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Utilisation de l'activateur tissulaire du plasminogen, son association avec une superoxyde-dismutase et formulation pharmaceutique contenant cette association.
La présente invention concerne l'activateur tissulaire du plasminogbne, son association avec une superoxydedismutase, des formulations pharmaceutiques les contenant et leur emploi en médecine humaine et veterinaire.
11 existe un équilibre dynamique entre le Systeme enzymatique capable de former des caillots sanguins (lesys- tème coagulateur) et le système enzymatique capable de dissoudre les caillots sanguins (le système fibrinolytique) qui maintient à l'état dégagé un lit vasculaire intact.
Pour limiter la perte de sang par une blessure, des caillots sanguins sont formés dans le vaisseau lésé. Après la réparation naturelle de la blessure, les caillots sanguins superflus sont dissous par l'action du système fibrinolytique.
Des caillots sanguins peuvent occasionnellement se former en l'absence de blessure traumatique et peuvent se loger dans des vaisseaux sanguins importants en faisant ainsi partiellement ou même totalement obstacle à l'écoulement du sang. Si cela se produit dans le coeur, le poumon ou le cerveau, il peut s'ensuivre un infarctus du myocarde, une embolie pulmonaire ou un ictus cerebral. Ces affections constituent ensemble la principale cause de morbidité et de mortalité dans les nations industrialisées.
Les caillots sanguins sont constitués d'unreseau fibreux qui est susceptible d'être dissous par une enzyme protéolytique, la plasmine. Cette enzyme est dérivée d'une pro-enzyme inactive, le plasminogène, un composantdu plasma sanguin, sous l'action d'un activateur de plasminogène. 11 existe chez les mammifères deux activateurs de plasminogen immunologiquement distincts. L'activateur intrinsèque du plasrninogènet éga1ement connu en tant qu'urokinase, est une enzyme produite par le rein qui peut être isolée de l'urine.
On peut également le préparer ä partir d'un certain nombre de cultures tissulaires qui en sont des sources. L'activateur extrinsèque du plasminogène, également connu en tant qu'acti- vateur vasculaire du plasminogène et en tant qu'activateur tissulaire du plasminogbne (AP-t), peut être isole de nom-
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breux homogénats tissulaires (notamment d'uterus humain), de la paroi des cellules vasculaires et de certaines cul- tures tissulaires. En plus de ces deux types d'activateurs du plasminogène, il existe également un produit bactérien, la streptokinase, préparé ä partir de streptocoques betahémolytiques.
Un inconvénient majeur affectant ä la fois l'urokinase et la streptokinase est qu'elles sont actives dans toute la circulation et non juste à l'emplacement d'un caillot sanguin. Elles peuvent, par exemple, détruire d'autres protéines du sang, telles que le fibrinogène, la prothrombine, le facteur V et le facteur VIII, en réduisant ainsi le pouvoir de coagulation du sang et en augmentant le risque d'hémorragie. Par contre, l'activité biologique de AP-t dépend de la présence de fibrine ä laquelle il se lie et où il est activé. L'activité maximale ne se développe ainsi qu'au seul emplacement d'un caillot sanguin, c'est-à- dire en présence du réseau fibrineux ä dissoudre, et le risque d'hémorragie s'en trouve écarté dans une large mesure.
L'interruption du courant sanguin dans un vaisseau mène généralement ä la survenue d'une ischémie. Dans cette Situation, le tissu est privé d'oxygène et se trouve menacé, un état dans lequel le tissu est altéré mais encore potentiellement viable. Cependant, si cette situation se prolonge pendant une periode de, par exemple trois heures ou plus, le tissu se nécrose et, une fois dans cet état, ne peut être récupéré. 11 est donc important qu'une réirrigation, c'est- à-dire le rétablissement du courant sanguin, ait lieu aussi tot que possible pour sauver le tissu avant qu'il ne soit définitivement endommagé.
Ironiquement, même si elle est réalisée avant que le tissu ne devienne nécrotique, la réirrigation elle-même engendre un ensemble complexe de phénomènes, y compris la formation présumée du radical superoxyde, qui exercent un effet délétère sur le tissu hypoxique. Par conséquent, la réirrigation ne peut conduire qu'à une récupération partielle du tissu menacé, le reste gtantdafiniti- vement endommage par la survenue d'un ou plusieurs de ces phénomènes. -
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On a maintenant découvert que AP-t inhibe l'encom- magement d'un tissu menacé pendant la réirrigation en protégeant ce tissu ä l'encontre d'un ou plusieurs des phénomènes susmentionnés.
Le mécanisme d'action par lequel AP-t apporte cette protection n'a pas été explicite mais il n'est pas lié à son activité d'agent thrombolytique. Cette propriété nouvellement découverte donne ainsi la possibilité d'utiliser AP-t, ou une formulation pharmaceutique le contenant, comme inhibiteur d'endommagement de tissu menace dans les girconstances globalement exposées ici.
En consequence, la présente invention propose : (a) un procédé pour inhiber l'endommagement d'un tissu menacd pendant une réirrigation chez un mammifère, qui consiste ä administrer au mammifère une quantité efficace de AP-t (b) l'utilisation de AP-t pour inhiber l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation chez un mammifère ; (c) l'utilisation de AP-t pour la fabrication d'un media- ment destine ä l'inhibition de l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation chez un mammifère : et (d) une formulation pharmaceutique ä utiliser pour inhiber l'endommagement d'un tissu menace pendant une réirriga- tion chez un mammifère, qui comprend AP-t et un support pharmaceutiquement acceptable.
Bien que la présente inventionpuisse être mise en oeuvre pour protéger un quelconque tissu menacé, elle est particulièrement utile pour inhiber l'endommagement d'un tissu myocardique menacé.
Le AP-t ä utiliser dans la présente invention peut etre n'importe quelle protéine biologiquement active correspondant sensiblement au AP-t des mammifères, et en particulier des etres humains, et il englobe les formes avec et sans glycosylation. 11 peut s'agir de AP-t à une ou deux chaines, ou d'un mélange de tels AP-t, comme décrit dans le document EP-A-112 122,-et, dans le cas de AP-t humain totalement glycosylé, son poids moleculaire apparent sur gel de polyacrylamide est d'environ 70 000 et son point
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isoélectrique est compris entre 7, 5 et 8, 0. De préférence, l'activité spécifique du AP-t est d'environ 500 000 UI/mg (Unités Internationales/mg,
l'Unité Internationale étant une unité d'activité définie par le National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead Londres, NW3 6RB, Royaume-Uni, dans le cadre de l'Organisation Mondiale de la Santé).
