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Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C. Deacetoxycephalosporin C eignet sich zur Herstellung von 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure, die abgekürzt auch als 7-ADCA bezeichnet wird.
Deacetoxycephalosporin C, das die Strukturformel
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Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird Deacetoxycephalosporin C gebildet, indem man Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 züchtet. Das Verfahren wird durchgeführt, indem man den obigen Mikroorganismus in einem wässerigen Nährkulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und ferner anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen so lange züchtet, bis im Kulturmedium eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität entstanden ist.
S. clavuligerus produziert zusammen mit Deacetoxycephalosporin C ferner 7- (5-Amino-5-carboxyvaleramido) -7-methoxy-3- oarbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäureund7- (5-Ammo-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl- 3-cephem-4-carbonsäure, die beide auch als Antibiotica A-15886I und A-1688611 bezeichnet werden.
Deacetoxycephalosporin C wird vom Mikroorganismus zwar in geringeren Mengen gebildet als die andern erwähnten Cephalosporine, es lässt sich jedoch mühelos von diesen Antibiotica abtrennen und chromatographisch in reiner Form isolieren, wie dies im folgenden beschrieben wird.
Der für das erfindungsgemässe Verfahren verwendete Mikroorganismus wurde aus Bodenproben von Südamerika isoliert. Der Organismus wurde aus den Bodenproben isoliert, indem man gewisse Mengen der Bodenproben in sterilem destilliertem Wasser suspendierte und die Suspensionen auf Nähragar aufstrich. Die so beimpften Nähragarplatten wurden dann mehrere Tage bei etwa 25 bis 350C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Mikroorganismenkolonien mittels einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertragen.
Die Agarschrägen wurden dann inkubiert, um so geeignete Mengen in Inoculum zur Bildung von Deacetoxycephalosporin C zu bekommen.
Bei dem für das erfindungsgemässe Verfahren eingesetzten Mikroorganismusstamm handelt es sich um einen Actinomyceten, der nach Verfahren identifiziert wurde, welche zur Charakterisierung von Streptomyces species für das International Streptomyces Projekt empfohlen wurden (Shirling et al., Methods für Cha-
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Die taxonomischen Eigenschaften von S. clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen und Aus- führungen zusammengefasst. Die Zuordnung der Farbnamen in diesen Tabellen wurdenach der ISCC-NBS-Methode vorgenommen, wie sie Kelly etal. in The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names (U. S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D. C. 1955') beschrieben wurde.
Die in Klammer angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Tresner und Backus-Farbtabellen (Tresner
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die Bezeichnungen der Farbreiter sind unterstrichen. Die Farbblöcke von Maerz und Paul (Maerz et al., Dictionary of Color [McGraw-HillBookCo., Inc., New York, 1950]) sind in Klammern angegeben. Sofern nichts anderes gesagt ist, liess man alle Kulturen 14 Tage bei 300C wachsen.
S. clavuligerus NRRL 3585 liess sich schwierig in Genus Streptomyces klassifizieren, da es sich dabei um eine atypische sporophore Morphologie handelt. Die bei der Zellwandanalyse erhaltenen Werte zeigen jedoch, dass diese Kultur als Species aus Streptomyces genus anzusehen ist. Dieser Organismus wird daher als neue Species behandelt und mit dem Namen Streptomyces clavuligerus bezeichnet.
Dieser Organismus bildet in charakteristischer Weise ein umfangreiches Netzwerk kurzer sympodialverzweigter Lufthyphen, die sich eventuell in Sporen teilen. Es werden kurze keilförmige Seitenäste gebildet, die normalerweise aus je 1 bis 4 Sporen entstehen. Es entstehen keine Substratkonidien. Im Elektronenmikroskop lassen sich glattwandige Sporen feststellen.
