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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fruktose durch Isomerisieren von Glukose. Insbesondere wird durch die Erfindung ein Verfahren der vorstehend angegebenen Art geschaffen, bei dem eine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung eingesetzt wird, in der mindestens ein Teil des Glukoisomerase-Enzyms extrazellularen Ursprungs ist.
Das Isomerisieren von Glukose zu Fruktose durch die Einwirkung von wässerigem Alkali ist schonseit langem bekannnt. Solche Katalysatoren, wie z. B Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat, Kalziumhydroxyd, Erdalka- licarbonate, Alkaliionenaustauscher, Ammoniak, Pyridin usw., wurden zum Isomerisieren von Glukose benutzt. DieAusbeute an hiebei gebildeter Fruktose beläuft sich jedoch höchstens auf 20 bis 3ífF/a d. Th., wodurch dieses Verfahren unwirtschaftlich wird. Ferner kann die allenfalls erwünschte Isolierung von Fruktose aus dem Reaktiongemisch nur mit grosser Schwierigkeit und mit beträchtlichen Verlusten durchgeführt werden.
Bei Versuchen zur Verbesserung dieses Verfahrens wurde eine Anzahl von Isomerisierungsverfahren vorge schlagen, welche auf der Wirkung von Enzymen beruhten. Diese Vorschläge waren als für die Technik unbrauchbar befunden worden, weil folgende Nachteile vorhanden waren : schlechte Ausbeute, langsame Reaktion, Schwierigkeiten bei der gewünschten Enzymzubereitung, die Unmöglichkeit, den Fruktosebestandteil als solchen zu gewinnen, u. a.
Insbesondere waren derartige Enzymverfahren bisher an die Verwendung von intrazellularen Enzymsystemen
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aber zeitraubend und mitunter schwierig durchzuführen und verursacht merklich erhöhte Produktionskosten.
Es erschien daher aussichtsreich zu versuchen, bei der Herstellung von Fruktose eine Glukoisomerase-Zubereitung anzuwenden, welche einen hohen Grad an extrazellularer Enzymaktivität aufweist. Wenn eine solche Zubereitung auch noch ohne die zusätzliche lästige Stufe der Zellaufbrechung erhalten werden könnte, würde dies einen beträchtlichen technischen Fortschritt für die Herstellung von Fruktose darstellen.
Eine Enzymzubereitung mit hohem extrazellularen Gehalt ist aus verschiedenen Gründen anzustreben ; So ist allgemein bekannt, dass intrazellulare Enzyme ihre spezifischen Wirkungen langsamer ausüben als die extrazellularen. Extrazellulares Enzymmaterial wird allgemein sowohl zur Erzielung eines höheren Isomerisierungsgrades als auch zur Gewinnung höherer prozentueller Ausbeuten in kürzerer Zeit gegenüber intrazellularen Medien für wirksamer gehalten. Bis jetzt jedoch wurde noch keine Glukoisomerase-Zubereitung gefunden, in wel cher das Enzym ausschliesslich im extrazellularen Zustand vorliegt oder auch nur eine Zubereitung, welche einen beachtlichen Teil an extrazellularer Enzymaktivität zusätzlich zur intrazellularen aufgewiesen hätte.
Die Erfindung ermöglicht es, das Isomerisieren von Glukose zu Fruktose mittels einer Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung auszuführen, welche einen hohen Grad an extrazellularer Aktivität aufweist.
Beim erfindungsgemässen Verfahren können sogar Glukoisomerase-Zubereitungen hergestellt und beim Isome- risieren von Fruktose eingesetzt werden, welche ihre Enzymaktivität nur im extrazellularen Anteil der Kulturflüssigkeit enthalten, d. h. dass die Kulturflüssigkeit ohne die Zellenreste zum Einsatz gelangt.
Die Erfindung ermöglicht es ferner, dass das zu Fruktose führende Isomerisierungsverfahren dem Arbeiten mit hohen Konzentrationen an Glukosesubstrat angepasst werden kann und auch ausgezeichnete Ausbeuten an Fruktose in verhältnismässig kurzen Zeiten liefert.