La séquence d'amino-acides de AP-t correspond de préférence sensiblement ä celle qui est exposée sur la figure 1 des dessins annexés. 11 s'agit donc d'une séquence identique à celle de la figure l ou comportant une ou plusieurs délétions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides, d'origine allélomorphe ou autre, la séquence résultante présentant au moins 80 %, et de préférence 90 %, d'homologie avec la séquence de la figure 1 et conservant essentiellement les memes propriétés biologiques et immunologiques que cette protéine.
En particulier, la séquence est identique ä celle de la figure 1 ou bien est la même à la différence que l'amino-acide de la 245ème position ä partir de la sérine N-terminale est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence contenant éventuellement une préséquence polypeptidique N-terminale additionnelle consistant en Gly-Ala-Arg.
La sequence -d'amino-acides représentée-sur la figure l contient trente-cinq résidus de cystéine et a donc la capacité de former dix-sept ponts disulfure. Sur la base d'une analogie faite avec d'autres protéines dont la structure a été déterminée plus en détail, la figure 2 montre la structure proposée pour la séquence (résultant de la formation de ponts disulfure) comprise entre l'amino-acide de la 90ème position et la proline C-terminale. on est moins sur de la structure de la région N-terminale, bien que quelques propositions aient été avancées (Progress in Fibrinolysis, 1983, /=269-273 : et Proc. Natl. Acad. Sei., 1984., 81, 5355-5359).
Les caractéristiques les plus importantes de la structure de AP-t sont les deux régions en anneau (comprises
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entre les 92ème et 173ème amino-acides et entre les 180ème et 261ème amino-acides), qui sont responsables de la liaison de la protéine à la fibrine, et la région des sérine-protéases qui constitue la majeure partie de la chaîne B et qui est responsable de l'activation du plasminogène. Les amino-acides particulièrement importants des sérine-protéases sont ceux de la triade catalytique His/Asp/Ser. Dans AP-t, ceux-ci apparaissent aux 322ème, 371ème et 463ème positions.
Le pont
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'-me et disulfure reliant les résidus de cystéine des 264ème et 395ème positions est légalement important en ce sens qu'il maintient ensemble les chaînes A et B dans la forme bicaté- naire de AP-t.
Sur les figures 1 et 2, les résidus d'amino-acides sont désignés par les codes conventionnels ä une et trois lettres suivants : Asp D Acide aspartique Cys C Cystéine His H Histidine Thr T Thréonine Val V Valine Arg R Arginine Ser S Sérine Ile I Isoleucine Lye K Lysine Glu E Acide glutamique Leu L Leucine Trp KTryptophanne Pro P Proline Tyr Y Tyrosine Gln Q Glutamine Gly G Glycine Phe F Phénylalanine Met M Methionine Ala A Alanine Asn N Asparagine Sur la figure 2, l'astérisque désigne le site de clivagede AP-t monocatenaire en AP-t bicaténairedans lequel la chaine A contient les deux régions en anneau et la chaine B contient
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la région des sérine-protéases.
Le AP-t peut être obtenu par l'une quelconquedes techniques décrites ou connues dans l'art antérieur. Par exemple, on peut 1 t obtenir à partir d'une lignée cellulaire normale ou néoplasique du type décrit dans Biochemica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153 ; et les documents EP-A- 41 766 et EP-A-113 319. On préfère cependant que AP-t soit tir d'une lignée cellulaire cultivée transformée et transfectée, dérivée en utilisant une technique d'ADN recombinant comme décrit par exemple dans les documents EP-A-93 619, EP-A-117 059, EP-A-117 060, EP-A-173 552, EP-A-174 835, EP-A-178 105, WO 86/01538, WO 86/05514 et WO 86/05807.
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On préfère en particulier l'utilisation de cellules d'ovaire de hamster chinois (OHC) pour la production de AP-t, et que ces cellules soient dérivées de la manière décrite dans Molecular and Cellular Biology, 1985, 5 (7), 1750-1759. Selon cette methode, le gène cloné est co-transfecté avec le gène codant la dihydrofolate-réductase (dhfr) dans des cellules dhfr- de OHC. Les transformants exprimant dhfr sont selec- tionnés sur des milieux manquant de nucléosides et sont exposés ä des concentrations croissantes de méthotrexate.
Les gènes de dhfr et de AP-t sont ainsi amplifiés conjointement en conduisant ä une lignée cellulaire stable capable d'exprimer des taux élevés de AP-t.
De préférence, on purifie le AP-t en utilisant n'importe laquelle des techniques décrites ou connues dans l'art antérieur, par exemple les techniques décrites dans Biochemica et Biophysica Acta, 1979,580, 140-153 : J. Biol.
Chem., 1979, 254 (6), 1998-2003 : ibid., 1981, 256 (13), 7035- 7041 ; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686 ; et les documents EP-A-41 766, EP-A-113 319 et GB-A-2 122 219.
Le AP-t peut être utilisé ä la manière de la présente invention soit seul, soit en association avec un autre agent thérapeutique qui inhibe également l'endommagement d'un tissu menacé pendant une reirrigation. Un exemple particu- lièrement utile-dLme telle association est celle faite avec la superoxyde-dismutase (SOD), une enzyme dont on sait qu'elle entraine et détruit les radicaux superoxyde qui sont l'agent d'un des phénomènes capables de provoquer l'endommagement du tissu. En fait, on a également constaté que le degré d'inhibition offert par l'association de AP-t et SOD est fortement potentialisé comparativement à ceux que procurent AP-t et SOD par eux-mêmes. En conséquence, la présente invention propose également une association de AP-t et de SOD.
L'association de AP-t et SOD fournit un moyen particulièrement commode pour réaliser à la fois l'élimination des caillots sanguins et l'inhibition de l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation subséquente.
