BE1030645B1 - Methode de detection de microorganismes - Google Patents
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Abstract
Utilisation d'une composition de prélèvement liquide comprenant un ou plusieurs agents tensioactifs et une ou plusieurs enzymes pour la détection par immunologie ou génétique de bactéries choisies parmi Salmonella, Pseudomonas et/ou Listeria.
Description
METHODE DE DETECTION DE MICROORGANISMES
Domaine technique
La présente invention se rapporte à une méthode de détection de microorganismes, basée sur un échantillonnage de ces microorganismes, puis par un marquage immunologique ou génétique ou impliquant la mise en culture de ces microorganismes, ainsi que sur les compositions permettant un échantillonnage compatible avec les tests immunologiques ou génétiques.
L'art antérieur
Dans de nombreux domaines d'activités comme les secteurs agroalimentaires, les collectivités, les secteurs médicaux et vétérinaires, des contaminations problématiques dues à la présence de microorganismes sont observées très fréquemment.
Classiquement, dans les hôpitaux et dans les cabinets médicaux ou vétérinaires, la présence de microorganismes est responsable de maladies nosocomiales tandis qu'en agroalimentaire et en collectivité, ces microorganismes sont responsables de la dégradation de denrées périssables mais aussi du transfert de contaminants vers les consommateurs des produits issus par exemple d'une chaîne de production de viande, de fruits, de légumes ou autres.
Or, de nos jours, des normes strictes en matière d'hygiène sont imposées et il convient donc de s'assurer que le nombre de microorganismes responsables de telles contaminations soit maintenu sous une valeur seuil acceptable, cette valeur seuil acceptable étant propre à chaque domaine d'activité.
Les bactéries planctoniques sont un premier exemple de microorganismes contaminants, ces bactéries sont libres au niveau d'un substrat liquide ou solide et posent un problème en soi car elles sont à même de contaminer directement tout type de surface comme les denrées alimentaires, les outils médicaux, les bandes transporteuses, les réservoirs de stockage ou encore les patients humains ou les animaux eux- mêmes.
Toutefois, aujourd'hui, il est largement reconnu que les problématiques liés à la contamination par des microorganismes sont d'autant plus importants que ces derniers forment des biofilms.
En effet, dans tout type d'industrie et plus particulièrement dans le domaine de l'industrie agroalimentaire, les biofilms se forment de manière inévitable, cela au vu de la richesse du milieu environnant.
Les biofims sont définis comme un consortium de
Mmicroorganismes enchâssés dans une matrice de substances polymériques extracellulaires. Autrement dit, les biofilms sont des pellicules visqueuses qui se développent sur toutes les surfaces, suite à l'adhésion de microorganismes sur ces surfaces et à la sécrétion par ceux-ci de polymères les recouvrant, facilitant leur adhésion à la surface et formant ainsi Ia matrice extracellulaire. Les biofilms constituent ainsi une couche de protection autour des microorganismes très résistante aux agressions chimiques et thermiques ce qui rend ainsi leur élimination très difficile au moyen des biocides conventionnels et représentent de plus une source récurrente et important de contamination du milieu environnant.
Cette résistance est expliquée d'une part par la matrice de substances polymériques extracellulaires qui forme une barrière physique à la diffusion des molécules biocides dans le biofilm et, d'autre part, à l'état sessile des microorganismes et à leur capacité à s'échanger entre eux très rapidement des gènes responsables de certains mécanismes de résistance aux biocides.
Dès lors, on comprend aisément que les biofilms sont des structures très résistantes et extrêmement variées, par exemple des souches différentes d'une même bactérie peuvent former des biofilms différents, ces biofilms étant encore plus variés qu'ils sont composés de plusieurs bactéries différentes. De plus, les bactéries s'échangeant entre elles des gènes de résistance et l'environnement influe également sur le biofilms, accentuant encore leur complexité et leur résistance.
En outre, la matrice extracellulaire des biofims peut être identifiée lorsqu'elle est fortement développée mais, dans Ia majorité des cas, le biofiim se développe insidieusement dans les installations et sa présence ne sera détectée que lors de l'analyse de la qualité du produit fini.
Concernant la croissance du biofilm, celle-ci a leu de manière cyclique en comprenant une phase de croissance durant laquelle se produit l'accumulation des microorganismes et une phase de détachement durant laquelle des morceaux entiers de biofilms et des microorganismes se détachent par érosion et sous l'effet de leur poids pour contaminer les surfaces, les denrées alimentaires, les outils médicaux, les bandes transporteuses, les réservoirs de stockage ou encore les patients humains, consommateurs ou les animaux eux-mêmes.
Cela devant entraîner pour l'industriel, l'arrêt de sa chaîne de production, effectuer un cycle de nettoyage pour éliminer le biofilm, représentant de nombreuses heures de travail, ressources déployées et de perte de rendement.
De tout ceci, il ressort que les microorganismes contaminants et/ou les biofims constituent une réelle problématique, tout particulièrement dans le domaine des soins de santé (hôpitaux, cabinets dentaires ou médicaux), des soins vétérinaires et de l'agroalimentaire.
Cette problématique est d'autant plus critique que les microorganismes et/ou les biofims peuvent impliquer des bactéries responsables d'infections potentiellement mortelles chez les individus, que ces bactéries soient présentes dans les hôpitaux, les cabinets vétérinaires ou encore dans l'industrie agroalimentaire et se retrouvent au final sur les produits alimentaires destinés à la consommation.
Comme cela a été indiqué plus haut, la problématique des microorganismes et plus particulièrement des biofilms est double. D'une part, les désinfectants et biocides classiques sont très souvent inefficaces car ils ne parviennent pas à atteindre les microorganismes protégés par la matrice extracellulaire du biofilm, cette matrice étant de structure et de composition complexe et très variable. D'autre part, un biofilm est généralement mixte, c'est-à-dire qu'il contient une multitude de bactéries différentes ou de mêmes bactéries mais qui sont de souches différentes, ce qui favorise la propagation des gènes de résistance entre les bactéries du biofilm et rend ainsi leur traitement très difficile voire inefficace.