Ausserdem gestattet es das erfindungsgemässe Glukoisomerisierungsverfahren, Fruktose in Mengen zu erzeu gen, welche an durch Gleichgewichtsbedingungen bestimmte theoretische Grenzen heranreichen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Fruktose durch Isomerisieren von Glukose besteht in seinem Wesen darin, dass man eine Glukoisomerase-Zubereitung durch Züchten einer Streptomycesart, die imstande ist, dieses Enzym bei extrazellularer Enzymaktivität zu erzeugen, in einem eine geeignete Kohlenstoff quelle enthaltenden Kulturmedium herstellt, gegebenenfalls die flüssige Phase von den Zellen abtrennt und dass man Glukose der Einwirkung der gesamten Enzym-Zubereitung oder einer aus den abgetrennten Teilen gewonne- nen Zubereitung unterwirft.
Die die extrazellulareEnzymaktivität enthaltende Flüssigkeit kann von denZellresten durch Filtration oder andere einfache Methoden leicht abgebaut werden. Um weite Aktivität aus den Zellen freizumachen und extrazellular anzureichern, muss man die Zellwände durch physikalische oder chemische Methoden zerreissen.
Besonders bevorzugte Spezies unter den Streptomycesarten sind Streptomyces venezuelae und Streptomy ces olivochromogenes. Kulturen von einem Stamm jeder dieser Organismen wurden in der American Type Cul- tureCollection von Mikroorganismen niedergelegt. Sie haben die folgenden Bezeichnungen erhalten : Streptomyces venezuelae = ATCC Nr. 21113 ; Streptomyces olivochromogenes =ATCC Nr. 21114. Diese Stämme erzeugen Glukoisomerase, welche zum grossen Teil extrazellular vorliegt, wie dies bisher noch nicht bekannt war.
Das gewünschte Enzym wird in der üblichen Weise hergestellt. Ein Impfmaterial, hergestellt beispielsweise auf einemAgar-Substrat, wird zum Impfen eines Kolbens benutzt, welcher ein geeignetes Nährmedium enthält.
So wird z. B. eine Kultur, welche einen geeigneten Streptomyces-Stamm enthält, dazu verwendet, ein Substrat zu impfen, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält. Hier lässt man den Organismus wachsen, wobei das gewünschte Enzym erzeugt wird. Die Inkubationszeit kann über einen weiten Zeitbereich, inAbhän-
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gigkeit von der Art des Mikroorganismus und dem benutzten Kulturmedium, schwanken. Im allgemeinen wird die Inkubationszeit etwa 4 bis48 h dauern. Üblicherweise wird nur ein aliquoter Teil oder die gesamte Organs- musmasse dann dazu benutzt, ein grösseres Volumen an Nährstoff zu impfen. Dies kann ein oder mehrere Male wiederholt werden.
Die Endkultur wird, mit oder ohne Reinigungsverfahren, weiterverwendet, um die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose durchzuführen.
So kann man das gesamte Medium unmittelbar als Glukoisomerase-Zubereitung verwenden oder das Me- dium kann filtriert oder in anderer Weise behandelt werden. Das Filtrat oder Zentrifugat enthält gewöhnlich die extrazellulare Enzymzubereitung, welche dann unmittelbar verwendet oder noch weiter durch eineAnzahl bekannter Verfahren gereinigt werden kann. In gleicher Weise kann die intrazellulare Fraktion, welche übli- cherweise als eine feste Zellmasse zurückbleibt, entweder verworfen oder getrennt in der Glukoisomerisierungs- stufe benutzt werden. Aus wirtschaftlichen Gründen verwendet man normalerweise das gesamte Medium ohne weitere Trennung, wenn die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose in grosstechnischem Massstab ausgeführt werden soll.
Man kann 2ffl/o der gesamten Glukoisomeraseaktivität bis zu etwa 60go oder sogar noch mehr der extrazel- lularen Aktivität zuordnen. Es sind jedoch nicht alle Streptomycesarten oder-Stämme in dieser Weise aktiv.
