"Procédé de synthèse de composés alcaloïdes dimères"
La présente invention concerne un procédé nouveau et perfectionné destiné notamment à la production de composés alcaloïdes dimères, en particulier du groupe des alcaloïdes de Catharanthus (Vinca), et elle concerne en particulier un procédé perfectionné de production des composés antileucémiques (antinéoplastiques) antiviraux, à savoir la vincristine 'et la vinblastine, de formule I
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Le composé ci-dessus est la vinblastine
(NSC 49482) lorsque R est un groupe COOCH3 et R1 est un
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et N1 est un groupe N-CHO (N-formyle).
La présente série d'alcaloïdes dimériques, comprenant des agents antitumoraux importants, est formée à partir d'un indole tel que la catharanthine
(formule II, R = COOCH3) et d'un motif dihydro-indole, par exemple la vindoline (formule III), dont les moitiés sont attachées par une liaison carbone-à-carbone impli-
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vindoline.
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Les conditions de la réaction de couplage, comme décrit dans la présente invention, sont en rapport avec une modification importante du procédé mis au point dans ces laboratoires [brevet des Etats-
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2858 (1976)] (schéma 1). En particulier, la modification selon l'invention permet la préparation et l'isolement du composé intermédiaire de dihydropyridinium VI (R = COOCH3) très instable, qui est formé dans
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avec la vindoline (formule III).
En général, le dérivé Nb-oxyde du motif
<EMI ID=8.1> n a une valeur de 0 à 10) préparés avec un peracide
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tel que le chlorure de méthylène ou d'autres solvants organiques polyhalogénés, sont obtenus à des températures
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biante et au-dessus. Le N-oxyde intermédiaire ainsi formé est utilisé pour l'étape suivante sans isolement. La réaction de fragmentation, qui fragmente la liaison
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en présence d'un réactif tel que l'anhydride trifluoracétique. Pour maximiser la réaction de couplage subséquente qui favorise la formation d'un dimère naturel
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indole peut être ajouté au mélange réactionnel avant la réaction de fragmentation. Comme autres réactifs pour le composant anhydride trifluoracétique utilisé dans la fragmentation et le couplage, on peut choisir l'anhydride trichloracétique, l'anhydride acétique, des halogénures d'acétyle et l'anhydride tosylique. Ces réactifs provoquent une fragmentation du type
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représentés par les formules IIa et IV.
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Les conditions de réaction, à savoir température, temps et pression, sont en général analogues à celles qui sont utilisées dans la réaction de Polonovski qui, dans son application originelle, a impliqué la déalkylation d'amines tertiaires et hétérocycliques par acylation des N-oxydes correspondants avec l'anhydride acétique ou le chlorure d'acétyle
(voir Merck Index, 8ème édition, 1968, page 1203). La température de la réaction de fragmentation et
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situe de préférence dans la partie basse de cette plage. Les étapes de la réaction relatives à la formation du N-oxyde peuvent être conduites à l'air libre ou en atmosphère de gaz inerte tel que de l'argon ou un autre gaz inerte du Groupe Zéro du Tableau Périodique tel que l'hélium, l'azote, le néon, etc. Les mêmes conditions en atmosphère inerte sont utilisées dans les étapes de fragmentation et de couplage de la réaction et avec un réglage positif de température
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A cause de la basse température nécessaire pour les réactions à un stade ultérieur, la durée de réaction peut varier de quelques heures à plusieurs jours.
Le premier composé intermédiaire dimérique indole-dihydro-indole formé, après la réaction (stéréospécifique) de couplage, possède une fonction sel
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comme représenté par les formules V ou VI. La réduction de ce sel d'iminium intermédiaire par réaction avec
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produit le ou les alcaloïdes dimériques comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
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Dans la présente invention, le sel d'iminium intermédiaire (formule V ou VI) peut être isolé tel quel par une manipulation effectuée avec précaution. Lorsque la réaction de couplage est terminée, le mélange réactionnel est traité directement sur un système chromatographique approprié tel que chromatographie sur colonne, chromatographie sur couche mince ou chromatographie en phase liquide à haute performance, de préférence avec inversion de phase et/ou par des opérations de séparation par exclusion dimensionnelle. La température de l'opération peut
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variante, des réactifs et des solvants volatils qui sont présents conjointement avec le sel d'iminium intermédiaire dans le mélange réactionnel peuvent être éliminés sous pression et à température réduites, de préférence au-dessous de -10[deg.]C. La matière solide résultante (formule V ou VI) est ensuite dissoute dans divers solvants organiques tels que des hydrocarbures halogénés, des éthers, des alcools, l'acétonitrile, etc., et/ou divers tampons aqueux. Le pH du tampon peut varier de 2 à 10. La solution du sel d'iminium intermédiaire (formule V ou VI) peut ensuite être purifiée par les opérations chromatographiques décrites ci-dessus, avant d'autres caractérisations. A titre de variante, la solution de sel d'iminium intermédiaire peut être utilisée directement pour des réactions subséquentes.
L'utilisation d'une atmosphère inerte peut ou non être nécessaire.
Lorsque le motif indole de départ a une double liaison en C3-C4 (par exemple la catharanthine
(II)), le composé intermédiaire de couplage résultant contient un groupe fonctionnel iminium à non-saturation
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LiBH4) donne des composés de 3',4'-déhydrovinblastine
(formule VII). Le procédé de l'invention utilise.un mode nouveau de réduction dans lequel la transformation du sel d.'iminium intermédiaire (formule VI) en l'énamine (formule VIII) peut être réalisée. Des réactifs utilisés pour cette réduction comprennent des composés de 1,4-dihydropyridine (que l'on appelle modèles de NADH) comme représenté par la formule IX :
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Deux séries de tels composés sont aisément disponibles [Chem. Rev. 82, 232 (1982) ; Chem. Rev. 72, 1 (1972)].
La première série est connue sous le nom d'esters
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La seconde série comprend les 1,4-dihydronicotinamides substitués sur l'atome d'azote (formle IX) où R.. est une fonction alkyle substitué ou aryle substitué , par
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du groupe comprenant l'hydrogène et les fonctions alkyle, alkyle substitué, aryle et aryle substitué.
