UNIVERSIDAD JUÁREZ DEL ESTADO DE
DURANGO
Doctorado Interinstitucional en
Ciencias Biomédicas
Obtención de inhibidores de la shikimato cinasa de Staphylococcus
aureus resistente a meticilina. Cribado virtual, caracterización cinética,
actividad biológica y toxicológica.
M. en C. Lluvia Iveth Rios Soto
Comité Tutoral
Dra. Claudia Isela Avitia Domínguez
FAMEN-UJED DGO.
Director
Dr. Alfredo Téllez Valencia
FAMEN-UJED DGO.
Co-Director
Dr. Erick Sierra Campos
FCQ-UJED GP.
Asesor
Dr. Jesús Oria Hernández
INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRIA
Asesor
Dr. Antonio Romo Mancillas
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO
Asesor 2
Resistencia antimicrobiana
Mortalidad global por COVID-19, influenza y cáncer en comparación con la mortalidad
proyectada por resistencia antimicrobiana
2050
10 millones
de muertes
Influenza COVID-19 Cáncer RAM
650, 000 6,730,000 9, 600, 000 700, 000
muertes muertes muertes muertes
Modificado de : Groves, G. DeGroote Institute for Infectious Disease Research, McMaster University. 2022 3
COVID-19 y RAM
AMENAZA DOBLE ¿Cómo contribuye el COVID-19 a la
resistencia a antimicrobianos?
Se reportó el uso de
antimicrobianos como
Resistencia a terapia temprana hasta en
COVID 19 antimicrobianos
un:
Se estimó que para el final del 2020
Sólo en el
Murieron gracias al
COVID-19 de los pacientes con COVID-19 se
encontró que presentaron una
coinfección bacteriana
Murieron gracias a infecciones
por microorganismos
resistentes
Modificado de : Rawson ,TM., 2020.
Turner, P., et al. , Wellcome Open Res, 2020 4
Clancy, C., et al., Clinical Infectious Diseases 2020.
Prioridad Acinetobacter baumannii
Resistente a los carbapenémicos
Crítica
Pseudomonas aeruginosa
Resistente a los carbapenémicos
Enterobacteriaceae
Resistente a los carbapenémicos
Resistente a cefalosporinas de 3ra gen.
Prioridad Enterococcus faecium Staphylococcus aureus
Resistente a la vancomicina
Alta Resistente a la meticilina y
vancomicina
Helicobacter pylori Campylobacter
Resistente a la claritromicina Resistente a las fluoroquinolonas
Salmonella Neisseria gonorrhoeae
Resistente a las Resistente a cefalosporinas de 3ra
fluoroquinolonas gen.
Resistente a fluorquinolonas
Modificado de : OMS, 2017.
5
Eritrosa-4-fosfato Fosfoenolpiruvato
DAHP sintasa
3-deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato
Ruta del dehidroquinato sintasa
3-dehidroquinato
shikimato dehidroquinato deshidratasa
Presente en : 3-dehidro-shikimato
Bacterias
Plantas shikimato deshidrogenasa
Hongos
Shikimato
Parásitos apicomplexa
shikimato cinasa
Shikimato-3-fosfato
EPSP sintasa
5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato
corismato sintasa
Corismato
Folato p-amino- p-hidroxi- Ubiquinona
benzoato benzoato
6
Modificado de Parish, T., et al.
Microbiology. 2002. L-Tirosina L-Fenilalanina L-Triptófano
Shikimato cinasa de Staphylococcus aureus resistente a
meticilina (SaSK)
Estructura tridimensional
Pertenece a la familia de las nucleósido
monofosfato cinasas.
Monómero
Peso molecular de 18.6 kDa
shikimato cinasa
Shikimato Shikimato-3-fosfato
Favela-Candia, A., et al. Molecular Biotechnology, 2019.
7
Objetivo General
Obtener y caracterizar inhibidores de la shikimato cinasa de
Staphylococcus aureus resistente a meticilina mediante cribado
virtual, cinética enzimática, actividad biológica y toxicológica.