Die Erfindung soll aber trotzdem nicht auf die Verwendung eines besonderen Organismus oder Mikroorganismus beschränkt sein. Erkannt wurde dieF higkeit von speziellen Streptomyceserganismen, eine Enzymzubereitung zu erzeugen, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens einen beachtlichen Teil der Enzymaktivität extrazellular enthält. Wie bereits erwähnt, waren solche Enzymzubereitungen bisher unbekannt.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine besonders geeignete Kohlenstoffquel- le oder ein Nährstoff zur Züchtung der Streptomycesart benutzt. Diese Kohlenstoffquelle ist Stärke und Xylose lieferndes Material, z. B. eine Mischung aus Xylose und Stärke, welche als einzige Kohlenstoffquelle oder in
Kombination mit einer Vielzahl von andern Kohlenstoffquellen, wie z. B. Mannit, Glukonsäure, Galaktose, Glycerin, Sorbit, Glukose und andern reinen oder unreinen Quellen von Kohlenhydraten, verwendet werden kann. Diese Mischung aus Xylose und Stärke ist als ein Ganzes besser als Kulturmedium geeignet als einer der beiden Bestandteile in gleicher Menge. Die Nährstoffmischung erzeugt insbesondere eine aktivere Enzymzubereitung als Xylose, welche in grossem Umfang als Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Glukoisomerase benutzt wurde.
Auch Stärke allein ist als Kohlenstoffquelle weniger geeignet.
DerStärkenährstoff, welcher bei der Herstellung derGlukoisomerase-Zubereitung imRahmen des erfindungsgemässen Verfahrens benutzt werden kann, kann aus einer beliebigen pflanzlichen Quelle stammen, z. B. Mais, Weizen, Kartoffel, Tapioca, Reis, Sago und Sorghumkorn. Wachsstärken können ebenfalls verwendet werden. Die Bezeichnung "Stärke" wird hier ganz allgemein gebraucht und umfasst unmodifizierte Stärke und Rückstände sowie auch Stärke, welche durch Behandlung mit Säuren, Alkali, Enzymen oder Oxydationsmitteln modifiziert wurde. Lösliche oder teillösliche modifizierte Stärken, Dextrine, vorgelatinierte Produkte und Stärkederivate, z. B. gewisse kationische, anionische und nichtionische Stärkederivate, sind ebenfalls verwendbar. Typische hier brauchbare Stärken sind Mais- und Kartoffelstärke.
DerXyloseanteil des Materials kann Xylose selbst sein oder auch ihre nativen Formen, welche in den Zellwänden von fast allen Pflanzen in der Form von Xylanpolymeren vorkommen, die Xylosezucker als Hauptbestand- teilenthalten. Somit kann Xylose benutzt werden, so wie sie in unreiner Form in Stroh, Spreu, Holz, Maiskol- ben. Weizenkleie u. dgl., zugegenist. Üblicherweise werden die erwähnten oder andere Materialien mit Alkali behandelt, um die Hemizellulose aus den verschiedenen Abfallmaterialien, die als Medien benutzt werden, zu entfernen. Um die Monosaccharidxylose zu erhalten, wird die Hemizellulose üblicherweise hydrolysiert.
Somit soll unter dem hier verwendetenAusdruck"Xylose"verstanden werden, dass er sowohl das reine Material wie auch die unreinen, dieses Kohlenhydrat enthaltenden Quellen einschliesst.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung der Glukoisomerase-Zubereitung ist die Kohlenstoffmischung üblicherweise aus 25 bis 75% Stärke und 25 bis 751o Xylose, bezogen nur auf das gesamte Mischungsgewicht der Kohlenstoffquelle, zusammengesetzt. In anderer Weise ausgedrückt umfasst die Xylose und Stärke enthaltende Kohlenstoffquelle üblicherweise 0, 2 bis 10 und öfters 0, 5 bis 2 Gew.- des Kulturmediums.
