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Im prokaryotischen und eukaryotischen Leben sind Zellen und subzellulare Räume vonei an- der durch Membranen getrennt. Der regulierte und selektive Durchtritt von spezifischen Molekmien durch diese Membranen ist ein grundlegendes und hochbewährtes Prinzip. Die Bedeutung des Membrantransports wird durch Umstand veranschaulicht, dass fast 20 % der Gene des E. coll Transportfunktionen zugeordnet sind (1). Transmembraner Transport wird durch spezifische ffro- teine vermittelt, die der Membran zugeordnet sind, in einer Zahl von Familien gruppiert sind und deren Mitglieder miteinander hinsichtlich Sequenz, molekularem Mechanismus und evolutina em Ursprung verwandt sind.
Transporter stellen immer noch einen Mittelpunkt dar, insbesondere in der biologischen nd medizinischen Forschung, mit zystischer Fibrose Arzneimitteln und antibiotischer Resistenz als ständige Herausforderungen.
Wir waren daran interessiert, ob Taurin in der Lage ist, den Membrantransport zu induzieren oder zu unterdrücken mit der Grundlage, dass die gut belegte detoxifizierende Wirkung des Ta rin gegenüber endogenen Toxinen und Xenobiotika von unterschiedlicher und völlig voneinander unabhängiger chemischer Struktur (2) ihre Ursache in der Aktivierung des Transportmechanisnus Gifte aus der Zelle zu pumpen haben kann ; ein Mechanismus, der für das Phänomen der Arz ei- mittelresistenz beschrieben ist (3).
Hierfür haben wir das Prinzip des Auffindens von Genen durch substraktive Hybridisier ng (SH) gewahlt, ein Verfahren, bei dem mRNA in Organen von mit Taurin behandelten Ratten von mRNA in Organen von nicht behandelten Ratten und umgekehrt abgezogen wird, um so ine substraktive Bank zu bilden.
Die subtrahierten mRNAs werden durch reverse Transkription in cDNA umgewandelt, d rch PCR vervielfältigt und die erhaltenen cDNAs wurden sequenzlert. Die Sequenzen aus der SH werden mit Genbank-Sequenzen verglichen und so identifiziert.
Durch Anwenden dieser Technik fanden wir eine Reihe von aufwärts- oder hinunter regulie ten Transporter-Transkripten im Hirn und im Herz von mit Taurin behandelten Ratten. Unsere D ten
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hiefür eine Basis bilden.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Taurin zur Herstellung ei ies Mittels zum Beeinflussen des Transportes von Substanzen aus pro-und eukaryotischen Ze len oder in solche Zellen, insbesondere zur Transporter mediierten Detoxifizierung.
Bevorzugterweise wird Taurin erfindungsgemäss für die Herstellung eines Mittels zum Be in- flussen des Transportes von Substanzen aus pro-oder eukaryotischen Zellen oder in solche Ze len verwendet, wobei der Transport durch ein Protein, ausgewählt aus dem Phosphonat-Trans ort
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n-eingeschrankt sein soll, sowie der Zeichnungsfiguren näher erläutert.
Beispiel : Verfahren : 6 Sprague-Dawley-Ratten, 12 Wochen alt, weiblich, werden drei Wochen lang oral mit 100 mg/kg Körpergewicht Taurin (Sigma) gefüttert und 6 Tiere dienten als Kontrolle (Institut of Animal Breeding, Hlmberg, AT). Sie hatten freien Zugang zu Trinkwasser und Rattenkuchen (AI : romine) und wurden unter einem Tag-Nacht-Rhythmus (4) gehalten.
Am Ende der Fütterungsperiode wurden sie durch Halsdislokation getötet, das gesamte Hirn und das gesamte ventrikuläre Gew be wurden entnommen und in flussigem Stickstoff schockgefroren Das Auffinden der Gene wurde an gesammelten Hirnen und Herzen von jeder der beiden Gruppen nach der subtraktiven Hybridi ie- rung ausgeführt
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Protokoll der subtraktiven Hybridisierung (5) :
Die Pools an Hirn und Herz von mit Taurin behandelten und von unbehandelten Ratten wurden in flüssigen Stickstoff gegeben und für die Isolierung von mRNA zerkleinert.
Die Isolierung von mRNA wurde mit dem Quick Prep Micro mRNA-Reinigungs-Kit (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, SE, Kat. 27 92 55 01) ausgeführt.
