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CAPÍTULO
3

ADN recombinante
Tecnología

Aislamiento y purificación de ADN

Electroforesis separa fragmentos de ADN por tamaño

Las enzimas de restricción cortan el ADN; La ligasa se une al ADN

Métodos de detección de ácidos nucleicos

Marcaje radiactivo de ácidos nucleicos y autorradiografía

Detección de fluorescencia de ácidos nucleicos

Marcado químico con biotina o digoxigenina

Las hebras complementarias se derriten y se vuelven a recocer

Hibridación de ADN o ARN en transferencias Southern y Northern

63
Fluorescencia En situ Hibridación (FISH)

Propiedades generales de los vectores de clonación

Características útiles para la clonación de vectores

Tipos específicos de vectores de clonación

Obtención de genes clonados en bacterias por transformación

Construcción de una biblioteca de genes

Cribado de la biblioteca de genes por hibridación

Bibliotecas de expresión eucariótica

Características de los vectores de expresión

La recombinación aumenta la velocidad de la clonación de genes

Vectores de clonación Gateway®

Biotecnología
Copyright © 2016 Elsevier Inc. Todos los derechos
reservados. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-385015-7.00003-X
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Tecnologia de ADN recombinante

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ADN

Básico para toda investigación biotecnológica es la capacidad de manipular el ADN. En primer lugar, para el
trabajo con ADN recombinante, los investigadores necesitan un método para aislar el ADN de diferentes organismos.
Aislar el ADN de las bacterias es el procedimiento más fácil porque las células bacterianas tienen poca
estructura más allá de la pared celular y la membrana celular. Las bacterias como E. coli son los organismos
preferidos para manipular cualquier tipo de gen debido a la facilidad con la que se puede aislar el ADN. E. coli
mantiene tanto el ADN genómico como el plásmido dentro de la célula. El ADN genómico es mucho más grande
que el ADN plasmídico, lo que permite separar las dos formas diferentes.

Para liberar el ADN de una célula, la membrana celular debe destruirse. Para las bacterias, una enzima llamada
lisozima digiere el peptidoglicano, que es el principal componente de la pared celular. A continuación, un
detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) revienta las membranas celulares al alterar la bicapa lipídica.
Para otros organismos, la alteración de la célula depende de su arquitectura. Las muestras de tejido de animales y
plantas deben triturarse para liberar los componentes intracelulares. Las células vegetales se cortan mecánicamente
en una licuadora para romper las paredes celulares resistentes, y luego el tejido de la pared se digiere con enzimas
que rompen los polímeros largos de lignina y celulosa en monómeros.
El ADN de la punta de la cola de un ratón se aísla después de que la proteinasa K degrada el tejido y el
detergente disuelve las membranas celulares. Las células cultivadas en placas son probablemente las más
fáciles ya que no tienen paredes celulares u otras estructuras fuera de su membrana celular. El detergente solo
rompe la membrana celular para liberar los componentes intracelulares. Cada organismo o tejido necesita ligeras
variaciones en el procedimiento para liberar componentes intracelulares, incluido el ADN.

Una vez liberados, los componentes intracelulares se separan de los restos insolubles, como las membranas
celulares, los huesos, los cartílagos y/o la pared celular, ya sea por centrifugación o extracción química. La
centrifugación separa los componentes según el tamaño, porque las moléculas más pesadas o más grandes
sedimentan a un ritmo más rápido que las moléculas más pequeñas. Además, los materiales que son insolubles
en la fase líquida forman agregados que sedimentan más rápidamente en el fondo de un tubo de centrífuga. Por
64 ejemplo, después de digerir la pared celular, sus fragmentos son más pequeños que las grandes moléculas de
ADN. La centrifugación hace que el ADN forme un sedimento, pero los fragmentos solubles de la pared celular
permanecen en solución. Otro método de separación de componentes celulares, la extracción química, utiliza las
propiedades del fenol para eliminar las proteínas no deseadas del ADN. El fenol es un ácido que disuelve del
60% al 70% de toda la materia viva, especialmente las proteínas. El fenol no es muy soluble en agua, y cuando
se mezcla con una muestra acuosa de ADN y proteína, las dos fases se separan, como el aceite y el agua. La
proteína se disuelve en la capa de fenol y los ácidos nucleicos en la capa acuosa. Las dos fases se separan por
centrifugación y la capa acuosa de ADN se elimina del fenol.

Una vez que se eliminan las proteínas, la muestra aún contiene ARN junto con el ADN. Debido a que el ARN
también es un ácido nucleico, no es soluble en fenol. Afortunadamente, la enzima ribonucleasa (RNasa) digiere
el ARN en ribonucleótidos. El tratamiento con ribonucleasa deja una muestra de ADN en una solución que
contiene fragmentos cortos de ARN y ribonucleótidos. Cuando se agrega un volumen igual de alcohol, el ADN
extremadamente grande se cae de la fase acuosa y se aísla por centrifugación. Los ribonucleótidos más
pequeños permanecen solubles. El ADN está entonces listo para su uso en varios experimentos.

El ADN se puede aislar eliminando primero la pared celular y los componentes de la membrana celular. A
continuación, el fenol elimina las proteínas y, finalmente, la ribonucleasa elimina el ARN.

LA ELECTROFORESIS SEPARA LOS FRAGMENTOS DE ADN POR TAMAÑO

La electroforesis en gel se usa para separar fragmentos de ADN por tamaño (Fig. 3.1). El gel consiste en
agarosa, un polisacárido extraído de algas marinas que se comporta como gelatina. La agarosa es un polvo que
se disuelve en agua solo cuando se calienta. Después de que la solución se enfría, la agarosa se endurece.
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Capítulo 3

FIGURA 3.1
Electroforesis de ADN

(A) Foto de suministros de

electroforesis. La cámara de
electroforesis contiene un gel de
agarosa en la parte central y el
resto del tanque se llena con
una solución tampón.
Luego, los cables rojo y negro se
conectan a una fuente eléctrica.
Sistemas de electroforesis

horizontal FisherBiotech, sistema

Midigel; Estándar; tamaño de gel
de 13 × 16 cm; Volumen de
tampón de 800 ml; Número de
modelo FB-SB-1316.

(B) Separación de ADN en gel

de agarosa. El tamaño de los

A B fragmentos se puede calcular

comparándolos con el marcador
de ADN estándar en el carril 1.

Las bandas más brillantes en el

marcador son 1000 pares de
Para visualizar el ADN, la agarosa se solidifica en una losa rectangular de aproximadamente 1/4 de pulgada de espesor bases y 500 pares de bases, con
arrojando el líquido fundido en una bandeja especial. Insertar un peine en un extremo de la bandeja antes de que se el marcador de 1000 pares de
endurezca hace pequeños pozos o agujeros. Después de que el gel se solidifica, se retira el peine, dejando pequeños bases más cerca de los pocillos
pozos en un extremo. (marcados con números 1–8).
Usado con permiso de Gha
La electroforesis en gel utiliza corriente eléctrica para separar las moléculas de ADN por tamaño. La losa de agarosa se daksaz, et al. (2014). La prevalencia
sumerge en un tanque lleno de tampón que tiene un electrodo positivo en un extremo y un electrodo negativo en el otro. de algunos genes de virulencia de sesenta y cinco

Las muestras de ADN se cargan en los pocillos y, cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN migra a través del gel. Pseu domonas relacionados con
la formación de biopelículas y la
El esqueleto de fosfato del ADN tiene carga negativa, por lo que se aleja del electrodo negativo y se acerca al electrodo
producción de alginato entre
positivo.
aislados clínicos.
La agarosa polimerizada actúa como un tamiz con pequeños agujeros entre las cadenas enredadas de agarosa.
J Appl Biomed 13(1), 61–
El ADN debe migrar a través de estos espacios. La agarosa separa el ADN por tamaño porque las piezas más grandes
68. DOI: 10.1016/j.
de ADN son más lentas por la agarosa. jab.2014.05.002.

Para visualizar el ADN, se retira el gel de agarosa del tanque y se sumerge en una solución de bromuro de etidio.
Este colorante se intercala entre las bases del ADN o del ARN, aunque se une menos colorante al ARN porque es
monocatenario. Cuando el gel se expone a la luz ultravioleta, emite una fluorescencia de color naranja brillante. Dado
que el bromuro de etidio es un mutágeno y carcinógeno, en la mayoría de los laboratorios ahora se utilizan tintes de
ADN menos peligrosos como SYBR Safe®.
Este tinte de ADN también es excitado por la luz ultravioleta, emitiendo una fluorescencia naranja brillante. En la
Figura 3.1, los fragmentos de ADN se visualizan mediante un colorante cargado positivamente de la familia de las
tiazinas. El tinte interactúa con la columna vertebral cargada negativamente del ADN y es una alternativa no tóxica que
no requiere fuentes de luz ultravioleta.

El tamaño del ADN que se examina afecta el tipo de gel que se utiliza. Las moléculas de ADN del mismo tamaño
generalmente forman una banda estrecha, y el tamaño se puede determinar comparándolo con un conjunto de
estándares de peso molecular que se ejecutan en un pocillo diferente. Debido a que los estándares son de tamaño
conocido, el fragmento de ADN experimental se puede comparar directamente. Cuando las muestras de ADN se
separan por tamaño a través de un gel de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN de aproximadamente 200
pares de bases a 10,000 pares de bases. Para fragmentos de ADN de 50 a 1000 pares de bases, se utilizan geles de
poliacrilamida en su lugar. Estos geles pueden resolver fragmentos de ADN que varían en un solo par de bases y son
esenciales para la secuenciación de ADN con el método de Sanger (consulte el Capítulo 4). Para fragmentos de ADN
muy grandes (10 kilobases a 10 megabases), se usa agarosa, pero la corriente se alterna en dos ángulos diferentes.
Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), ya que es
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Tecnologia de ADN recombinante

llamado, permite que fragmentos muy grandes de ADN migren más que si la corriente fluye en una sola dirección.
Cada cambio de dirección afloja grandes fragmentos de ADN que están atrapados dentro de la matriz del gel, lo que
les permite seguir migrando. Finalmente, la electroforesis en gel de gradiente se puede usar para resolver fragmentos
que tienen un tamaño muy similar. Un gradiente de concentración de acrilamida, tampón o electrolito puede reducir la
compresión (es decir, el amontonamiento de fragmentos de tamaño similar) debido a la estructura secundaria y/o
ralentizar los fragmentos más pequeños en el extremo inferior del gel.