Bei einer andern Ausführungsform der Erfindung enthält ein besonders erwünschtes Kulturmedium auch Maiseinweichwasser als Proteinquelle. Diese Kombination zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Mischungaus Xylose und Stärke als Kohlenstoffquelle ist besonders vorteilhaft. Üblicherweise macht die Maiseinweichflüssigkeit, angesetzt aus verschiedenen Aminosäuren, 0, 1 bis 5, 0 Gew.- ) des Kulturmediums aus.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäss eingesetzten Glukoisomerase-Zubereitung können das Impfmedium und die nachfolgendenZellwachstumsmedien zusätzlich zu den oben beschriebenen oder andern Kohlenstoffquellen gewünschtenfalls eine geeignete Stickstoffquelle, anorganische Salze, z. B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat usw., und andere Materialien enthalten. Üblicherweise wird die Kultur, z. B. Streptomyces venezuelae, bei einem PH im Bereich von etwa 7 bis etwa 9 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 400C gezüchtet.
Die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose hängt von den Bedingungen ab, wie z. B. der Konzentration an
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Glukose, der Temperatur, der An- oder Abwesenheit anderer Enzymcofaktoren u. dgl., Sie kann im Hinblick auf die Zeit und Fruktoseausbeuten schwanken. Angemessene Ausbeuten werden üblicherweise innerhalb etwa 1 bis 36 h erhalten. Während dieser Stufe kann die Temperatur Raumtemperatur sein oder auf etwa 50 bis 70 C gesteigert werden. Üblicherweise wird der pH-Wert des der Isomerisierung unterworfenen Glukosesystems durch Verwendung geeigneter Puffersysteme, z. B. eines Phosphatpuffers, auf etwa 7 bis 9 eingestellt. Andere Aktivatoren, z. B. Magnesium-oder Manganionen, können auch anwesend sein.
Es kann mitunter möglich sein, Nebenreaktionen durch Zusatz von Inhibitoren, beispielsweise durchAnwendung vonNatriumarsenat, Natriumarsenit und Natriumfluorid, auf einem Mindestmass zu halten. Es wurde festgestellt, dass die Enzymaktivität durch Verwendung eines Enzymcofaktors, wie z. B. Kobalt in Form von Kobaltchlorid, auf ein Maximum erhöht werden kann.
Die Glukose selbst ist üblicherweise eine konzentrierte Lösung. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden erhal-
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ebenso wie übersättigte Lösungen isomerisiert werden.
In den folgenden Beispielen sind Teile und Prozente als Gew.-Teile und Gew.-Prozente zu verstehen.
Beispiel l : Extrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen wurden aus zwei Spezies, nämlich S. venezuelae ATCC Nr. 21113 und S. olivochromogenes ATCC Nr. 21114, hergestellt und die Enzymzubereitungen wurden zum Isomerisieren von Glukose-Mustern verwendet.
Das bei diesem Versuch benutzte Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> löslich <SEP> gemachte
<tb> Kartoffelstärke <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> Kobaltchlorid <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb>
Der PH-Wert des Kulturmediums wurde vor der Impfung auf etwa 7, 0 eingestellt.
Nach dem Sterilisieren und Abkühlen auf 250C wurden 100 ml Proben des vorstehenden Xylose-Stärke-Mediums mit der vorstehend erwähnten Spezies beimpft. Die Beimpfungen wurden in spezifischer Weise durch Beimpfen des Mediums mit drei Ösen voll an Zellen aus Xylose-Stärke-Agarztichtung durchgeführt. Nach 48stün- diger Inkubation bei28 C auf einem Shaker zum Lüften der Kultur wurden Zellen durch Zentrifugieren des Kulturmediums mit10 000 Umdr/min während 10 min geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 0, 85%oigerSalzlö- sung gewaschen und in 5 ml von 0, 05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7, 5) suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann in einem wassergekühlten Schalloszillator während 20 min bei j.
O KC behandelt und dann nochmals mit 12000 Umdr/min während 30 min geschleudert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als eine Rohquelle von intrazellularer Glukoisomerase-Enzym-Lösung verwendet.