Les réducteurs ci-dessus peuvent être utilisés individuellement ou en association. Lorsqu'on utilise des 1,4-dihydropyridines pour réduire le sel d'iminium VI, on se sert de solvants organiques tels que des alcools, l'acétonitrile ou des représentants supérieurs de cette série, le diméthylsulf oxyde, - le diméthylformamide, divers éthers tels que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, etc., des hydrocarbures chlorés, etc., normalement sans utiliser de tampon aqueux comme co-solvant. On contrôle la progression de la réduction par l'analyse directe du mélange réactionnel sur un système chromatographique approprié, de préférence par chromatrographie en phase liquide à haute performance à inversion de phase. Ce procédé est utilisé pour optimiser la température, le temps et la pression de la réaction et la concentration des corps réactionnels.
La température de réaction peut varier de <EMI ID=27.1> ambiante. Le temps de réaction peut varier de quelques minutes à plusieurs jours selon d'autres paramètres. La réduction est conduite en vase clos dans des conditions inertes, par exemple sous argon ou dans un gaz inerte du Groupe Zéro du Tableau Périodique (azote, hélium, néon, etc.). L'énamine (formule VIII) formée dans la réduction ci-dessus peut être utilisée directement pour la réaction subséquente ou isolée par une manipulation effectuée avec précaution. Le mélange réactionnel est traité directement sur un système chromatographique approprié, par exemple par chromatographie sur colonne, sur couche mince ou chromatographie en phase liquide à haute performance, de préférence avec inversion de phase, et/ou soumis à des opérations de séparation par perméation sur gel.
La température de l'opération peut varier de 4[deg.]C à la température ambiante. A titre de variante, les réactifs et les solvants volatils présents dans le mélange réactionnel sont chassés sous pression et à température réduites, de préférence au-dessous de -10[deg.]C. Le résidu résultant peut être purifié par les opérations chromatographiques décrites ci-dessus avant d'être caractérisé ou transformé.
. Le traitement de l'énamine VIII avec un <EMI ID=28.1>
vinblastine (formule XI, R = COOCH3). Tandis que dans des conditions oxydantes, l'énamine VIII peut être transformée en la série vinblastine/vincristine en passant par le sel d'iminium intermédiaire (formule
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Des conditions oxydantes qui sont utilisées pour convertir une énamine (formule VIII) en un sel d'iminium intermédiaire (formule XVI) comprennent les suivantes :
(1) aération/oxygénation réglée ;
(2) addition de coenzymes de flavine [riboflavine, formule XII, R = H ; flavine-mononucléotide
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suivie d'une opération d'aération/oxygénation réglée;
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XII
(3) addition de la forme réduite des coenzymes de flavine (dihydroriboflavine, formule XIII, R = H ; dihydroflavine-mononucléotide (FMNH2), formule <EMI ID=33.1> d'une opération d'aération/oxygénation réglée ;
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(4) addition d'analogues de coenzymes de flavine à structure d'iso-alloxazine comme repré-
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vent être des représentants du groupe comprenant les fonctions alkyle, alkyle substitué, aryle et aryle substitué, suivie d'une opération d'aération/oxygé nation réglée ;
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XIV
(5) addition de la forme réduite (1,5dihydro) des analogues de coenzymes de flavine cidessus, comme représenté par la formule XV dans laquelle
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les fonctions alkyle, alkyle substitué, aryle et aryle substitué, suivie d'une opération d'aération/oxygénation réglée ;
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(6) addition de peroxyde d'hydrogène et/ou d'hydroperoxydes comme représenté par la formule R-OOH, dans laquelle R peut être une fonction alkyle, alkyle substitué, aryle ou aryle substitué ;
(7) addition de peracides comme représenté
<EMI ID=39.1> fonction alkyle, alkyle substitué, aryle ou aryle substitué ;
(8) addition de superoxydes ;
(9) addition d'un radical hydroxyle (OH) engendré de diverses façons, par exemple par l'utilisation de peroxyde d'hydrogène en présence de l'ion ferreux ;
(10) addition d'un ion métallique qui est un bon accepteur d'électrons, par exemple l'ion
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(Ag+1), suivie d'une opération d'aération/oxygénation réglée.
Les processus d'oxydation impliquant une aération/oxygénation réglée (condition (1)), les analo-
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des peroxydes (condition (6)), des peracides (condition (7)), des superoxydes (condition (8)), le radical hydroxyle (OH) (condition (9)) et des ions métalliques capables d'un transfert d'électrons (condition (10)) peuvent être effectués dans des solvants organiques tels que des alcools, l'acétonitrile ou des représentants supérieurs de cette série, le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, divers éthers tels que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, des hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène, etc.
Les processus d'oxydation impliquant des coenzymes de flavine (conditions (2), (3)) nécessitent un tampon aqueux (par exemple tampons aux phosphates, au chlorhydrate de tris, au MES)) à pH 5-9, mais de préférence dans la plage de 6 à 8, comme solvant. Un co-solvant organique, par exemple des alcools, l'acétonitrile ou un membre supérieur de cette série, le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, peut être utilisé.
L'évolution du processus d'oxydation est contrôlée par l'analyse directe du mélange réactionnel sur un système chromatographique approprié, de préférence par chromatographie en phase liquide à haute performance avec inversion de phase. Cette méthode est utilisée pour optimiser la température, le temps, la pression de réaction et la concentration des corps réactionnels. La température de la réaction peut varier de -60 à +60[deg.]C et de préférence de 4[deg.]C à la température ambiante. La durée de la réaction peut varier de quelques minutes à plusieurs jours, selon les autres paramètres. La réaction est conduite à la pression atmosphérique.
La transformation du composé intermédiaire
(formule' XVI) en vinblastine (formule I) peut être
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hydrure de métal alcalin (NaBH4, KBH4, LiBH4) dans des solvants convenables (organiques ou aqueux) comme on en utilise dans le processus d'oxydation (conditions (1)-(10)).
