TP CH A2 Séparation et identification d’espèces

chimiques par chromatographie

Buts : * comprendre sur un exemple simple le principe de la chromatographie

* réaliser une chromatographie sur couche mince ( C.C.M. )
* identifier les espèces chimiques présentes dans l’huile essentielle issue de l’écorce d’orange

La chromatographie permet d’identifier et de séparer les différentes espèces chimiques présentes dans un
mélange… Il existe plusieurs types de chromatographies ; nous allons parcourir ces différentes techniques
au cours du TP.

I – Chromatographie sur colonne

1 ) qu’est-ce que la chromatographie sur colonne ?

La chromatographie sur colonne est comme la chromatographie sur couche mince une chromatographie
d’adsorption, c’est à dire basée sur la plus ou moins bonne fixation d’une espèce chimique à la surface
d’un solide.

Elle comprend :
 la phase fixe ou stationnaire constituée d’un solide, le plus souvent de la silice ou de l’alumine qui
remplissent une colonne.
 La phase mobile ou éluant constituée d’un solvant liquide choisi en fonction des espèces chimiques à
séparer et de la phase stationnaire.

Remarque : l’éluant progresse de haut en bas de la colonne par gravité.

La séparation des espèces chimiques est basée sur des différences de vitesses d’entraînement vers le bas de
la colonne, des espèces chimiques contenues dans l’échantillon. Ces vitesses dépendent de la capacité
d’adsorption de l’espèce par la phase stationnaire.

2) mode opératoire
Verser de l’eau 5cm au dessus du coton supérieur.
Laisser couler l’eau jusqu’au coton puis verser un peu de sirop de menthe.
Quand celui-ci a imbibé le coton, verser à nouveau de l’eau et en continu dans la burette afin que celle-ci
ne soit pas dépourvue d’eau.
Recueillir les deux colorants dans deux tubes à essais.

3) Questionnaire
a. Fais un schéma légendé du montage de l'élution.
b. Qu’observe-t-on ? Quelle est la couleur du premier colorant recueilli ? Quelle est celle du deuxième ?
c. Conclure quant à la composition du sirop de menthe ( mélange de colorants ou colorant pur ? )
d. Quel colorant a le plus d’affinité avec le gel de silice ? Quel colorant a le plus d’affinité avec l’eau ?

II – Chromatographie sur papier de colorants alimentaires

1) mode opératoire

 Préparation de la cuve
 Verser au fond de la cuve à chromatographie ( un pot à confiture par exemple ), sur une hauteur
d’environ 5 mm, du solvant appelé éluant ( ici un mélange d’1 volume d’éthanol pour 14 volumes
d’eau salée ). Refermer la cuve.
 Dépôts des échantillons à analyser
 Sur un papier Whatman (appelé "phase fixe" ou "support adsorbant"), trace au crayon à papier un trait
fin à 1,5 cm du bas et repère 4 points notés R, V, O et J si les colorants proposés sont le rouge, le vert ,
le orange et le jaune.

 Dépose sur chaque point R, V, O et J, à l'aide d'une pique en bois dont le

bout a été écrasé, une microgoutte de colorant correspondant. Le
diamètre optimal de la tache est 2 à 3 mm; si besoin, laisse sécher et dépose
une nouvelle goutte de colorant.

 Elution
 Place le papier verticalement dans le pot en le maintenant avec le couvercle. Le bas du papier doit
plonger dans l'éluant et non les taches…Le papier ne doit pas toucher les parois. L'élution commence ...
 Attends la migration de l'éluant jusqu'à 2 cm du haut. Sors le papier et note d'un trait au crayon à papier
la hauteur atteinte par l'éluant.
 Sécher le papier ( à l’air libre en agitant, au sèche cheveu ou à l’étuve … )

 Révélation : il s’agit de lire le chromatogramme

ici les espèces étant colorées, aucune révélation n’est nécessaire
2) Questionnaire
a. Fais un schéma légendé du montage de l'élution.

b. Note tes observations.

c. Colle sur ton compte-rendu le chromatogramme.

d. Fais l’exploitation du chromatogramme grâce aux indications suivantes :

Exploitation d’un chromatogramme :

À chaque tache correspond une espèce chimique.

i. Pour chaque tache, on définit un nombre Rf positif sans unité appelé "rapport frontal" tel que

Rf = h / H,

où h est la hauteur parcourue par la tache (du trait au milieu de la tache) et H est la hauteur parcourue par
l'éluant (de trait à trait)

ii. La valeur de Rf (d'une substance donnée dans un éluant donné) est la même que la substance soit
pure ou mélangée à d'autres substances.

iii. Numérote les taches et détermine leur rapport frontal Rf.

e. Les quatre colorants sont-ils des substances chimiques pures ou des mélanges ?
f. Les quatre colorants ont-ils des composants communs ?