Los fragmentos de ADN se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. Una corriente hace que los fragmentos de
ADN se alejen del electrodo negativo y se acerquen al positivo. A medida que el ADN viaja a través de la agarosa, los
fragmentos más grandes se atascan en los poros del gel más que los fragmentos de ADN más pequeños.
La electroforesis en gel de campo pulsado separa grandes piezas de ADN alternando la corriente eléctrica en
ángulo recto.

LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN EL ADN; LA LIGASA SE UNE AL ADN

La capacidad de aislar, separar y visualizar fragmentos de ADN sería inútil a menos que se dispusiera de algún
método para cortar el ADN en fragmentos de diferentes tamaños. Afortunadamente, las enzimas de restricción
naturales o las endonucleasas de restricción son la clave para producir fragmentos de ADN. Estas enzimas
bacterianas se unen a sitios de reconocimiento específicos en el ADN y cortan la columna vertebral de ambas
hebras. Evolucionaron para proteger a las bacterias del ADN extraño, como los virus. Las enzimas no cortan el ADN
de sus propias células porque son sensibles a la metilación; es decir, si una de las bases de nucleótidos en la
secuencia de reconocimiento está metilada, entonces la enzima de restricción no puede unirse y, por lo tanto, no
puede cortar el ADN metilado. Las bacterias producen enzimas de modificación que reconocen la misma secuencia
que la enzima de restricción correspondiente. Estos metilan cada sitio de
reconocimiento en el genoma bacteriano.
66 5 - GTTAAC-3 5 - GOATTC -3
3 - CAATTG -5 3 - CTTAAG-5
Por lo tanto, las bacterias pueden producir la enzima de restricción sin
poner en peligro su propio ADN.
CORTE POR Hpa1 CORTE POR EcoR1
Las enzimas de restricción se han aprovechado para cortar el ADN
en sitios específicos, ya que cada enzima de restricción tiene una
secuencia de reconocimiento particular. Las diferencias en el sitio de
5 - GTT CAA-3 AATTC -3
escisión determinan el tipo de enzima de restricción. Las enzimas de
3 - AAC TTG-5 5 - sol G-5
restricción de tipo I cortan la cadena de ADN 1000 o más pares de bases
3 - CTAA
de la secuencia de reconocimiento. Las enzimas de restricción de tipo II

EXTREMOS ROMOS EXTREMOS PEGAJOSOS

cortan en el medio de la secuencia de reconocimiento y son las más útiles
para la ingeniería genética. Las enzimas de restricción de tipo II pueden
FIGURA 3.2 cortar ambas hebras de la doble hélice en el mismo punto, dejando extremos romos, o pueden cortar en diferentes
Enzimas de restricción de sitios de cada hebra dejando extremos monocatenarios, a veces llamados extremos pegajosos (Fig. 3.2). Las
tipo II: extremos romos frente a
secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción de tipo II suelen ser repeticiones invertidas, de modo que
extremos adhesivos
la enzima corta entre las mismas bases en ambas cadenas. Algunas enzimas de restricción comúnmente utilizadas
Hpal es una enzima de restricción
para aplicaciones biotecnológicas se enumeran en la Tabla 3.1. Dado que las enzimas de restricción reconocen una
de extremos romos; es decir, corta
ambas hebras de ADN secuencia nucleica específica, también se pueden usar para comparar la secuencia de nucleótidos de diferentes
exactamente en la misma posición. organismos o individuos (ver Cuadro 3.1).
EcoRI es una enzima de restricción
El número de pares de bases en la secuencia de reconocimiento determina la probabilidad de corte.
de extremo pegajoso. La enzima
corta entre la G y la A en ambas Encontrar una secuencia particular de cuatro nucleótidos es mucho más probable que encontrar una secuencia de
hebras, lo que genera cuatro pares reconocimiento de seis pares de bases. Entonces, para generar menos fragmentos más largos, se usan enzimas de
de bases sobresalientes en los restricción con seis o más secuencias de reconocimiento de pares de bases. Por el contrario, las enzimas de cuatro
extremos del ADN. Dado que estos pares de bases producen más fragmentos más cortos del mismo segmento original de ADN.
extremos pueden formar pares de

bases con secuencias Cuando se cortan dos muestras de ADN diferentes con la misma enzima de restricción de extremos cohesivos,
complementarias, se consideran todos los fragmentos tendrán salientes idénticos. Esto permite unir fragmentos de ADN de dos fuentes (p. ej., dos
"pegajosos". organismos diferentes) (fig. 3.3). Los fragmentos se unen o ligan usando ADN ligasa, la misma enzima que liga los
fragmentos de Okazaki durante la replicación (consulte el Capítulo 4).
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Capítulo 3

Tabla 3.1 Tabla de enzimas de restricción comunes

Enzima Organismo fuente Secuencia de reconocimiento

HpaII Haemophilus parainfluenzae C/CGG

GGC/C

MBOI Moraxella bovis /GATC

AGTC/

NdeII Neisseria denitrificans /GATC

AGTC/

EcoRI Escherichia coli RY13 G/AATTC

CTAA / G

EcoRII Escherichia coli RY13 /CCWGG

GGWCCC /

EcoRV Escherichia coli J62/pGL74 GAT/ATC

CTA / ETIQUETA

BamHI Bacilo amyloliquefaciens G/GATCC

CCTAG/G

saI estafilococo aureus CC/TNAGG

GRANDE/CC

BglI Bacilo globigii GCCNNNN / NGGC

CGGN/NNNNCCG

notas Nocardia otitidis-caviarum GC/GGCCGC

CGCCGG/CG

Dra II Deinococcus radiophilus RG/GNCCY 67

YCCNG / GR

/, posición donde se corta la enzima.

N, cualquier base; R, cualquier purina; Y, cualquier pirimidina; W, A o T.

La ligasa más común utilizada es en realidad del bacteriófago T4. La ligasa cataliza el enlace entre el
3ÿ-OH de una cadena y el 5ÿ-PO4 de la otra cadena de ADN. La ligasa es mucho más eficiente con los
extremos pegajosos que sobresalen, pero también puede unir los extremos romos mucho más lentamente.

Las enzimas de restricción son enzimas naturales que reconocen una secuencia de ADN particular y cortan el esqueleto de fosfato.

Cuando dos fragmentos de ADN son cortados por la misma enzima de restricción, los dos extremos tienen una apariencia compatible.
cuelga que puede ser reconectado por ligasa.

Recuadro 3.1 Los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción identifican a los individuos

Las enzimas de restricción son útiles para muchas aplicaciones diferentes. Esta técnica se puede aplicar al ADN de dos individuos de la misma especie. Aunque las
Debido a que la secuencia de ADN es diferente en cada organismo, el patrón de los sitios diferencias en la secuencia de ADN serán pequeñas, se pueden usar enzimas de restricción
de restricción también será diferente. La fuente de aislamiento para identificar estas diferencias. Si la diferencia de secuencia cae en un sitio de
El ADN puede ser identificado por este patrón. Si el ADN genómico se aísla de un reconocimiento de enzimas de restricción, da un polimorfismo de longitud de fragmentos
organismo y se corta con una enzima de restricción particular, se puede separar e identificar de restricción (RFLP) (Fig. A).
un conjunto específico de fragmentos mediante electroforesis. Si la misma enzima de Cuando se comparan los patrones de las enzimas de restricción, el número y el tamaño de
restricción corta el ADN de un organismo diferente, se generará un conjunto diferente de uno o dos fragmentos se verán afectados por cada diferencia de base que afecte a un sitio
fragmentos. de corte.

(Continuado)
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Tecnologia de ADN recombinante

Recuadro 3.1 Los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción identifican a los individuos—continuación

Cortar sitio Cortar sitio Cortar sitio Cortar sitio Cortar sitio

I a I B yl C iii D IV Y v F

CORTE CON ENZIMA

a D
Dos
relacionado
B Y
GOTA
moléculas
C F

Sitio de corte mutado

yl a I B yl C iii D IV Y v F

CORTE CON ENZIMA

a Y
68

B F

c+d

GELES CORRER

I yl

CD
D falta d
a a

F F

B B

Y Y
C falta c

FIGURA A Análisis RFLP

El ADN de organismos relacionados muestra pequeñas diferencias en la secuencia que provocan cambios en los sitios de restricción. En el ejemplo que se muestra, al cortar un segmento
de ADN del primer organismo se obtienen seis fragmentos de diferentes tamaños (etiquetados como a–f en el gel). Si la región equivalente de ADN de un organismo relacionado fuera
digerida con la misma enzima, se esperaría un patrón similar. Aquí, está presente una diferencia de un solo nucleótido, que elimina uno de los sitios de restricción. En consecuencia, la
digestión de este ADN produce solo cinco fragmentos. Los fragmentos c y d ya no se ven, sino que forman una nueva banda etiquetada como cd.
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Capítulo 3

5 GGATCC 3 5 AGACTO 3
3 CCTAGG 5 3 TCTAGA 5

bam hola DIGERIR BGL II

PAGS

OH
5 GRAMO
3 5 GATTC 3

3 CCTAG 5 3 A 5

PAGS OH

RECOCER

OH PAGS

5 AGTC T
GRAMO
3

3 CCTAG A 5

PAGS

OH

LIGASA

OH PAGS

5 AGTC T
GRAMO
3

3 CCTAG A 5

PAGS

OH
atp
69
ADP+Pi

5 AGTC T
GRAMO
3

3 CCTAG A 5

PAGS

OH
ADP+Pi

atp

5 AGTC T
GRAMO
3

3 CCTAG A 5

UNA PIEZA

FIGURA 3.3 Los salientes compatibles se unen mediante ADN ligasa

BamHI y Bgl Il generan los mismos extremos salientes o pegajosos: un saliente 3'-CTAG-5' más un saliente 5'-GATC-3'. Estos son
complementarios y pares de bases por enlaces de hidrógeno. Las rupturas en los esqueletos del ADN están selladas por la ligasa de ADN
T4, que hidroliza el ATP para activar la reacción.