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Ainsi, de l'administration de AP-t et SOD résulte tout d'abord l'Elimination du caillot sanguin sousl'action thrombolytique connue de AP-t, puis l'inhibition del'endommagement du tissu sous les actions conjuguées de AP-t et de SOD.
La SOD a utiliser en association avec AP-t peut etre n'importe quelle protéine biologiquement active correspondant sensiblement ä l'une ou plusieurs quelconques d'un groupe d'enzymes globalement désignées par ce nom. Elle est de préférence d'origine mammifère et en particulier bovine ou humaine, et se trouve généralement combinée à un cation métallique dont on se sert normalement pour la classer. Des exemples de cations métalliques comprennent ceux de fer, manganèse et cuivre et, de préférence, des associations de cuivre avec d'autres métaux tels que le zinc, le cadmium, le cobalt ou le mercure, parmi lesquelles on préfère l'association cuivre/zinc. Les formes combinées au manganèse et au cuivre/zinc de SOD se rencontrent naturellement chez les êtres humains.
Les formes combinées au fer et au manganèse de SOD d'origine bactérienne ont toute deux un poids molécu- laire d'environ 40 000 et sont des dimères. D'autre part, la forme combinée au manganèse de SOD d'origine eucaryotique est un tétramère dont le poids moléculaire est d'environ
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80 000. La forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine eucaryotique est un dimère qui contient un cation cuivre et un cation zinc par sous-unité et dont le poids moleculaire est d'environ 32 000.
Le cation cuivre est lié par coordination à quatre résidus d'histidine par sous-unité et le cation zinc est lié par coordination entre un residu d'histidine et un résidu d'acide aspartique. 11 existe également une forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine eucaryotique qui se compose de quatre sous-unités et dont le poids moléculaire est d'environ 130 000. Les poids moléculaires des diverses formes de SOD ont été estimés par équilibre de sédimentation, tamisage moleculaire ou en utilisant des gels de polyacrylamide.
Les points isoélectriques des diverses formes de SOD s'échelonnent de 4 à 6,5, selon le degré de
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sulfatation et/ou de désamidation. De preference, 1'activité spécifique de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine bovine ou humaine est d'au moins 3000 U/mg (l'unité d'activité étant comme définie dans J. Biol. Chem., 1969,
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244, 6049-6055).
La séquence d'amino-acides de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine bovine ou humaine correspond de préférence sensiblement ä celle exposée dans J. Biol. Chem., 1974, 249 (22), 7326-7338, dans le cas de l'origine bovine, et dans Biochemistry, 1980, 19, 2310-2316 et FEBS Letters, 1980,120, 53-55, dans le cas de l'origine humaine. Cette sequence est donc identique à l'une de celles exposées dans ces articles ou comporte une ou plusieurs délétions, substi-
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tutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides, d'origine allélomorphe ou autre, la sequence résultante étant suffisamment homologue ä la séquence publiée choisie pour conserver essentiellement les mêmes propriétés biologiques et immunologiques.
La sequence d'amino-acides de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine bovine contient trois résidus de cystéine par sous-unité (J. Biol. Chem., 1974, 249 (22), 7326- 7338). Le pont disulfure intracaténaire se trouve entre les résidus Cys 55 et Cys 144, tandis que le pont disulfure intercaténaire se trouve entre les résidus Cys 6. La séquence d'amino-acides de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine humaine contient quatre résidus de cystéine par sous-unité (Biochemistry, 1980,19, 2310-2316, et FEBS Letters, 1980, 120,53-55). Le pont disulfure intracaténaire se trouve entre les résidus Cys 57 et Cys 146, tandis que le pont disulfure intercaténaire se trouve entre les résidus Cys 6.
Le résidu Cys 111 reste libre.
La SOD peut être obtenue par n'importe quelle technique décrite ou connue dans l'art antérieur. Par exemple, on peut-la tirer des érythrocytes ou du foie par un procédé d'extraction du type décrit dans les documents GB-A-1 407 807 et GB-A-1 529 890. En variante, la SOD peut etre tirée d'une
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1ignée cellulaire cultivée transformée ou transfectée, dérivée en utilisant une technique d'ADN recombinant comme décrit, par exemple, dans la demande de brevet australien
Na 27461/84 et les documents WO 85/01503, EP-A-138 111,
EP-A-164 566, EP-A-173 280 etEP-A-180 964.
La SOD est de préférence purifiée par une quel- conque technique appropriée décrite ou connue dans l'art antérieur, par exemple la technique décrite dans le document
EP-A-112 299.
Pour utiliser AP-t, ou une association de AP-t et SOD, ä la manière de la présente invention, il est pree- rable d'employer le ou les ingrédients actifs sous forme d'une formulation pharmaceutique. Dans le cas de l'associa- tion, les ingrédients actifs peuvent se trouver dans des formulations séparées qui sont administrées simultanément ou successivement. Si on les administre successivement, il est preferable d'administrer d'abord la formulation contenant
AP-t et ensuite la formulation contenant SOD. Dans l'un ou l'autre cas, le dé1ai d'administration de la seconde des deux formulations ne doit pas être tel que l'on perde le bénéfice de l'effet potentialisé d'inhibition de l'endomma- gement des tissus qui résulte de l'association in vivo des ingrédients actifs.
Toutefois, plutôt que d'employer des formulations séparées, il est bien plus commode de présenter les deux ingrédients actifs ensemble dans une seule formu- lation mixte. En conséquence, la présente invention propose également une formulation pharmaceutique qui comprend AP-t et SOD et un support pharmaceutiquement acceptable.
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En général, le AP-t ou l'association de AP-t et SOD seront administres par voie intravasculaire, que ce soit par perfusion ou par injection d'un embol, et une formulation ä usage parenteral est donc nécessaire. 11 est préférable de présenter une formulation lyophilisée au médecin ou au vete- rinaire en raison des importants avantages qu'offre une telle formulation sur le plan du transport et de la conservation.
Le médecin ou le vétérinaire peut ensuite reconstituer la
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formulation lyophilisée dans une quantité appropriée de solvant, comme il le taut et au moment voulu.