Modificado de: O’Neill, 2014.
8
Objetivos específicos
1. Selección de moléculas de una quimioteca con base en sus propiedades
druglike (in silico).
2. Realizar un cribado virtual de las moléculas en el sitio de unión a shikimato
de la SaSK.
3. Evaluar la capacidad de inhibición de las moléculas seleccionadas a una
concentración de 200 µM en la SaSK.
4. Calcular la concentración inhibitoria 50 (IC50) de los compuestos con mayor
Modificado de: O’Neill, 2014. capacidad de inhibición en la SaSK. 9
Objetivos específicos
5. Caracterizar el mecanismo de inhibición de las mejores moléculas
mediante cinética enzimática y dinámica molecular.
6. Evaluar la toxicidad de los compuestos en mitocondrias aisladas de tejido
hepático de res.
7. Determinar la actividad biológica de estos compuestos en una cepa de
SARM.
Modificado de: O’Neill, 2014.
10
Metodología
Quimioteca de compuestos de Sigma-Aldrich (67,449 compuestos en la
base de datos de ZINC)
Determinación de parámetros druglike y ADMET
14077 compuestos
Cribado virtual
Glide Autodock Vina
250 compuestos 250 compuestos
Disponibilidad
Pureza >97%
40 compuestos
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Metodología
40 compuestos (Seleccionados por cribado virtual y métodos in silico)
Ensayos de inhibición a 200 µM
Selección de 4 compuestos :
C4 C13 C14 C36
Determinación de IC50 de los compuestos.
Evaluación de los compuestos con mayor inhibición en SaSK en mitocondrias aisladas de
tejido hepático de res.
Determinación de la actividad biológica de los compuestos seleccionados en una
cepa de SARM.
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Resultados preeliminares
• Obtención de la IC50 de tres de los 4 compuestos seleccionados.
C4 C13 C14 C36
IC50 = 400 µM IC50 = 320 µM IC50 = 175 µM IC50 = 200 µM
13
Resultados preeliminares
• Ensayos con mitocondrias aisladas de tejido hepático de res.
Los inhibidores de la SaSK (C13 y El C36 fue capaz de inhibir el
C36) fueron capaces de bloquear el Complejo II mitocondrial, con una
consumo de oxígeno mediante IC50 de 111 µM.
inhibición del Complejo I
mitocondrial.
14
Resultados preeliminares
Los 4 compuestos fueron ensayados frente a SARM para la obtención de CMI.
CMI Compuesto CMI
DMSO 2.5% C4 No fue posible
evaluar
C13 No inhibió
C14 550 µM
C36 500 µM
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Resultados
Se iniciaron ensayos de caracterización
cinética de los 4 compuestos ya
mencionados
Sin embargo, al realizar dichos ensayos
los compuestos ya NO inhibían a la
SaSK.
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Resultados
Se ensayaron 217 compuestos.
% de inhibición a
Compuestos
200 µM
2 Aprox. 50 %
25 10% a 20%
< 10 %
60
95 Sin inhibición
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Ensayos con quimioteca de bencimidazoles
Selección de los 2 compuestos mas potentes:
IVM 1 IVM 7
IC50 = 70 µM IC50 = 100 µM
18
Compuesto IVM 1 vs SHK
Inhibición acompetitiva
19
Compuesto IVM 1 vs ATP
Inhibición mixta
20
Compuesto IVM 7 vs SHK
Inhibición acompetitiva
21
Compuesto IVM 7 vs ATP
Inhibición no competitiva
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IVM 1
Resultados
8 7 6 5 4 3 2 1
1.- Blanco (Bacteria)
2.- 0.20 mM
3.- 0.30 mM
4.- 0.5 mM
5.- 0.750 mM
6. - 1 mM
7.- 1.5 mM
8.- 2 mM
IVM 7
3 2 1
1.- Blanco (Bacteria)
2.- 0.20 mM
3.- 0.30 mM
23
Gracias
24