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Las metodologías de ADN recombinante requieren la capacidad de detectar ADN. Una de las formas más
fáciles de detectar la cantidad de ADN o ARN en solución es medir la absorbancia de la luz ultravioleta a
260 nm (Fig. 3.4). El ADN absorbe la luz ultravioleta debido a las estructuras de anillo en las bases. El
ARN monocatenario y los nucleótidos libres también absorben la luz ultravioleta. De hecho, ellos
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Tecnologia de ADN recombinante

FIGURA 3.4 Bases libres repartidas absorben más luz porque sus estructuras son
y absorber más más sueltas. Dado que la absorbancia de la
Determinación de la
concentración de ADN Nucleico luz UV depende de la cantidad de ADN y de la
Todos los ácidos nucleicos absorben UV ácido
estructura molecular, la relación entre la
luz a través de los anillos polímero
ultravioleta
absorbancia UV y la concentración es
aromáticos de las bases. Los fuente
nucleótidos apilados (a la izquierda)
absorben menos UV que las bases Concentración de ADN de doble cadena (ÿg/
dispersas (a la derecha) debido a
ml) = (DO260) × (50 ÿg de ADN/ml)/
la estructura ordenada.
(1 unidad OD260 )
Concentración de ARN (ÿg/ml) = (OD260) × (40
ÿg de ARN/ml)/(1 unidad OD260 )

Además de la cantidad de ADN, se suele utilizar una segunda lectura de absorbancia a 280 nm para determinar
la pureza de la muestra. La relación del valor de absorbancia de 260 nm dividido por el valor de absorbancia de
280 nm indicará si la muestra es pura. Si la muestra es ADN puro, entonces la relación 260/280 es 1,8; mientras
que una proporción de 260/280 para el ARN puro es de 2,0. Cuando las proporciones se desvían del valor
esperado, podría haber fenol residual de la purificación o una concentración muy baja de ADN o ARN.

La concentración de ADN o ARN en un líquido se puede determinar midiendo la absorbancia de la luz ultravioleta
a 260 nm.

Marcaje radiactivo de ácidos nucleicos y autorradiografía

La absorción de luz ultravioleta es un método general para detectar ADN pero no distingue entre diferentes
70
moléculas de ADN. El ADN también se puede detectar con isótopos radiactivos (fig. 3.5). Durante la replicación
se pueden incorporar precursores radiactivos como el 32P en forma de grupo fosfato y el 35S en forma de
fosforotioato .
Debido a que el ADN nativo no contiene átomos de azufre, uno de los átomos de oxígeno de un grupo fosfato
se reemplaza con azufre para producir fosforotioato. La mayoría de las moléculas radiactivas utilizadas en los
laboratorios tienen una vida corta. 32P tiene una vida media de 14 días y 35S tiene una vida media de 68 días, por
lo que los isótopos se degradan bastante rápido. Aunque el ADN radiactivo es invisible, la película fotográfica se
volverá negra cuando se exponga al ADN radiactivo. El ADN marcado radiactivamente se considera "caliente",
mientras que el ADN no marcado se considera "frío".

La autorradiografía identifica la ubicación del ADN marcado radiactivamente en el gel (fig. 3.6).
Si el gel es delgado, como la mayoría de los geles de poliacrilamida, se seca con calor y vacío. Si el gel es
espeso, como los geles de agarosa, el ADN se transfiere a una membrana de nailon por acción capilar (ver Fig.
3.9, más adelante). El gel seco o la membrana de nailon se coloca junto a la película fotográfica. A medida que
el fosfato radiactivo se desintegra, la radiación vuelve negra la película fotográfica. Solo las áreas próximas al
ADN radiactivo tendrán manchas o bandas negras. El uso de película detecta dónde está el ADN caliente en un
gel, y el uso de bromuro de etidio muestra dónde está todo el ADN, caliente o frío. Estos dos métodos permiten
distinguir un fragmento de ADN de otro.

Los isótopos radiactivos se incorporan a la columna vertebral del ADN durante la replicación. La autorradiografía identifica el ADN “caliente”
marcado radiactivamente.

Detección de fluorescencia de ácidos nucleicos

La autorradiografía tiene sus méritos, pero trabajar con desechos radiactivos y eliminarlos es costoso, tanto
económica como ambientalmente. El uso de nucleótidos marcados con fluorescencia fue
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Capítulo 3

5 el EL 5 EL 35S

32P PAGS

Base Base
-O EL EL -O OO

OH OH

EL 35S

32P PAGS

Base Base
-O OO -O OO

OH OH
3 3

ADN MARCADO CON 32P ADN MARCADO CON 35S

FIGURA 3.5 ADN marcado radiactivamente

El ADN se puede sintetizar con nucleótidos precursores radiactivos. Estos nucleótidos tienen 32P (en lugar de fósforo 31P no
radiactivo) o 35S (que reemplaza al oxígeno) en el esqueleto de fosfato.

LA GENTE AUTORADIOGRAFÍA

La gente Película

71

Película

La gente

Gel con radiactivo Coloque la película sobre el gel y manténgalo Posición de los programas de cine
pero bandas invisibles oscuro, luego revelar la película de bandas
de ADN

FIGURA 3.6 Autorradiografía

Se seca un gel que contiene ADN (o ARN) radiactivo y se coloca encima un trozo de película fotográfica. Los dos están cargados en una caja de cassette que evita que
entre la luz. Después de algún tiempo (horas o días), la película se revela y aparecen líneas oscuras donde estaba presente el ADN radiactivo.

desarrollado como un mejor método de detección de ADN (Fig. 3.7). Las etiquetas fluorescentes absorben
luz de una longitud de onda, lo que excita los átomos y aumenta el estado de energía de la etiqueta. Este
estado excitado libera un fotón de luz a una longitud de onda diferente (más larga) y vuelve al estado
fundamental. El fotón emitido se detecta con un fotodetector. Hay muchas etiquetas fluorescentes
diferentes, y cada una emite una longitud de onda de luz diferente. Algunos sistemas de fotodetectores son
lo suficientemente sensibles para distinguir entre estas diferentes etiquetas; por lo tanto, si diferentes bases
tienen diferentes etiquetas fluorescentes, el fotodetector puede determinar qué base está presente. Esta es
la base de la mayoría de las modernas máquinas de secuenciación de ADN (ver Capítulo 4).
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Tecnologia de ADN recombinante

Los nucleótidos marcados con fluorescencia se pueden utilizar para incorporar una etiqueta fluorescente en el ADN durante la replicación o la

amplificación por PCR.

NIVELES DE ENERGÍA EN FLUORESCENCIA

MARCADO FLUORESCENTE DE ADN

S1 estado excitado

2 estado excitado
S1
Etiqueta fluorescente
Relajación

Excitante Fluorescencia

Haz de luz
1 Excitación Fluorescencia
3
(longitud (longitud
de onda más corta de onda más larga
fotón) fotón)

A GOTA B S0 Estado fundamental

FIGURA 3.7 Marcaje fluorescente de ADN

(A) Marcado fluorescente de ADN. Durante la síntesis, se incorpora un nucleótido unido a una etiqueta fluorescente en el extremo 3' del ADN. Un haz de luz excita la
etiqueta fluorescente, que a su vez libera luz de una longitud de onda más larga. (B) Niveles de energía en fluorescencia. La molécula fluorescente unida al ADN tiene
tres niveles de energía diferentes: S0, S1' y S1. El S0, o estado fundamental, es el estado antes de la exposición a la luz. Cuando la molécula fluorescente se expone a
un fotón de luz, la etiqueta fluorescente absorbe la energía y entra en el primer estado excitado, S1'. Entre S1ÿ y S1, la etiqueta fluorescente se relaja un poco pero no
emite ninguna luz. Eventualmente, el estado de alta energía libera su exceso de energía emitiendo un fotón de mayor longitud de onda. Esta liberación de fluorescencia
devuelve la molécula al estado fundamental.
72

Marcado químico con biotina o digoxigenina

La biotina es una vitamina y la digoxigenina es un esteroide de la planta dedalera. El uso de estas
dos moléculas permite a los científicos marcar el ADN sin radiactividad ni fotodetectores costosos. Para
incorporar la etiqueta en el ADN, una molécula de biotina o digoxigenina se une químicamente al uracilo;
por lo tanto, el ADN se sintetiza con el uracilo marcado en sustitución de la timina utilizando in vitro
La replicación del ADN como se describe en el Capítulo 4. La plantilla de ADN monocatenario, la ADN
polimerasa, un cebador de ADN corto y los nucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, más dUTP unido a biotina o
digoxigenina) se mezclan en un tubo y se incuban. La ADN polimerasa sintetiza la hebra complementaria a
la plantilla, incorporando uracilo unido a biotina o digoxigenina frente a todas las adeninas.

El ADN marcado se visualiza en un proceso de dos pasos (Fig. 3.8). Para visualizar la biotina, se
agrega a la muestra de ADN una molécula de avidina o estreptavidina, que tienen una gran afinidad
por la biotina. La avidina, originalmente identificada en la clara de huevo, tiene una mayor tendencia a
la agregación y está glicosilada; por lo tanto, la estreptavidina se usa con más frecuencia. La
estreptavidina se aísla de Streptomyces avidinii y no está glicosilada. Por el contrario, se utiliza un
anticuerpo específico para visualizar la digoxigenina. Tanto la avidina como el anticuerpo contra la
digoxigenina se conjugan con un fluoróforo o una enzima indicadora, lo que permite una detección visible.
Un ejemplo de una enzima informadora es la fosfatasa alcalina, una enzima que elimina los fosfatos de
una variedad de sustratos. Varias moléculas cromogénicas diferentes actúan como sustratos para la
fosfatasa alcalina, pero la más utilizada es X-Phos. Una vez que la fosfatasa alcalina elimina el grupo
fosfato de X-Phos, la molécula intermedia reacciona con el oxígeno y forma un precipitado azul. Este color
azul revela la ubicación del ADN marcado. Otro sustrato de la fosfatasa alcalina es Lumi-Phos, que es
quimioluminiscente y emite luz visible cuando se elimina el fosfato. Al igual que la autorradiografía, cuando
se coloca una película fotográfica sobre
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Capítulo 3

FIGURA 3.8 Marcaje y

GOTA GOTA
detección de ADN con biotina
o digoxigenina
biotina Digoxigenina

estreptavidina El ADN se puede sintetizar in

anticuerpo contra vitro con un nucleótido de uracilo
fluoróforo digoxigenina unido a biotina o digoxigenina. La

estreptavidina se une fuertemente a

Ligero
Ligero la avidina (paneles de la izquierda)

y el anticuerpo contra la digoxigenina

se une a la digoxigenina (paneles

de la derecha).