Des formulations pharmaceutiques contenant AP-t, lyophilisées et ä usage parenteral, sont connues dans l'art antérieur- Des exemples en sont fournis par les documents EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A-113 319, EP-A- 123 304, EP-A-143 081, EP-A-156 169, WO 86/01104, le brevet japonais publié NO 57-120523 (demande NO 56-6936) et lebrevet japonais publié N 58-65218 (demande NO 56-163145).
D'autres exemples préférés sont fournis par les documents GB-A-2 176 702 et GB-A-2 176 703. Toutes ces formulations conviennent également pour SOD et pour l'associationde AP-t et SOD.
Les perfusions intravasculaires sont normalement effectuées en utilisant la solution à usage parentéral contenue dans un sachet ou un flacon de perfusion ou encore dans une seringue de perfusion actionnée électriquement.
La solution peut être délivrée au malade ä partir du sachet ou du flacon sous l'effet d'un écoulement par gravité ou en utilisant une pompe de perfusion. L'utilisation de systemes de perfusion ä écroulement par gravité ne permet pas de maitriser suffisamment la vitesse d'administration de la solution ä usage parentéral et on préfère donc l'utilisation d'une pompe de perfusion, notamment avec les solutions dont la concentration en ingrédients actifs est relativement élevée. On préfère cependant encore plus l'utilisation d'une seringue de perfusion actionnee electriquement quipermetde maitriser mieux encore la vitesse d'administration.
La quantité de AP-t, et d'une association deAP-t et SOD, qui est efficace pour inhiber l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation est évidemment fonction d'un certain nombre de facteurs comprenant, par exemple l'âge et le poids du mammifère, l'affection exacte necessi- tant le traitement et sa gravité, la voie d'administration, et cette quantité sera en fin de compte laissee a l'appre- ciation du médecin ou vétérinaire traitant.
Toutefois, dans
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le cas de AP-t, une dose efficace est généralement comprise dans l'intervalle de 0, 2 ä 4 mg/kg (c'est-à-dire de 100 000 ä 2 000 000 UI/kg en admettant une valeur de 500 000 UI/mg pour l'activité spécifique de AP-t), de preference de 0, 3 ä
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2 mg/kg (c'est-à-dire 150 000 ä 1 000 000 UI/kg), de poids corporel du malade et par heure. Ainsi, pour un être humain adulte pesant 70 kg, une quantité efficace par heure est de préférence comprise entre 20 et 140 mg (c'est-à-dire entre 10 000 000 et 70 000 000 UI), et en particulier d'environ 70 mg (c'est-à-dire 35 000 000 UI).
Dans le cas où AP-t est associé ä SOD, une dose efficace de SOD est alors généralement comprise dans l'intervalle de 1000 ä 50 000 U/kg, de préférence de 7000 ä 20 000 U/kg, de poids corporel du malade et par heure. Ainsi, pour un etre humain adulte pesant 70 kg, une quantité efficace de SOD, par heure, est de préférence comprise entre 500 000 et 1 500 000 U.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention.
Exemple 1 : préparation d'une Formulation de AP-t ä Usage
Parentéral
On prépare une formulation de AP-t à usage parentéral en procédant sensiblement comme décrit dans le document GB-A-2 176 703 ; l'activité spécifique du AP-t utilisé est d'environ 300 000 UI/mg.
Exemple 2 : préparation d'une Formulation de SOD ä Usage
Parenteral
On dissout dans du sérum physiologique sensiblement neutre de la SOD bovine, forme combinée au cuivre/zinc, fournie sous forme d'une poudre par Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, U. S. A., 63178.
Exemple 3 : Preparation d'une Formulation de AP-t et SOD a Usage Parenteral
On mélange les formulations des Exemples 1 et 2 et on dilue encore le melange obtenu pour atteindre le dosage requis.
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Exemple 4 : Protection de tissu menace en utilisant AP-t et en utilisant AP-t et SOD (a) Méthodologie
On anesthesie des chiens de race bigle mâles (10-12 kg1 avec du pentobarbital sodique, les intube et les ventile ä l'air ambiant au moyen d'un respirateur de Harvard. On implante des cathéters pour perfusion et mesures de pression arterielle dans la veine jugulaire gauche et l'artère carotide gauche. On pratique une thoracotomie au niveau du quatrième espace intercostal, on suspend le coeur dans un arceau péricardique et on isole l'artère interventriculaire antérieure (AIA) juste au-dessous de la première branche diagonale principale.
On place une sonde de débit électromagnétique sur l'AIA. On provoque une occlusion de l'AIA pendant 90 minutes en plaçant une anse de fil de soie 1/0 en aval de la sonde de débit. On commence le traitement par voie intraveineuse quinze minutes avant la levée de l'anse d'occlusion et le poursuit pendant 45 minutes après la levée. On referme la thoracotomie et on laisse les animaux se remettre des actes chirurgicaux. On anesthésie de nouveau les animaux 24 heures après l'occlusion et on redetermine le débit dans l'AIA. On retire ensuite le coeur pour une quantification post-mortem de la taille de l'infarctus.
On soumet quatre groupes de chiens ä l'évaluation.
Le Groupe 1 se compose de témoins recevant une solution saline. Les animaux du Groupe II reçoivent 2, 5 mg/kg (750 000 Ul/kg) de AP-t, ceux du Groupe II reçoivent 16 500 U/kg de SOD bovine et ceux du Groupe IV reçoivent 2,5 mg/kg (750 000 UI/kg) de AP-t ainsi que 16 500 U/kg de SOD bovine. Les formulations utilisées sont celles décrites dans les Exemples 1 ä 3.
On détermine quantitativement la taille des infarctus du myocarde par une technique de double- perfusion extra vivo. On introduit des canules dans l'AIA immédiatement en aval du si te d'occlusion et dans l'aorte au-dessus
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des orifices coronaires. On perfuse dans le lit coronaire de AIA du chlorhydrate de triphényl-tétrazolium (CTT) à
1, 5 % dans du phosphate de potassium tampon 0, 02M, pH 7, 4.