Sur les étiquettes des flacons on lit les codes administratifs des composants de chaque colorant: Rouge (E124), Bleu (E131),
Vert (E102 , E131), Jaune (E102).

g. Quel serait le code observé sur un flacon de colorant orange ?

h. Quel chromatogramme obtiendrais-tu par élution d'un mélange de colorants jaune et vert ?
i. Et pour un mélange R, J et V ?

III – Chromatographie sur papier du sirop de menthe

Comment vérifier que les deux colorants du sirop de menthe identifiés par la chromatographie sur colonne
correspondent aux colorants disponibles dans le commerce ?

a. Proposer votre protocole.

b. Faire un schéma de l’expérience.
c. Qu’obtenez-vous ? Commentez.

IV – Chromatographie de l’huile essentielle d’écorce d’orange par chromatographie sur couche

mince ( C.C.M. )

1) Mode opératoire

 Préparation de la cuve
 Verser l’éluant, au fond de la cuve à chromatographie sur une hauteur d’environ 5 mm
Déjà prêt !
 Refermer la cuve de manière à ce qu’elle se sature en vapeurs d’éluant.

 Dépôts des échantillons à analyser

 Sur une plaque à chromatographie ( dimensions 5 cm x 8 cm ), tracer très légèrement au crayon à
papier une ligne à 1 cm du bas.
ATTENTION : ne pas mettre les doigts sur la plaque pour ne pas la « salir ».
 Puis tracer très légèrement sur cette ligne autant de repères qu’il y a d’échantillons : limonène (L),
citral (C), huile essentielle de l’écorce d’orange (H).
 A l’aide d’une « pique en bois » dont le bout a été coupé, déposer sur chaque repère une microgoutte
( diamètre inférieur à 2 mm ) de chaque échantillon à analyser.
 Sécher la plaque ( à l’air libre en agitant, au sèche cheveu ou à l’étuve … )

 Elution

 Placer verticalement la plaque dans la cuve, bien refermer et laisser « monter » l’éluant.
 Lorsque le front de l’éluant se trouve à 1 cm du bord supérieur, retirer la plaque de la cuve et marquer
au crayon la position du front de l’éluant.
 Sécher rapidement ( au sèche cheveu, à l’étuve, … )

 Révélation :

 Poser la plaque à chromatographie sur la solution de permanganate ( couche de silice vers le bas ).
 Retirer au bout de quelques secondes la plaque et l’égoutter sur papier.
 Les espèces chimiques oxydées par le permanganate apparaissent sous forme de tâches. Les repérer en
les entourant au crayon.

2) Questionnaire

a - Pourquoi faut-il fermer la cuve avant la chromatographie ?

b - Pourquoi est-il indispensable de révéler pour cette chromatographie ?
c - Recopier le chromatogramme obtenu.
d - Calculer le Rf de chaque tache.
e - Pourquoi peut-on dire que l’huile essentielle d’écorce d’orange est un mélange ?
f - A l’aide des authentiques, identifier la ou les espèces chimiques présentes dans l’huile essentielle de lavande.
 Elution

 Placer verticalement la plaque dans la cuve, bien refermer et laisser « monter » l’éluant.
 Lorsque le front de l’éluant se trouve à 1 cm du bord supérieur, retirer la plaque de la cuve et marquer
au crayon la position du front de l’éluant.
 Sécher rapidement ( au sèche cheveu, à l’étuve, … )

 Révélation :

 Poser la plaque à chromatographie sur la solution de permanganate ( couche de silice vers le bas ).
 Retirer au bout de quelques secondes la plaque et l’égoutter sur papier.
 Les espèces chimiques oxydées par le permanganate apparaissent sous forme de tâches. Les repérer en
les entourant au crayon.