1 Mikrogramm von mRNA von jeder (der zwei) Präparationen wurde mit einem cDNA-Klo- nierungs-Kit (Gibco, Life Technologies, Eggenstein, DE, Kat. 18248013) qualitätsgeprüft, wobei der Einbau von [alpha-32 P] dATP (Amersham, Buckinghamshire, UK, Kat. AA0004) mit nachfolgender Elektrophorese auf 1 % Agarose, gefolgt vo Autoradiographie verwendet wurde. Der Reflektionfilm (Dupont NEF 496) wurde bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von zwei Stunden exponiert.
Erstellen der subtraktiven Bank : 10 Mikrogramm jeweils von mRNA aus dem Hirn von DS und der Kontrolle wurden durch UV-Bestrahlung bei 360 nm nach den Anleitungen des Subtraktor-Kits (invitrogen, Leek, NL, Kat K432001) biotinyliert. 1 Mikrogramm der mRNA-Pools jeweils von der DS-Hirnprobe wurde einer reversen Transkriptasereaktion (Subtraktor-Kit Invitrogen) unterworfen und die cDNA-Pools wurden mit den entsprechenden biotinylierten mRNAs aus den Kontrollen hybridisiert Die subtraktive Hybridisierungsmischung wurde mit Streptavidin entsprechend dem oben erwähnten Subtraktor-Kit inkubiert und so die biotinilierten Moleküle (nicht einschliesslich biotinilierte mRNA und das Hybrid [biotiniliertes mRNA/cDNA])
komplexiert. Die Streptavidinkom- plexe wurden durch mehrfache Phenol-Chloroformextraktion abgetrennt und die subtrahierten cDNA wurden aus der wässerigen Phase durch Alkoholfällung (Subtraktor-Kit) abgetrennt.
Um die subtrahierte cDNA zu vervielfältigen und zu kloneren, wurden sie mit Not t-Linkern ligiert, gefolgt durch Not !-Verdau. Diese Not t-ge ! inkten cDNAs wurden in die Not l-Stelle des sPORT 1-Klonierungsvektor (cDNA-Klonierungssatz, Gibco) ligiert.
Um die subtrahierten cDNA zu visualisieren, wurden die klonierten cDNA unter Verwendung universeller Primer
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11 5'-ACAGCTATGACCATG-3' aus der multiplen Klonierungsstelle des sPORT-1-Vektors (cDNA-Klonierungs-Kit, Gibco) amplifiziert. Die amplifizierten cDNAs wurden auf 1 % Agarose-Elektrophorese analysiert.
Knieren von subtrahierten Not-l-gelinkten cDNA
Not t-ge) inkte cDNAs, die mit sPORT 1-Vektor ligiert waren, wurden für die Transformation von hochkompetenten INFalpha F'E. coli-Zellen (Invitrogen, Leek, Netherlands, Kat. C2020-03) verwendet und die platierte Klone wurden mit dem Plasmid-Isolations-Kit (Quiagen, Hilden, Germany, Kat. 12245) analysiert und Verdau mit Eco RI/Hind 111 ausgeführt. Rekombinante Klone wurden durch K. Granderath, MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland) sequenztert.
Homologien wurden durch computerunterstützten Vergleich der Daten aus der Genbankse- quenz-Bank : fastA@ebi. ac. uk (GBALL, Gen Bank, EMBL, Heidelberg, Deutschland) bestimmt.
Subtraktive Hybridisierung wurde kreuzweise ausgeführt, d. h. DS-Proben mRNA Subtraktion von Kontrolle und umgekehrt im 1 : 3-Niveau (DSmRNA : control mRNA).
Ergebnisse
Hirn
Alle Sequenzen, die aus der subtraktiven Bank erhalten wurden, wurden wenigstens dreifach nach unten oder aufwärts reguliert, da das Niveau der mRNA, die für die Subtraktion verwendet wurden, auf 1 : 3 eingestellt war,
1. Der Klon P33 der subtraktiven Bank enthielt eine aufwarts regulierte Sequenz mit hoher Homologie von 66, 3% zu der Phosphonat-Transport-ATPase PHNC von E. coli.
Die Länge des Fragmentes war 262 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten ist in Fig. 1 gezeigt.