Zellwandpräparationen enthalten das L, L-Isomere von Diaminopime1insäure und Glycin ausser den Hauptbestandteilen Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin. Die Sporen sind in der Masse grau, und das Pri- märmycel ist fahlgelb bis gelbbraun. Es wird kein lösliches Pigment gebildet. Die Kultur verfügt über einen optimalen Temperaturbereich von 26 bis 300C. Bei 370C kommt es zu keinem Wachsen. Morphologisch ähnelt diese Kultur bestimmten Stämmen von Thermonospora und Micromonospora.
Die Eigenschaften von S. clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen und Ausführungen zusammengefasst.
Morphologie von S. clavuligerus NRRL 3585
Auf einem umfangreichen Luftmycel werden Sporophoren gebildet, und diese bestehen aus einem Netzwerk kurzer sympodialvernetzter Hyphen. Normalerweise entspringen 1 bis 4 Sporen an kurzen keulenförmigen Seitenästen. Unter Umständen teilen sich Sporophoren auch in Segmente auf, wodurch sich Ketten von Sporen bilden. Die Sporen haben normalerweise Abmessungen von 0,34 bis 0,84 x 0, 85 x 3, 3 je., im Mittel 0,64 x 1, 53 g. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die Sporen glattwandig sind. Im Substratmycel werden keine Sporen gebildet.
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Tabelle I : Kulturcharakteristiken von S. clavuligerus NRRL 3585
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<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstumscharakteristiken
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> (Hefe-Malz-Extrakt-Agar) <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrgräulichgelb <SEP> [12K3],
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> dunkelgrau <SEP> (G) <SEP> 3ih <SEP> [21B1],
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 3 <SEP> (Hafermehl-Agar) <SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelb <SEP> [11Cl], <SEP> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> b <SEP> [27A1], <SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> Pigment
<tb> ISP <SEP> No.
<SEP> 4 <SEP> (anorganischer <SEP> Salz-Star-reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrgräulichgelb <SEP> [12B2], <SEP>
<tb> ke-Agar) <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> mittelgrau <SEP> (GY) <SEP> 2fe <SEP> [45A1],
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 5 <SEP> (Glycerin-Asparagin-Agar) <SEP> leidliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgrun <SEP> [10B1],
<tb> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> a, <SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> Pigment
<tb> Tomatenpaste-Hafermehl-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrgräulichgelb <SEP> [11E4],
<tb> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> hellgräulicholiv <SEP> (GN) <SEP> 1-1/2ig
<tb> [21B1], <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Emerson-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelb <SEP> [11C1],
<tb> Luftmycel <SEP> spärlich,
<SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Bennet-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrhellgelb <SEP> [11J2],
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> dunkelgräulichgrün <SEP> (GN)
<tb> 24-1 <SEP> ! <SEP> 2ih <SEP> [23A3], <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Czapek-Agar <SEP> spärliches <SEP> Wachstum
<tb> Glucose-Asparagin-Agar <SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgrun <SEP> [10B1],
<tb> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> b <SEP> [27A1], <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelb <SEP> [10B2], <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> gelblichgrau <SEP> (GY) <SEP> 2dc <SEP> [10A2], <SEP> kein
<tb> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Nähr-Agar <SEP> leidliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgrün <SEP> [10B1],
<tb> Lufmycel <SEP> spärlich, <SEP> weiss,
<SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Calciummalat <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgriin <SEP> [10B1],
<tb> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> a
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Milch <SEP> keine <SEP> Koagulation, <SEP> Aufklaren <SEP> innerhalb <SEP> von <SEP> 17 <SEP> Tagen
<tb> Nitratreduktion <SEP> negativ
<tb> Gelatineverflüssigung <SEP> keine
<tb> Einfluss <SEP> der <SEP> pu-wanderung <SEP> auf <SEP> optimaler <SEP> pH-Bereich <SEP> zum <SEP> Wachsen <SEP> 5,0 <SEP> bis <SEP> 6, <SEP> 0,
<tb> das <SEP> Wachstum <SEP> Wachstum <SEP> jedoch <SEP> keine <SEP> Sporulation <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> bis
<tb> 8,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> Melaninproduktion
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> und
<tb> Trypton-Hefeextrakt-Brühe <SEP> keine
<tb> Temperaturbedingungen <SEP> Wachstum <SEP> und <SEP> Sporulation <SEP> sind <SEP> bei <SEP> 26 <SEP> bis <SEP> 300C <SEP> gut,
<tb> bei <SEP> 37 C <SEP> oder <SEP> darüber <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb> Hauptsächliche <SEP> Bestandteile <SEP> der <SEP> L, <SEP> L-Diaminopimelinsäure, <SEP> Glycin, <SEP> Glutaminsäure,
<tb> gesamten <SEP> Zellhydrolysate <SEP> Asparaginsäure, <SEP> Alanin <SEP> und <SEP> Leucin <SEP>
<tb>
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In Tabelle II sind die Ergebnisse der Kohlenstoffutilisation zusammengefasst, die man bei Versuchen mit S. clavuligerus NRRL 3585 erhält.