Par conséquent, d'un environnement à l'autre ou d'un secteur d'activité à l'autre, il est plutôt fréquent que les biofilms détectés soient totalement différents. Afin de détecter les biofilms, il existe des kits de détection de la présence de biofilms sur des surfaces ou dans des installation plus spécifiques (circuits d'eau, etc…), ces kits (tel que celui divulgué dans le document EP2537601) permettent de réaliser une coloration sélective des biofilms. II est donc actuellement possible de déterminer des zones où sont présents des biofilms afin de procéder à une élimination de ces derniers sans toutefois connaître la nature précise des microorganismes (bactéries) à l'origine du biofilm ciblé. en résulte que des compositions d'élimination des biofilms comprenant plusieurs enzymes sont employées sans toutefois savoir si les enzymes utilisées et éventuellement formulées dans une base détergente
(voir par exemple le document EP2243821) sont réellement adéquates pour agir sur un biofilm donné. Pour cette raison, les traitements actuels sont plutôt aléatoires et non spécifiques, ce qui est économiquement non rentable et peut entraîner une perte de temps et un arrêt considérable 5 des installations.
Par ailleurs, des techniques de prélèvement de microorganismes au départ de surfaces ont été développées afin de caractériser et/ou de quantifier les populations de microorganismes présentes sur des surfaces et responsables de contaminations. Ces méthodes de prélèvement permettent donc de déterminer, sur une surface, les différents types (de souches) de bactéries et de microorganismes présents.
Parmi les méthodes de prélèvement de microorganismes présents sur une surface, l'une des références en la matière est la Norme
ISO 18593 :2004/F} qui prévoit et définit des méthodes horizontales pour des techniques de prélèvement sur des surfaces (plus spécifiquement sur des surfaces se rencontrant dans l'environnement des industries agroalimentaire). La méthode à «l'étoffe/éponge » est un exemple de techniques de prélèvement cité dans cette Norme, cette méthode permettant de rechercher et/ou de dénombrer des microorganismes présents sur une surface. Brièvement, selon cette méthode de prélèvement, il s'agit de mouiller l'étoffe/éponge avec une quantité de diluant qui est du sérum physiologique stérile, d'échantillonner la surface dans deux directions perpendiculaires avant d'introduire l'étoffe/éponge dans un récipient stérile avec le diluant. Par la suite, après un éventuel stockage du prélèvement, ce dernier est analysé quantitativement et/ou qualitativement.
Malheureusement, si une telle méthode permet d'assurer un prélèvement de microorganismes libres à Ia surface d'un substrat, c'est-
à-dire un prélèvement de microorganismes planctoniques, elle se relève être inefficace lorsque la surface est contaminée por des microorganismes ayant formé un biofilm. En effet, comme expliqué plus haut, les microorganismes protégés par la matrice extracellulaire du biofilm, cette matrice étant de structure et de composition complexe et très variable et les biofilms étant mixtes, ils sont encore plus variés et complexes qu'ils sont composés de plusieurs bactéries différentes ou de souches différentes.
De plus, il s'avère que les techniques de prélèvement reposant sur un support imprégné d'eau peuvent avoir un effet bénéfique sur le développement des microorganismes, même lors de la réalisation d'un prélèvement au départ d'une surface. En effet, il est reconnu que certaines bactéries présentent une croissance accrue en présence d'eau, le support imbibé d'eau favorisant donc cette croissance pendant le prélèvement mais également après celui-ci puisqu'une fine pellicule d'eau subsiste sur le support traité où a eu lieu le prélèvement. Ceci peut donc favoriser le développement de certains microorganismes non prélevés, en particulier lorsqu'ils sont protégés par Un biofilm.
Afin de pallier aux inconvénients des supports de prélèvement imprégnés d'eau, on connait de l'état de la technique le document DE10304331 qui divulgue une préparation enzymatique qui peut être utilisée pour éliminer les biofilms des surfaces en l'absence de biocides. Cette préparation enzymatique comprend une ou plusieurs enzymes du groupe des polysaccharidase et/ou protéases et éventuellement des nucléases.
Malheureusement, même si les compositions selon le document DE10304331 présentent une certaine efficacité en terme de prélèvement des microorganismes, il apparaît qu'elles sont insuffisantes compte tenu de la diversité et de Ia complexité des microorganismes et des biofilms qui peuvent être présents sur une surface d'une installation et qu'elles ne permettent pas un prélèvement représentatif des populations bactériennes y étant pourtant bien présentes, c'est-à-dire qu'elles ne permettent qu'un faible recouvrement des microorganismes.
En effet, les biofilms et/ou les microorganismes présents sur une surface d'une installation sont d'une part composés d'une population de microorganismes variée et complexe, c'est-à-dire différents microorganismes mais également ces différents
Microorganismes pouvant encore être de souches différents, cela entraînant des résistances différentes mais également la formation de matrices extracellulaires de biofilms variées, complexes et différentes, parfois au sein d'une même surface d'une installation.
Il existe donc un réel besoin de fournir une composition qui a pour but de pallier les inconvénients de l'état de la technique en permettant un prélèvement efficace, représentatif et de manière adéquate des populations de microorganismes, qu'ils soient libres mais également sous la forme d'un biofilm de structure complexe qui peut varier considérablement d'un prélèvement à un autre. En outre, il existe un besoin de fournir une composition permettant le prélèvement des microorganismes sur différents types de surfaces, dans différents environnements, stable dans le temps et qui soit compatible avec les
Utilisateurs ou encore avec la chaîne de production, par exemple les aliments dans une industrie agroalimentaire.
A ce titre, Ia demande de brevet WO 2018/002013 décrit une solution aqueuse visqueuse comprenant une ou plusieurs enzymes et 8,4% de surfactants pour une application sur une surface horizontale ou même verticale, en vue d'une imprégnation prolongée d'un tissu placé sur cette surface, de manière à récupérer un Maximum des micro-organismes éventuellement présents tout en préservant leur viabilité et de quantifier leur présence.
Cependant, la durée de prélèvement est longue et les composant ont été sélectionnés dans le but de préserver la viabilité des microorganismes, pas de permettre un test immunologique en aval.
Finalement, ces étapes de prélèvement et d'échantilonnage doivent être compatibles avec les tests de détection immunologiques, ce qui implique des fortes contraintes au niveau des réactifs à Utiliser.
Bref résumé de l'invention
Un premier aspect de la présente invention porte sur l'utilisation d'une composition de prélèvement liquide comprenant un ou plusieurs agents tensioactifs et une ou plusieurs enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, pour la détection de bactéries choisies parmi Salmonella (ex. Salmonella enterica, Salmonella bongori), Pseudomonas (ex. Pseudomonas aeruginosa) et/ou Listeria (ex.
