Pruebas de Laboratorio para VIH

Dra. Ellen Koenig Instituto Dominicano de Estudios Virolgicos (IDEV)

Haga la prueba del VIH en:

Cualquier paciente que lo pide Personas con compaeros sexuales VIH (+). Personas con las enfermedades transmitidas sexualmente (ETS) Mujeres embarazadas y los hijos de mujeres (+) a los 18 meses. Hijos de mujeres VIH (+) a diagnosticarse Las personas con tuberculosis Las personas con virus B o C de la hepatitis Personas con Cndida oral Personas con sntomas compatible con infeccin con VIH. Antes de comenzar tratamiento en personas recibiendo tratamiento post-exposicin. Repetir a los 6 meses.

Importante Que

Paciente entienda que va a hacer la prueba de VIH y que significa estos resultados Firma voluntariamente un consentimiento informado Un adulto firma para un nio Hay consultara pre y post prueba. Informa el paciente PRIMERO y despus la familia si el/ella da su permiso Los resultados quedan confidencia

Pruebas De VIH
Prueba de Anticuerpos
Indica si se han desarrollado o no los anticuerpos especficos al VIH por la infeccin con el virus. Buscan en sangre pero hay pruebas que detectan anticuerpos en la saliva.

Tipos de Pruebas ELISA: Ensayo Inmunoabsorbente ligado a enzima Western Blot Inmunoflourescencia Pruebas Rpidas

ELISA:
Es la primera prueba que se hace porque es barata, sencilla y da resultados confiables. Si la prueba sale negativa, no se hacen mas pruebas* Cuando sale positiva, se confirma los resultados con la prueba de Western Blot, o con una prueba complementaria La mayora de las personas que tengan el virus habrn desarrollado anticuerpos dentro de 3-4 semanas y 6 meses.

* En caso de contacto con alguien VIH (+), se repita la prueba en 6 meses. No es necesaria despus de este tiempo si no hay mas contacto sexual.

Enzyme Immunoassay

Rubella antibody in patient serum binds to antigen coated bead.

Enzyme Immunoassay

OPD substrate reacts with Enzyme to form yellow-orange color measurable at 492 nm.

La Prueba de ELISA

Otra prueba de tamizaje:

Aglutinacin
Prueba similar a prueba de tipificacin de sangre

Pruebas Rpidas para VIH

Pueden hacer en el campo Pueden ser ledas en menos de 15-30 minutos Tan sensibles como ELISA Orasure aprobados en los EU fue primero

Ahora hay Uni Gold Recombigen y Reveal G 2 Multispot por BioRad defiere infeccion con tipo 1 de tipo 2

Determine aprobado en Europa

Utilizado para no perder el paciente a seguimiento

Apoyo Emocional

Los individuos esperando resultados pueden estar deprimidos y pueden tener mucha ansiedad, igual que personas que reciben noticia sobre su patrn de resistencia. El apoyo emocional del paciente durante estos tiempos es muy importante. Cada laboratorio que hace la prueba deberan tener un medico, psiclogo, o un educador entrenado en manejar los resultados para entregarlos.

Perdida de Pacientes
31% de los 27,000 a 30,000 personas quien hacen prueba de VIH en los EU no viene a recoger sus resultados 29% de personas infectadas en los EU no saben que son VIH (+) 37% desarrollan SIDA entre un ao despus de su primer prueba 25% personas VIH (+) en NY aprendan que son VIH (+) cuando diagnostican SIDA

Por eso promueve la prueba de VIH como parte de cuidad rutinario del individuo
Ya que aqu esta el Programa Nacional, esta idea puede aplicar a la Republica Dominicana

Pruebas Confirmatorias
2.

Western Blot Inmunoflourescencia Indirecta

1.

WesternBlot Enzyme Immunoassy

Color Developer

Sample

Conjugate

Interpretacin de Resultados

160,000 120,000 55,000 41,000 24,000 17,000 + muestra

gp120

Nomenclatura de las Bandas del Western blot

Gen Protena VIH-1 VIH-2

env

Precursora de la envoltura Glucoprotena externa Glucoprotena transmembrana Precursora del core Protena principal Protena de la matriz Transcriptasa inversa Integrasa Proteasa

gp160 gp120 gp41 p55 p24 p17 p68 p34 p12

gp140 gp105 gp 36 p55 p26 p15 p64 p34 p11

gag

pol

WHO. Wkly Epidemiol Rec 1990; 37: 281-8

Interpretacin De Los Resultados

Positivo: La persona est infectada por el VIH, y

debe tomar precauciones para no transmitirle el virus a otra persona. No significa que la persona tiene SIDA Negativo: Slo quiere decir que no se encontraron anticuerpos al VIH en esta muestra de sangre. No significa que la persona no tenga VIH por la posibilidad que este recientemente infectado Indeterminado: Tiene bandas pero no llena criterio para ser positivo.