La estreptavidina y el anticuerpo
contra la digoxigenina se
biotina Digoxigenina
pueden conjugar con un fluoróforo
estreptavidina que emite luz de longitudes de
anticuerpo contra
onda específicas (paneles
digoxigenina
Enzima reportera superiores) o con enzimas
Enzima reportera indicadoras como la peroxidasa
de rábano picante o la fosfatasa
Sustrato luz o color alcalina (paneles inferiores). Las
Sustrato Luz o color o precipitado enzimas reporteras actúan sobre
diferentes sustratos, algunos de

ADN marcado tratado con Lumi-Phos, la luz emitida hace que la película se oscurezca. Otra posible enzima los cuales liberan luz y otros
forman un precipitado coloreado.
informadora es la peroxidasa de rábano picante o HRP, una enzima que reacciona con el luminol para liberar
luz. Como antes, la luz se puede detectar con película fotográfica.

El ADN marcado con biotina y digoxigenina se detecta utilizando estreptavidina o anticuerpos contra la digoxigenina.

Cualquier marcador puede conjugarse con fosfatasa alcalina, que reacciona con X-Phos para dejar un precipitado azul o con Lumi-Phos para
73
emitir luz visible. Otra enzima indicadora comúnmente utilizada es la peroxidasa de rábano picante. Estas enzimas indicadoras se utilizan para

identificar, cuantificar o localizar el ADN marcado.

LAS HILAS COMPLEMENTARIAS SE FUNDEN SEPARAN Y SE RENECEN

Las hebras antiparalelas complementarias de ADN forman una molécula elegante que puede descomprimirse o
fundirse y volver a juntarse o reasociarse (fig. 3.9). Los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos mitades
son relativamente débiles. Calentar una muestra de ADN disolverá los enlaces de hidrógeno, dando como resultado
dos hebras simples complementarias.
C GRAMO C GRAMO C GRAMO C GRAMO

Si la misma muestra de ADN se enfría lentamente, las dos

A T A T A T
hebras se reasociarán de modo que G coincida con C y A A A
T A T T T A T A
FRIO
coincida con T, como antes. A T CALOR A A CALOR A T A T
T T DESPACIO
T A T A T A
La proporción de pares de bases G/C afecta la cantidad GRAMO C GRAMO C GRAMO C GRAMO C
C C C C
de calor que se requiere para fundir una doble hélice de
GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO

GRAMO C GRAMO C GRAMO C GRAMO C

ADN. Los pares de bases G/C tienen tres enlaces de
hidrógeno para fundirse, mientras que los pares de bases A/ FIGURA 3.9 Calor
T tienen solo dos. En consecuencia, el ADN con un mayor porcentaje de GC requerirá más energía para fundirse derrite el ADN; Enfriamiento
Rehibre el ADN
que el ADN con menos pares de bases de GC. La relación GC se define de la siguiente manera:
Los puentes de hidrógeno

se disuelven fácilmente cuando

G+C
× 100 % se calientan, dejando las dos
A+G+C+T hebras intactas pero separadas.

Cuando la temperatura vuelve a la

La capacidad de comprimir y descomprimir el ADN es crucial para la función celular y también se ha explotado en
normalidad, los enlaces de hidrógeno
biotecnología. La replicación (ver Capítulo 4) y la transcripción (ver Capítulo 2) dependen de la separación de
se forman de nuevo.
cadenas para generar nuevas cadenas de ADN o ARN, respectivamente. En la investigación de biología molecular,
muchas técnicas, desde PCR hasta secuenciación de ADN, aprovechan la naturaleza complementaria de las hebras
de ADN.
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Tecnologia de ADN recombinante

Las hebras complementarias de ADN se separan fácilmente con calor y se reasocian espontáneamente como el ADN.
la mezcla se enfría.

HIBRIDACIÓN DE ADN O ARN EN SUR Y NORTE

BLOQUES
Si se funden dos hélices dobles diferentes de ADN, las hebras simples se pueden mezclar antes de enfriarlas y
reasociarlas. Si las dos moléculas de ADN originales tienen secuencias similares, una sola hebra de una puede
emparejarse con la hebra opuesta de la otra molécula de ADN. Esto se conoce como hibridación y se puede utilizar
para determinar si las secuencias de dos muestras separadas de ADN o ARN están relacionadas. En los
experimentos de hibridación, el término molécula sonda
se refiere a una secuencia o gen de ADN conocido que se utiliza para examinar la muestra experimental o el
ADN diana en busca de secuencias similares.

Las transferencias de Southern se utilizan para determinar qué tan estrechamente se relaciona el ADN de
una fuente con una secuencia de ADN de otra fuente. La técnica consiste en formar moléculas de ADN híbridas
FIGURA 3.10 La mezclando el ADN de las dos fuentes. Una transferencia Southern tiene dos componentes: la secuencia de la
acción capilar transfiere sonda (p. ej., un gen de interés conocido de un organismo) y el ADN objetivo (a menudo de un organismo
el ADN del gel a la diferente). Una transferencia Southern típica comienza aislando el ADN objetivo de un organismo, digiriéndolo
membrana
con una enzima de restricción que produce fragmentos de aproximadamente 500 a 10 000 pares de bases de
El ADN monocatenario de un
longitud y separando estos fragmentos mediante electroforesis.
gel se transferirá a la membrana.
Los fragmentos separados serán de doble cadena, pero si el gel se incuba en un ácido fuerte, el ADN se separa
El papel de filtro absorbe el
tampón del tanque, a través del
en cadenas sencillas. Usando la acción capilar, las hebras simples se pueden transferir a una membrana como
gel y la membrana, y hacia las se muestra en la Fig. 3.10. El ADN permanece monocatenario una vez unido a la membrana.
toallas de papel. A medida que
se mueve el líquido tampón, el
74 A continuación, se prepara la sonda. Primero, la secuencia o gen conocido debe aislarse y etiquetarse de
ADN monocatenario también
viaja desde el gel y se adhiere a alguna manera (ver discusión anterior). La identificación de genes se ha vuelto más fácil ahora que muchos
la membrana. El peso en la parte genomas se han secuenciado por completo. Por ejemplo, un científico puede obtener fácilmente una copia
superior de la configuración de un gen humano para usarlo como sonda para encontrar genes similares en otros organismos.
mantiene la membrana y el gel Alternativamente, utilizando datos de secuencia, se puede diseñar una sonda de oligonucleótidos única que
en contacto y ayuda a absorber
reconozca solo el gen de interés (consulte el Capítulo 4). Si un oligonucleótido tiene una secuencia común, se
el líquido del tanque.
unirá a muchas otras secuencias. Por lo
Peso para presionar
tanto, las sondas de oligonucleótidos
ven diez
deben ser lo suficientemente largas para
Pila de toallas de papel
tener secuencias que se unan a solo uno
(o muy pocos) sitios específicos en el
Membrana genoma objetivo. Para preparar sondas
de ADN para una transferencia de
La gente
Southern, se marcan con radioactividad,
bioestaño o digoxigenina (consulte la
discusión anterior). Finalmente, el ADN
marcado se desnaturaliza a alta
temperatura para hacerlo monocatenario.

Papel de filtro (Los oligonucleótidos sintéticos no

requieren tratamiento, ya que son
monocatenarios).

Para realizar una transferencia Southern, la sonda monocatenaria se incuba con la membrana que lleva
el ADN diana monocatenario (fig. 3.11). Estos se incuban a una temperatura que permite que se formen hebras
de ADN híbrido con solo una pequeña cantidad de desajustes. La temperatura y, por lo tanto, el nivel de
desajuste tolerado, se puede variar dependiendo de cuán idénticas se espera que sean la sonda y la secuencia
objetivo. A una temperatura alta, la sonda solo
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Capítulo 3

CARGAR Y NYLON DEL SUR FOTOGRÁFICO FIGURA 3.11 Moléculas de ADN

GEL PARA CORRER HOJA MANCHA PELÍCULA híbrido
Cargando Puede detectar relacionados
tragamonedas

Secuencias en
Manchas del sur
TRANSFERIR INMERSIÓN EN LUGAR
La transferencia Southern
INVESTIGACION PELÍCULA

SOLUCIÓN ENCIMA requiere que el ADN objetivo se

Invisible
MANCHA corte en fragmentos más pequeños
bandas
y se ejecute en un gel de agarosa.