A des fins pratiques, un isolement des composés intermédiaires (formules V, VI, VIII, XVI) n'est pas requis et le processus entier depuis le motif indole (formule II) et le motif dihydro-indole
(formule III) jusqu'à la vinblastine (formule I) constituant le produit final peut être conduit de préférence dans une opération en récipient unique.
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En résumé, le procédé de l'invention est applicable à l'obtention de produits dimères à partir de catharanthine et de dihydrocatharanthine avec la vindoline comme matière de départ et des dérivés phényliques, alkyliques et amidiques répondant aux formules
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La formule XXI correspond à la représentation qui en est donnée et dans cette formule, alk
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tel que benzyle, styryle et xylyle ; R1 est un membre du groupe comprenant l'hydrogène, des radicaux alk,
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R2 et R3 sont-des représentants du groupe comprenant l'hydrogène et un radical -CO-alk ; R4 est un représentant du groupe comprenant les radicaux COO-alk, CONH-NH2,
<EMI ID=49.1> de l'indole représenté par la formule XXII dans laquelle R7 est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène
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prenant l'hydrogène, un radical OH, 0-alk, OCO-alk
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l'hydrogène, un radical OH, 0-alk, OCO-alk ou alk; R10 est un membre du groupe comprenant l'hydrogène, un radical OH, 0-alk, OCO-alk, ou de formule XXIII dans laquelle R11 est un représentant du groupe comprenant l'hydrogène ou un radical COO-alk ; R12 est un groupe alkyle.
La présente invention diffère de l'art antérieur [brevet des Etats-Unis d'Amérique
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notamment l'isolement et la caractérisation de composés intermédiaires V, VI, VIII et XVI instables et leur transformation ultérieure en vinblastine et vincristine qui sont des médicaments à usage clinique. L'art antérieur décrit un procédé de production d'alcaloïdes dimères qui sont des analogues des médicaments à usage clinique, par exemple la 3',4'-déhydrovinblastine de formule VII.
On prépare des composés intermédiaires V et VI par mise en contact de vindoline ou d'un dérivé de vindoline [formule XXI dans laquelle R représente H] avec un dérivé d'indole représenté par un composé
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du groupe comprenant l'hydrogène ou un radical COOalk, ou par un composé de formule XXV dans laquelle
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l'hydrogène ou un radical alkyle.
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En plus de la catharanthine, tout motif d'indole représenté par la formule XXVI peut être
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membres du groupe comprenant l'hydrogène, un radical OH, 0-alk, OCO-alk, alkyle ou aryle. Dans la formule XXVI, comme indiqué ci-dessus, alk est un groupe alkyle
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est un groupe mono-aryle tel que benzyle, xylyle, etc.
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Dans les formules XXI à XXVI et d'une manière générale dans la présente demande, alk et alkyle désignent un groupe alkyle inférieur tel que défini pour la formule XXI, et aryle désigne un groupe mono-aryle tel que défini de façon similaire dans la formule XXI.
Le composé intermédiaire VI ainsi obtenu est utilisé dans un procédé nouveau et très spécifique impliquant une réduction en positions 1,4 en vue de former le composé intermédiaire VIII qui est le suivant par ordre d'importance. Le composé intermédiaire VIII est en outre converti par un procédé nouveau en le composé intermédiaire XVI nouveau et ce dernier est utilisé dans un autre procédé nouveau de réduction pour former les composés de structure générale XXI lorsque R est un composé de formule XXII.
Dans une série similaire de réactions, le composé intermédiaire V conduit à des composés de structure générale XXI lorsque R est un composé de formule XXIII.
Une autre particularité nouvelle et très importante de la présente invention est que l'isolement de composés intermédiaires VI, VIII et XVI n'est pas essentiel et que le procédé en entier, soigneusement contrôlé par chromatographie en phase liquide à haute performance pour VI, VIII et XVI, peut être mis en oeuvre en vue de l'obtention de produits dimériques de formule XXI à partir des motifs indole (formules II, XXII et XXIII) et dihydro-indole (formule XXI, R = H) de départ dans une opération en réacteur unique.
PARTIE EXPERIMENTALE
Préparation du sel d'iminium intermédiaire (formule VI) par la réaction de Polonovski modifiée
La réaction a été conduite dans des conditions anhydres. Toute la verrerie a été séchée à l'étuve à 120[deg.]C. Le chlorure de méthylène utilisé comme solvant et l'anhydride trifluoracétique utilisé comme réactif
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0,8 mmole) a été ajouté à une solution de catharanthine (II, 200 mg, 0,6 mmole) dans du chlorure de méthylène anhydre (2 ml) à -20[deg.]C sous atmosphère positive d'argon et le mélange a été agité pendant 5 minutes. Une solution de vindoline (III, 270 mg, 0,6 mmole) dans du chlorure de méthylène (1 ml) a été ajoutée au N-oxyde de catharanthine (lia) ainsi formé et le mélange a été refroidi à -60[deg.]C. De l'anhydride trifluoracétique (0,2 ml, 1,5 mmole) a été ajouté au mélange réactionnel sous agitation maintenu à -60[deg.]C pendant 2 heures. Après cette période, le solvant et les réactifs en excès ont été chassés sous vide à -20[deg.]C en laissant un résidu brun rougeâtre contenant le sel d'iminium intermédiaire.
Ce dernier a été caractérisé par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) à inversion de phase (cartouche Waters Radial-Pak C18 ou CN, système de solvants formé de méthanol-H20-Et3N). Il a été montré que le rendement en VI dans cette réaction dépassait 80 % par réduction de VI (NaBH4, méthanol, 0[deg.]C) en la 3',4'-déhydrovinblastine connue (formule VII).
Réduction du sel d'iminium intermédiaire (formule VI) avec le 1-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (formule
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Synthèse de l'énamine (formule VIII) - (Mode opératoire A)
Du 1-benzyl-1,4-dihydronicotinamide
(135 mg, 0,63 mmole, 6 équivalents) sous atmosphère
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a été ajouté en une période de 5 heures à une solution sous agitation du sel d'iminium intermédiaire (VI,
100 mg) dans de l'acétonitrile (5 ml) dégazé. Après cette période de 5 heures, le mélange réactionnel, comme contrôlé par CLHP avec l'inversion de phase
<EMI ID=62.1>
vants formé de méthanol/H20/Et3N) a indiqué la transformation totale de VI en un mélange d'énamine VIII* et de 3',4'-déhydrovinblastine (VII) dans un rapport de 1:1 (rendement 75 %).