Listeria monocytogenes) potentiellement présentes sur une surface.
Avantageusement, la détection se fait par immunologie ou par test génétique et/ou après culture des bactéries.
De préférence, pour cette utilisation, la composition de prélèvement comprend des tensioactifs présents à une teneur comprise entre 0,02% et 1% en poids par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
De préférence, dans cette Utilisation, ces tensioactifs (présents dans la composition de prélèvement) comprennent au moins un tensioactif anionique, de préférence ledit tensioactif anionique étant choisi dans le groupe constitué des alkyle éther sulfate, de préférence un sel de laureth sulfate, alkyle sulfate, alkyloenzène sulfonate et les savons, de préférence le(s) tensioactif(s) est (sont) essentiellement un ou plusieurs tensioactifs anioniques.
De préférence, dans cette utilisation, la composition de prélèvement comprend en outre au moins 15% d'un agent stabilisant choisis parmi un polyol, de préférence le glycérol, et le propylène glycol, par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
De préférence, dans cette utilisation, la composition de prélèvement comprend une protéase étant une sérine protéase.
Un aspect connexe à la présente invention porte sur un kit pour la détection de microorganismes choisis parmi Salmonella sp. et/ou
Listeria sp. potentiellement présents sur une surface comprenant : - une composition de prélèvement liquide stérile comprenant un ou plusieurs agents tensioactifs et une ou plusieurs enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanose ; - des moyens d'application contrôlée de ladite composition de prélèvement et/ou des moyens de stockage stérile de la composition de prélèvement après son application.
De préférence, la composition de prélèvement de ce kit comprend des tensioactifs à une teneur comprise entre 0,02% et 1% en poids par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
De préférence, les tensioactifs de cette composition de prélèvement (qui fait partie du kit) comprennent au moins un tensioactif anionique étant choisi dans le groupe constitué des alkyle éther sulfate,
de préférence un sel de laureth sulfate, alkyle sulfate, alkylbenzène sulfonate et les savons.
De préférence les tensioactifs de cette composition de prélèvement (qui fait partie du kit) sont (essentiellement) un ou plusieurs tensioactifs anioniques.
Avantageusement, la composition de prélèvement [qui fait partie du kit} comprend en outre au moins 15% d'un agent stabilisant choisis parmi un polyol, de préférence le glycérol, et le propylène glycol, par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
De préférence, ce kit comprend en outre une solution de conservation comprenant un dérivé de polyoxyéthylène sorbitane, de préférence le monooléate de polyoxyéthylène sorbitane, et/ou un dérivé de phosphoglycéride, de préférence la phosphatidylcholine, et/ou un hydrolysat de protéines.
Avantageusement, dans ce kit, la composition de prélèvement comprend une protéase étant une sérine protéase et, optionnellement, la composition de conservation comprend un inhibiteur de sérine protéase, de préférence le PMSF.
De préférence, dans ce kit, la solution de conservation comprend un hydrolysat de protéine, de préférence de la peptone, à une teneur d'au moins 10 g/L.
De préférence, dans ce kit, la solution de conservation comprend en outre au moins un agent osmotique choisi dans le groupe constitué du chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sulfate de potassium, le phosphate tribasique de sodium, le phosphate dibasique de sodium, le phosphate monobasique de sodium, de préférence ledit au moins un agent osmotique est le chlorure de sodium.
De préférence, ce kit comprend en outre des moyens de détection spécifique et/ou de quantification spécifique par immunologie ou génétique de bactéries, de préférence choisies parmi Salmonella (ex.
Saimonella enterica, Salmonella bongori}, Pseudomonas (ex.
Pseudomonas aeruginosa) et/ou Listeria (ex. Listeria monocytogenes).
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
Les inventeurs ont remarqué que de nombreux composés utilisés pour un prélèvement efficace de microorganismes interfèrent avec les différents tests de détection de microorganismes, des tests qui impliquent une culture de microorganismes, et au moins un parmi les tests de mesure de l'ATP générée, des tests génétiques et des tests immunologiques.
Ces tests sont importants pour mesurer qualitativement quels microorganismes sont présents, mais également pour mesurer la variation en nombre au cours du temps sur une surface donnée, ce qui est un paramètre important, en tout cas pour les industries telles que les industries alimentaires (au sens large), ou les hôpitaux, ou encore les cantines. En particulier en ce qui concerne des microorganismes dangereux tels que _ Listeria sp. ou Salmonella sp.
Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant l'invention l'utilisation d'une composition stérile d'échantilonnage, de décrochage et de prélèvement de microorganismes pour l'identification de microorganismes (ex. Listeria sp. et/ou de Salmonella sp.), comprenant : - UN ou plusieurs tensioactifs représentant au moins 0,01% en poids par rapport au poids de ladite composition et au maximum 1,5%, de préférence au maximum 0,5%, voire 0,1% en poids de ladite composition,
ce tensioactif ou ces tensioactifs comprenant, voire consistant (essentiellement) en un (ou plusieurs) tensioactif anionique, - QU Moins un polyol et/ou le propylène glycol en tant qu'agent stabilsant (et/ou agent viscosant), représentant au moins 15%, de préférence au moins 18%, en poids par rapport au poids de ladite composition, - avantageusement, au moins un agent séquestrant (les cations di- ou multi-valents), - au moins deux enzymes (en concentration apte à dégrader les éventuels biofilms bactériens ou les souillures), lesdites au moins deux enzymes étant choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, cette composition présentant de préférence (i) un pH compris entre 5 et 11 et/ou (ii) une viscosité dynamique (20°C) comprise entre 10 et 100 mPass ; de préférence, ces au moins deux enzymes présents dans la composition sont choisis et incorporés en une teneur de manière à ne pas interférer avec les tests microbiologiques qui seront réalisé par après.
Avantageusement, la composition de prélèvement a été stérilisée par des moyens physiques, tels que l'iradiation, par exemple aux rayons gamma ou par faisceau d'électrons ou par filtration stérilisante.
Avantageusement, la composition de prélèvement comprend en outre une teneur en conservateur, tel que le (2- )phénoxyéthanol, ne dépassant pas 50 ppm. Les compositions préférées ont, avantageusement, une concentration en conservateurs moindre, par exemple moins de 20 ppm en 2-phénoxyéthanol, moins de 10 ppm 2- phénoxyéthanol, moins de 5 ppm 2-phénoxyéthanol (partie pour million : poids de la somme des conservateurs (2-phénoxyéthanol) : poids total de la composition), une teneur en-dessous de la limite de détection et/ou en- dessous de 0,1 ppm.