Los fragmentos se desnaturalizan

químicamente para dar hebras

permanecer unido a lugares con secuencias casi idénticas; mientras que a baja temperatura, la sonda se
simples y luego se transfieren a una
unirá a lugares con múltiples nucleótidos que no coinciden. Si la sonda es radiactiva, la membrana se expone membrana de nailon. un radiactivo
a una película fotográfica. Si la sonda está marcada con biotina o digoxigenina, la membrana puede tratarse la sonda (también monocatenaria)
con un sustrato quimioluminiscente para detectar la sonda marcada y el híbrido de ADN diana, y luego se incuba con la mem

exponerse a una película fotográfica. Las bandas oscuras en la película revelan las posiciones de los brana a una temperatura que

fragmentos con una secuencia similar a la de la sonda. Alternativamente, los marcadores de biotina o permite la formación de híbridos

digoxigenina pueden visualizarse mediante tratamiento con un sustrato cromogénico. En este caso, se (con algunos desajustes). Cuando

se coloca una película fotográfica

formarán bandas azules directamente en la membrana en la posición de las secuencias relacionadas.
sobre la parte superior de la
membrana, la ubicación de la radiación

Las transferencias Northern también se basan en la hibridación de ácidos nucleicos. La diferencia es que Se revelan moléculas híbridas.

el ARN es el objetivo en una transferencia Northern. La sonda para una transferencia Northern es un
fragmento de un gen o un oligonucleótido único, como en una transferencia Southern. El ARN diana suele
ser ARN mensajero. En eucariotas, la detección de ARNm es más eficiente porque el ADN genómico tiene
muchos intrones, lo que puede interferir con la unión de las sondas a la secuencia correcta. Además, el
ARNm ya es monocatenario, por lo que no es necesario tratar el gel de agarosa con un ácido fuerte. Al igual
que una transferencia Southern, las transferencias Northern comienzan separando el ARNm por tamaño mediante electroforesis.
El ARNm se transfiere a una membrana
de nailon y se incuba con una sonda DOT ssDNA O ARNm 75

marcada monocatenaria. Como antes, la PUNTO FOTOGRÁFICO

MANCHA PELÍCULA
sonda se puede marcar con biotina,
1 1
digoxigenina o radioactividad. La membrana
se procesa y se expone a una película o 2 2
muestras
{ Diferente
sustrato cromogénico. INMERSIÓN EN 3 EXPONER 3
en cada
INVESTIGACION A
hilera 4 4
Una variación de estas técnicas de SOLUCIÓN PELÍCULA

5 5
hibridación es el dot blot
(Figura 3.12). Aquí, la muestra objetivo no
está separada por tamaño. El objetivo de punto diferente

ADN o ARNm simplemente se une a la concentraciones de muestra

membrana de nailon como un pequeño punto. FIGURA 3.12 Punto

Al igual que en las transferencias de Southern, la muestra de ADN debe ser monocatenaria antes Mancha

de unirse a la membrana. Como antes, se permite que la membrana de transferencia puntual hibride con Las transferencias de puntos

una sonda marcada. Las membranas se procesan y se exponen a la película. Si el punto de ADN o ARNm comienzan colocando muestras de

ADN o ARN en una membrana de

contiene una secuencia similar a la sonda, la película se volverá negra en esa área. Las transferencias de
nailon. A menudo, diferentes concentraciones de
puntos son una forma rápida y fácil de determinar si la muestra de destino tiene una secuencia relacionada,
la muestra están punteadas una al
antes de un análisis más detallado mediante transferencias Southern o Northern.
lado de la otra. La membrana se
Otra ventaja de las transferencias de puntos es que se pueden procesar múltiples muestras en una menor incuba con un radiactivo

cantidad de espacio. sonda y luego se exponen a una

película fotográfica. Muestras que

contienen ADN o ARN

complementaria a la sonda dejará

Las transferencias de Southern forman moléculas de ADN híbridas para determinar si una muestra de ADN tiene una secuencia homóloga a otra
una mancha negra en la película.
sonda de ADN.

Las transferencias Northern determinan si una muestra de ARNm tiene una secuencia homóloga a una sonda de ADN. En grande

genomas, usar ARNm es más eficiente porque se eliminan todos los intrones.
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FLUORESCENCIA EN SITUAR HIBRIDACIÓN (PECES)

Las técnicas de hibridación discutidas anteriormente se basan en ADN o ARN purificado en un gel de
agarosa. En la hibridación fluorescente in situ (FISH), la sonda se hibrida directamente con el ADN o el
ARN dentro de la célula (fig. 3.13). Como se describió anteriormente, la sonda es un pequeño segmento
de ADN que ha sido marcado con marcadores fluorescentes para poder visualizarse. El ADN o ARN
objetivo se encuentra dentro de la célula y requiere un procesamiento especial. Las células objetivo
pueden ser secciones extremadamente delgadas de tejido de un organismo en particular. Por ejemplo,
cuando a una persona se le realiza una biopsia, se extrae un pequeño trozo de tejido para su análisis.
Este tejido se conserva y luego se corta en secciones extremadamente delgadas para analizarlas bajo un
microscopio. Estos pueden usarse para determinar la presencia de un gen con FISH. Otra fuente de
células diana para FISH son las células de mamífero o de insecto cultivadas (consulte el Capítulo 1).
Además, la sangre se puede aislar y procesar para aislar los glóbulos blancos. (Nota: los glóbulos rojos
no contienen núcleo y, por lo tanto, no contienen ADN). Los cromosomas de los glóbulos blancos se pueden aislar

Sonda de ADN fluorescente

Padre Mamá Niño (17p13.1 Del)

DESNATURALIZAR
Y
HIBRIDIZAR

Niño (17p13.1 Del)

76
A

sonda de ADN
Etiqueta fluorescente

DESNATURALIZAR, VISTA POR

MEZCLA, FLUORESCENCIA canal17: 7.515.000 7.520.000 7.525.000 7.530.000
Y MICROSCOPIO Deleciones asociadas con retraso en el desarrollo
CELDA RECOCER CELDA

B
TP53
Exón: 11 9 763 1

Deleciones asociadas con el cáncer de aparición temprana

C 5kb

FIGURA 3.13 Ubicación del gen en los cromosomas por FISH

(A) FISH puede localizar un gen en un lugar específico en un cromosoma. Primero, los cromosomas en metafase se aíslan y se unen a un portaobjetos de microscopio. El ADN
en metafase se desnaturaliza en piezas monocatenarias que permanecen adheridas al portaobjetos. La sonda de ADN marcada con fluorescencia se hibrida con el gen
correspondiente. Cuando se ilumina el portaobjetos, las moléculas híbridas emiten fluorescencia y revelan la ubicación del gen de interés. (B) Una célula con ADN intacto en su
núcleo se trata para desnaturalizar el ADN en cadenas sencillas. La sonda de ADN marcada con fluorescencia se agrega y se hibrida con la secuencia correspondiente dentro del
núcleo. La molécula híbrida emitirá fluorescencia cuando la etiqueta fluorescente se excite con la longitud de onda de luz correcta e identifique la ubicación del gen en el núcleo.
(C) Un análisis de cromo alguna estructura usando sondas TP53 (roja) y 17ptel (verde). El ADN humano normal tiene dos copias de la región de ADN complementaria a las sondas
TP53 y 17ptel. (Nota: los cromosomas en metafase tienen cuatro copias porque el ADN se ha replicado). Los padres tienen una estructura de ADN normal para estas dos
secuencias de sonda. En comparación, el niño tiene solo dos manchas rojas TP53 en un cromosoma y el otro cromosoma no tiene manchas rojas, lo que sugiere que esta región
de uno de los cromosomas del niño está eliminada. La deleción es visible tanto en los cromosomas en metafase (arriba) como en los núcleos en interfase (abajo). De Shlien et al. (2010).
Un mecanismo molecular común subyace a dos síndromes de microdeleciones 17p13.1 fenotípicamente distintos. Am J Hum Gen 87, 631–642.
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Capítulo 3

y se dejó caer sobre un portaobjetos de vidrio. FISH se puede hacer en interfase o metafase chro
mosomas

Ya sea que el ADN objetivo sea de sangre, células cultivadas en placas o secciones de tejido reales, las células deben
calentarse para que el ADN sea monocatenario. Las muestras en las que el ARN es el objetivo no necesitan calentarse. La
sonda marcada con fluorescencia se hibrida con secuencias complementarias en el ADN o el ARN, y cuando las células se
iluminan con la longitud de onda adecuada, la ubicación de la sonda en el cromosoma puede identificarse mediante
fluorescencia.

FISH es una técnica en la que una sonda marcada se incuba con células cuyo ADN ha sido desnaturalizado
por calor. La sonda se hibrida con su secuencia homóloga en el cromosoma.

PROPIEDADES GENERALES DE LOS VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonación son plásmidos especializados (u otros elementos genéticos) que retendrán cualquier
fragmento de ADN extraño para su posterior estudio o manipulación. La cantidad y los tipos de plásmidos disponibles para la
clonación han aumentado. Además, ahora se utilizan otros elementos de ADN, incluidos virus y cromosomas artificiales. Una
vez que se ha clonado e insertado un fragmento de ADN en un vector adecuado, se pueden fabricar grandes cantidades de
ADN, se puede determinar la secuencia y cualquier gen del fragmento se puede expresar en otros organismos. Estudiar genes
humanos en humanos es virtualmente imposible debido a las ramificaciones éticas. Por el contrario, el estudio de un gen
humano expresado en bacterias proporciona información útil que a menudo se puede aplicar a los humanos. La biotecnología
moderna depende de la capacidad de expresar genes extraños en organismos modelo. Antes de discutir cómo se clona un
gen, se consideran las propiedades de los vectores.

Características útiles para la clonación de vectores 77

Aunque ahora existen muchos vectores especializados, las siguientes propiedades son convenientes y se encuentran en la
mayoría de los plásmidos de clonación generalizada modernos:

n Tamaño reducido, lo que facilita su manipulación una vez aislados

n Fácil de transferir de una celda a otra (generalmente por transformación)
n Fácil de aislar del organismo huésped
n Fácil de detectar y seleccionar
n Múltiples copias, lo que ayuda a obtener grandes cantidades de ADN
n Sitios de restricción agrupados (polienlace) para permitir la inserción de ADN clonado
n Método para detectar la presencia de ADN insertado (p. ej., complementación alfa)

La mayoría de los plásmidos bacterianos satisfacen los primeros tres requisitos. El siguiente rasgo clave de la clonación de
vectores es una manera fácil de detectar su presencia en el organismo huésped. Los plásmidos de clonación bacterianos a
menudo tienen genes de resistencia a los antibióticos que hacen que las bacterias sean resistentes a determinados antibióticos.
Cuando se trata con el antibiótico, solo sobrevivirán las bacterias con el gen de resistencia codificado por plásmido. Otras
bacterias morirán. Se han explotado otros rasgos para detectar plásmidos.
Los vectores derivados del plásmido 2ÿ de levadura a menudo portan genes para sintetizar aminoácidos esenciales, como la
leucina, que permiten que levaduras con mutaciones en la biosíntesis de leucina crezcan en medios que carecen de leucina.

Los plásmidos varían en su número de copias. Algunos plásmidos existen en solo una o unas pocas copias en sus células
huésped, mientras que otros existen en múltiples copias. Dichos plásmidos multicopia son en general más útiles ya que la
cantidad de ADN del plásmido es mayor, lo que los hace más fáciles de aislar y purificar. El tipo de origen de la replicación
controla el número de copias, ya que esta región del plásmido determina la frecuencia con la que la ADN polimerasa se une e
induce la replicación.