A titre de variante, on a ajouté goutte à goutte ou par portions une solution de 1-benzyl1,4-dihydronicotinamide (56 mg, 0,26 mmole, 2,5 équivalents) dans du méthanol (2 ml) sous pression positive d'argon en une période de 5 heures à une solution sous agitation du sel d'iminium intermédiaire (VI,
100 mg) dans du méthanol (5 ml), initialement maintenue à 0[deg.]C pendant 0,5 heure. Pendant cette période de 5 heures, on a laissé la solution se réchauffer à la température ambiante. Un contrôle par CLHP effectué comme ci-dessus a indiqué la transformation totale de VI en un mélange d'énamine VIII et de 3',4'-déhydrovinblastine (VII) dans un rapport de 1:1 (rendement
75 %).
Dans un essai, le mélange d'énamine (VIII) et de 3',4'-déhydrovinblastine (VII) obtenu comme décrit ci-dessus a été traité avec du borohydrure de sodium en excès (500 mg) à 0[deg.]C. Le mélange réactionnel a ensuite été rendu basique avec de l'hydroxyde d'ammonium et il a été extrait à l'acétate d'éthyle
(3 x 200 ml). Les phases organiques rassemblées ont été déshydratées sur du sulfate de magnésium. Le produit obtenu, après élimination du solvant organique, a été soumis à une chromatographie préparative sur couche mince, sur gel de silice (élution avec un mélange mé thanol/acé tate d'éthyle). Il a été montré que le produit consistait en un mélange de 3',4'déhydrovinblastine (VII) n'ayant pas réagi et de composés connus, à savoir la 4'-déhydrovinblastine (X, R = COOCH3) et la 4'-déoxo-4'-épivinblastine (XI,
<EMI ID=63.1>
a mis en évidence sans ambiguïté la structure de l'énamine VIII.
Réduction du sel d'iminium intermédiaire (formule VI) avec la 3,5-diéthoxycarbonyl-2,6-diméthyl-4-phényl1,4-dihydropyridine (analogue d'ester de Hantzch,
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CH3 ; R4 = phényle) - Variante de synthèse d'énamine
(formule VIII) - (Mode opératoire B)
De la 3,5-diéthoxycarbonyl-2,6-diméthyl4-phényl-1,4-dihydropyridine (264 mg, 8 équivalents) dans de l'éthanol (12 ml) sous atmosphère positive d'argon a été ajoutée à une solution sous agitation du sel d'iminium intermédiaire (VI, 100 mg) dans de l'acétonitrile dégazé (3 ml). Le mélange réactionnel a été chauffé au reflux pendant 3 heures. Après cette période, l'analyse par CLHP avec inversion de phase
(comme décrit ci-dessus) a indiqué la formation, entre autres produits, d'énamine VIII et de 3',4'-déhydrovinblastine (VII) dans un rapport de 1:1 (rendement
60 %).
Synthèse de la vinblastine (formule I) par oxydation d'énamine (formule VIII) en sel d'iminium intermédiaire
(formule XVI) avec le flavine-mononucléotide (FMN,
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Du FMN (80 mg, 1 équivalent) en solution dans un tampon au chlorhydrate de tris (2 ml) sous atmosphère positive d'argon a été ajouté à un mélange réactionnel sous agitation contenant l'énamine (VIII) obtenue comme décrit ci-dessus (mode opératoire A)
à partir du sel d'iminium VI (100 mg). La solution a été maintenue à l'obscurité à la température ambiante
(20[deg.]C) pendant. 16 heures. Ensuite, l'atmosphère inerte d'argon a été remplacée par de l'air et le mélange réactionnel a été agité pendant encore 2,5 heures. Des analyses par CLHP avec inversion de phase ont indiqué la transformation de l'énamine VIII en le sel d'iminium intermédiaire XVI ainsi qu'en d'autres produits (voir plus loin). Du borohydrure de sodium
(500 mg) a été ajouté à 0[deg.]C et le mélange réactionnel a été rendu basique avec de l'hydroxyde d'ammonium et extrait à l'acétate d'éthyle (3 x 200 ml). Les extraits organiques rassemblés ont été déshydratés sur du sulfate de magnésium et le solvant a été chassé sous vide en donnant un produit brut (85 mg).
La purification de ce dernier produit par chromatographie sur couche épaisse (gel de silice, méthanol:acétate d'éthyle 1 : 5 ) a permis la séparation des produits dinériques suivants : vinblastine (formule I, 22 mg, 23 %) :
3',4'-déhydrovinblastine (formule VII, 16 mg, 17 %); leurosine (formule XVII, 8 mg, 9 %), catharine (formule XVIII, 7 mg, 7,5 %) ; vinamidine (formule XIX,
5 mg, 5,6 %) et le produit de réduction de la vinamidine (formule XX, 19 mg, 20 %).
Synthèse de la vinblastine (formule I) par oxydation de l'énamine (formule VIII) au peroxyde d'hydrogène en le sel d'iminium intermédiaire (formule XVI) Procédé 2
Du peroxyde d'hydrogène (30 %, 1,2 ml,
95 équivalents) sous atmosphère inerte d'argon a été ajouté à une solution contenant l'énamine (VIII) obtenue à partir du sel d'iminium intermédiaire VI (100 mg, mode opératoire A). Le mélange réactionnel a été agité à la température ambiante pendant 5,5 heures aux termes desquels des analyses par CLHP avec inversion de phase ont indiqué la transformation complète de l'énamine VIII. Du borohydrure de sodium (500 mg)
<EMI ID=66.1>
(3 x 200 ml). Les extraits organiques rassemblés ont été déshydratés sur du sulfate de magnésium et le solvant a été chassé sous vide. Le produit mixte résultant a été séparé par chromatographie sur couche épaisse
(gel de silice, méthanol/acétate d'éthyle) en donnant les alcaloïdes dimériques suivants : vinblastine (I, 4 mg, 4 %), 3',4'-déhydrovinblastine (VII, 5 mg, 4,8 %), leurosine (XVII, 13 mg, 12,5 %), catharine
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(XX, 30 mg, 27,6 %).