Rohe extrazellulare Glukoisomerase wurde hergestellt durch Aussalzen von 50 ml Kulturzentrifugatmittels Ammoniumsulfat von 60% Sättigung. Nach dem Zentrifugieren wurde die partiell gereinigte extrazellulare Enzymlösung erhalten durch Auflösen der Ausfällung in 4 ml von 0, 05 molarer Phosphatpufferlösung (PH 7, 5) und Dialysieren der Lösung gegen den Puffer während eines Tages bei 5 C.
Die Isomerisierung selbst wurde durchgeführt durch Zubereitung einer 1, 6 molaren wässerigen Lösung von Glukose, welche auch 0, 05 molaren Phosphatpuffer, 0, 2 molares Magnesiumsulfat und 0,05 molares Kobaltchlorid enthielt. 2 ml der oben erwähnten Enzymlösungen wurden zu 2 ml der Glukoselösung zugesetzt.
Nach einer Inkubation von 3 h bei 600C wurden 0, 5 ml der Reaktionsmischung abgezogen in 4, 5 ml von 0, 5n-Perchlorsäurelösung. Die Menge an in dem aliquoten Teil gebildeter Fruktose wurde nach der CysteinCarbazol-Methode bestimmt, wiesieinJ. Biol. Chem., 192 [ 1951]. S. S83, beschrieben ist. In diesem Test wurde Farbintensität während 10 min bei 600C nach dem Zusatz der Reagenzien entwickelt. Die Intensität wurde dann in einem Spektrophotometer bei 560 mIJ abgelesen und die Menge an vorhandener Fruktose aus Standardwerten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse folgen. Enzymaktivitäten sind berechnet, um die Aktivität/ml an ursprünglichem Kulturmedium zu zeigen.
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Tabelle I
EMI4.1
<tb>
<tb> Intrazellulare <SEP> Glukoisomeraseaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter <SEP> mg <SEP> Fruktose/ml <SEP> % <SEP> Fruktose/ml
<tb> Mikroorganismus <SEP> Fruktose <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP>
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> S. <SEP> olivochromogenes <SEP> 38, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP>
<tb> Extrazellulare <SEP> Glukoisomeraseaktivität
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> S. <SEP> olivochromogenes <SEP> 5,6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 24, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 99 <SEP>
<tb>
Beispiel 2 : Hier wurde die Wirkung der Kulturperiode auf die Isomeraseaktivitätvon S. venezuelae ATCC Nr. 21113 untersucht.
Das Kulturmedium und die andern Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiell beschrieben, mit der Abänderung, dass 10 ml einer Vorkulturbruhe als eine Impfung zu dem 100 ml Hauptkulturgemisch zugesetzt waren. Sowohl Zellen wie Kulturfiltrat wurden nach 16,20, 24,48, 72 und 168 hInkubation geerntet und als Glukoisomeraselösungen benutzt. Die Ergebnisse folgen in Tabelle 2.
Wie ersichtlich, zeigte die intrazellulare Enzymaktivität aus S. venezuelae Höchstaktivität nach nur 16 Kulturstunden und behielt diese Aktivität im wesentlichen auf einer konstanten Höhe während etwa 7 Tagen. Die intrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Aktivität von S. venezuelae nahm allmählich zu und blieb im allgemeinen nach etwa 2 Tagen konstant. Somit ist ersichtlich, dass eine stark bevorzugte Enzym-erzeugende Spezies S. venezuelae für die Zwecke der Erfindung ist, infolge der hervorragenden Aktivität im Erzeugen sowohl erheblicher Mengen von extrazellular-und intrazellular-derivierter Aktivität.