La mayoría de los vectores de clonación tienen varios sitios de enzimas de restricción únicos. Por lo general, estos sitios se
agrupan en una ubicación llamada sitio de clonación múltiple (MCS) o policonector (Fig. 3.14). Esto permite
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FIGURA 3.14 Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento investigadores para abrir el vector de
sitio para sitio para sitio para sitio para
Polylinker típico o clonación en un sitio sin alterar ninguno de
restricción restricción restricción restricción
sitio de clonación múltiple los genes de replicación del vector. Los
enzima 1 enzima 3 enzima 5 enzima 7
Los sitios de las enzimas de
fragmentos de ADN extraño se digieren con
restricción dentro de la región del
enzimas que coinciden con las del policonector.
policonector son únicos. Esto
asegura que el plásmido sea cortado
La ligasa conecta el vector y el inserto. Se
Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento
solo una vez por cada enzima de restricción. sitio para sitio para sitio para pueden agregar sitios de enzimas de restricción
restricción restricción restricción específicos utilizando cebadores de PCR u
enzima 2 enzima 4 enzima 6 oligómeros de ADN sintético (consulte el
Capítulo 4).

Algunos vectores tienen formas de detectar

si contienen o no una inserción. La forma
más sencilla de hacerlo es la inactivación
por inserción de un gen antibiótico (fig.

3.15A). Aquí, el vector tiene dos genes de

resistencia a los antibióticos diferentes. El ADN
extraño se inserta en uno de los genes
resistentes a los antibióticos. Por tanto, la
bacteria huésped será resistente a un antibiótico
y sensible al otro.

plásmido
Alternativamente, se puede usar la
complementación alfa (ver Fig. 3.15B).
El vector tiene una pequeña porción de la
gen de la ÿ-galactosidasa (el fragmento alfa), y el cromosoma bacteriano tiene el resto del gen.
Si ambos fragmentos de genes se transcriben y luego se traducen en proteínas, las proteínas parciales se combinan
78
para formar ÿ-galactosidasa funcional. Si el ADN se inserta en el segmento del gen transportado por el plásmido, la
subunidad codificada no se produce y no se produce ÿ-galactosidasa. Cuando se expresa la ÿ-galactosidasa, las bacterias
pueden degradar X-gal, lo que hace que la colonia bacteriana se vuelva azul. Si se inserta un trozo de ADN en el gen del
fragmento alfa, las bacterias no pueden dividir X-gal y permanecen blancas.

Una vez que se ha elegido un vector apropiado para el gen de interés u otro inserto, las dos piezas se ligan en una
sola construcción. El término construcción se refiere a cualquier molécula de ADN recombinante que se haya
ensamblado mediante ingeniería genética. Si tanto el vector como el inserto se cortan con la misma enzima de
restricción, las dos piezas tienen extremos complementarios y solo requieren ligasa para unirlas. Se utilizan trucos para
hacer compatibles dos fragmentos de ADN con extremos no relacionados. A veces, se sintetizan oligonucleótidos cortos
y se agregan a los extremos del inserto para hacerlos compatibles con el vector. Estos oligonucleótidos cortos se
denominan enlazadores y agregan uno o unos pocos sitios nuevos de enzimas de restricción a los extremos de un
segmento de ADN. Además de agregar conectores, los extremos de los fragmentos de ADN se pueden hacer
compatibles con un sitio de clonación múltiple del vector mediante amplificación por PCR. Los cebadores pueden tener
extensiones de secuencia de ADN que contengan el sitio de reconocimiento para una enzima de restricción. Después
de la amplificación por PCR, el ADN puede cortarse con la enzima de restricción y ligarse al vector (consulte el Capítulo
4 para obtener más información).

Los vectores de clonación tienen múltiples sitios de clonación con muchos sitios únicos de enzimas de restricción, tienen genes para la

resistencia a los antibióticos que hacen que la célula bacteriana pueda crecer con el antibiótico presente, y tienen una forma de detectar

cuando está presente una pieza extraña de ADN, como alfa complementación

TIPOS ESPECÍFICOS DE VECTORES DE CLONACIÓN

Debido a que E. coli es el principal organismo huésped utilizado para manipular el ADN, la mayoría de los vectores
se basan en plásmidos o virus que pueden sobrevivir en E. coli o bacterias similares. La mayoría de los vectores tienen
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Capítulo 3

INACTIVACIÓN INSERCIONAL FIGURA 3.15

Detección de inserciones en
Antibiótico plásmidos
gen de resistencia #1
(A) Inactivación por inserción.
Las células con un inserto se
LIGAR
vuelven sensibles al segundo
INSERTAR EN Vector
antibiótico. Las células sin inserto
Vector ANTIBIÓTICO
Más
RESISTENCIA siguen siendo resistentes al
insertar
GEN #2 antibiótico. (B) Complementación
alfa. La complementación alfa se
Cortar sitio refiere a la capacidad de la ÿ-
Antibiótico Insertar galactosidasa para expresarse
gen de resistencia #2 como dos fragmentos de proteína,
que se ensamblan para formar una
VECTOR PORTADOR DE CÉLULAS VECTOR PORTADOR DE CÉLULAS
proteína funcional.
SON RESISTENTES A CON INSERTO SON
En células sin un inserto en el
AMBOS ANTIBIÓTICOS RESISTENTE A LA PRIMERA
A SOLO ANTIBIÓTICO plásmido, la ÿ-galactosidasa está
activa y divide X-gal para formar un
colorante azul. En las células con
COMPLEMENTACIÓN ALFA un inserto, el fragmento alfa no se
produce y la ÿ-galactosidasa está

inactiva.
Estas células permanecen blancas

plásmido Cromosoma plásmido Cromosoma en medios con X-gal.

LaCCON Y Y
gramo
norte
LaCCON Y Y
gramo
norte

lacZÿ es
lacZÿ
separar
MCS

TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN 79

fragmento ÿ se combina con Ningún fragmento tan ÿ-gal

resto de la proteína LacZ está inactivo
para formar ÿ-galactósido activo

ÿ-gal metaboliza ÿ-gal no puede metabolizar

B
X-gal para formar tinte azul X-gal y bacterias permanecen blancas

orígenes bacterianos de replicación y genes de resistencia a antibióticos. El polienlazador o sitio de clonación

múltiple suele colocarse entre las secuencias del promotor y del terminador procariotas (fig. 3.16A). Algunos
vectores también pueden suministrar el sitio de unión al ribosoma, por lo que cualquier secuencia codificante
insertada se expresará como una proteína. Muchas otras características están presentes en los vectores de
clonación especializados. La siguiente discusión presentará algunas de las diferentes categorías de vectores con sus
características esenciales.

Muchos vectores de levadura se basan en el círculo de levadura de 2 ÿ. La versión nativa del círculo de 2 ÿ se ha
modificado de varias formas para su uso como vector de clonación. Un vector lanzadera contiene orígenes de
replicación para dos organismos más cualquier otra secuencia necesaria para sobrevivir en cualquiera de los organismos
(ver Fig. 3.16B). Los vectores lanzadera que se basan en el plásmido 2ÿ tienen los componentes necesarios para la
supervivencia en levaduras y bacterias, además de resistencia a los antibióticos y un policonector. La secuencia Cen es
una secuencia de centrómero eucariótico (Cen) que mantiene el plásmido en la ubicación correcta durante la mitosis y
la meiosis en la levadura. Debido a que las células de levadura son eucariotas y también tienen una célula tan gruesa
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Tecnologia de ADN recombinante

VECTOR BACTERIANO TÍPICO VECTOR DE TRANSPORTE DE LEVADURA

MCS Bacteriano Origen y origen de la levadura

Bacteriano terminador de replicación
genes de replicación
promotor para bacterias

Antibiótico leucina
LacZÿ
resistencia biosíntesis
gene
gene gen para
CLONACIÓN LANZADERA selección en
PLASMIDO VECTOR levadura

Origen de la replicación centrómero de levadura

gen para (bacteriano) Clonación múltiple
A Resistencia antibiótica
B sitio
secuencia

VECTOR DE REEMPLAZO DE LAMBDA

Integración y
recombinación

algo
a algo
0 10 20 30 40 48
aprox. aprox.

Cabeza y cola región no esencial Regulación y

C proteinas (puede ser reemplazado por ADN clonado) síntesis de ADN

COSMID CROMOSOMA ARTIFICIAL

inserto de ADN
AmpR
algo o algo
CS
METRO

CY
norte

50 KB

ENVASADO IN VITRO R
A
plásmido circular
A forma voluntad
porque termina
replicar en Levadura
80 bacterias
El seleccionable
Cola rI marcador
TYL TYL
Cabeza
forma lineal BamHI BamHI

INFECCIÓN COMPENDIO CON BamHI

PARA LINEAR

Bacteriano
de forma autónoma
cromosoma Bacteriano Múltiple
Circular replicando
origen de clonación
formulario secuencia
algo
replicación sitio
(origen levadura)

Tel ori Amp ARS cen MCS Teléfono

célula de E. coli
Telómero Centrómero Seleccionable
secuencia marcador
Seleccionable
para levadura
marcador
YAC lineal
para bacterias
forma voluntad
D Y
replicar en levadura

FIGURA 3.16 Varios vectores de clonación

(A) Vector de clonación bacteriano típico. Este vector tiene secuencias bacterianas para iniciar la replicación y la transcripción. Además, tiene un sitio de clonación múltiple incrustado dentro del gen

lacZ ÿ para que el inserto pueda identificarse mediante complementación alfa. El gen de resistencia a los antibióticos permite al investigador identificar cualquier célula de E. coli que tenga el plásmido.