Cette composition de prélèvement est de préférence pour une application sur une surface, telle qu'une surface utilisée dans les
Industries, par exemple les industries alimentaires, ou les hôpitaux ou les cantines.
Les caractéristiques de la composition de prélèvement présentent l'avantage de fournir une composition de prélèvement de microorganismes, qu'ils soient sous forme planctoniques ou bien sous forme de biofilms complexes et variés. Cette composition permet un échantillonnage précis des microorganismes.
La composition de prélèvement, en comprenant au moins deux enzymes choisies dans le groupe comprenant une (sérine) protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, permet avantageusement de dégrader et de déstructurer efficacement la matrice extracellulaire des biofilms et notamment d'une population variée et complexe de biofims ayant des matrices extracellulaires différentes permettant ainsi de libérer les bactéries afin de les prélever.
Les teneurs en agents de conservation (ex. le 2- phénoxyéthanol) des enzymes utilisées dons la composition de prélèvement est donc avantageusement connue ou mesurée. Ceci permet avantageusement de choisir des compositions enzymatiques relativement pauvres en agents de conservation.
L'incorporation d'une (sérine) protéase dans la composition de prélèvement est préférée. Cependant les inventeurs ont remarqué (1) que les protéases interfèrent avec les tests microbiologiques en aval, tels que les tests impliquant des enzymes (PCR, luciférase) ou des reconnaissances d'antigènes (ELISA). En outre, les inventeurs ont remarqué que de nombreux lots commerciaux de protéase contenaient des teneurs très importantes en agent de conservation, et les inventeurs ont remarqué que ces agents interféraient avec plusieurs tests microbiologiques en aval, surtout ceux impliquant la culture de microorganisme pour leur amplification, en particulier les inventeurs ont remarqué que Listeria sp. était particulièrement sensible à de tels agents.
En outre, l'agent séquestrant ainsi que le pH compris entre 5 et 11 de la composition de prélèvement permet avantageusement de former des complexes avec des ions minéraux qui vont être fixés sous une forme empêchant leur précipitation par les réactions habituelles et ainsi de stabiliser dans le temps la composition de prélèvement, notamment au vu des enzymes présentes dans de telles proportions.
Dans le contexte de la présente invention, l'agent séquestrant potentiellement présent dans la composition de prélèvement est de préférence une substance chimique ayant la capacité à former des complexes avec des ions minéraux qu'il fixe sous une forme empêchant leur précipitation par les réactions habituelles. A titre d'exemple, l'agent séquestrant peut être l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, le glucono-delta-lactone, le gluconate de sodium, le gluconate de potassium, le gluconate de calcium, l'acide citrique, l'acide phosphorique, l'acide tartrique, l'acétate de sodium, le sorbitol, un composé comportant un atome de phosphore, voire la carboxyméthyl inuline (le sel sodique). Alternativement, l'agent séquestrant peut être un oxyde de phosphore tel qu'un phosphonate, un phosphinate ou un phosphate ou leur mélange, ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine portant au moins, dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate, seul ou en combinaison, ou un sel de ceux-ci.
Dans le cadre de la présente invention, il a été déterminé que la composition de prélèvement suivant l'invention en comprenant au moins un tensioactif anionique qui représentent au moins 0,01% (de préférence moins de 1,5%, voire moins de 1%, voire moins de 0,5% ou encore moins de 0,1%) en poids par rapport au poids de cette composition, permet de manière particulièrement avantageuse de décrocher et de prélever une proportion représentative et complète d'une population de microorganismes présents sur une surface, qu'ils soient planctoniques ou bien sous la forme de biofims, tout en n'interférant pas de manière problématique avec les tests de détection, y compris ceux qui sont spécifiques pour Listeria (culture, marquage et/ou détection par anticorps, identification génétique, PCR, biologie moléculaire).
Avantageusement, parmi ces tensioactifs anioniques se trouvent des tensioactifs moussants, cela présentant l'avantage d'une part de décrocher et prélever les microorganismes et d'autre part d'emprisonner les microorganismes prélevés dans la composition selon l'invention afin de réaliser un prélèvement efficace et représentatif de la population de contaminants d'une surface.
De préférence les tensioactifs sont choisis de manière à ce que, globalement, ils aient une valeur HLB comprise entre 10 et 16.
De préférence, l'au moins un tensioactif anionique de la composition de prélèvement est un sel (ex. sodique) de laureth sulfate, (numéro CAS 9004-82-4). II s'agit, de préférence du laureth-2 sulfate de sodium et/ou du laureth-3 sulfate de sodium
De préférence, la composition de prélèvement comprend au moins 15%, de préférence au moins 18% en poids d'un agent stabilisant, de préférence le glycérol.
De préférence, la composition de prélèvement comprend au moins 60% en poids d'eau, de préférence au moins 70% en poids, voire au moins 75% en poids d'eau
Ainsi, Ia composition en comprenant au moins un tensioactif anionique (à faible teneur) ainsi qu'au moins un agent stabilisant est stable dans le temps, tout en étant compatible avec les tests microbiologiques, y compris ceux pour la détection de Salmonella et de
Listeria.
Il en résulte que la composition de prélèvement, au contraire des compositions actuelles, permet d'obtenir un prélèvement réellement représentatif et complet des contaminants présents sur une surface, pour différents types de surfaces et pour différents environnements. Cela est particulièrement avantageux car, en ayant un prélèvement représentatif et suffisamment complet des microorganismes, ceux-ci pourront par la suite être identifiés et un traitement d'élimination ciblé et efficace, en utilisant les composés adéquats et non plus un cocktail de composés bien souvent inefficace, voire écotoxiques pourra être appliqué sur Ia surface.
Ceci représente bien entendu un avantage économique et de temps considérable.
L'intérêt de la composition de prélèvement est donc double en ce sens qu'elle permet d'une part de prélever et d'échantilonner l'ensemble des contaminants d’une surface qu'ils soient planctoniques ou sous forme de biofilms en vue de leur analyse et qu'elle permet ensuite de déterminer précisément quel traitement d'élimination de ces contaminants sera à appliquer.
De préférence, la composition de prélèvement comprend en outre un agent régulateur de pH.