Tabelle II
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<tb>
<tb> Intrazellulare <SEP> Glukoisomerase-Enzym-Aktivität
<tb> Kulturperiode <SEP> % <SEP> gebildeter <SEP> mg <SEP> Fruktose/ml <SEP> % <SEP> Fruktose/ml
<tb> Mikroorganismus <SEP> (h) <SEP> Fruktose <SEP> Kulturmedium <SEP> Kulturmedium
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d) <SEP> (e) <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 16 <SEP> 39, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 98 <SEP>
<tb> 20 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 24 <SEP> 39, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 48 <SEP> 36. <SEP> 4 <SEP> 5. <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 91 <SEP>
<tb> 72 <SEP> 38, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> 168 <SEP> 38, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> Extrazellulare <SEP> Glukoisomerase-Enzym-Aktivität
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d) <SEP> (e) <SEP>
<tb> S.
<SEP> venezuelae <SEP> 16 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP>
<tb> 24 <SEP> 17, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP>
<tb> 48 <SEP> 19, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> 72 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP>
<tb> 168 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 64 <SEP>
<tb>
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3 :nutzt, Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, lieferte das Stärkexylose enthaltende Medium eine höhere Fruktose bilden- deAktivität im Vergleich zurXylose, und insbesondere in bezug auf die Lieferung von intrazellularer Glukoiso- merase -Enzym -Aktivität.
Tabelle III
EMI5.2
<tb>
<tb> Intrazellulare <SEP> Glukoiso- <SEP> Extrazellulare <SEP> Glukoiso- <SEP>
<tb> Mikroorganismus <SEP> Kohlenstoffquelle <SEP> merase-Enzym-Aktivität <SEP> merase-Enzym-Aktivität
<tb> 0/0 <SEP> gebildeter <SEP> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> Fruktose
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> Xylose-39, <SEP> 3 <SEP> 5,0
<tb> ATCC <SEP> 21113 <SEP> Stärke
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> Xylose <SEP> 24,5 <SEP> 3,5
<tb> ATCC <SEP> 21113
<tb> S. <SEP> olivochromo- <SEP> Xylose-26, <SEP> 6 <SEP>
<tb> genes <SEP> Stärke
<tb> ATCC <SEP> 21114
<tb> S. <SEP> olivochromo- <SEP> Xylose <SEP> 14, <SEP> 9
<tb> genes
<tb> ATCC <SEP> 21114
<tb>
Es ist nicht ganz aufgeklärt worden, welche besondere Wirkung Stärke aufdieFruktosegewinnunghat, wenn als Kulturmedium verwendet.
Es wird jedoch angenommen, dass die Stärke in irgendeiner Weise das Wachstum des Mikroorganismus veranlasst und aktiviert und infolgedessen die sich darauf ergebende Enzymaktivität vergrössert.
Beispiel 4 : In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Enzym erzeugende Aktivität von S. venezuelae über verschiedene Kulturzeiten verfolgt. Wie im nachstehenden gezeigt, wurde die intrazellulare Glukoisomerase-Aktivität wieder auf einer im wesentlichen konstanten Höhe sogar während 7 Tagen beibehalten. Die extrazellulare Enzymaktivität dieses Species nahm zu während der ganzen Wachstumsperiode und erreichte ein konstantes Maximum nach etwa 5 Kulturtagen. Da während des Verlaufes dieser Zeit die intrazellulare Enzymaktivität nicht proportional verringert wurde, betont dies insbesondere die Tatsache, dass die extrazellulare Aktivität sich nicht ableitet aus intrazellularer Enzymaktivität, die aus Zellautolyse freigesetzt wurde.
Bei der Ausführung dieser Untersuchungen wurden die folgenden Wachstumsmedien für die Kultur von
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tenden Medien als eine Stickstoffquelle schien die Glukoseisomerisierung weiter zu begünstigen. Es folgt die Zusammensetzung der beiden benutzten Kulturmedien :
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<tb>
<tb> Medium <SEP> mit <SEP> Maiseinweich- <SEP> Medium <SEP> ohne <SEP> Maiseinweichflüssigkeit <SEP> g <SEP> flüssigkeit <SEP> g
<tb> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Kartoffelstärke <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Kartoffelstärke <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Maiseinweich <SEP> - <SEP>
<tb> flüssigkeit <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> Pepton <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Pepton <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0,
<SEP> 25 <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> Kobaltchlorid <SEP> 0, <SEP> 0024 <SEP>
<tb> Kobaltchlorid <SEP> 0, <SEP> 0024 <SEP>
<tb>
Das PH dieser Medien war in beiden Fällen 7, 2.