(B) Vector lanzadera de levadura. Este vector puede sobrevivir en bacterias o levaduras porque tiene origen de replicación tanto en levaduras como en bacterias, un centrómero de levadura y marcadores

seleccionables para levaduras y bacterias. Como ocurre con la mayoría de los vectores de clonación, existe un policonector. (C) Vectores de sustitución lambda. Debido a que el fago lambda es fácil de

cultivar y manipular, su genoma se ha modificado para aceptar insertos de ADN extraños. La región del genoma que se muestra en verde no es esencial para el crecimiento y el empaquetamiento de

lambda. Esta región se puede reemplazar con insertos grandes de ADN extraño (hasta aproximadamente 23 kb). (D) Cósmidos. Los cósmidos son pequeños plásmidos multicopia que llevan sitios cos. Están

linealizados y cortados de modo que cada mitad tenga un sitio coseno (no se muestra). A continuación, se inserta ADN extraño para volver a unir las dos mitades del ADN cósmido. Esta construcción se

empaqueta en cabezas de virus lambda y se usa para infectar E. coli. (E) Cromosomas artificiales. Los cromosomas artificiales de levadura tienen dos formas: una forma circular para crecer en bacterias y

una forma lineal para crecer en levadura. La forma circular se mantiene como cualquier otro plásmido en las bacterias, pero la forma lineal debe tener secuencias de telómeros para mantenerse en la levadura.

La forma lineal puede contener hasta 2000 kb de ADN clonado y es muy útil para la investigación genómica.
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Capítulo 3

pared, la mayoría de los antibióticos no matan la levadura. Por lo tanto, se

ÿE (ámbar) ÿD (ámbar)
usa una estrategia diferente para detectar la presencia de plásmidos en la
lisógeno lisógeno
levadura. Un gen para la síntesis de un aminoácido, como la leucina, permite
el crecimiento de cepas de levadura que requieren leucina. INDUCIR
ÿ LISIS
Los vectores de bacteriófagos son genomas virales que han sido
modificados para que grandes fragmentos de ADN no viral puedan
Cruz Cruz
empaquetarse en la partícula viral. Los bacteriófagos lambda tienen genomas
Proteínas de ensamblaje Proteínas de ensamblaje
lineales con dos extremos cohesivos: secuencias cos (extremos cohesivos Proteína D Proteína E

lambda). Estos son extremos adhesivos superpuestos de 12 bases.

Sin encabezados previos Sin encabezados previos
Cuando están dentro de la cubierta del virus, los extremos cohesivos se (por falta de E) (por falta de D)
recubren con proteína para evitar que se hibriden. Después de que lambda
se une a E. coli, inserta solo el ADN lineal. Las proteínas que protegen los
ADN lambda
extremos cohesivos se pierden y el genoma circula con la ayuda de la ADN con inserto

ligasa. La forma circular es la forma replicativa (RF) y se replica mediante el MEZCLA

mecanismo del círculo rodante (ver Capítulo 4). La expresión de varios genes
lambda produce las proteínas que se ensamblan en cubiertas de proteínas.
EMBALAJE EXITOSO

Cada capa está empaquetada con un genoma, y después de ensamblar

muchos de estos, el huésped de E. coli explota, liberando el nuevo
bacteriófago para infectar otras células.

El bacteriófago lambda es un vector de clonación muy utilizado (v . fig. Cabeza

3.16C). Se eliminó el segmento medio del genoma lambda y se agregó un
polienlazador. Se puede ligar un inserto de 37 a 52 kb en el policonector y
empaquetarlo en partículas virales. Para trabajar con el ADN del bacteriófago
sin matar toda la E. coli

Cola 81
cultivo, el investigador elimina uno o más genes necesarios para el empaque.
Cuando el investigador quiere formar bacteriófagos completamente
empaquetados, recubre las proteínas del virus auxiliar
se puede agregar (Fig. 3.17). Los virus auxiliares no contienen ADN FIGURA 3.17 In Vitro

extraño, pero aportan los genes que faltan para las proteínas de la cubierta. Debido a que las proteínas de cubierta se embalaje
Un vector de clonación
autoensamblan in vitro, los lisados auxiliares se mezclan con ADN lambda recombinante y se producen partículas virales
lambda que contiene ADN clonado
completas que contienen ADN. Esto se conoce como envasado in vitro .
debe empaquetarse en una
cabeza de fago antes de que
Los vectores cósmidos pueden contener fragmentos de ADN de hasta 45 kb de longitud (ver Fig. 3.16D). Estos son
pueda infectar a E. coli. En primer
vectores lambda altamente modificados con todas las secuencias entre los sitios cos eliminadas y reemplazadas con el
lugar, un cultivo de células de E.
inserto. El ADN de interés se liga entre los dos sitios cos usando enzimas de restricción y ligasa. Esta construcción se
coli se infecta con una lambda
empaqueta en una partícula lambda producida por el fago auxiliar (ver Fig. 3.17), y luego se usa para infectar E. coli.
mutante que carece del gen de
una de las proteínas principales
denominada E. Un cultivo diferente
Los cromosomas artificiales contienen las piezas más grandes de ADN (ver Fig. 3.16E). Estos incluyen cromosomas
de E. coli se infecta con un
artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de bacteriófago P1
mutante diferente, que carece de
(PAC). Se utilizan para contener longitudes de ADN de 150 kb a 2000 kb. Los YAC contienen la mayor cantidad de ADN, la proteína principal del fago D.
hasta aproximadamente 2000 kb. Los YAC tienen centrómeros de levadura y telómeros de levadura para el mantenimiento Se induce la lisis de los dos
en la levadura. Los BAC se pueden circularizar y cultivar en bacterias; por lo tanto, tienen un origen bacteriano de replicación cultivos, lo que libera las colas,

y genes de resistencia a antibióticos. las proteínas de ensamblaje y las

proteínas de la cabeza, pero no
las cabezas completas debido a
la falta de proteínas. Cuando estos
Muchos vectores de clonación diferentes están disponibles para la investigación biotecnológica. Los genes más pequeños se estudian se mezclan con un vector de
utilizando plásmidos bacterianos o vectores lanzadera, mientras que los genes más grandes se estudian en vectores de bacteriófagos, reemplazo lambda, los tres forman
cósmidos y cromosomas artificiales. espontáneamente partículas

Los vectores lanzadera tienen secuencias que les permiten sobrevivir en dos organismos diferentes, como la levadura. virales completas que contienen ADN.
y bacterias Estos se utilizan luego para infectar
E. coli.
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Tecnologia de ADN recombinante

CONSEGUIR GENES CLONADOS EN BACTERIAS POR TRANSFORMACIÓN

Una vez que el gen de interés se clona en un vector, la construcción se puede volver a colocar en una célula
bacteriana a través de un proceso llamado transformación (Fig. 3.18) (ver Cuadro 3.2). Aquí, la construcción de ADN
se mezcla con células de E. coli competentes . Para que las células sean competentes, es decir, capaces de captar
ADN, la pared celular debe abrirse temporalmente. Las células de E. coli se mezclan con iones de calcio en hielo y
luego se someten a choques a una temperatura más alta, como 42 °C, durante unos minutos, lo que desestabiliza la
membrana y la pared celular. La mayoría de las células mueren durante el tratamiento, pero algunas sobreviven y
toman el ADN. Otro método para hacer que las células de E. coli sean competentes es exponerlas a un choque de alto voltaje.
La electroporación abre la pared celular, permitiendo que entre el ADN. Este método es mucho más rápido y versátil.
La electroporación se usa para otros tipos de bacterias además de levaduras.

Las bacterias pueden tener diferentes plásmidos, pero deben tener diferentes orígenes de replicación. Si hay dos
plásmidos diferentes con el mismo origen de replicación, uno de los dos se perderá durante la replicación bacteriana.
Por ejemplo, si los genes A y B se clonan en el mismo tipo de vector y ambos genes clonados entran en la misma
célula bacteriana, la bacteria perderá un plásmido y conservará el otro. Esto se debe a la incompatibilidad de
plásmidos, que impide que una célula bacteriana albergue dos plásmidos del mismo tipo. La incompatibilidad surge
de conflictos entre dos plásmidos con orígenes de replicación idénticos o relacionados. Solo uno puede replicar en
una celda determinada. Si un investigador quiere que una célula tenga dos genes clonados, se podrían usar dos tipos
diferentes de plásmidos, o se podrían colocar ambos genes en el mismo plásmido.

Recuadro 3.2 Descubrimiento de ADN recombinante

En 1972, dos investigadores se reunieron en una conferencia en Hawái para hablar sobre los se fragmenta en un pequeño plásmido de E. coli. Este fue el primer ADN recombinante

plásmidos, los pequeños anillos de ADN extracromosómico que se encuentran en las bacterias. fabricado. Finalmente, transformaron el plásmido modificado nuevamente en E. coli. Las

Herbert W. Boyer, PhD, era miembro de la facultad de la Universidad de California, San Diego, células expresaron los genes plásmidos normales así como los insertados en el plásmido

y estaba estudiando enzimas de restricción y modificación. Acababa de presentar su artificialmente. Esto provocó la revolución en la ingeniería genética y, desde entonces, todos
82
investigación sobre EcoRI. stanley n los laboratorios de biotecnología han utilizado alguna variación de su técnica. Boyer y Cohen

Cohen, MD, era miembro de la facultad en Stanford y estaba interesado en cómo los plásmidos solicitaron una patente sobre tecnología de ADN recombinante. De hecho, Boyer cofundó

podían conferir resistencia a diferentes antibióticos. Su laboratorio perfeccionó la transformación Genentech con Robert Swanson, un capitalista de riesgo.

de laboratorio de Escherichia coli usando cloruro de calcio para permeabilizar las células.