On perfuse du bleu Evans ä 0, 5 % en mode rétrograde dans l'aorte. On met les deux régions sous perfusion avec leurs colorants respectifs ä une pression constante de 100 mm de mercure pendant cinq minutes. On découpe le coeur en tran- ches de 8 mm perpendiculaires ä l'axe pointe-base. On iden- tifie par l'absence de bleu Evans la zone du ventricule gauche qui est soumise au risque d'infarctus en raison de sa dépendance anatomique ä l'égard de l'AIA en ce qui con- cerne le courant sanguin. A 1'intérieur de la zone à risque, la region de myocarde infarci se démarque par l'absence de coloration du tissu une fois qu'il a été soumis ä la perfu- sion de CTT, et ce en raison d'une perte de déshydrogénases.
On dessine soigneusement les coupes ventriculaires transversales sur des calques acryliques transparents pour disposer dlun enregistrement permanent de la morphologie de l'infarctus et permettre la confirmation planimétrique de la taille de l'infarctus. On débarrasse ensuite les coupes ventriculaires du muscle ventriculaire droit, des valvules et du tissu adipeux. On sépare par une dissection soignée la zone ä risque totale du ventricule gauche et l'infarctus, et on les pèse. La taille de l'infarctus est exprimée en pourcentage par rapport ä la zone anatomique à risque. On procède ä une comparaison statistique de chaque groupe traité par un medicament avec le groupe témoin en effectuant une analyse univoque de variance par la méthode de Bonferroni pour comparaison multiple (Circulation Research, 1980,47,
1-9).
On prend une valeur p inférieure à 0, 05 comme critère de significativité.
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(b) Résultats
TABLEAU
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<tb>
<tb> NOMBRE <SEP> ZONE <SEP> A <SEP> % <SEP> DE <SEP> VENTRIGROUPE <SEP> DE <SEP> RISQUE <SEP> CULE <SEP> SOUMIS
<tb> CHIENS <SEP> INFARCIE <SEP> AU-RISQUE-*
<tb> I. <SEP> Solution <SEP> 5 <SEP> 36,0¯8,9 <SEP> 37,3¯7,6
<tb> saline
<tb> II. <SEP> AP-5 <SEP> 6 <SEP> 14,3¯11,7 <SEP> 35,7¯5,4
<tb> III. <SEP> SOD <SEP> 4 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 30, <SEP> 6+2, <SEP> 6
<tb> IV. <SEP> AP-t <SEP> + <SEP> SOD <SEP> 3 <SEP> 2,3¯1,3 <SEP> 37,2¯9,1
<tb>
* Les résultats sont exprimés en moyenne t écart-type.
Selon l'analyse de variance, la proportion de ventricule gauche rendue ischémique par occlusion mécanique de l'AIA ne diffère pas significativement entre aucun des groupes traités et le groupe témoin (c) Conclusions
L'utilisation de AP-t inhibe significativement la taille de l'infarctus du myocarde, ce qui démontre son aptitude ä protéger le tissu menacé pendant la réirrigation. De plus, par l'utilisation conjointe de AP-t et SOD, on parvient à cet égard ä produire un effet inhibiteur synergique, l'association procurant un taux d'inhibition superieur ä celui fourni par chacun de AP-t et SOD indépendamment.
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Use of the tissue activator of plasminogen, its association with a superoxide dismutase and pharmaceutical formulation containing this association.
The present invention relates to the tissue activator of plasminogen, its association with a superoxydedismutase, pharmaceutical formulations containing them and their use in human and veterinary medicine.
There is a dynamic balance between the Enzymatic System capable of forming blood clots (the coagulator system) and the Enzymatic System capable of dissolving blood clots (the fibrinolytic system) which maintains an intact vascular bed in the cleared state.
To limit blood loss from an injury, blood clots are formed in the injured vessel. After the natural repair of the wound, excess blood clots are dissolved by the action of the fibrinolytic system.
Blood clots can occasionally form in the absence of a traumatic injury and can lodge in large blood vessels, partially or even completely obstructing the flow of blood. If this occurs in the heart, lung or brain, it can result in a myocardial infarction, a pulmonary embolism or a stroke. These conditions together constitute the main cause of morbidity and mortality in industrialized nations.
Blood clots are made up of a fibrous network that can be dissolved by a proteolytic enzyme, plasmin. This enzyme is derived from an inactive pro-enzyme, plasminogen, a component of blood plasma, under the action of a plasminogen activator. There are two immunologically distinct plasminogen activators in mammals. The intrinsic activator of plasnogenogen, also known as urokinase, is an enzyme produced by the kidney that can be isolated from urine.
It can also be prepared from a number of tissue cultures which are sources thereof. The extrinsic plasminogen activator, also known as a vascular plasminogen activator and as a tissue plasminogen activator (AP-t), can be isolated from many
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homogeneous tissue homogenates (in particular of human uterus), of the wall of vascular cells and of certain tissue cultures. In addition to these two types of plasminogen activators, there is also a bacterial product, streptokinase, prepared from betahemolytic streptococci.
A major drawback affecting both urokinase and streptokinase is that they are active throughout the circulation and not just at the site of a blood clot. They can, for example, destroy other proteins in the blood, such as fibrinogen, prothrombin, factor V and factor VIII, thereby reducing the clotting power of the blood and increasing the risk of bleeding. In contrast, the biological activity of AP-t depends on the presence of fibrin to which it binds and where it is activated. Maximum activity thus develops only at the location of a blood clot, that is to say in the presence of the fibrinous network to be dissolved, and the risk of hemorrhage is largely eliminated.
The interruption of blood flow in a vessel usually leads to the onset of ischemia. In this situation, the tissue is deprived of oxygen and is threatened, a state in which the tissue is altered but still potentially viable. However, if this situation continues for a period of, say, three hours or more, the tissue will necrosis and, once in this state, cannot be recovered. It is therefore important that a re-irrigation, that is to say the restoration of blood flow, take place as soon as possible to save the tissue before it is permanently damaged.
Ironically, even if it is done before the tissue becomes necrotic, re-irrigation itself generates a complex set of phenomena, including the presumed formation of the superoxide radical, which exerts a deleterious effect on the hypoxic tissue. Consequently, re-irrigation can only lead to partial recovery of the threatened tissue, the rest being permanently damaged by the occurrence of one or more of these phenomena. -
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It has now been discovered that AP-t inhibits the uptake of threatened tissue during re-irrigation by protecting that tissue from one or more of the above phenomena.