Synthèse de la vinblastine (I) par oxydation de l'énamine (VIII) en présence d'air en le sel d'iminium intermédiaire (formule XVI) - Procédé 3
Une solution contenant l'énamine (VIII) obtenue à partir du sel d'iminium intermédiaire (VI,
100 mg) par le mode opératoire A a été agitée à l'air libre à la température ambiante pendant 3 heures. Après cette période, du borohydrure de sodium (500 mg) a été ajouté à 0[deg.]C et le mélange réactionnel a été rendu basique avec de l'hydroxyde d'ammonium et extrait à l'acétate d'éthyle (3 x 200 ml). Les extraits organi-ques rassemblés ont été déshydratés sur du MgS04 et chassés sous vide. Le produit brut résultant a été séparé par chromatographie préparative sur couche épaisse (gel de silice, méthanol/acétate d'éthyle) en donnant la vinblastine (I, 4 mg, 4 %).
Synthèse de la vinblastine (I) par oxydation de l'énamine (formule VIII) à l'air en présence de chlorure ferrique en le sel d'iminium intermédiaire (XVI) Procédé 4
Du chlorure ferrique (1 équivalent) a été ajouté à une solution sous agitation contenant l'énamine (VIII) obtenue à partir du sel d'iminium intermédiaire (VI, 100 mg, mode opératoire A) et on
<EMI ID=68.1>
réactionnel basique avec de l'hydroxyde d'ammonium avant l'extraction à l'acétate d'éthyle (3 x 100 ml). Les extraits organiques rassemblés ont été déshydratés sur du Na2S04 et le solvant a été chassé sous vide. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur couche épaisse (gel de silice, méthanol/acétate d'éthyle) en donnant la vinblastine (I, 37 mg). Sur la base de l'énamine (50 mg) présente dans le mélange, le rendement dans cette étape est de 70 %.
"Process for the synthesis of dimeric alkaloid compounds"
The present invention relates to a new and improved process intended in particular for the production of dimeric alkaloid compounds, in particular from the group of Catharanthus alkaloids (Vinca), and it relates in particular to an improved process for producing antiviral antileukemic (antineoplastic) compounds, know vincristine 'and vinblastine, formula I
<EMI ID = 1.1>
The above compound is vinblastine
(NSC 49482) when R is a COOCH3 group and R1 is a
<EMI ID = 2.1> <EMI ID = 3.1>
and N1 is an N-CHO (N-formyl) group.
The present series of dimeric alkaloids, comprising important antitumor agents, is formed from an indole such as catharanthine
(formula II, R = COOCH3) and a dihydro-indole unit, for example vindoline (formula III), the halves of which are attached by a carbon-to-carbon bond impli-
<EMI ID = 4.1>
vindoline.
<EMI ID = 5.1>
The conditions of the coupling reaction, as described in the present invention, are related to a significant modification of the process developed in these laboratories [US patent
<EMI ID = 6.1>
2858 (1976)] (Figure 1). In particular, the modification according to the invention allows the preparation and isolation of the very unstable dihydropyridinium VI intermediate compound (R = COOCH3), which is formed in
<EMI ID = 7.1>
with vindoline (formula III).
In general, the Nb-oxide derivative of the motif
<EMI ID = 8.1> n has a value from 0 to 10) prepared with a peracid
<EMI ID = 9.1>
such as methylene chloride or other polyhalogenated organic solvents, are obtained at temperatures
<EMI ID = 10.1>
biante and above. The intermediate N-oxide thus formed is used for the next step without isolation. The fragmentation reaction, which fragments the bond
<EMI ID = 11.1>
in the presence of a reagent such as trifluoroacetic anhydride. To maximize the subsequent coupling reaction that promotes the formation of a natural dimer
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indole can be added to the reaction mixture before the fragmentation reaction. As other reagents for the trifluoroacetic anhydride component used in the fragmentation and coupling, trichloroacetic anhydride, acetic anhydride, acetyl halides and tosylic anhydride can be chosen. These reagents cause a fragmentation of the type
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represented by formulas IIa and IV.
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The reaction conditions, namely temperature, time and pressure, are generally analogous to those used in the Polonovski reaction which, in its original application, involved the dealkylation of tertiary and heterocyclic amines by acylation of the N-oxides corresponding with acetic anhydride or acetyl chloride
(see Merck Index, 8th edition, 1968, page 1203). The temperature of the fragmentation reaction and
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preferably located in the lower part of this range. The steps of the reaction relating to the formation of N-oxide can be carried out in the open air or in an atmosphere of inert gas such as argon or another inert gas of Group Zero of the Periodic Table such as helium, nitrogen, neon, etc. The same conditions in an inert atmosphere are used in the fragmentation and coupling stages of the reaction and with a positive temperature control.
<EMI ID = 16.1>
<EMI ID = 17.1>
Due to the low temperature required for reactions at a later stage, the reaction time can vary from a few hours to several days.
The first dimeric indole-dihydro-indole intermediate compound formed, after the (stereospecific) coupling reaction, has a salt function
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as represented by formulas V or VI. The reduction of this intermediate iminium salt by reaction with
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produces the dimeric alkaloid (s) as described in the United States patent
<EMI ID = 20.1>
In the present invention, the intermediate iminium salt (formula V or VI) can be isolated as it is by careful handling. When the coupling reaction is complete, the reaction mixture is treated directly on an appropriate chromatographic system such as column chromatography, thin layer chromatography or high performance liquid chromatography, preferably with phase inversion and / or by operations. separation by dimensional exclusion. Operation temperature can
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alternatively, volatile reagents and solvents which are present together with the intermediate iminium salt in the reaction mixture can be removed under reduced pressure and temperature, preferably below -10 [deg.] C. The resulting solid material (formula V or VI) is then dissolved in various organic solvents such as halogenated hydrocarbons, ethers, alcohols, acetonitrile, etc., and / or various aqueous buffers. The pH of the buffer can vary from 2 to 10. The solution of the intermediate iminium salt (formula V or VI) can then be purified by the chromatographic operations described above, before other characterizations. Alternatively, the intermediate iminium salt solution can be used directly for subsequent reactions.