In dieser Tabelle werden folgende Symbole verwendet : + = Wachstum und Utilisation - = kein Wachstum, keine Utilisation (+) = mögliche Utilisation (-) = fragliche Utilisation
Tabelle II
Kohlenstoffutilisation für NRRL 3585
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<tb>
<tb> Verbindung <SEP> Wachstumsverhalten <SEP>
<tb> L-Arabitiose
<tb> Rhanmose
<tb> FructoseD-Xylose
<tb> Melezitose <SEP> (-) <SEP>
<tb> Raffinose
<tb> Dextrose
<tb> Cellobiose
<tb> Maltose <SEP> + <SEP>
<tb> Saccharose
<tb> Cellulose
<tb> Inosit <SEP> (+) <SEP>
<tb> Mannit
<tb> Na-Glutamat <SEP> (+) <SEP>
<tb>
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diums in Mengen vor, die für ein entsprechendes Wachsen der erfindungsgemäss verwendeten Actinomycete ausreichen.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann variiert werden. Dieser Anfangs-pH-Wert des Mediums sollte zweckmässigerweise jedoch zwischen 6,5 und 7,2 liegen. Wie bei andern Actinomyceten, so steigt auch im vorliegenden Fall der pH-Wert des Mediums allmählich während der Wachstumsperiode des Organismus, während der das Antibioticum gebildet wird, und kann hiebei einen Wert von 6,7 bis 7,5 oder darüber errei- chen, wobei der End-pH-Wert wenigstens vom ursprünglichen pH-Wert des Mediums, den im Medium vor- handenen Puffern und der jeweiligen Wachstumszeit für den Organismus abhängt.
Submerse aerobe Kulturbedingungen sind die Bedingungen der Wahl für die Produktion von Deacetoxy- cephalosporin C. Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen bedient man sich einer Schüttelflaschen- und Oberflächenkultur in Flaschen. Für die Herstellung grosser Mengen wird eine submerse aerobe Kultur in sterilen Tanks hevorzugt, Tanks bevorzugt.
Das Medium im sterilen Tank kann mit einer sporulierten Suspension inokuliert werden. Wegen der bei
Verwendung einer sporulierten Suspension beobachteten Wachstumsverzögerung verwendet man als Inokulum vorzugsweise jedoch die vegetative Form der Kultur.
Auf diese Weise umgeht man die Wachstumsverzögerung und kann die Fermentationsvorrichtungen bes- ser ausnutzen. Vorzugsweise stellt man daher zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus her, indem man eine verhältnismässig kleine Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus inokuliert.
Sobald dabei ein junges aktives vegetatives Inokulum entstanden ist, überträgt man dieses vegetative Inokulum aseptisch auf den grossen Tank. Das Medium, in dem man das vegetative Inokulum produziert, kann entweder gleich oder verschieden sein von dem für die grosstechnische Produktion verwendeten Medium.
Der Mikroorganismus, der Deacetoxycephalosporin C produziert, wächst über einen breiten Temperaturbereich zwischen etwa 25 und 370C. Zu optimaler Produktion scheint es bei Temperaturen von 26 bis 30 C zu kommen. Eine maximale Produktion an Antibiotikum erhält man normalerweise innerhalb von etwa 36 bis 72 h nach Inokulation des Kulturmediums.