De préférence, la composition de prélèvement présente un pH compris entre 6 et 10, de préférence entre 7 et 9, préférentiellement entre 8 et 9, de manière particulièrement avantageuse entre 8,2 et 8,6.
De préférence, la composition de prélèvement est sous forme liquide, de préférence sous forme liquide pulvérisable.
De préférence, la composition de prélèvement comprend en outre au moins une enzyme additionnelle choisie dans le groupe constitué des oxydo-réductases, des lyases, des transférases, des estérases, des glucosaminidases, des nucléases. Cependant, de telles enzymes additionnelles ne sont préférées que si elles sont présentes dans des compositions pauvres en agents conservateurs.
Comme expliqué ci-avant, l'intérêt de la composition de prélèvement est double en ce sens qu'elle permet d'une part de prélever et d'échontilonner l'ensemble des contaminants d'une surface qu'ils soient planctoniques ou sous forme de biofilms et qu'elle permet ensuite de déterminer précisément quel traitement d'élimination de ces contaminants sera à appliquer après que des analyses aient été réalisées pour identifier et caractériser précisément les contaminants.
Par conséquent, il est important que la composition d'échantilonnage (de prélèvement), qui contient les contaminants, microorganismes et biofilms suite au prélèvement, puisse permettre une analyse fiable, correcte et représentative de la population prélevée sans que ladite composition après prélèvement n'interfère avec les analyses ultérieures.
L'invention se rapporte donc également à un kit de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.
Ce kit est utile pour la détection de Listeria et/ou de Salmonella.
Ce kit comprend la composition de prélèvement décrite ci- dessus, et un moyen d'application contrôlée de celle-ci. Par exemple un pulvérisateur calioré de manière à projeter la même quantité de composition, avec la même dispersion et en gouttelettes de volume identiques.
Un volume à pulvériser est, de préférence, de 0,2 ml. Un volume plus faible (ex. 0,1 ; 0,15 ml) ou plus important (0,25 : 0,3 ; 0,4 ; 0,5 mi) peut être choisi, pour autant qu'il soit bien calibré. De préférence, le pulvérisateur calibré a un angle de dispersion large, ce qui permet de couvrirune surface de 10 cm? avec une application de 0,2 ml de volume, voire moins.
En d'autres termes, il est prévu un kit de décrochage (d'une surface), de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiaole en vue d'analyses de laboratoire ultérieures comprenant: - une composition d'échantilonnage (de décrochage et/ou de prélèvement) stérile de microorganismes telle que décrite ci- dessus, - Qu moins un dispositif d'application contrôlée de cette composition d'échantilonnage (de décrochage et de prélèvement) sur la surface ; - de préférence au moins un moyen de récolte stérile de ces microorganismes, - de préférence au moins un récipient stérile, par exemple un sachet stérile, comprenant avantageusement une solution de conservation des microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures ; - de préférence des moyens de détection par immunologie ou par biologie moléculaire (séquençage, PCR, sondes ou amorces nucléotidiques spécifiques) de bactéries, avantageusement de détection de Salmonella (ex. Salmonella enterica et/ou Salmonella bongori}, Pseudomonas (ex. Pseudomonas aeruginosa) et/ou de
Listeria (ex. Listeria monocytogenes).
De préférence, l'au moins un moyen de récolte stérile des microorganismes du kit selon la présente invention est un tissu, une lingette ou une éponge.
La solution de conservation, dans le contexte de la présente invention, comprend, de préférence, un hydrolysat de protéines (peptone). et/ou du polyoxyéthylène sorbitane et/ou un dérivé de phosphoglycéride (ex. de la lécithine); cette composition a, de préférence, comme fonction de neutraliser une quelconque potentielle activité protéolytique et/ou biocide qui serait présente dans la composition de prélèvement tout en assurant la viabilité des microorganismes récupérés.
L'invention se rapporte en outre à un procédé d'identification et/ou de quantification de microorganismes comprenant les étapes suivantes : au moins une application (pulvérisation) contrôlée d'une composition d'échantilonnage, de décrochage et de prélèvement, de microorganismes décrite ci-dessus, - laisser agir cette composition d'échantillonnage (de décrochage, de prélèvement) sur cette surface à prélever, - déposer au moins un moyen de récolte de ces microorganismes sur cette surface à prélever, - laisser imbiber ce moyen de récolte par cette composition d'échantilonnage (de décrochage, de prélèvement),
- prélever stérilement ce moyen de récolte des microorganismes imbibé et le déposer dans au moins un récipient stérile, par exemple un sachet stérile, comprenant une solution de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable, - mesurer et/ou quantifier Ia présence de microorganismes par un test immunologique ou génétique (ex. par séquençage et/ou PCR), le ou les microorganismes comprenant Salmonella sp. et/ou Listeria sp.
Dons le contexte de la présente invention, un test immunologique s'entend, de préférence, par tout test comprenant un ou plusieurs anticorps capables de se lier spécifiquement à un composant d'une bactérie déterminée. Un tel test immunologique est donc qualitatif (identité de la souche bactérienne, présence d'un facteur donné) et/ou quantitatif. Ce test peut comprendre des moyens de marquage secondaires, tels que fluorescents, qui permettent une analyse rapide et précise.
Dans le contexte de la présente invention, un test génétique s'entend, de préférence, par tout test où la présence, voire l'abondance, d'une molécule d'acide nucléique cible dans l'échantillon est analysée.
Les tests génétiques préférés sont le séquençage et la PCR (Polymerase
Chain Reaction} ou d'autres types d'amplification génétique (y compris les techniques d'amplifications isothermes) impliquant des sondes et/ou des amorces spécifiques du ou des microorganismes à identifier (ex.
Listeria et/ou Salmonella).
Avantageusement les bactéries à détecter sont choisies parmi
Saimonella (ex. Salmonella enterica, Salmonella bongori), Pseudomonas (ex. Pseudomonas …—aeruginosa) et/ou Listeria (ex. Listeria monocytogenes).
Avantageusement, l'étape d'action de la composition de prélèvement a lieu pendant une durée d'au moins 10 secondes, 20 secondes, 30 secondes, 1 mn, de préférence d'au moins 2mn, préférentiellement d'au moins 3mn, avantageusement d'au moins 4mn, de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5 mn; de préférence moins de 15 minutes.
De préférence, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape de stockage de ce récipient stérile contenant ce moyen de récolte imbibé, à une température inférieure à 15 °C, de préférence inférieure à 10°C, avantageusement inférieure à 5°C, qui précède le test immunologique.