The mechanism of action by which AP-t provides this protection has not been explicit, but it is not linked to its activity as a thrombolytic agent. This newly discovered property thus gives the possibility of using AP-t, or a pharmaceutical formulation containing it, as an inhibitor of damage to threatened tissue in the circumstances generally exposed here.
Accordingly, the present invention provides: (a) a method for inhibiting damage to threatened tissue during re-irrigation in a mammal, which comprises administering to the mammal an effective amount of AP-t (b) the use of AP-t for inhibiting damage to threatened tissue during re-irrigation in a mammal; (c) the use of AP-t for the manufacture of a material intended for the inhibition of damage to threatened tissue during re-irrigation in a mammal: and (d) a pharmaceutical formulation to be used for inhibit damage to threatened tissue during re-irrigation in a mammal, which includes AP-t and a pharmaceutically acceptable carrier.
Although the present invention can be implemented to protect any threatened tissue, it is particularly useful for inhibiting damage to threatened myocardial tissue.
The AP-t to be used in the present invention can be any biologically active protein corresponding substantially to the AP-t of mammals, and in particular humans, and includes forms with and without glycosylation. It can be AP-t with one or two chains, or a mixture of such AP-t, as described in document EP-A-112 122, -and, in the case of fully human AP-t glycosylated, its apparent molecular weight on polyacrylamide gel is approximately 70,000 and its point
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isoelectric is between 7.5 and 8.0. Preferably, the specific activity of AP-t is approximately 500,000 IU / mg (International Units / mg,
the International Unit being a unit of activity defined by the National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead London, NW3 6RB, United Kingdom, within the framework of the World Health Organization).
The amino acid sequence of AP-t preferably corresponds substantially to that shown in Figure 1 of the accompanying drawings. It is therefore a sequence identical to that of FIG. 1 or comprising one or more deletions, substitutions, insertions, inversions or additions of amino acids, of allelomorphic or other origin, the resulting sequence having at least 80 %, and preferably 90%, of homology with the sequence of FIG. 1 and essentially retaining the same biological and immunological properties as this protein.
In particular, the sequence is identical to that of FIG. 1 or is the same except that the amino acid of the 245th position from the N-terminal serine is valine instead of methionine, the either sequence optionally containing an additional N-terminal polypeptide pre-sequence consisting of Gly-Ala-Arg.
The amino acid sequence shown in Figure 1 contains thirty-five cysteine residues and therefore has the capacity to form seventeen disulfide bridges. On the basis of an analogy made with other proteins whose structure has been determined in more detail, FIG. 2 shows the proposed structure for the sequence (resulting from the formation of disulfide bridges) between the amino acid of the 90th position and the C-terminal proline. we are less sure of the structure of the N-terminal region, although some proposals have been put forward (Progress in Fibrinolysis, 1983, / = 269-273: and Proc. Natl. Acad. Sci., 1984., 81, 5355 -5359).
The most important features of the AP-t structure are the two ring regions (included
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between the 92nd and 173rd amino acids and between the 180th and 261st amino acids), which are responsible for the binding of protein to fibrin, and the region of serine proteases which constitutes the major part of the B chain and which is responsible for activating plasminogen. The particularly important amino acids of the serine proteases are those of the catalytic triad His / Asp / Ser. In AP-t, these appear at 322nd, 371st and 463rd positions.
The bridge
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'-me and disulfide connecting the cysteine residues of the 264th and 395th positions is legally important in the sense that it holds the A and B chains together in the double-stranded form of AP-t.
In Figures 1 and 2, the amino acid residues are designated by the following conventional one- and three-letter codes: Asp D Aspartic acid Cys C Cysteine His H Histidine Thr T Threonine Val V Valine Arg R Arginine Ser S Sérine Ile I Isoleucine Lye K Lysine Glu E Glutamic acid Leu L Leucine Trp KTryptophanne Pro P Proline Tyr Y Tyrosine Gln Q Glutamine Gly G Glycine Phe F Phenylalanine Met M Methionine Ala A Alanine Asn N Asparagine In Figure 2, the asterisk cleavage of single-stranded AP-t into double-stranded AP-t in which chain A contains the two ring regions and chain B contains
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the serine protease region.
AP-t can be obtained by any of the techniques described or known in the prior art. For example, one can obtain from a normal or neoplastic cell line of the type described in Biochemica and Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; and EP-A-41 766 and EP-A-113 319. However, it is preferred that AP-t be derived from a cultured transformed and transfected cell line, derived using a recombinant DNA technique as described for example in EP-A-93 619, EP-A-117 059, EP-A-117 060, EP-A-173 552, EP-A-174 835, EP-A-178 105, WO 86/01538, WO 86/05514 and WO 86/05807.
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Particularly preferred is the use of Chinese hamster ovary (OHC) cells for the production of AP-t, and that these cells are derived as described in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5 (7), 1750 -1759. According to this method, the cloned gene is co-transfected with the gene encoding dihydrofolate reductase (dhfr) in dhfr- cells of OHC. Transformants expressing dhfr are selected on media lacking nucleosides and are exposed to increasing concentrations of methotrexate.
The dhfr and AP-t genes are thus amplified together leading to a stable cell line capable of expressing high levels of AP-t.
Preferably, the AP-t is purified using any of the techniques described or known in the prior art, for example the techniques described in Biochemica and Biophysica Acta, 1979,580, 140-153: J. Biol.
Chem., 1979, 254 (6), 1998-2003: ibid., 1981, 256 (13), 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; and documents EP-A-41 766, EP-A-113 319 and GB-A-2 122 219.
AP-t can be used in the manner of the present invention either alone or in combination with another therapeutic agent which also inhibits damage to threatened tissue during re-irrigation. A particularly useful example of such an association is that made with superoxide dismutase (SOD), an enzyme which is known to cause and destroy superoxide radicals which are the agent of one of the phenomena capable of causing l tissue damage. In fact, it has also been found that the degree of inhibition offered by the combination of AP-t and SOD is strongly potentiated compared to those which AP-t and SOD provide by themselves. Accordingly, the present invention also provides a combination of AP-t and SOD.
The combination of AP-t and SOD provides a particularly convenient way to achieve both the elimination of blood clots and the inhibition of damage to threatened tissue during subsequent re-irrigation.