Wie bei aeroben submersen Kulturverfahren üblich, wird auch im vorliegenden Fall sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und eine entsprechende Bildung an Antibioticum sollte man hiebei bei der Tankproduktion mit einem Luftvolumen von 0,2 bis 0,4 Volumina Luft pro Minute pro Volumen Kultur arbeiten. Bevorzugt arbeitet man bei einem Luftvolumen von 0,40 Volumina Luft pro Minute und pro Volumen Kulturmedium.
Die Konzentration antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium lässt sich während der Fermentationszeit ohne weiteres verfolgen, indem man Proben des Kulturmediums bezüglich ihrer hemmenden Wirkung gegenüber dem Wachsen von Mikroorganismen untersucht, von denen man weiss, dass sie durch Deacetoxycephalosporin C inhibiert werden. Die Organismen Sarcina lutea und Salmonella gallinarum erwiesen sich für diesen Zweck als geeignet. Die Untersuchung der Proben kann an Hand des bekannten turbidometrischen Verfahrens oder an Hand des üblichen Scheibenplattenverfahrens durchgeführt werden.
Zu einer maximalen Produktion an antibiotischer Wirksamkeit kommt es im allgemeinen innerhalb von einem bis 3 Tagen nach Inokulation des Kulturmediums bei einem submersen aeroben Kulturverfahren oder bei einem Schüttelflaschen-Kulturverfahren.
Die vom Streptomyceten während der Fermentation gebildete antibiotische Aktivität tritt in der antibiotischen Brühe auf. Die beim erfindungsgemässen Verfahren angewandten Isoliertechniken sind daher so ausgelegt, dass man aus der Brühe ein Maximum des Antibioticum gewinnen kann.
Hiezu werden beispielsweise Mycel und ungelöste Feststoffe aus der Fermentationsbrühe in bekannter Weise entfernt, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe kann man dann das Gemisch der entstandenen Antibiotica, beispielsweise durch Extraktion oder Adsorption, gewinnen.
Deacetoxycephalosporin C wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe als Bestandteil des bei der Fer- mentation produzierten antibiotischen Gemisches gewonnen. Das Deacetoxycephalosporin C wird dann von den andern antibiotischen Bestandteilen dieses Gemisches (beispielsweise den oben erwähnten Antibiotica A-16 8861, A-16 886II und A-16 884) abgetrennt und als praktisch reine Verbindung säulenchromatographisch isoliert.
Zur Gewinnung des antibiotischen Gemisches durch Adsorptionstechniken werden Ionenaustauscherharze bevorzugt. Diese Gewinnung kann jedoch genausogut auch mit Adsorptionsmaterialen erfolgen, wie Aktivkohle, Silicagel, Aluminiumoxyd oder Cellulose.
Deacetoxycephalosporin C und die oben erwähnten gleichzeitig gebildeten Antibiotica können in der Fermentationsbrühe in Salzform oder in amphoterer Form (zwitterionischer Form) vorliegen, u. zw. je nach dem End-pH-Wert der Brühe. Das Gemisch der Antibiotica kann beispielsweise durch Adsorptionschromatographie oder durch Ionenaustauscherchromatographie gewonnen und in die einzelnen Bestandteile aufgetrennt werden, wenn diese in einer der genannten Formen oder als Gemisch hievon vorliegen.
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Die Eluatfraktionen werden durch Papierchromatographie oder durch einen mikrobiociden Versuch ständig überwacht, und alle Fraktionen, die hienach lediglich Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Die ersten Eluatfraktionen enthalten die bekannten Antibiotica A-16 8861 und 16886TI,
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(5-Amino-5-earboxyvaleramido)-7-methoxy-3-earbamoyloxymethyl-3-cephenk-4-earbonsäureBeispiel l : Herstellung von Deacetoxycephalosporin C mit S. clavuligerus NRRL 3585.