Fig. 1
Das Alignment des Klons P33 aus der Taurin- subtraktiven Bank wurde mit der PhosphonatTransport-ATPase PHNC-Sequenz aus der Genbank EMBL (P16677) verglichen : : bedeutet identische Basenpaare, * steht für identische Aminosäuren und 0 bedeutet Aminosäuren mit ähnlicher Funktion.
2. Der Klon P29 aus der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine aufwärts regulierte Sequenz mit
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hoher Homologie von 76, 8% zu dem Multidrug-Transporter-Homologen MTH104 von Methcino- bakterium thermoautotrophicum
Die Länge des Fragmentes war 459 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten i t in Fig. 2 gezeigt.
Fig. 2
Das Alignment von Klon P29 aus Taurin-SL wurde mit dem Multidrug-Transporterhomolcgen MTH104 von Methanobakterium thermoautotrophicumsequenz (026207) von der Genbank Ef BL bestimmt.
3. Der Klon P21 aus der subtraktiven Bibliothek (SL) enthielt eine hinunter regulierte Sequenz mit hoher Homologie von 71, 4% zu dem Protein-Export-Membran-Protein SECD von Haemop ilus influenza.
Die Lange des Fragmentes war 616 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten ist in Fig. 3 gezeigt.
Fig. 3
Das Alignment des Klons P21 der Taurin-SL wurde zu der Protein-Exportmembran-Protein SECD-Sequenz aus der Genbank EMBL (P44591) bestimmt.
4. Der Klon P23 aus der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine hinunter regulierte Sequenz mit hoher Homologie von 62, 1% zu dem Oligopeptid-Transporter oppA von heliobacter pylori.
Die Länge des Fragmentes betrug 594 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdatel ist in Fig. 4 gezeigt.
Fig. 4
Das Alignment des Klons P23 der Taurin-SL wurde zu dem Oligopeptid-Transporter 0 pASequenz von der Genbank EMBL (025845) bestimmt.
5. Der Klon D9 aus der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine hinunter regulierte Sequenz mit Homologie von 54, 4% zu dem Oligopeptid-Transporter oppD von rhodobakter sphaeroides
Die Länge des Fragmentes war 483 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten 't in Fig 5 gezeigt.
Fig. 5
Das Alignment des Klons D9 der Taurin-SL ist zu dem Oligopeptid-Transporter oppD-Sequenz von der Genbank EMBL (B07798) bestimmt.
Herz
6. Der Klon P14 der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine aufwärts regulierte Sequenz mit hc her Homologie von 69, 6% zu dem ABC-Transporter BRAF-2 von archaebacterium fulgidus.
Die Länge des Fragmentes war 238 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten i. t in Fig 6 gezeigt.
Fig. 6
Das Alignment des Klons P14 aus der Taurin-SL wurde zu dem ABC-Transporter BRAI :-2Sequenz aus der Genbank EMBL (029436) ermittelt.
7. Der Klon P19 der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine aufwärts regulierte Sequenz mit hcher Homologie von 68, 1% zu der Kation-Transport-ATPase PACS von Synechocystis sp.
Die Länge des Fragmentes war 745 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten ist in Fig 7 gezeigt
Fig. 7
Das Alignment des Klons P19 der Taunn-SL wurde mit dem Kation-Transport-ATPase PACS- Sequenz von der Genbank EMBL (P73241) ermittelt.
Diskussion
Die orale Verabreichung von Taurin führte zu einer Modifikation der Transporterexpressio) in Hirn und Herz. Da das Niveau der Subtraktion auf 1 : 3 eingestellt war, ist davon auszugehen, dass
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zustand-Niveaus beitragen.
Die Phosphonat-Transport ATPase PHNC (PHNC) ebenso wie andere Transporter, di In dieser Untersuchung beobachtet wurden, wurden nie zuvor im Säugetiersystem beschneben, obwohl die bekannte, hohe Kor' : erung von Transportsystemen die Anwesenheit dieser Biom) ie- küle in allen Spezien stark natk : ! egt.