Un aspect lié de la présente invention est donc l'utilisation de la composition de prélèvement ou du kit comprenant cette composition de prélèvement pour la détection par immunologie ou génétique (ex. par séquençage et/ou PCR) de bactéries, avantageusement choisies parmi
Salmonella (ex. Salmonella enterica, Salmonella bongori), Pseudomonas (ex. Pseudomonas aeruginosa)] et/ou Listeria (ex. Listeria monocytogenes).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront tirés de la description non limitative qui suit, et en faisant référence aux exemples.
Exemples.
Les premiers obstacles que les inventeurs ont dus surmonter portent sur le manque de représentativité des biofilms générés au laboratoire, par rapport à la situation sur site. Ceci complique en particulier les choix des activités enzymatiques (nature des enzymes, leurs abondances, présence de composés potentiellement délétères). Sur base de ces tests préliminaires, les inventeurs ont donc décidé que toutes les compositions qui seraient formulées au laboratoire devraient être testées en conditions réelles : de nombreuses formulations prometteuses à l'échelle du laboratoire sont inutilisables, en pratique, et les inventeurs n'ont pas trouvé de directives publiées, même à l'aide de leur expertise, qui aurait pu les aider à identifier les compositions fonctionnelles.
Cependant, une fois qu’une formulation complexe a été identifiée, telles celles décrites ci-dessous, certains composés de cette formulation peuvent être remplacés par d'autres, ce qui est facilement testable au laboratoire (efficacité, absence de toxicité pour les microorganismes), puis sur site, ou directement sur site. Ainsi, dans une certaine mesure, une protéase est substituable par une autre, en particulier lorsque celles-ci sont des sérine-protéases (subtilisines). Cependant, lorsque des compositions enzymatiques commerciales sont utilisées, les inventeurs ont remarqué que, selon les fournisseurs, et même les marques, différents additifs risquent d'interférer avec les analyses de microbiologie, ainsi les variations de la composition de la présente invention sont possibles, grâce à l'enseignement de la présente invention, mais nécessitent de suivre les règles de prudence décrites dans la présente invention.
Example 1
Une société de transformation de viande située en Belgique a été sélectionnée pour cette étude. Toutes les installations ont été préalablement nettoyées et désinfectées avant de réaliser les prélèvements.
Le protocole de décrochage est appliqué avec une limitation des actions mécaniques pouvant introduire une erreur de reproductibilité ; il comporte les étapes suivantes :
Parcourir rapidement (screener) les zones à prélever avec la lampe UV et kit de détection BDK (Realco) ;
Préchauffer la solution de prélèvement à 45°C ;
Déposer deux gabarits sur les surfaces à prélever (afin de délimiter une surface de 10cm sur 10 cm): eau physiologue vs composition de prélèvement (14 sprays pour couvrir Ia zone ;1,2 g /spray) ;
Laisser agir 5 minutes la solution de prélèvement ;
Déposer la lingette stérile sur les deux zones de prélèvement et laisser imbiber ;
Prélever stérilement à l'aide de pince et déposé dans un sachet stérile de transport ;
Stocker les échantillons dans des bacs frigos à 4°C ;
Évaluer après les deux zones avec la lampe et le BDK.
Au total 6 zones de prélèvements ont été incluses dans cette étude : Zone 1 table ronde ; Zone 2 couvercle pour table poubelle ; Zone 3 bac inox; Zone 4 table scie; Zone 5 surface plastique ; Zone 6 découenneuse.
Dans ces 6 zones, la composition de prélèvement comprenant des enzymes (dont une subtilisine, activité équivalente à 10
Unités Anson/kg} et des détergents (environ 10% en poids) permet une bien meilleure récupération des microorganismes, tant en microbiologie classique que par mesure ATP (2G) ou par culture. Réciproquement, il ne resta plus de microorganismes sur les surfaces où la solution de prélèvement a été placée, contrairement à la surface traitée par l'eau physiologique. La différence est surtout marquée au niveau de lo microbiologie classique, par rapport à l'ATP 2G ou par test impliquent une étape de culture (peu de différence remarquées).
Les inventeurs ont reproduit l'exemple, pour y inclure des analyses métagénomiques, tout en variant le temps de contact de la composition de prélèvement sur la surface (30 secondes et 5 minutes). A nouveau, la composition enzymatique permet un bien meilleur prélèvement (ex. 100 fois mieux en microbiologie classique et 14 fois mieux en qPCR). Les bactéries retrouvées montrent une proportion accrue en
Pseudomonas.
Exemple 2 - addition d'une solution de conservation ;
Salmonella
Les inventeurs, suspectant des effets délétères associés à la composition de prélèvement, ont cherché à déterminer dans quelle mesure une solution adjuvante pouvait contrecarrer ceux-ci, dans le cadre de tests visant à déterminer la présence de Salmonella et/ou de
Listeria, soit par PCR ou OPCR, soit en utilisant des kits de détection commerciaux, par exemple ceux de BioMérieux. Pour ce faire, une solution dite ‘de conservation a été testée (en g/l) : Protéines (extrait de viande de boeuf ; 5) ; Peptone, 10 ; Polysorbate 80 (Tween 80 ; 5) ; Lecithin 0,7 ; NaCl, 5. En outre, divers inhibiteurs de sérine protéase ont été utilisés, dans le but de neutraliser l'activité de la subtilisine de la solution de prélèvement.
La première série de tests a été réalisée en laboratoire, où des quantités connues des bactéries (0,1 ml de 107 UFC/ml de Salmonella} ont été incubées soit dans une solution physiologique (100 ml), soit dans la composition de prélèvement de l'exemple 1 (óml + 94 ml eau physiologique), soit dans la composition de l'exemple 1, avant que la solution de conservation ne soit ajoutée (6 ml composition de prélèvement, 90 ml eau, 4 ml de la solution de conservation).
Lorsque 107 UFC/ml de Salmonella sont analysés (donc 104
UFC/ml dans le mélange final), les différentes situations sont compatibles avec l'identification du microorganisme au moyen d'analyses PCR ou du test Vidas® Salmonella. Cependant, une mise en évidence par le test
Vidas SLM® (bouillon culture, puis mesure spécifique par test antigénique et fluorescence ; ce test renseigne quant à l'absence ou à la présence de Salmonella) échoue lorsque la composition de prélèvement est présente, alors qu'il fonctionne lorsque les bactéries sont diluées dans l'eau physiologique ou lorsque la solution de conservation a été ajoutée.
