol in which it is very slightly soluble. After evaporation of the methanol under vacuum at 30, the residual oil is freed of the last traces of methanol by several times with benzene. The resin obtained (19 g.) Is esterified over 1 hour at 15 in benzene solution with 3,5-dinitro-benzoyl chloride in the presence of pyridine.
After washing the benzene solution with 10% sodium bicarbonate solution, with water and then with dilute hydrochloric acid, the benzene is removed under reduced pressure to 10-15.
The oily crude dinitrobenzoate obtained (30 g.) Is dissolved in a mixture of 40 cc. of benzene and 400 cc. petroleum ether. A slight insoluble material is separated by filtration and then chromatographed on a 300 g column. neutral alumina. The chromatogram was developed by washing with 10% benzene petroleum ether until the yellow color reached the bottom of the column.
The lower half of the alumina column, after separation of the upper half, is washed with ether, which elutes 13 g. of crude precalciferol dinitrobenzoate which crystallizes on taking up a little petroleum ether. After recrystalli-
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Dissolution by dissolving at 20 in 3 volumes of methyl ethyl ketone and adding 5 volumes of absolute alcohol, 10 g are obtained. of pure precalciferol di-nitrobenzoate, in thin pale yellow needles.
F. 103-104.
The yield is therefore about 50% by weight relative to. the resin free of ergosterol and not esterified.
The precalciferol is obtained from its dinitrobenzoate by alkaline saponification, according to the usual methods, but taking care to always maintain the temperature below 15.
E x e m p 1 e 2. Indirect process. (Obtaining precalciferol from calciferol dinitrobenzoate).
100 g. of calciferol dinitrobenzoate are dissolved in 100 cc. of benzene and heated at slight reflux for 8 hours. The benzene is driven off under reduced pressure at a lower temperature. to 20. The concrete residue is taken up by 100 cc. of methyl ethyl ketone and left overnight in a cooler, the unconverted calciferol dinitrobenzoate is drained, washed with a little methyl ethyl ketone and dried at 50 (76.5 g.)
The mother methyl ethyl ketone is removed in vacuo at a temperature below 20. The oily residue is dissolved in 100 cc. petroleum ether. After staying overnight in a cooler, 6.5 g are filtered off. of precalciferol dinitrobenzoate.
The solution is diluted to 200 cc. by addition of petroleum ether and chromatographed on 100 g. neutral alumina. Washed with petroleum ether. The filtrate is concentrated in vacuo at a temperature below 20. Crystallization is initiated and left overnight in a cooler. Another 4.5 g are collected. of precalciferol dinitrobenzoate.
In total we have separated: g. of precalciferol dinitrobenzoate, mp 103-104 (block), (Ó) D = +30 (Benzene c = 1%) +45 (CHCl, c = 1%), and recovered 76.5 g. of calciferol dinitrobenzoate, F.
1580 (block), (Ó) D = +57 (Benzene 1%), +88 (CHC13 'c = 1%)
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Example 3. Preparation of vitamin D2 or calciferol from precalciferol without input of light energy and under the sole influence of moderate heating.
A 1% benzene solution of precalciferol dinitrobenzoate is heated at 60 for example for 20 hours and protected from light. It is also possible to carry out, on this solution, other types of heating, at 40 for example for 2 days or at 80 for 2 to 3 hours. The higher the temperature, the shorter the duration of the desired transformation. In practice, it seems preferable not to exceed 80 in order to avoid excessive resinification.
At the start of the experiment, the specific optical rotation is that of precalciferol dinitrobenzoate to benzene, ie +30.
Little by little, this optical rotation evolves in the direction of an increase and at the end of the test it reaches a value quite close to that of pure calciferol dinitrobenzoate, in general +50. It suffices to distill the benzene under reduced pressure, then to recrystallize in the usual manner to separate the pure calciferol dinitrobenzoate, F. 158-159, (Ó) D = +57 (C6H6). Vitamin D2 is finally obtained by saponifying its di-nitrobenzoate in the usual manner.
In the above experiment, the starting material was precalciferol dinitrobenzoate. The preparation can also be carried out also by simple heating, starting with free precalciferol, obtained by saponification of its dinitrobenzoate. The rotatory power of precalciferol in benzene solution is almost half that of calciferol: +43 instead of +85. By carrying out the heating test as has just been indicated, the change in optical rotation leads, at the end of the test, to a value of the order of +70. The usual concentrations and recrystallizations then make it possible to separate the calciferol.
It is also possible to proceed with the direct esterification of the heated product, by
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dinitrobenzoyl chloride and collect in excellent yield the pure calciferol dinitrobenzoate from which the calciferol is liberated by saponification.
In both cases, the novel vitamin D2 generator which is the object of the present invention therefore indeed supplied vitamin D2 under the influence of moderate heating and in the absence of light. Many variants can be adopted without the very principle of the preparation of calciferol from the new generator, precalciferol, being called into question.