The use of an inert atmosphere may or may not be necessary.
When the starting indole motif has a C3-C4 double bond (for example catharanthine
(II)), the resulting intermediate coupling compound contains an unsaturated iminium functional group
<EMI ID = 22.1>
LiBH4) gives 3 ', 4'-dehydrovinblastin compounds
(formula VII). The process of the invention uses a new reduction mode in which the transformation of the intermediate minimium salt (formula VI) into the enamine (formula VIII) can be carried out. Reagents used for this reduction include 1,4-dihydropyridine compounds (so-called NADH models) as represented by formula IX:
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<EMI ID = 24.1>
Two series of such compounds are readily available [Chem. Rev. 82, 232 (1982); Chem. Rev. 72, 1 (1972)].
The first series is known as esters
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The second series comprises 1,4-dihydronicotinamides substituted on the nitrogen atom (formle IX) where R .. is a substituted alkyl or substituted aryl function, by
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from the group comprising hydrogen and the alkyl, substituted alkyl, aryl and substituted aryl functions.
The above reducers can be used individually or in combination. When 1,4-dihydropyridines are used to reduce the iminium VI salt, organic solvents such as alcohols, acetonitrile or higher representatives of this series, dimethylsulfoxide, - dimethylformamide, various, are used. ethers such as dioxane, tetrahydrofuran, etc., chlorinated hydrocarbons, etc., normally without using an aqueous buffer as a co-solvent. The progress of the reduction is monitored by direct analysis of the reaction mixture on an appropriate chromatographic system, preferably by high performance liquid phase chromatography with phase inversion. This process is used to optimize the temperature, time and pressure of the reaction and the concentration of the reactants.
The reaction temperature can vary from ambient <EMI ID = 27.1>. The reaction time can vary from a few minutes to several days depending on other parameters. The reduction is carried out in a vacuum under inert conditions, for example under argon or in an inert gas from Group Zero of the Periodic Table (nitrogen, helium, neon, etc.). The enamine (formula VIII) formed in the above reduction can be used directly for the subsequent reaction or isolated by careful handling. The reaction mixture is treated directly on an appropriate chromatographic system, for example by column chromatography, thin layer chromatography or high performance liquid chromatography, preferably with phase inversion, and / or subjected to permeation separation operations on gel.
The operating temperature can vary from 4 [deg.] C to room temperature. As a variant, the reactants and volatile solvents present in the reaction mixture are removed under pressure and at reduced temperature, preferably below -10 [deg.] C. The resulting residue can be purified by the chromatographic operations described above before being characterized or transformed.
. Treatment of enamine VIII with <EMI ID = 28.1>
vinblastine (formula XI, R = COOCH3). While under oxidizing conditions, enamine VIII can be transformed into the vinblastine / vincristine series via the intermediate iminium salt (formula
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Oxidizing conditions which are used to convert an enamine (formula VIII) to an intermediate iminium salt (formula XVI) include the following:
(1) regulated aeration / oxygenation;
(2) addition of flavin coenzymes [riboflavin, formula XII, R = H; flavin-mononucleotide
<EMI ID = 31.1>
followed by a set aeration / oxygenation operation;
<EMI ID = 32.1>
XII
(3) addition of the reduced form of flavin coenzymes (dihydroriboflavin, formula XIII, R = H; dihydroflavin-mononucleotide (FMNH2), formula <EMI ID = 33.1> of a controlled aeration / oxygenation operation;
<EMI ID = 34.1>
(4) addition of flavin coenzyme analogs with an iso-alloxazine structure as a representative
<EMI ID = 35.1>
may be representatives of the group comprising the alkyl, substituted alkyl, aryl and substituted aryl functions, followed by a controlled aeration / oxygenation operation;
<EMI ID = 36.1>
XIV
(5) addition of the reduced form (1,5dihydro) of the flavin coenzyme analogs above, as represented by formula XV in which
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the alkyl, substituted alkyl, aryl and substituted aryl functions, followed by a controlled aeration / oxygenation operation;
<EMI ID = 38.1>
(6) addition of hydrogen peroxide and / or hydroperoxides as represented by the formula R-OOH, in which R can be an alkyl, substituted alkyl, aryl or substituted aryl function;
(7) addition of peracids as shown
<EMI ID = 39.1> alkyl, substituted alkyl, aryl or substituted aryl function;
(8) addition of superoxides;
(9) addition of a hydroxyl radical (OH) generated in various ways, for example by the use of hydrogen peroxide in the presence of the ferrous ion;
(10) addition of a metal ion which is a good electron acceptor, for example the ion
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(Ag + 1), followed by a set aeration / oxygenation operation.
Oxidation processes involving controlled aeration / oxygenation (condition (1)), the analo-
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peroxides (condition (6)), peracids (condition (7)), superoxides (condition (8)), hydroxyl radical (OH) (condition (9)) and metal ions capable of transferring electrons (condition (10)) can be carried out in organic solvents such as alcohols, acetonitrile or higher representatives of this series, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, various ethers such as dioxane, tetrahydrofuran, aromatic hydrocarbons such than benzene, toluene, etc.
Oxidation processes involving flavin coenzymes (conditions (2), (3)) require an aqueous buffer (e.g. phosphate buffers, tris hydrochloride, MES)) at pH 5-9, but preferably in the range of 6 to 8, as a solvent. An organic co-solvent, for example alcohols, acetonitrile or an upper member of this series, dioxane, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, can be used.
The progress of the oxidation process is monitored by direct analysis of the reaction mixture on an appropriate chromatographic system, preferably by high performance liquid phase chromatography with phase inversion. This method is used to optimize the temperature, time, reaction pressure and concentration of the reactants. The reaction temperature can vary from -60 to +60 [deg.] C and preferably 4 [deg.] C at room temperature. The reaction time can vary from a few minutes to several days, depending on the other parameters. The reaction is carried out at atmospheric pressure.