Zur Herstellung einer sporulierten Kultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 lässt man den Organismus auf einem Nährschrägagar wachsen :
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<tb>
<tb> Dextrin <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein
<tb> (''N-Z <SEP> Amin-Typ <SEP> A, <SEP> t1 <SEP>
<tb> Sheffield <SEP> Chemical
<tb> Company, <SEP> Lindhurst, <SEP> N. <SEP> J.) <SEP> 2, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Rinderextrakt <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Meer-Agar <SEP> (dreimal
<tb> gewaschen) <SEP> 20, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
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Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf PH 7, 0 eingestellt.
Der Schrägagar wird mit Sporen von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inokuliert und 4 bis 5 Tage bei 300C inkubiert. Der Schrägagar wird dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und schliesslich sorgfältig abgekratzt, um so von ihm die Sporen und Zellen in Form einer wässerigen Suspension zu entfernen. Einen Milliliter der erhaltenen Suspension verwendet man zum Inokulieren von je 100 ml Mengen eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15,00 <SEP> g
<tb> Maisschlempefeststoffe <SEP> 5, <SEP> 00g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2,00 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wird durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf PH 6,7 eingestellt.
Das erhaltene vegetative Medium schüttelt man 24 bis 48 h bei 300C auf einem Reziprokschüttler mit einer Geschwindigkeit mit 108 Umdr/min bei einem Ausschlag von etwa 5 cm. Das so hergestellte Inokulum verwendet man dann zu der im folgenden beschriebenen Produktion von Deacetoxycephalosporin C.
In einen 40 I fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl werden 241 eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben :
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<tb>
<tb> Antifoam <SEP> A <SEP> (Ein <SEP> von <SEP> Corning
<tb> Company, <SEP> Midland, <SEP> Mich.,
<tb> vertriebenes <SEP> Antischaummittel) <SEP> 5,00 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 1125, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Nadrisol
<tb> (National <SEP> Distillers
<tb> Produkts <SEP> Co., <SEP> N. <SEP> Y., <SEP> N. <SEP> Y.) <SEP> 125,00 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehlgrütze <SEP> 500,00 <SEP> g
<tb> Glycerin <SEP> 187,50 <SEP> g
<tb> N-Z <SEP> Amin <SEP> A <SEP> 125, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Eisen <SEP> (ll) <SEP> sulfat-heptahydrat <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> kaltes <SEP> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 24 <SEP> 1
<tb>
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Ansatz mit einem mechanischen Rührer bei 420 Umdr/min rührt.
Der End-pH-Wert liegt bei 6, 3.
Etwa 751 der gesamten Brühe, die man durch Vereinigung der gesamten Brühen aus drei wie oben beschrieben ausgeführten Fermentationen erhält, werden unter Verwendung von Diatomeenerde in einer Menge von 5 g pro 100 ml filtriert.
Das dabei erhaltene Brühenfiltrat wird dann auf eine 9, 5 x130 cm Säule gegeben, die mit 8 1 Aktivkohle (Pittsburg CAL. 12 x 40 ; Pittsburg Activated Carbon Co.) bepackt ist, wobei die Aufgabegeschwindigkeit 60 ml pro Minute beträgt. Die Säule wird anschliessend mit 101 deionisiertem Wasser (PH 5, 2) gewaschen, worauf man die an der Aktivkohle adsorbierte Aktivität entfernt, indem man auf die Säule 50% iges wässeriges Aceton aufgibt.
Die die antibiotische Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung von Aceton im Vakuum eingeengt, und das dabei erhaltene Konzentrat gibt man auf eine 9, 5 x 140 cm Säule, die mit Dowex 1-X1 (einem stark basischen Anionenaustauscherharz, das von Dow Chemical Co. Midland, Mich., vertrieben wird) in der Formiatform bepackt ist. Die Säule wird dann mit 101 deionisiertem Wasser gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit 0, 1 molarem Ammoniumformiat entfernt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und in einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Minute auf eine 9, 5 x 100 cm Säule gegeben, die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 x 40) bepackt ist.
Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit
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einem 1 : 4 Gemisch aus Aceton und Wasser mit einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Minute eluiert. Hiebei erhält man 15 Fraktionen aus je 21. Durch anschliessende Eluierung mit einem 1 : 1 Gemisch aus Aceton und
Wasser erhält man 18 Fraktionen mit je einem Liter. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zum Entfer- nen von Aceton im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.
40 g der vereinigten lyophilisierten Präparationen werden mit 41 Methanol durch 16h langes Rühren mit einem Magnetrührer extrahiert. Die in Methanol unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, worauf man die in Me- thanol löslichen Stoffe mit 5 Volumina Aceton ausfällt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und ge- trocknet. Die Ausbeute beträgt 20,6 g.
Die dabei erhaltene Präparation löst man in einem Minimum Wasser, und die erhaltene Lösung gibt man mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute auf eine mit Dextran (Sephadex G-25 ; Pharmacie Fine Chemi- cals, Piscatawa, N. J.) bepackte 5,8 x 120 cm Säule. Die in der Säule befindliche Aktivität wird mit deioni- siertem Wasser eluiert, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.
10 g des oben erhaltenen Materials werden in 256 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (55 : 45) gelöst, und die erhaltene Lösung gibt man auf eine 5, 5 x 85 cm Säule, die mit einem in einem Lö- sungsmittelgemisch aus Acetonitril und Wasser (7 : 3) hergestellten Silicagel bepackt ist.
Die Aufgabe erfolgt in einer Geschwindigkeit von 3 ml pro Minute. Nach Aufgabe der Probe wird die
Säule mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (7 : 3) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml pro Minute eluiert. Die am meisten aktiven Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zur Trockne eingedampft und lyophilisiert.
50 g des obigen lyophilisierten antibiotischen Gemisches, das man durch Vereinigung des Materials aus mehreren in obiger Weise durchgeführten Versuchen hergestellt, werden in 80 ml Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung adsorbiert man an mikrokristalline Cellulose. Die dabei erhaltene Mischung wird getrocknet und dann auf eine 7, 4 x 115 cm Säule gegeben, die mit mikrokristalliner Cellulose meinem Gemisch aus Acetonitril: n-Propanol: Wasser (l ; l : 0,5, V : V : V) bepackt ist.
Die Säule wird dann mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit einer Geschwindigkeit von 18 ml pro Minute eluiert. Fraktionen von jeweils 11 Eluat werden gesammelt, und alle Fraktionen, die auf Grund der Papierchromatographie oder eines mikrobiologischen Versuches Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, und das erhaltene Konzentrat wird schliesslich lyophilisiert, wodurch man praktisch reines Deacetoxycephalosporin C in Form des Ammoniumsalzes erhält.
12 g des gefriergetrockneten Produktes werden in folgender Weise weiter gereinigt. Das erhaltene Material wird in 75 ml Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung gibt man auf eine 3,0 x 70 cm Säule, die mit einem in Wasser hergestellten Amberlit XAD-4-Harz (Röhm und Haas, Philadelphia, Pa.) bepackt ist. Das auf der Säule befindliche Produkt wird mit Wasser in einer Geschwindigkeit von 2,5 ml pro Minute eluiert, wobei man eine Reihe von Eluatfraktionen von jeweils 20 ml auffängt. Die erhaltenen Eluatfraktionen werden ständig papierchromatographisch und mikrobiologisch untersucht.