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Thus, from the administration of AP-t and SOD results first of all the elimination of the blood clot under the known thrombolytic action of AP-t, then the inhibition of tissue damage under the combined actions of AP-t and SOD.
The SOD to be used in combination with AP-t can be any biologically active protein corresponding substantially to any one or more of a group of enzymes generally designated by this name. It is preferably of mammalian origin and in particular bovine or human, and is generally found combined with a metal cation which is normally used to classify it. Examples of metal cations include those of iron, manganese and copper and, preferably, associations of copper with other metals such as zinc, cadmium, cobalt or mercury, among which the association copper / zinc. The combined manganese and copper / zinc forms of SOD are found naturally in humans.
The combined iron and manganese forms of SOD of bacterial origin both have a molecular weight of about 40,000 and are dimers. On the other hand, the form combined with manganese of SOD of eukaryotic origin is a tetramer whose molecular weight is approximately
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80,000. The combined copper / zinc form of SOD of eukaryotic origin is a dimer which contains one copper cation and one zinc cation per subunit and whose molecular weight is approximately 32,000.
The copper cation is linked by coordination to four histidine residues per subunit and the zinc cation is linked by coordination between a histidine residue and an aspartic acid residue. There is also a copper / zinc combined form of SOD of eukaryotic origin which consists of four subunits and whose molecular weight is approximately 130,000. The molecular weights of the various forms of SOD have been estimated by equilibrium of sedimentation, molecular sieving or using polyacrylamide gels.
The isoelectric points of the various forms of SOD range from 4 to 6.5, depending on the degree of
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sulfation and / or deamidation. Preferably, the specific activity of the copper / zinc combined form of SOD of bovine or human origin is at least 3000 U / mg (the activity unit being as defined in J. Biol. Chem., 1969,
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244, 6049-6055).
The amino acid sequence of the copper / zinc combined form of SOD of bovine or human origin preferably corresponds substantially to that set out in J. Biol. Chem., 1974, 249 (22), 7326-7338, in the case of bovine origin, and in Biochemistry, 1980, 19, 2310-2316 and FEBS Letters, 1980, 120, 53-55, in the case of human origin. This sequence is therefore identical to one of those exposed in these articles or includes one or more deletions, substi-
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tutions, insertions, inversions or additions of amino acids, of allelomorphic or other origin, the resulting sequence being sufficiently homologous to the published sequence chosen to retain essentially the same biological and immunological properties.
The amino acid sequence of the copper / zinc combined form of bovine SOD contains three cysteine residues per subunit (J. Biol. Chem., 1974, 249 (22), 7326-7338). The intracatenary disulfide bridge is found between residues Cys 55 and Cys 144, while the intercatenarian disulfide bridge is found between residues Cys 6. The amino acid sequence of the combined copper / zinc form of SOD of human origin contains four cysteine residues per subunit (Biochemistry, 1980,19, 2310-2316, and FEBS Letters, 1980, 120,53-55). The intracatenary disulfide bridge is between residues Cys 57 and Cys 146, while the intercatenarian disulfide bridge is between residues Cys 6.
The Cys 111 residue remains free.
SOD can be obtained by any technique described or known in the prior art. For example, it can be extracted from erythrocytes or from the liver by an extraction method of the type described in documents GB-A-1 407 807 and GB-A-1 529 890. As a variant, the SOD can be obtained from 'a
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Cultured cell line transformed or transfected, derived using a recombinant DNA technique as described, for example, in the Australian patent application
Na 27461/84 and documents WO 85/01503, EP-A-138 111,
EP-A-164 566, EP-A-173 280 and EP-A-180 964.
The SOD is preferably purified by any suitable technique described or known in the prior art, for example the technique described in the document.
EP-A-112,299.
To use AP-t, or a combination of AP-t and SOD, in the manner of the present invention, it is convenient to employ the active ingredient (s) in the form of a pharmaceutical formulation. In the case of the combination, the active ingredients can be in separate formulations which are administered simultaneously or successively. If administered successively, it is preferable to administer the formulation containing
AP-t and then the formulation containing SOD. In either case, the time of administration of the second of the two formulations should not be such that the benefit of the potentiated effect of inhibition of the damage of the tissues which is lost is lost. results from the in vivo association of active ingredients.
However, rather than employing separate formulations, it is much more convenient to present the two active ingredients together in a single mixed formulation. Accordingly, the present invention also provides a pharmaceutical formulation which comprises AP-t and SOD and a pharmaceutically acceptable carrier.
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In general, AP-t or the combination of AP-t and SOD will be administered intravascularly, either by infusion or by injection of an embol, and a parenteral formulation is therefore necessary. It is preferable to present a lyophilized formulation to the doctor or the veterinarian because of the important advantages which such a formulation offers in terms of transport and storage.
The doctor or veterinarian can then reconstruct the
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lyophilized formulation in an appropriate amount of solvent, as needed and when desired.
Pharmaceutical formulations containing AP-t, lyophilized and for parenteral use, are known in the prior art. Examples are provided by documents EP-A-41,766, EP-A-93,619, EP-A-112,122 , EP-A-113 319, EP-A-123 304, EP-A-143 081, EP-A-156 169, WO 86/01104, the published Japanese patent NO 57-120523 (application NO 56-6936) and Japanese patent published N 58-65218 (application NO 56-163145).
Other preferred examples are provided by GB-A-2 176 702 and GB-A-2 176 703. All these formulations are also suitable for SOD and for the combination of AP-t and SOD.
Intravascular infusions are normally performed using the parenteral solution contained in an infusion bag or vial or in an electrically operated infusion syringe.
The solution can be delivered to the patient from the sachet or vial by gravity flow or by using an infusion pump. The use of gravity flow infusion systems does not sufficiently control the speed of administration of the solution for parenteral use and therefore the use of an infusion pump is preferred, especially with solutions whose concentration in active ingredients is relatively high. However, it is even more preferred to use an electrically actuated infusion syringe which allows the speed of administration to be controlled even better.