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Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse dieser verschiedenen Untersuchungen. Tabelle IV bezieht sich auf Enzymaktivität von S. venezuelae, welche aus einem Maiseinweichflüssigkeit enthaltenden Medium bestand. Tabelle V zeigt die Aktivität aus einem Maiseinweichflüssigkeit nicht enthaltenden Medium stammenden En- zym. Etwas bessere Ergebnisse wurden erhalten, wenn Maiseinweichflüssigkeit einen Teil des Nährmediums bildete.
Tabelle IV
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<tb>
<tb> Zeit
<tb> h <SEP> Tage
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Intrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 44, <SEP> 4 <SEP> 43, <SEP> 8 <SEP> 45,9 <SEP> 40, <SEP> 8 <SEP> 43, <SEP> 8 <SEP> 42, <SEP> 8 <SEP> 45, <SEP> 2 <SEP> 45, <SEP> 2 <SEP> 30, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Extrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 4,4 <SEP> 9,6 <SEP> 8,9 <SEP> 9,5 <SEP> 13,9 <SEP> 13,6 <SEP> 17,8 <SEP> 16,8 <SEP> 15,1
<tb>
Tabelle V
EMI6.2
<tb>
<tb> Zeit
<tb> h <SEP> Tage <SEP>
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP>
<tb> PH <SEP> 7,
<SEP> 3 <SEP> 7,6 <SEP> 7, <SEP> 75 <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> 8,2 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 9,0 <SEP> 9,0
<tb> Intrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 39, <SEP> 3 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 41, <SEP> 2 <SEP> 37,0 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 40, <SEP> 8 <SEP> 32, <SEP> 2 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Extrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 5,0 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 14, <SEP> 6 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel 5: Auch hier wurden verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet für die Gewinnung eines Glukoisomerase-Enzyms, in diesem Fall einer intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung.
Wie aus den Werten der folgenden Tabelle VI entnehmbar, war die Xylose-Stärke-Nährstoffmischung deutlich überlegen in der Erzeugung von aktiveren Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen im Vergleich zu Xylose oder Stärke allein als Nährstoffmedium.
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Tabelle VI
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<tb>
<tb> Fruktose <SEP> mg <SEP> Enzym/ml
<tb> Mikroorganismus <SEP> Kohlenstoffquelle <SEP> *) <SEP> % <SEP> Reaktionsgemisch <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> Xylose-Stärke
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> (Mischung <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> Gew.. <SEP> i1fo) <SEP> 35,5 <SEP> 12,5
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> Xylose <SEP> 9,2 <SEP> 6,8
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> Stärke <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> Glukose <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 5
<tb>
*) Die Gesamtmenge an verwendetem Nährstoff war die gleiche in allen Fällen.
Beispiel 6 : Hier wurde eine Anzahl von Variablen untersucht mit Bezug auf die Gewinnung von extrazellularen und intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen durch die S. venezuelae Species ATCC Nr. 21113.
Zuerst wurden die extrazellularen und intrazellularen Enzymaktivitäten untersucht in bezug auf die Wirkung des PH. Die Umwandlungsreaktion aus dem extrazellularen Typ erreichte ein Optimum bei einem PH von etwa 9, 0. Die intrazellulare Aktivität war auch optimal bei einem pH von etwa 9, 0.
Auch wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um festzustellen, welche Wirkung die Temperatur auf die Aktivitäten von extrazellularen und intrazellularen Enzymen von S. venezuelae hinsichtlich der Begünstigung der Umwandlung besitzt. Die intrazellulare Aktivität nahm linear über einen Temperaturbereich von 40 bis zu etwa 700C bei Reaktionszeiten von 1 und 3 h zu. Das Optimum wurde bei etwa 700C gefunden. Bei einer halbstündigen Reaktionszeit war die optimale Temperatur 800C. Wenn die Reaktionszeit über etwa 1 h dauert, nimmt die intrazellulare Aktivität oberhalb einer Temperatur von etwa 700C ab.