Transformation of the intermediate compound
(formula 'XVI) in vinblastine (formula I) can be
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alkali metal hydride (NaBH4, KBH4, LiBH4) in suitable solvents (organic or aqueous) as used in the oxidation process (conditions (1) - (10)).
For practical purposes, isolation of the intermediate compounds (formulas V, VI, VIII, XVI) is not required and the whole process from the indole unit (formula II) and the dihydro-indole unit
(formula III) up to the vinblastine (formula I) constituting the final product can preferably be carried out in a single container operation.
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In summary, the process of the invention is applicable to obtaining dimeric products from catharanthine and dihydrocatharanthine with vindoline as starting material and phenyl, alkyl and amide derivatives corresponding to the formulas
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The formula XXI corresponds to the representation which is given of it and in this formula, alk
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such as benzyl, styryl and xylyl; R1 is a member of the group comprising hydrogen, alk radicals,
<EMI ID = 48.1>
R2 and R3 are representatives of the group comprising hydrogen and a radical -CO-alk; R4 is a representative of the group comprising the radicals COO-alk, CONH-NH2,
<EMI ID = 49.1> of the indole represented by the formula XXII in which R7 is chosen from the group comprising hydrogen
<EMI ID = 50.1>
taking hydrogen, an OH, 0-alk, OCO-alk radical
<EMI ID = 51.1>
hydrogen, an OH, O-alk, OCO-alk or alk radical; R10 is a member of the group comprising hydrogen, an OH, O-alk, OCO-alk radical, or of formula XXIII in which R11 is a representative of the group comprising hydrogen or a COO-alk radical; R12 is an alkyl group.
The present invention differs from the prior art [United States patent
<EMI ID = 52.1>
in particular the isolation and characterization of unstable intermediate compounds V, VI, VIII and XVI and their subsequent transformation into vinblastine and vincristine which are drugs for clinical use. The prior art describes a process for the production of dimeric alkaloids which are analogues of medicaments for clinical use, for example 3 ', 4'-dehydrovinblastine of formula VII.
Intermediate compounds V and VI are prepared by contacting vindoline or a vindoline derivative [formula XXI in which R represents H] with an indole derivative represented by a compound
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from the group comprising hydrogen or a COOalk radical, or by a compound of formula XXV in which
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hydrogen or an alkyl radical.
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In addition to catharanthine, any indole motif represented by the formula XXVI can be
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members of the group comprising hydrogen, an OH, O-alk, OCO-alk, alkyl or aryl radical. In formula XXVI, as indicated above, alk is an alkyl group
<EMI ID = 57.1>
is a mono-aryl group such as benzyl, xylyl, etc.
<EMI ID = 58.1>
In formulas XXI to XXVI and generally in the present application, alk and alkyl denote a lower alkyl group as defined for formula XXI, and aryl denotes a mono-aryl group as defined similarly in the formula XXI.
The intermediate compound VI thus obtained is used in a new and very specific process involving a reduction in positions 1,4 in order to form the intermediate compound VIII which is the following in order of importance. The intermediate compound VIII is further converted by a new process to the new intermediate compound XVI and the latter is used in another new reduction process to form the compounds of general structure XXI when R is a compound of formula XXII.
In a similar series of reactions, the intermediate compound V leads to compounds of general structure XXI when R is a compound of formula XXIII.
Another new and very important feature of the present invention is that the isolation of intermediate compounds VI, VIII and XVI is not essential and that the entire process, carefully monitored by high performance liquid chromatography for VI, VIII and XVI, can be used with a view to obtaining dimeric products of formula XXI from the indole (formulas II, XXII and XXIII) and dihydro-indole (starting formula XXI, R = H) units in an operation in a single reactor.
EXPERIMENTAL PART
Preparation of the intermediate iminium salt (formula VI) by the modified Polonovski reaction
The reaction was carried out under anhydrous conditions. All the glassware was dried in an oven at 120 [deg.] C. Methylene chloride used as solvent and trifluoroacetic anhydride used as reagent
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0.8 mmol) was added to a solution of catharanthine (II, 200 mg, 0.6 mmol) in anhydrous methylene chloride (2 ml) at -20 [deg.] C under a positive argon atmosphere and the mixture was stirred for 5 minutes. A solution of vindoline (III, 270 mg, 0.6 mmol) in methylene chloride (1 ml) was added to the catharanthine N-oxide (IIa) thus formed and the mixture was cooled to -60 [deg. ]VS. Trifluoroacetic anhydride (0.2 ml, 1.5 mmol) was added to the reaction mixture with stirring maintained at -60 [deg.] C for 2 hours. After this period, the solvent and the excess reagents were removed in vacuo at -20 [deg.] C leaving a reddish brown residue containing the intermediate iminium salt.
The latter was characterized by high performance liquid phase chromatography (HPLC) with phase inversion (Waters Radial-Pak C18 or CN cartridge, solvent system formed from methanol-H20-Et3N). It was shown that the yield of VI in this reaction exceeded 80% by reduction of VI (NaBH4, methanol, 0 [deg.] C) in the known 3 ', 4'-dehydrovinblastine (formula VII).
Reduction of the intermediate iminium salt (formula VI) with 1-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (formula
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Enamine synthesis (formula VIII) - (Procedure A)
1-Benzyl-1,4-dihydronicotinamide
(135 mg, 0.63 mmol, 6 equivalents) under atmosphere
<EMI ID = 61.1>
was added over a period of 5 hours to a stirred solution of the intermediate iminium salt (VI,
100 mg) in degassed acetonitrile (5 ml). After this 5 hour period, the reaction mixture, as controlled by HPLC with phase inversion
<EMI ID = 62.1>
vants formed of methanol / H2O / Et3N) indicated the total transformation of VI into a mixture of enamine VIII * and 3 ', 4'-dehydrovinblastine (VII) in a ratio of 1: 1 (yield 75%).