PHNC ist ein transportbezogenes Protein, das für die Aufnahme und den Abbau von Pros-
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phonat in Bakterien notwendig ist. Biochemisch dient es als Nukleotid-bindendes Protein des bindeproteinabhängigen Phosphonattransportsystems (6). Metcalf und Wanner haben das Wissen ausgeweitet, indem sie gezeigt haben, dass PHNC zusammen mit anderen Mitgliedern des PHNGen-Klusters einen bindeproteinabhängigen Phosphonattransporter darstellt, der auch Phosphate, Phosphatester und anorganische Phosphate transportiert (7). Die Aufwärtsregulierung eines Phosphat-Phosphonatträgers stimmt mit Beobachtungen überein, dass Taurin bei der Proteinphosphorylation eine Rolle spielt (8).
Die Überexpression des Multidrug-Transporter-Homologen MTH104 im Hirn von mit Taurin behandelten Ratten reflektiert möglicherweise die hauptsächliche Erkenntnis der Studie, da es die detoxifizierenden Eigenschaften von Taurin mit dem Multidrug-Transport-System zu verknüpfen vermag. Das Multidrug-Transporter-System, das durch das Multidrug-Resistenz-System (MDR) veranschaulicht ist, spielt eine grössere Rolle für Multidrug-Resistenz, d. h. therapeutisches Versagen bei der Chemotherapie von Krebs und Infektion. Verstärkte MDR-Expression in Tumorzellen führt zu einer erhöhten Beseitigung von zytotoxischen Wirkstoffen, da chemotherapeutische Arzneimittel aus der Zelle gepumpt werden (3,9, 10).
Anderseits kann das MDR-Transportsystem unter physiologischen Bedingungen von äusserster Wichtigkeit für Detoxifizierungsprozesse sowohl
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Transportprozesses würde teleologisch auf eine solche biologische Funktion hinweisen und dies würde auch die hochkonservierte Natur von Multidrug-Transportern erklären (11,12). Die Aufwärtsregulierung des Multidrug-Transporter-Homologen durch Taurin, das seinerseits eine Vielzahl von chemisch nicht verwandten Verbindungen entgiftet, kann diese Wirkung von Taurin gut erklären.
Die Demonstration des Protein-Export-Membran-Proteins SECD im Rattenhim ist das Erste, um die Anwesenheit des bakteriellen, integralen Membran-Protein Translokationfaktors sec für den Proteinexport im Säugetierorgan zu zeigen. Gardel und Mitarbeiter haben gezeigt, dass die secDStelle von E. coli für zwei Membran-Proteine kodiert, die für den Proteinexport erforderlich sind (13). Pogliano und Beckwith konnten jedoch zeigen, dass secD den Proteintransport in E. coli nicht voraussetzt, jedoch erleichtert (14). Wir sind nicht in der Lage der Feststellung der Abwärtsregulation des Protein-Export-Membranproteins SECD im Rattenhirn eine funktionelle Implikation zuzuordnen.
Die neue Feststellung des oppA und oppD ABC-Transporter-Homologen im Rattenhim zeigt, dass diese Oligopeptid-Transporter im Säugetiersystem enthalten sind. Dieses Oligopeptid-Transportsystem besteht aus zwei ATP-bindende Proteine, oppD und oppF, zwei integralen MembranProteinen, oppB und oppC, und einem Substrat-Bindeprotein oppA. Die Rolle des oppA in Bakterien ist nicht nur die Funktion als Peptidtransporter (15-17), sondern auch als ein Chaperon (18).
Diese biologische Bedeutung von durch Taurin im Rattenhirn hinunter reguliertem oppA und oppD kann derzeit nicht beantwortet werden. Es gibt jedoch einen Schlüssel von oppA defizienten Mutanten, die nicht in der Lage sind, Leuenkephalin zu transportieren (17) Eine allgemeine Rolle für proteolytische und Peptid-Recycling-Systeme kann abgeleitet werden.
Im Herz wurden zwei Transportsysteme als taurinsensitiv festgestellt. Der ABC-Transporter BRAF-2 kann das sehr ähnliche, menschliche Homologe des bakteriellen Transportsystems verzweigtkettiger Aminosäuren sein, das aus fünf Komponenten zusammengesetzt ist : BraC, ein penplasmatisches Bindeprotein für verzweigtkettige Aminosäuren ; BraD und BraE integrale Mem- branproteine ; BraF und BraG mutmassliche Nukleotid-bindende Proteine (19). Aufwärtsregulation von BRAF-2 kann in Übereinstimmung sein mit dem verstärkten Transport verzweigtkettiger Aminosäuren im Herz und dies kann wieder die Folge von Taurin sein, für sich oder durch Produkte, die sich aus seiner Wechselwirkung mit dem Carbohydrat-Insulin-verzweigtkettige Aminosäure Metabolismus sein (20).