Die gleiche Einwirkung der Temperatur wurde auch auf dieextrazellulare Aktivität festgestellt, mit der Ausnahme, dass Inaktivierung bei einer etwas höheren Temperatur auftritt.
Bei einer andern Reihe von Untersuchungen wurden 0, 5-, 1, 0-, 2, 0-, 3, 0-, und 4, 0 molarer Konzentrationen von Glukose sowohl mit extrazellularen als auch intrazellularen Glukoisomerase-Enzymen von S. venezuelae behandelt. Es wurde gefunden, dass sogar bei der aussergewöhnlich hohen Konzentration von4, 0 Mol Glukose/l, fast eine gesättigte Lösung, sowohl die intrazellulare wie die extrazellulare Enzymreaktion fortschritt und sich dem theoretischen Gleichgewicht näherte, wenn die Reaktionszeit ausgedehnt wurde. Somit ist ersichtlich, dass die Erfindung geeignet war, sogar hochkonzentrierte Glukoselösungen zu isomerisieren, was sie noch reizvoller für ein technisch ausführbare Verfahren macht.
In einer noch ändern Versuchsreihe wurde die Isomerisierungsreaktion während einer verhältnismässig langen Zeit durchgeführt, um einen annähemdenGleichgewichtszustand zu bestimmen. In bezug auf Intraumwand- lung unter Verwendung intrazellularen Enzyms aus S. venezuelae erreichte der Fruktosegehalt etwa 48% des zugesetzten Zuckers unter Ausgehen von Glukose. Anderseits, wennFruktose das Substrat war, war der schliess- liche Fruktosegehalt etwa 50%. Somit scheint es, dass der Gleichgewichtspunkt in der Nachbarschaft von etwa 48 bis 50%. Intraumwandlung liegt.
Beispiel 7 : Es wurde bei Laboruntersuchungen festgestellt, dass, während eine Anzahl von Streptomyces-Species extrazellular-derivierte Glukoisomeraseaktivität entfaltet, eine überraschende Anzahl keine Glukoisomerase-Enzym-Aktivität extrazellularen Charakters besitzt. Untersuchungen, wie im allgemeinen in Beispiel 1 angegeben, wurden mit einer sehr grossen Anzahl von Streptomyces-Species durchgeführt. Die Ergebnisse bei einigen wenigen von diesen folgen in der Tabelle VII.
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Tabelle VII
EMI8.1
<tb>
<tb> Extrazellulare <SEP> Glukoisomerase-Aktrivität
<tb> mg <SEP> Fmktose/mI <SEP> % <SEP> Fmktose/m1 <SEP>
<tb> Mikroorganismus <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP> Kulturflüssigkeit
<tb> 8. <SEP> aureus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> flaveolus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> coelicolor <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> parvus <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> S. <SEP> roseochromogenus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> purpurascens <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> S. <SEP> scabies <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP>
<tb> S. <SEP> vinaceus <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> S. <SEP> tanashiensis <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb>
Während die Erfindung an besonderen Ausführungsbeispielen beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass sie weiterer Abwandlungen fähig ist.
Sie umfasst alle Abwandlungen, Verwendungen oder Anpassungen, wobei sie grundsätzlich benutzt wird und schliesst, solche Abweichungen von der vorstehenden Offenbarung ein,
EMI8.2
:net, dass man eine Glukoisomerase-Zubereitung durch Züchten einer Streptomycesart, die imstande ist, dieses Enzym bei extrazellularer Enzymaktivität zu erzeugen, in einem eine geeignete Kohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium herstellt, gegebenenfalls die flüssige Phase von den Zellen abtrennt und dass man Gluko- se der Einwirkung der gesamten Enzym-Zubereitung oder einer aus den abgetrennten Teilen gewonnenen Zubereitung unterwirft.