Alternatively, a solution of 1-benzyl1,4-dihydronicotinamide (56 mg, 0.26 mmol, 2.5 equivalents) in methanol (2 ml) was added dropwise or in portions. argon over a period of 5 hours in a solution with stirring of the intermediate iminium salt (VI,
100 mg) in methanol (5 ml), initially kept at 0 [deg.] C for 0.5 hour. During this 5 hour period, the solution was allowed to warm to room temperature. HPLC control performed as above indicated the total transformation of VI into a mixture of enamine VIII and 3 ', 4'-dehydrovinblastine (VII) in a ratio of 1: 1 (yield
75%).
In a test, the mixture of enamine (VIII) and 3 ', 4'-dehydrovinblastine (VII) obtained as described above was treated with excess sodium borohydride (500 mg) at 0 [deg.] vs. The reaction mixture was then made basic with ammonium hydroxide and was extracted with ethyl acetate
(3 x 200 ml). The combined organic phases were dried over magnesium sulfate. The product obtained, after removal of the organic solvent, was subjected to preparative thin layer chromatography on silica gel (elution with a methanol / ethyl acetate mixture). The product has been shown to consist of a mixture of unreacted 3 ', 4' dehydrovinblastin (VII) and known compounds, namely 4'-dehydrovinblastin (X, R = COOCH3) and 4'- deoxo-4'-epivinblastine (XI,
<EMI ID = 63.1>
unambiguously demonstrated the structure of enamine VIII.
Reduction of the intermediate iminium salt (formula VI) with 3,5-diethoxycarbonyl-2,6-dimethyl-4-phenyl1,4-dihydropyridine (Hantzch ester analog,
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CH3; R4 = phenyl) - Enamine synthesis variant
(formula VIII) - (Procedure B)
3,5-diethoxycarbonyl-2,6-dimethyl4-phenyl-1,4-dihydropyridine (264 mg, 8 equivalents) in ethanol (12 ml) under a positive argon atmosphere was added to a solution under agitation of the intermediate iminium salt (VI, 100 mg) in degassed acetonitrile (3 ml). The reaction mixture was heated at reflux for 3 hours. After this period, analysis by HPLC with phase inversion
(as described above) indicated the formation, among other products, of enamine VIII and 3 ', 4'-dehydrovinblastine (VII) in a ratio of 1: 1 (yield
60%).
Synthesis of vinblastine (formula I) by oxidation of enamine (formula VIII) to intermediate iminium salt
(formula XVI) with the flavin-mononucleotide (FMN,
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FMN (80 mg, 1 equivalent) in solution in a tris hydrochloride buffer (2 ml) under a positive argon atmosphere was added to a stirred reaction mixture containing the enamine (VIII) obtained as described above. (procedure A)
from iminium salt VI (100 mg). The solution was kept in the dark at room temperature
(20 [deg.] C) during. 16 hours. Then, the inert argon atmosphere was replaced with air and the reaction mixture was stirred for an additional 2.5 hours. Phase inversion HPLC analyzes indicated the transformation of enamine VIII into the intermediate iminium salt XVI as well as other products (see below). Sodium borohydride
(500 mg) was added at 0 [deg.] C and the reaction mixture was made basic with ammonium hydroxide and extracted with ethyl acetate (3 x 200 ml). The combined organic extracts were dried over magnesium sulfate and the solvent was removed in vacuo to give a crude product (85 mg).
The purification of the latter product by thick layer chromatography (silica gel, methanol: ethyl acetate 1: 5) allowed the separation of the following dineric products: vinblastine (formula I, 22 mg, 23%):
3 ', 4'-dehydrovinblastine (formula VII, 16 mg, 17%); leurosine (formula XVII, 8 mg, 9%), catharine (formula XVIII, 7 mg, 7.5%); vinamidine (formula XIX,
5 mg, 5.6%) and the vinamidine reduction product (formula XX, 19 mg, 20%).
Synthesis of vinblastine (formula I) by oxidation of enamine (formula VIII) with hydrogen peroxide to the intermediate iminium salt (formula XVI) Method 2
Hydrogen peroxide (30%, 1.2 ml,
95 equivalents) under an inert atmosphere of argon was added to a solution containing enamine (VIII) obtained from the intermediate iminium salt VI (100 mg, procedure A). The reaction mixture was stirred at room temperature for 5.5 hours at which time HPLC analyzes with phase inversion indicated complete transformation of enamine VIII. Sodium borohydride (500 mg)
<EMI ID = 66.1>
(3 x 200 ml). The combined organic extracts were dried over magnesium sulfate and the solvent was removed in vacuo. The resulting mixed product was separated by thick layer chromatography
(silica gel, methanol / ethyl acetate), giving the following dimeric alkaloids: vinblastine (I, 4 mg, 4%), 3 ', 4'-dehydrovinblastine (VII, 5 mg, 4.8%), leurosine (XVII, 13 mg, 12.5%), catharin
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(XX, 30 mg, 27.6%).
Synthesis of vinblastine (I) by oxidation of enamine (VIII) in the presence of air in the intermediate iminium salt (formula XVI) - Method 3
A solution containing enamine (VIII) obtained from the intermediate iminium salt (VI,
100 mg) by procedure A was stirred in the open air at room temperature for 3 hours. After this period, sodium borohydride (500 mg) was added at 0 [deg.] C and the reaction mixture was made basic with ammonium hydroxide and extracted with ethyl acetate (3 x 200 ml). The combined organic extracts were dried over MgS04 and removed in vacuo. The resulting crude product was separated by preparative chromatography on a thick layer (silica gel, methanol / ethyl acetate) giving the vinblastine (I, 4 mg, 4%).
Synthesis of vinblastine (I) by oxidation of enamine (formula VIII) in air in the presence of ferric chloride to the intermediate iminium salt (XVI) Method 4
Ferric chloride (1 equivalent) was added to a stirred solution containing enamine (VIII) obtained from the intermediate iminium salt (VI, 100 mg, procedure A) and
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basic reaction with ammonium hydroxide before extraction with ethyl acetate (3 x 100 ml). The combined organic extracts were dried over Na2SO4 and the solvent was removed in vacuo. The crude product was purified by thick layer chromatography (silica gel, methanol / ethyl acetate) to give vinblastine (I, 37 mg). Based on the enamine (50 mg) present in the mixture, the yield in this step is 70%.