Diejenigen Fraktionen, die lediglich Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man Deacetoxycephalosporin C hoher Reinheit mit folgenden Eigenschaften erhält :
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<tb>
<tb> Elementaranalyse <SEP> für <SEP> C14H18N3O6SNa <SEP> :
<tb> berechnet: <SEP> C <SEP> 44,32; <SEP> H <SEP> 4,78; <SEP> N <SEP> 11,08; <SEP> S <SEP> 8,45
<tb> gefunden: <SEP> C <SEP> 44,80; <SEP> H <SEP> 5,34; <SEP> N <SEP> 11,74; <SEP> S <SEP> 7,88
<tb>
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Ämax 260 (e 58 00) Potentiometrische Titration (66%iges DMF) :
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<tb>
<tb> Anfangs-pH-Wert <SEP> von <SEP> 5,0
<tb> pKa <SEP> 4, <SEP> 0, <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> und <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
EMI8.4
spiel 1 beschriebenen Verfahren, wobei man jedoch einProduktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet :
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<tb>
<tb> Distillers'solubles <SEP> (Nadrisol) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> (Nutrisoy <SEP> 200 <SEP> D <SEP> ; <SEP>
<tb> Archer <SEP> Daniels <SEP> Midland <SEP> Co.,
<tb> ChicÅago, <SEP> Ill.) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Proteinmelasse <SEP> (Blackstrap) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Hafermehl <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
An Stelle eines Rotationsschüttlers verwendet man ferner einen mit 108 Hüben pro Minute betriebenen Reziprokschüttler.
Bei s pie 1 3 : Pilotanlagenproduktion von Deacetoxycephalosporin C.
Ein 40 1 fassender Fermenter aus rostfreiem Stahl wird mit 24 1 Medium folgender Zusammensetzung beschickt :
EMI9.2
<tb>
<tb> Antifoam <SEP> A <SEP> (ein <SEP> von <SEP> Dow <SEP> Corning
<tb> vertriebenes <SEP> Antischäummittel) <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Dextrin <SEP> 700 <SEP> (A. <SEP> E. <SEP> Staley <SEP> Mfg. <SEP> Co.,
<tb> Decator, <SEP> Ill.) <SEP> 50, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Sojabohnengrütze <SEP> 25, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Melasse <SEP> (Blackstrap) <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Kaliumbiphosphat <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> kaltes <SEP> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 25 <SEP> 1
<tb>
Der Ausgangs-pH-Wert liegt bei 6, 5 und wird nicht eingestellt.
Das Medium sterilisiert man 30 min bei 120 C, und es wird dann abgekühlt und mit 5% des nach Beispiel 1 hergestellten vegetativen Inokulums beimpft. Sodann fermentiert man den Ansatz 66 h bei 30 C, wobei man mit Luft in einer Menge von 0, 35 V/ V/min belüftet und mit einem mechanischen Rührer mit 420 Umdr/min rührt. Der pH-Endwert beträgt 7, 5.
Etwa 601 der oben erhaltenen Brühe werden unter Verwendung von Diatomeenerde filtriert. Das Brühenfiltrat leitet man dann über eine 9, 6 x150 cm Säule, die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 x 40, Hersteller Pittsburgh Activated Carbon Co.) bepackt ist.
Die Säule wird so lange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom farblos ist, und die an der Kohle adsorbierte Aktivität entfernt man dann, indem man 50% iges wässeriges Aceton über die Säule leitet. Die die gewünschte Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung von Aceton im Vakuum eingeengt, und das Konzentrat gibt man dann auf eine 5, 9 x 104 cm Säule, die mit IRA-68-Harz (Formiatform) (einem von Röhm und Haas Co. Philadelphia, Pa., hergestellten Anionenaustauscherharz, das man zur Umwandlung des Harzes in die Formiatform mit Ameisensäure wäscht) bepackt ist.
Die Säule wird so lange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom klar und farblos ist, und die auf der Säule befindliche Aktivität wird dann durch Waschen mit 0, 1 molarer Ammoniumformiatlösung entfernt. Die
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den vereinigt, zur Entfernung von Acetonitril im Vakuum eingeengt und schliesslich gefriergetrocknet. Hiebei erhält man 25 bis 30 g Feststoffe.
Die gefriergetrocknete Präparation löst man in einem Minimum Wasser, und gibt die erhaltene Lösung dann in eine mit mikrokristalliner Cellulose bepackte Säule von 7, 2 x 60 cm, wobei diese Cellulose in 70%igem wässerigemAcetonitril suspendiert ist und man die Säule vor Aufgabe der aktiven Probe mit Acetonitril wäscht.