Diferentes Criterios de Interpretacin del Western blot para el Diagnstico de la Infeccin por VIH-1
Nombre Requisitos de positividad

FDA

ARC
CDC CRSS OMS CNTS/PEI

Al menos una banda de cada uno de los tres genes estructurales (gag, pol y env) Por los menos las tres bandas siguientes: p24, p31 y gp41 (u otra glicoprotena) Al menos dos bandas de las siguientes: p24, p31 y gp 41 Al menos una banda del core (gag o pol) y otra de la envoltura Al menos dos bandas de la envoltura Al menos dos bandas, una de ellas de la envoltura

ARC, American Red Cross; CDC, Centers for Disease Control; CNTS/PEI, Centre National de Transfusion Sanguine; CRSS, Consortium for Retrovirus Serology Standardization; FDA, Food and Drug Administration; OMS, Organizacin Mundial de la Salud

WHO. Wkly Epidemiol Rec 1990; 37: 281-8 Soriano et al. Med Clin (Barc) 1993;100; 561-6

Western Blot:
La interpretacin varia pero al menos anticuerpos contra las tres protenas virales [env, centrum(gag), polimerasa]
Criteria utilizado en IDEV

Inmunoflourescenia Indirecta

Prueba similar a FTA Utiliza anti inmunoglobulina humano unido a una tinte que brillo para identificar clulas que han reaccionada con anticuerpos especficos contra el VIH presente en el suero del paciente

La prueba de Western Blot es costoso

Entonces .

Prueba Complementaria

La OMS ha decidido que debido a alto costo de Western Blot, si hace 2 pruebas con reactivos diferentes y mtodos diferentes, se puede considerar el resultado definitivo. Si las pruebas no son iguales, el Western Blot es obligatorio.

Pero una prueba negativa no siempre significa que la persona no es positiva

Necesita 6 semanas a 6 meses para ser positiva aunque algunos reportan mas temprano

Y en Ninos que Nacen a Mujeres VIH (+)

La prueba definitiva es a los 18 meses.

Los Bancos de Sangre necesitaban algo mejor

Porque hay una ventana inmunolgica donde el individuo recientemente infectada no tiene anticuerpos

Evolucin de los Marcadores Serolgicos en la Infeccin por VIH-1

Concentracin srica IgG anti-env Anti-gp41 Anti-gp120 IgG anti-core

Ag VIH (p24)

Anti-p24 Anti-p17 IgM

3-6 semanas
I II

5-8 aos
III IV

Tiempo Estadio CDC

Soriano et al. Med Clin (Barc) 1990; 94: 441-3 Busch et al. Transfusion 1995; 35: 91-7

Aplicaciones de la Deteccin de Antigenemia p24

Diagnstico precoz de la infeccin aguda por VIH-1

Diagnstico de la infeccin por va vertical

Identificacin de individuos seropositivos con elevada infectividad (virmicos) Monitorizacin de la respuesta a antirretrovirales en individuos infectados por subtipos no B del VIH-1 Reconocimiento de la replicacin viral en cultivos celulares En los Estados Unidos se emplea en todas la unidades de sangre.
Soriano et al. Med Clin (Barc) 1990; 94: 441-3 Machuca et al. Antiviral Therapy 1998; 3: 187-9

Pruebas en Individuos ya con Prueba de VIH (+)

1. CD4 2. Carga Viral

Anormalidades Inmunolgicos en Infeccin con VIH

Baja numero CD4 Anormalidades en funcin de CD4 Activacin inmunolgica crnica Desregulacin de citoquines

Aumenta produccin de citoquines proinflamatorio Reduccin de produccin de IL 2 y IF gamma

Repuesta de CD4

Aumenta en numero por 3 fases cuando empiezan HAART

I. Reduccin de Apoptosis II. Redistribucin y proliferacin III. Sntesis de clulas nuevas, pasando por el timo

Efecto de HAART en CD4

Aumento de linfocitos despus que comienza Estos linfocitos son CD3+ Tambin lleva marcador CD4

No hay CD 19 de clulas B Clulas con CD 45RO+/RA

Marcador de clulas de memoria

Pruebas para Conteo de CD4

Ayuda en prognosis Defina cuando debera comenzar profilaxis

<200 cels/ul comienza T/S para toxo y neumocistis carinii Ideal: <350 cels/ul Programa Nacional: <250 cels/ul

Defina cuando debera comenzar HAART

Utilizada para monitorear el HAART

Tipos de Pruebas para Contar Linfocitos CD4

1. 2.