The amount of AP-t, and a combination of AP-t and SOD, which is effective in inhibiting damage to threatened tissue during re-irrigation is obviously a function of a number of factors including, for example, age and weight of the mammal, the exact condition requiring treatment and its severity, the route of administration, and this amount will ultimately be left to the discretion of the attending physician or veterinarian.
However, in
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in the case of AP-t, an effective dose is generally in the range of 0.2 to 4 mg / kg (i.e. 100,000 to 2,000,000 IU / kg assuming a value of 500 000 IU / mg for the specific activity of AP-t), preferably 0.3 to
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2 mg / kg (i.e. 150,000 to 1,000,000 IU / kg), patient's body weight per hour. Thus, for an adult human being weighing 70 kg, an effective amount per hour is preferably between 20 and 140 mg (that is to say between 10,000,000 and 70,000,000 IU), and in particular approximately 70 mg (i.e. 35,000,000 IU).
In the case where AP-t is associated with SOD, an effective dose of SOD is then generally in the range of 1000 to 50,000 U / kg, preferably 7000 to 20,000 U / kg, of the patient's body weight. and per hour. Thus, for an adult human being weighing 70 kg, an effective amount of SOD, per hour, is preferably between 500,000 and 1,500,000 U.
The following nonlimiting examples illustrate the present invention.
Example 1: Preparation of an AP-t Formulation for Use
Parenteral
A formulation of AP-t for parenteral use is prepared by proceeding substantially as described in document GB-A-2 176 703; the specific activity of the AP-t used is approximately 300,000 IU / mg.
Example 2: Preparation of a Use SOD Formulation
Parenteral
Bovine SOD, a form combined with copper / zinc, supplied in the form of a powder by Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, U. S. A., 63178, is dissolved in substantially neutral physiological saline.
Example 3: Preparation of a Formulation of AP-t and SOD for Parenteral Use
The formulations of Examples 1 and 2 are mixed and the mixture obtained is further diluted to reach the required dosage.
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Example 4: Protection of threatened tissue using AP-t and using AP-t and SOD (a) Methodology
Male bigle dogs (10-12 kg1) are anesthetized with sodium pentobarbital, intubated and ventilated with ambient air using a Harvard ventilator. Catheters for infusion and blood pressure measurements are implanted in the left jugular vein and left carotid artery. We perform a thoracotomy at the fourth intercostal space, suspend the heart in a pericardial arch and isolate the anterior interventricular artery (AIA) just below the first main diagonal branch .
An electromagnetic flow sensor is placed on the AIA. AIA is occluded for 90 minutes by placing a loop of 1/0 silk thread downstream of the flow probe. The intravenous treatment is started fifteen minutes before the lifting of the occlusion loop and continues for 45 minutes after the lifting. The thoracotomy is closed and the animals are allowed to recover from surgical procedures. The animals are again anesthetized 24 hours after the occlusion and the flow rate in the AIA is redetermined. The heart is then removed for post-mortem quantification of the size of the infarction.
Four groups of dogs are subjected to evaluation.
Group 1 is made up of controls receiving a saline solution. Group II animals receive 2.5 mg / kg (750,000 IU / kg) of AP-t, Group II animals receive 16,500 U / kg of bovine SOD and Group IV animals receive 2.5 mg / kg ( 750,000 IU / kg) of AP-t as well as 16,500 U / kg of bovine SOD. The formulations used are those described in Examples 1 to 3.
The size of myocardial infarction is quantitatively determined by an extra vivo double-perfusion technique. Cannulas are introduced into the AIA immediately downstream of the occlusion site and into the aorta above
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coronary orifices. Triphenyltetrazolium hydrochloride (CTT) is infused into the coronary bed of AIA
1.5% in 0.02M potassium phosphate buffer, pH 7.4.
0.5% Evans blue is perfused in retrograde mode in the aorta. The two regions are perfused with their respective dyes at a constant pressure of 100 mm of mercury for five minutes. The core is cut into 8 mm slices perpendicular to the point-base axis. The absence of Evans blue identifies the area of the left ventricle that is at risk of heart attack because of its anatomical dependence on AIA with respect to blood flow. Within the risk zone, the infarcted myocardial region is distinguished by the lack of colouration of the tissue once it has been subjected to the infusion of CTT, and this due to a loss of dehydrogenases.
Carefully draw the ventricular cross sections on transparent acrylic layers to have a permanent recording of the morphology of the infarction and allow planimetric confirmation of the size of the infarction. The ventricular sections are then stripped of the right ventricular muscle, valves and adipose tissue. The total risk area of the left ventricle and the infarction are separated by careful dissection and weighed. The size of the infarction is expressed as a percentage relative to the anatomical area at risk. Each drug-treated group is compared statistically with the control group by performing a one-to-one analysis of variance by Bonferroni's method for multiple comparison (Circulation Research, 1980,47,
1-9).
We take a p value less than 0.05 as the significance criterion.
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(b) Results
BOARD
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<tb>
<tb> NUMBER <SEP> AREA <SEP> TO <SEP>% <SEP> OF <SEP> VENTRIGROUPE <SEP> OF <SEP> RISK <SEP> CULE <SEP> SUBMITTED
<tb> DOGS <SEP> INFARCITED <SEP> AT-RISK- *
<tb> I. <SEP> Solution <SEP> 5 <SEP> 36.0¯8.9 <SEP> 37.3¯7.6
<tb> saline
<tb> II. <SEP> AP-5 <SEP> 6 <SEP> 14.3¯11.7 <SEP> 35.7¯5.4
<tb> III. <SEP> SOD <SEP> 4 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 30, <SEP> 6 + 2, <SEP> 6
<tb> IV. <SEP> AP-t <SEP> + <SEP> SOD <SEP> 3 <SEP> 2,3¯1.3 <SEP> 37.2¯9.1
<tb>
* The results are expressed as an average t standard deviation.
According to the analysis of variance, the proportion of left ventricle made ischemic by mechanical occlusion of the IAA does not differ significantly between any of the treated groups and the control group (c) Conclusions
The use of AP-t significantly inhibits the size of myocardial infarction, demonstrating its ability to protect threatened tissue during re-irrigation. In addition, by the joint use of AP-t and SOD, it is possible in this regard to produce a synergistic inhibitory effect, the combination providing a rate of inhibition greater than that provided by each of AP-t and SOD independently.