En outre, dans cet exemple, les inventeurs considèrent que les concentrations en Salmonella sont élevées, ce qui ne représente pas nécessairement, voire rarement, la situation sur le terrain, où même 1 CFU doit être détecté.
Exemple 3 - addition d'une solution de conservation ; Listeria
Dans ce cas, la solution enzymatique cause des problèmes au niveau de la détection (dénombrement et gPCR) ; ces problèmes sont réduits grâce à la solution de conservation, cependant le kit commercial
Vidas® (LMX) ne fonctionne toujours pas.
En outre, lorsque la quantité de Listera ensemencée est réduite, le microorganisme n'est généralement plus détecté suite au mélange (Vidas LMX®, jamais ; Vidas LMO2®, pas à chaque fois) avec la composition de prélèvement, alors que la détection reste robuste lorsque le mélange a été effectué uniquement dans l'eau physiologique. Dans ce cas (volontairement extrême), Ia composition de conservation n'a pas amélioré la détection. Par prudence, les tests ont été reproduits et trois souches de Listeria ont été testée avec toujours les mêmes résultats ; il s'agit des souches ATCC 19114, NCTC 11994 et ATCC 13932.
En comparant tous les résultats, les inventeurs concluent que la composition de prélèvement ralentit Ia croissance de microorganismes (Listeria), problème qui est partiellement résolu par la composition de conservation. Par contre, la composition de prélèvement interfère avec certains tests microbiologiques en aval. Vu que la nature et l'abondance des microorganismes sur une surface à tester est inconnue à l'avance, les inventeurs concluent donc que les compositions des exemples 1 à 3 sont utiles, mais gagneraient à être encore améliorées.
Exemple 4 - Identifications des composés délétères
Les inventeurs ont recherché dans les différentes enzymes commerciales si certains composés interféraient avec les tests microbiologiques en aval. Les inventeurs ont remarqué que la présence de composés tels que le phénoxyéthanol, le sorbate de potassium ou des dérivés de thiazolinone est assez répandue. Ainsi, les inventeurs ont sélectionné des compositions enzymatiques qui sont dépourvues de tels composés, ou les plus pauvres possibles, même si les inventeurs ont retrouvé des concentrations importantes de 2-phénoxyéthanol dans de nombreuses compositions enzymatiques commerciales. Parmi les composés recherchés se retrouvent le Bronopol, le triclosan, l'idocarb, le chlorhexidine, le DCOIT, le BIT, le OIT, le CIT, le MIT, l'éthyl-parabène, le méthylparabène, le butythylparabène, le phénylparabène, l'isoproylparabène, l'isobutylparabène, le propylparabène, l'acide salisyllique, l'acide 4-hydroxybenzoïque, l'acide 4-méthylbenzoïque, l'acide benzoïque, l'acide sorbique, l'acide déhydroacétique, le 1- phénoxypropane-2-ol, le 1,2dioromo-2,4-dicyonobutane, le 2-
hydroxybiphényle, le 2-phénoxyéthanol (le plus abondamment retrouvé, parfois jusqu'à 0,4% en poids), l'alcool bensylique et le chlorophenesin.
Exemple comparatif 1
Suspectant une interférence entre les protéases de lo composition de prélèvement et les enzymes ou les anticorps des tests en aval, les inventeurs ont testé l'effet de l'addition d'inhibiteurs de protéases dans la solution de conservation (cfr exemple 3), tout en évitant au maximum les compositions enzymatiques commerciales comprenant des composés identifiés comme délétères (cfr. exemple 4).
Différentes manières d'appliquer l'inhibiteur de protéase ont été testées. La protéase choisie étant une subtilisine ou la trypsine, deux inhibiteurs de serine-protéase ont été testés : le PMSF et l'AEBSF.
Le PMSF a permis une bonne inhibition des activités protéolytiques des sérine-protéases testées. Par contre, l'AEBSF n'a inhibé que la trypsine. Des tests de mesure où Listeria (les 3 souches ci-dessus ont été testées) est mise en contact avec une composition comprenant une subtilisine, puis l'AEBSF en concentration suffisante pour causer l'inhibition complète de la subtilisine ont montré que différents tests microbiologiques donnaient des valeurs plus basses, voire même ne détectaient pas Listeria dans les conditions du test, au contraire du contrôle sans les enzymes ou lorsque le PMSF est ajouté.
Ainsi, les inventeurs ont choisi d'incorporer le PMSF dans la solution de conservation à tester, malgré les inconvénients de cette molécule.
Malheureusement, même dans ces conditions, le test Vidas®
LMX ne permet pas de mettre en évidence la présence de Listeria monocytogenes.
Exemple 5 - Optimisation de la composition de prélèvement
Les inventeurs ont alors décidé de tester l'efficacité d'une composition de prélèvement fortement diluée et évitant autant que possible Ies composés identifiés comme délétères. En outre, les activités enzymatigues sont réduites, tout comme la teneur en détergent. Les détergents sont choisis après des tests au laboratoire pour leur compatibilité avec la vie des microorganismes, y compris de Listeria, qui a été identifiée comme plus sensible.
Tout d'abord, avec des concentrations en détergent de 10% en poids, même en présence d'activité enzymatique faible, en présence de teneur minimales en agents conservateurs (ex. non-détectables pour la quasi-totalité ; phénoxyéthanol inférieur à 4 ppm) et en absence de
PMSF, les tests de détection de Listeria, de type Vidas®, ne fonctionnent pas bien (sous-quantification massive), ou pas de manière reproductible.
Même des tests moins spécifiques ne fonctionnent pas lorsqu'une culture de Listeria est soumise à ces différents traitements.
Ainsi, tous les paramètres de la composition doivent être vérifiés, avec le problème qu'une trop forte dilution des activités enzymatiques risque de ne plus permettre le décrochage des microorganismes, alors qu'une trop forte dilution des détergents risque de ne plus permettre une application homogène de la composition ou un bon contact avec le biofilm. Ainsi, les inventeurs ont remarqué que, outre la quantité des composants, leur nature devait être reconsidérée.