Citometria de flujo Inmunoesferas

Citometria de Flujo

Tinte unida a anticuerpos monoclonales contra antigeno CD4 une a clulas CD4 Clulas identificado por su tamao y granularidad Cuenta los unidos a tinte con las caractersticas deseado Necesita hemograma para calcular nmeros Da porcentaje con caractersticas deseadas Maquina costoso; reactivos costoso Mas usado en pases desarrollados

Inmunoesferas

Anticuerpos unidos a esferas pequeas Esferas unen a clulas CD4 Reactivo bloqueador inhiba unin de esferas a macrfagos que tambin son CD4 (+) Reactivos baratos Solamente necesita microscopio Mas laborioso que citometria de flujo, mas lento Da numero absoluto; no da porcentaje

Futuro
Nuevas tcnicas mas sencillo y menos laborioso Piensen mas en pases en desarrollo donde hay problemas de luz y econmicas.

Conteo Directo de Cantidad de Virus en la Sangre

La carga viral

Carga Viral
Nmero de copias de ARN del VIH-1 presentes en un volumen de plasma o suero Valor predictivo de progresin a SIDA Monitorizacin del tratamiento antirretroviral (emplear

el mismo ensayo)
Incapacidad para cuantificar algunas variantes del virus

No es una tcnica diagnstica de la infeccin

por VIH
Saag. Nature Med 1996; 2: 625-9 Mellors et al. Ann Intern Med 1997; 126: 946-54 Clewley. Lancet 1995; 346: 1.489

Otras Pruebas de Laboratorio

Patrones de Resistencia

La Resistencia del Virus

Es la causa principal de fallo virolgico 3 de cada 4 personas tomando ARV tiene resistencia a uno de ellos 1 de 4 personas con VIH que NUNCA ha tomado ARVs, ya tiene resistencia. Tomando su ARVs todo los das en la misma hora puede ayudar combatir resistencia Una prueba de resistencia puede ayudar los mdicos de escoger mejor medicinas para PVVS

Fuente: www.hivdrugresistance.com 2005

Patrones de Resistencia Ayuda para Escoger el Tratamiento Adecuado cuando hay Fallo Virologico

En los E.U. y Europa, hacen pruebas de resistencia antes de comenzar el tratamiento

Fenotipo o genotipo

El Costo (US $300-$1000) es un factor limitante en nuestro ambiente

Tiene que enviar fuera del pas para procesar la muestra.

Tipos de Pruebas de Resistencia

Genotipo:

Por cambios en la secuencia de nucletidos, defina el patrn de resistencia

Fenotipo
Prueba utilizando cultivos del virus y su habilidad de crece en la presencia de diferentes ARVs Similar a antibiograma

Capacidad para Replicarse (CR)

Otra prueba sofisticada para determinar la habilidad del VIH de replicarse en un ambiente definido. Consideran que cuando VIH llega a ser resistente a ARVs, frecuentemente lo hace a costo de su habilidad de replicar (CR)

Mas sobre RC

Los con mas alto CD4, tienen virus con mas bajo CR Investigadores consideran que somos suficiente cerca de entender que CR es una medida confiable y relevante clnicamente y que podemos ahora desear ensayos clnicos para contestar cuando un medico podra considerar usando el RC.

PRN Notebook. September, 2004

En el Futuro:
CR + patrones de resistencia podran ayudar en la seleccin de los ARVs mas apropiados

GRACIAS POR SU ATENCION...

Preguntas

Un paciente viene con la familia para su prueba. La familia esta nerviosa y dice que el podria suicidarse a saber que es positivo. A quien entrega los resultados
El paciente La familia

PREGUNTA 2

Paciente con VIH positiva y confirmado por WB tiene carga viral indetectable (<50 copias/ul). Ud. entonces
A. presuma que la prueba de AC es falso Haga su VIH de nuevo Repita su CV Explica la implicacin de este resultado

PREGUNTA 3/4

Paciente con prueba VIH (+) y su WB indeterminado. Que recomienda? Nino con madre (+) con prueba VIH (+) a los 9 meses. Que dice a la familia

Cual otra prueba podria recomendar

Preguntas 5/6

Persona con 1 prueba rpida (+) y otra (-).

Que har si persona no tiene dinero Si pueda costear pruebas caras

Que es la diferencia entre la prueba de genotipo y fenotipo.

Cuando usa cada uno

HIV SEROLOGY

HTLV III Core Antibody

HTLV III Serum Antigen

Years Months Antigen Anti-Env Anti-Core British Medical Journal: 1987, 1, 119122