Nach erfolgter Aufgabe der Probe wird die Säule mit einem Säulenvolumen Acetonitril gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt
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und auf etwa 200 ml eingeengt, und aus dem dabei erhaltenen Konzentrat fällt man den darin enthaltenen Wirkstoff durch Zugabe von 10 Volumina Aceton aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 9 bis 12 g.
20 g des oben erhaltenen Materials werden in einer minimalen Wassermenge gelöst, und die erhaltene Lösung gibt man auf eine Silicagelsäule (7, 2 x 60 cm). Das verwendete Silicagel wird vorher mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und zum Bepacken der Säule in 70% Acetonitril suspendiert. Nach Aufgeben der Probe wäscht man die Säule mit einem Säulenvolumen Acetonitril, worauf die in der Säule befindliche Aktivität mit 70%igem Acetonitril eluiert wird.
Es werden mehrere Fraktionen aufgefangen, und kleine Teilmengen hievon werden zur Identifizierung des in jeder Fraktion vorhandenen antibiotischen Faktors papierchromatographisch untersucht. Das bekannte Antibioticum A-16 884 (7-Methoxycephalosporin C) geht zusammen mit den Anfangsfraktionen von der Säule, während sich das Deacetoxycephalosporin C erst bei den späteren Fraktionen sammeln lässt.
Alle Fraktionen, die auf Grund der papierchromatographischen Analyse nur Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und dann gefriergetrocknet. Die nach den oben erwähntenlaolier-und Reinigungs- verfahren erhaltene lyophilisierte Präparation ist praktisch reines Deacetoxycephalosporin C in Form des Ammoniumsalzes.
Beispiel 4 : Isolierung von Deacetoxycephalosporin C als Mononatriumsalz.
Etwa 60 l der gemäss Beispiel 3 erhaltenen Brühe werden unter Verwendung von Hyflo-Supercel filtriert.
Das Brühenfiltrat schickt mandurch eine 9, 6 x 150cm Säule, die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 x 40) bepackt ist. Die Säule wird so lange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos ist, und die in der
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lange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom klar und farblos ist, und die in der Säule befindliche Aktivität wird dann durch Waschen mit 0, 1 molarem Natriumacetat entfernt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und dann auf eine 4, 3 x 72 cm Säule gegeben, die mit Pittsburgh CAL. (12 x 40) Aktivkohle bepackt ist. Die
Säule wird mit dem 6fachen Säulenvolumen Wasser gewaschen, worauf man die in der Säule befindliche Aktivität mit 30%igem wässerigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung des Acetons im Vakuum eingeengt und schliesslich gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 20 bis 30 g.
Die Analyse ergibt einen Natriumgehalt von 2, 5%.
Das hiebei erhaltene rohe antibiotische Gemisch der Natriumsalze wird über mikrokristalliner Cellulo- se chromatographiert, worauf man das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C aus dem Salzgemisch über Silicagel nach dem in Beispiel 3 für die Isolierung des Ammoniumsalzes von Deacetoxycephalosporin C beschriebenen chromatographischen Trennverfahren abtrennt.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt lässt sich chromatographisch von Deacetoxycephalosporin C nicht mehr unterscheiden, das durch Hydrierung von Cephalosporin C nach dem in der USA-Patentschrift Nr. 3, 124, 576 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Das erhaltene Produkt verfügt über die im Beispiel 1 angegebenen physikalischen Eigenschaften.
Beispiel 5 : Herstellung von Deacetoxycephalosporin C in Form der freien Säure.
Das nach Beispiel 4 hergestellte Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C wird in destilliertem Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung versetzt man unter Rühren in kleinen Mengen mit sulfoniertem Polystyrolharz AG 50W-X4 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Cal.), bis der PH-Wert des Gemisches auf 2, 5 eingestellt ist. Sodann wird das Harz abfiltriert und das erhaltene Filtrat lyophilisiert, wodurch man die freie Säure von Deacetoxycephalosporin C in Form eines trockenen amorphen Feststoffes erhält.