Une formulation diluée a été testée comprenant environ 20% en poids de glycérol, environ 0,03% en poids d'un détergent anionique de type laureth sulfate (de sodium), 0,4% en poids de séquestrant (carboxyméthylinuline) ; 0,4% en poids de glycolate de sodium; 0,04 % en poids d'une subtilisine (activité 1 Unité Anson}, ainsi qu'une lipase ; une amylase, une cellulase et une mannanase. Les inventeurs ont sélectionné des enzymes, ici des enzymes commerciales, dépourvues d'agents conservateurs tels que le sorbate de potassium, le MIT, l'OIT, le BIT et le CIT.
Lorsque c'était possible, les inventeurs ont utilisé des enzymes commerciales dépourvues de phénoxyéthanol (cellulase et mannanase), ou à faible teneur en cette molécule (subtilisine ; 4 g/kg de la formulation enzymatique, lipase ; 0,249 g/kg et amylase ; 0,233 g/kg). Les enzymes autres que la subtilisine ont été ajoutées dans des teneurs pondérales comprises entre 0,1 et 0,5% (poids de la composition enzymatique :poids total) et la quantité d'enzyme est typiquement de 1 à 10% en poids par rapport à la formulation commerciale.
Suite à l'utilisation de cette composition, la présence de
Listeria est détectée, et le test Vidas® LMX pour Listeria est, enfin, positif et reproductible. Les inventeurs ont remarqué en outre que, dans ces conditions diluées, l'ajout de l'inhibiteur de protéase PMSF n'est pas nécessaire, et même réduit la propagation de Listeria.
Les inventeurs considèrent que la concentration des enzymes autres que les protéases (ici, une subtilisine) peuvent encore être quelque peu réduites, ex. la concentration la plus faible qui permet le détachement, tout comme celles de l'agent séquestrant. À la lumière de la présente invention, ceci peut se tester au laboratoire sur les 3 souches de Listeria ou dans d'autres modèles, y compris, de préférence, plus complexes.
Les inventeurs ont ensuite testé une éventuelle synergie avec la solution de conservation (cfr. exemples 2 et 3) : vu que les résultats sont déjà très bons, l'amélioration associée à l'ajout de la solution de conservation est marginale, mais elle a été cependant intéressante dans le cas d'un test qui comprend une propagation suivie d'une détection par PCR.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sorti du cadre des revendications annexées
Claims (15)
1. Utilisation d'une composition de prélèvement liquide comprenant un ou plusieurs agents tensioactifs et une ou plusieurs enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, pour la détection de bactéries choisies parmi Salmonella (ex. Saimonella enterica, Salmonella bongon). Pseudomonas (ex. Pseudomonas aeruginosa) et/ou Listeria (ex. Listeria monocytogenes) potentiellement présentes sur une surface.
2. L'utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la détection se fait par immunologie ou par test génétique et/ou après culture des bactéries.
3. L'utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la composition de prélèvement comprend des tensioactifs présents à une teneur comprise entre 0,02% et 1% en poids par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
4. L'utilisation selon la revendication 3, dans laquelle Ies tensioactifs comprennent un tensioactif anionique, de préférence ledit tensioactif anionique étant choisi dans le groupe constitué des alkyle éther sulfate, de préférence un sel de laureth sulfate, alkyle sulfate, alkylbenzène sulfonate et les savons, de préférence les tensioactifs sont essentiellement un ou plusieurs tensioactifs anioniques.
5. L'utilisation selon une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la composition de prélèvement comprend en outre au moins 15% d'un agent stabilisant choisis parmi un polyol, de préférence le glycérol, et le propylène glycol, par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
6. L'utilisation selon une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la composition de prélèvement comprend une protéase étant une sérine protéase.
7. Kit pour la détection de microorganismes choisis parmi Salmonella sp. et/ou Listeria sp. potentiellement présents sur une surface comprenant : - Une composition de prélèvement liquide stérile comprenant un ou plusieurs agents tensioactifs et une ou plusieurs enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase ; - des moyens d'application contrôlée de ladite composition de prélèvement et/ou des moyens de stockage stérile de lo composition de prélèvement après son application.
8. Le kit pour la détection de microorganismes selon la revendication 7, dans lequel la composition de prélèvement comprend des tensioactifs à une teneur comprise entre 0,02% et 1% en poids par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
9. Le kit pour la détection de microorganismes selon Ia revendication 8, dans lequel les tensioactifs comprennent au moins un tensioactif anionique, de préférence ledit tensioactif anionique étant choisi dans le groupe constitué des alkyle éther sulfate, de préférence un sel de laureth sulfate, alkyle sulfate, alkylbenzène sulfonate et les savons, de préférence les tensioactifs sont essentiellement un ou plusieurs tensioactifs anioniques.
10. Le kit pour la détection de microorganismes selon une quelconque des revendications précédentes 7 à 9, dans lequel la composition de prélèvement comprend en outre au moins 15% d'un agent stabilisant choisis parmi un polyol, de préférence le glycérol, et le propylène glycol, par rapport au poids de ladite composition de prélèvement.
11.Le kit pour la détection de microorganismes selon une quelconque des revendications précédentes 7 à 10 comprenant une solution de conservation comprenant un dérivé de polyoxyéthylène sorbitane, de préférence le monooléate de polyoxyéthylène sorbitane, et/ou un dérivé de phosphogiycéride, de préférence lo phosphatidylcholine, et/ou un hydrolysat de protéines.
12. Le kit pour la détection de microorganismes selon une quelconque des revendications précédentes 7 à 11, dans lequel la composition de prélèvement comprend une protéase étant une sérine protéase.
13.Le kit pour la détection de microorganismes selon Ia revendication 11 ou 12, dans lequel la solution de conservation comprend un hydrolysat de protéine, de préférence de la peptone à une teneur d'au moins 10 g/L.
14. Le kit pour la détection de microorganismes selon l'une quelconque des revendication précédentes 11 à 13, dans lequel la solution de conservation comprend en outre au moins un agent osmotique choisi dans le groupe constitué du chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sulfate de potassium, le phosphate tribasique de sodium, le phosphate dibasique de sodium, le phosphate monobasique de sodium, de préférence ledit au moins un agent osmotique est le chlorure de sodium.
15. Le kit pour la détection de microorganismes selon l'une quelconque des revendication précédentes 7 à 14 comprenant en outre des moyens de détection spécifique et/ou de quantification spécifique par immunologie ou génétique de bactéries, de préférence choisies parmi Salmonella (ex. Salmonella enterica, Salmonella bongori)., Pseudomonas (ex. Pseudomonas aeruginosa) et/ou Listeria (ex. Listeria monocytogenes).
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