Die zweite aufwärts regulierte Sequenz war das Kupfer-Transport-Säugetier-Homologe eines Kupfertransport P-Typ ATPase pacS, das in dem Thylakoidmembran von Synechococcus gefunden wurde. Dieses Mitglied einer grossen Familie von Kationenpumpen spielt entscheidende Rollen in vielen Organismen einschliesslich Bakterien, Pflanzen und Säugetieren. Es wurde festgestellt, dass PacS ein mutmassliches Metallbindungsmotiv (Gly-Met-X-Cys-X-X-Cys) in seinem N-ständigen Endteil besitzt, und tatsächlich erhöhen Metalle spezifisch pacS-mRNA und es gibt einen Nachweis, dass pacS in der Kupfer-Homeostase eine Rolle spielt (21).
Es wurde hervorgehoben, dass
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Taurin bei der Detoxifizierung von Metallen/metallischen Kationen eine Rolle spielt (22). Der vo ge- schlagene Metalle detoxifizierende Mechanismus war die Chelatbildung und Komplexbildung von Metallen durch Taurin. Hier schlagen wir die Aktivierung des PACS-Transportmechanik für das Einschliessen von metallischen Toxinen vor.
Wir haben eine Reihe von bakteriellen Transporter-Genen im Säugetierhirn und Herz und ihre Modulation durch Taurin beschrieben. Wir sind der Fehlerquellen und Nachteile der Genaurfin- dungsmethode bewusst, jedoch die hohe Homologie - Sequenzen wurden einer bekannten Da tenbanksequenz nur zugeordnet, wenn die Homologie über 50% betrug - berechtigt diese Identi zierungen Modifikation der Transporter-Genexpression kann von physiologischer Bedeutung ein, wenn man berücksichtigt, dass Taurin nicht nur ein normaler Bestandteil des Körpers ist, sondern auch in der Nahrung vorliegt.
Im pro- und eukaryotischen Leben werden Zellen und Subzellular-Räume durch Membranen getrennt und der regulierte und selektive Durchgang von spezifischen Molekülen durch d ese Membranen ist ein grundlegendes und hochkonserviertes Prinzip.
Uns hat interessiert, ob Taurin, eine natürlich vorkommende Aminosäure, in der Lage ware die Expression von Transportern zu induzieren oder zu unterdrücken, mit der Grundlage, dass gezeigt wurde, dass Taurin eine Reihe von endogenen Toxinen und Xenobiotika mit verschiedenen, hemisch nicht verwandten Strukturen detoxifiziert.
Hiezu wurde eine Genauffindungstechnik, die subtraktive Hybridisierung verwendet, bel der mRNA von taurinbehandeltem Rattenhirn und-herz von nichtbehandelten Kontrolltiere subtra iert wurde. Die subtrahierten mRNA wurden dann in cDNA umgewandelt, amplifiziert, sequenziert und durch Genbankdaten identifiziert.
Wir fanden fünf Transportertranskripte, die Phosphonat-Transport ATPase PHNC, das ulti- drug-Transporter-Homologe MTH104, das Protein-Export-Membran-Protein SECD, die Oligo ep- M-Transporter oppA und oppD im Hirn, und zwei ABC-Transporter BRAF-2 und Kationtransp rter ATPase PACS im Herz. Homologen der gefundenen Sequenzen waren in jedem Fall über 50%, so dass die Identifizierung der Transporter mit hoher Wahrscheinlichkeit möglich war.
Die biologische Bedeutung konnte sein, dass eine natürlich vorkommende Aminosäure, Taurin komplexe Transportsysteme moduliert Die wesentliche Erkenntnis ist die Aufwärtsregulation e nes Multidrug-Transporter-Transknpts, das einen Mechanismus für die nichtselektive, entgiftende ir- kung von Taurin erklärt.
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PATENTANSPRÜCHE :
1 Verwendung von Taurin zur Herstellung eines Mittels zum Beeinflussen des Transportes von Substanzen aus pro-und eukaryotischen Zellen oder in solche Zellen, insbesondere zur Transporter mediierten Detoxifizierung.
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