3) Questionnaire

a - Pourquoi faut-il fermer la cuve avant la chromatographie ?

b - Pourquoi est-il indispensable de révéler pour cette chromatographie ?
c - Recopier le chromatogramme obtenu.
d - Calculer le Rf de chaque tache.
e - Pourquoi peut-on dire que l’huile essentielle d’écorce d’orange est un mélange ?
f - A l’aide des authentiques, identifier la ou les espèces chimiques présentes dans l’huile essentielle de lavande.
 CORRIGE TP séparation et identification
d’espèces chimiques par chromatographie

II – Chromatographie de l’huile essentielle de fleurs de lavande par chromatographie sur couche

mince (C.C.M. )

Questionnaire :

2.1. il faut éviter le contact avec la peau et les yeux : donc porter gants et lunettes
il ne faut pas respirer les vapeurs : donc travailler sous la hotte
2.2. il faut fermer la cuve avant la chromatographie pour qu’elle se sature en vapeurs d’éluant
2.3. il est indispensable de révéler car les échantillons chromatographiés sont incolores.
2.4. Exemple de chromatogramme :
Front de
Tache 3E l’éluant

Tache 2E

Tache 1E H

h1E

Ligne
de
h1E 2,9 dépôt
2.5. Dépôt E ( 3 taches ) : Rf1E = = = 0,54 Linalol est un
H 5,35 authentique
h 2E 4,5 ( corps pur de
Rf2E = = = 0,84
H 5,35 référence )
h 3E 5,3
Rf3E = = = 0,99 Acétate de linalyle est
H 5,35 un authentique ( corps
h1C 3,2 pur de référence )
Dépôt C ( 3 taches ) : Rf1C = = = 0,59
H 5,4
h 2C 4,5
Rf2C = = = 0,83
H 5,4
h 3C 5,3
Rf3C = = = 0,98
H 5,4
hA 4,5
Dépôt A ( 1 tache ) : RfA = = = 0,84
H 5,35
hL 3,1
Dépôt L ( 1 tache ) : RfL = = = 0,58
H 5,3
2.6. la chromatographie de l’huile essentielle de lavande donne 3 taches, c’est donc un mélange
d’espèces chimiques.
2.7. il faut comparer les rapports frontaux des taches constituants l’huile essentielle à ceux des
authentiques or on constate que : Rf1E = 0,54 et RfL = 0,58 donc Rf1E  RfL : l’huile essentielle
contient du linalol
et Rf2E = 0,84 et RfA = 0,84 donc Rf2E = RfA : l’huile essentielle contient de
l’acétate de linalyle

il y a de plus une autre espèce ( tache 3 ) non identifiable par cette chromatographie car aucun
authentique ne donne une tache au même niveau que cette tache 3.
2nde
Matériel TP Séparation et identification d’espèces chimiques par
chromatographie

Par binôme :

- cuve à chromatographie avec crochet + pince à linge ( x 1 )

- éluant ( 1 volume d’éthanol pour 5 volumes d’eau salée à 20 g/L ) environ 10 mL par
binôme
- plaque de papier Whatman 5 cm x 8 cm ( x 1 )
- Cuve à chromatographie fermée avec du dichlorométhane sur une hauteur de 5 mm ( x 1 )
- Plaque CCM 5 cm x 8 cm ( x 1 )

Au bureau ( ou sur les premières paillasses élèves si salle 204 ) :

- colorants dans petits flacons

Jaune E102 , Rouge E122 ; Bleu E131
Vert E102 + E 131 , Marron ( voir mélange sur emballage Vahiné )
+ Verres de montre en plastique ( x 10 )
- Piques en bois
- Ciseaux
- Sèche cheveux
- Solution de permanganate à 0,02 mol/L ( environ 100 mL )
- Coupelle en faïence + pince à épiler ( x 2 )
- Essuie tout cette fois ci
- Papier calque
- Huile essentielle du TP précédent + 1 coupelle
- Huile essentielle commerciale ( diluée dans le dichlorométhane ) + 1 coupelle
- Acétate de linalyle commerciale ( dilué dans le dichlorométhane ) + 1 coupelle
- Linalol ( dilué dans le dichlorométhane ) + 1 coupelle