Después de que terminaron las conversaciones, los dos se encontraron. Genentech es una de las primeras empresas de biotecnología en los Estados Unidos, y bajo
sobre sándwiches de carne en conserva y combinaron sus dos ideas. la dirección de Boyer y Swanson, la empresa produjo

Aislaron diferentes fragmentos de ADN de animales, otras bacterias y virus y, usando somatostatina humana en E. coli.

enzimas de restricción, ligaron los

DESTRUIR CELDA AGREGAR ADN A

CELDA DEL RECEPTOR RECOMBINACIÓN
Y PURIFICA EL ADN

Cromosoma

ORIGINAL FRAGMENTOS TRANSFORMADO RECOMBINANTE

CÉLULA BACTERIANA DE ADN CELDA CELDA

FIGURA 3.18 Transformación

Las células bacterianas pueden absorber ADN, como plásmidos recombinantes, mediante incubación con iones metálicos como Ca++ en hielo. Esto desestabiliza la pared celular bacteriana y,
después de un breve choque térmico, algunas de las bacterias absorben el ADN o el plásmido. Si el ADN se integra en el cromosoma, la célula recombinante expresará cualquier gen que se
encuentre en el ADN. Una célula bacteriana también puede absorber plásmidos completos, y estos existen como elementos extracromosómicos con su propio origen de replicación.
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Capítulo 3

Cortar sitio FIGURA 3.19 Creación de una

biblioteca de ADN
El ADN genómico del organismo

elegido se digiere primero

DIGESTIÓN PARCIAL parcialmente con una enzima de
CON ESPECÍFICO DE 4 BASES
restricción que reconoce una
ENZIMA RESTRICTIVA
secuencia de cuatro pares de bases.
Se prefieren las digestiones

Mezcla de fragmentos, parciales porque algunos de los

algunos
sitios de las enzimas de
todavía con sitios cortados
restricción no se cortan y se
generan fragmentos más grandes.
Si cada sitio de reconocimiento
fuera cortado por la enzima de
restricción, entonces el ADN
FRAGMENTOS CLONADOS
genómico no contendría muchos genes completos.
EN VECTOR plásmido
Los fragmentos genómicos se
vector
clonan en un vector apropiado y
se transforman y mantienen en
bacterias.

TRANSFORMAR PLASMIDOS
EN BACTERIAS

83

colonias bacterianas
cada uno llevando
diferentes
fragmento clonado
de ADN

CONSTRUYENDO UNA BIBLIOTECA DE GENES

Las bibliotecas de genes se utilizan para encontrar nuevos genes, secuenciar genomas completos y comparar
genes de diferentes organismos (fig. 3.19). Las bibliotecas de genes se crean cuando el ADN completo de un organismo
en particular se digiere en fragmentos usando enzimas de restricción, y luego cada uno de los fragmentos se clona en un
vector y se transforma en un huésped apropiado.

Los pasos básicos utilizados para construir una biblioteca son los siguientes:

1. Aísle el ADN cromosómico de un organismo, como E. coli, levadura o humanos.

2. Digerir el ADN con una o dos enzimas de restricción diferentes.
3. Linealizar un vector de clonación adecuado con sitios de enzimas de restricción compatibles.
4. Mezcle los fragmentos de cromosomas cortados con el vector linealizado y ligue.
5. Transformar esta mezcla en E. coli.

6. Aísle un gran número de transformantes de E. coli .

El tipo de enzima de restricción afecta el tipo de biblioteca. Debido a que los sitios de restricción no están espaciados
uniformemente en el genoma, algunas inserciones serán grandes y otras pequeñas. El uso de una enzima de restricción
que reconoce solo cuatro pares de bases dará una mezcla de fragmentos en su mayoría pequeños, mientras que una
enzima de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento de seis u ocho pares de bases generará fragmentos más
grandes. (Tenga en cuenta que encontrar una secuencia particular de cuatro pares de bases en un genoma es más probable
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Tecnologia de ADN recombinante

que encontrar una secuencia de seis pares de bases). Incluso si se usa una enzima que reconoce una
secuencia de reconocimiento de cuatro pares de bases para digerir el genoma completo, estos sitios no están
igualmente espaciados en todo el genoma de un organismo. El genoma digerido contendrá algunos segmentos
demasiado grandes para ser clonados y algunos segmentos demasiado pequeños. Para evitar cortar piezas
demasiado pequeñas, a menudo se utiliza la digestión parcial. Se permite que la enzima corte el ADN durante un
tiempo breve y muchos de los sitios de la enzima de restricción no se cortan, lo que deja piezas más grandes para
la biblioteca. Además, es habitual construir otra biblioteca utilizando una enzima de restricción diferente.

Las bibliotecas de genes se utilizan para muchos propósitos porque contienen casi todo el genoma de un organismo en particular.

PROYECCIÓN DE LA BIBLIOTECA DE GENES POR HIBRIDACIÓN

Una vez que se ensambla la biblioteca, los investigadores a menudo quieren identificar un gen o segmento de ADN
en particular dentro de la biblioteca. A veces, el gen de interés es similar a uno de otro organismo. A veces, el gen
de interés contiene una secuencia particular. Por ejemplo, muchas enzimas usan ATP para proporcionar energía.
Las enzimas que se unen al ATP comparten una secuencia de firma común, ya sea que provengan de bacterias o
humanos. Esta secuencia se puede usar para encontrar otras enzimas que se unan al ATP. Tales motivos de
secuencia comunes también pueden sugerir que una proteína se unirá a varios cofactores, otras proteínas y ADN,
por nombrar algunos ejemplos.

La selección de bibliotecas de ADN por hibridación requiere la preparación de la biblioteca de ADN y la

preparación de la sonda marcada. Una biblioteca de genes se almacena como un cultivo bacteriano de células
de E. coli , cada una con un plásmido con un inserto diferente. El cultivo se cultiva, se diluye y se coloca en muchas
placas de agar diferentes para que las colonias estén separadas unas de otras. Las colonias se transfieren a un
filtro de nailon y el ADN de cada colonia se libera de las células al lisarlas con detergente. Los componentes
84 celulares se enjuagan de los filtros.
FIGURA 3.20
Detección de una biblioteca con
colonias bacterianas El ADN se adhiere a la membrana de nailon y luego
sonda de ADN
en agar cada llevar
En primer lugar, las colonias
se desnaturaliza para formar cadenas sencillas (fig. 3.20).
un fragmento clonado
bacterianas que contienen los insertos de ADN

de la biblioteca se cultivan y se colocan

Si un científico está buscando un gen particular en el
en placas en platos grandes y poco
organismo objetivo, la sonda para la biblioteca puede ser
profundos llenos de agar. Se colocan

en placas muchas colonias diferentes

el gen correspondiente de un organismo relacionado. La
TRANSFERIR A
para que cada pieza clonada de ADN sonda suele ser solo un segmento del gen porque una
MEMBRANA O FILTRO
esté presente. Estas colonias se pieza más pequeña es más fácil de manipular. A
transfieren a filtros de nailon y se lisan continuación, la sonda de ADN se sintetiza y se marca
para abrirlas. Los restos celulares se
con radiactividad o con quimioluminiscencia. El ADN de
lavan
la sonda monocatenario se mezcla con el ADN de la
lejos, mientras que el ADN
biblioteca en los filtros de nailon. La sonda se hibrida con
genómico y plásmido se adhiere al

nailon. Las secuencias se hacen

secuencias coincidentes en la biblioteca. El nivel de
monocatenarias incubando los coincidencia necesario para la unión se puede ajustar
filtros en una base fuerte. Cuando incubando a varias temperaturas. Cuanto mayor sea la
LISIS DE CÉLULAS BACTERIANAS
estos se incuban con un radiactivo temperatura, más estrictas, es decir, más estrechamente
Y DESNATURALIZACIÓN DEL ADN
coincidentes deben ser las secuencias.
sonda monocatenaria a la temperatura

adecuada, la sonda se hibrida con

AÑADIR SONDA DE ADN ETIQUETADA
Cuanto más baja es la temperatura, menos estricto. Si la
cualquier secuencia coincidente.
sonda está marcada con radiactividad, la película fotográfica
se volverá negra donde la sonda y el ADN de la biblioteca
La sonda se une al ADN
hibridaron. La mancha negra se alinea con la colonia
de colonias con
secuencias coincidentes bacteriana original. Por lo general, la colonia más probable
y sus vecinas se seleccionan, cultivan, sembran en placas
y se vuelven a examinar con
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Capítulo 3

la misma sonda para garantizar que se aísle un solo transformante. Luego, el ADN de este aislado se puede
analizar mediante secuenciación (consulte el Capítulo 4).

Proyectar una biblioteca tiene dos partes. Primero, los clones de la biblioteca que crecen en E. coli se unen a filtros de nailon y los
componentes celulares se eliminan por lavado y luego se desnaturalizan para formar piezas de ADN monocatenario.
En segundo lugar, se marca una sonda con radiactividad, se calienta para derretir la hélice en hebras simples y finalmente se
agrega a las membranas de nailon donde se hibrida con su secuencia coincidente.

BIBLIOTECAS DE EXPRESIÓN EUCARIOTICA

En bibliotecas de expresión, el vector tiene
secuencias requeridas para la transcripción y FIGURA 3.21
traducción del inserto. Esto significa que el Elaboración de una
CÉLULAS DE LUZ AAAA
inserto de ADN se expresa como ARN y biblioteca de ADNc a
AAAA
EXTRACTO Y partir de ARNm eucariótico
luego se traduce en una proteína. Una AAAA
PURIFICAR ARNm En primer lugar, se lisan las
biblioteca de expresión, en esencia, genera eucariota mezcla de ARNm células eucariotas y se purifica
una proteína a partir de cada inserto clonado, células
el ARNm. A continuación, se
ya sea un gen real o no. LA TRANSCRIPTASA INVERSA
añaden tramos de transcriptasa
USO DE LA PRIMERA OLIGO(dT)
inversa más cebadores que

Cuando se estudia el ADN eucariótico, se contienen oligo(dT). El oligo(dT)

se hibrida con la adenina en la cola

construyen bibliotecas de expresión usando
5 AAAAAAA 3 ARNm/ADNc poli(A) del ARNm y actúa como
ADN complementario (ADNc) para ayudar
3 5 cebador para la transcriptasa
a garantizar que el inserto sea verdaderamente TTTTTT heterodúplex
inversa. Esta enzima produce la
un gen. El ADN eucariótico, especialmente cadena de ADN complementaria,
RIBONUCLASA H
en plantas y animales superiores, es en gran formando un heterodúplex de
parte no codificante, con regiones codificantes ARNm/ADNc.
monocatenario
muy separadas. Incluso los genes se 3 TTTTTT 5 La cadena de ARNm se digiere con
ADNc 85
ribonucleasa H y se agrega ADN
interrumpen con intrones no codificantes. El
ADNc es una copia de ADN de doble cadena polimerasa I para sintetizar la cadena
1) ADN POLIMERASA I
de ADN opuesta, creando así ADNc
del ARNm. El ADNc se produce mediante la
2) NUCLEASA S1 de doble cadena. A continuación, se
transcriptasa inversa, una enzima que se agrega la nucleasa S1 para recortar
identificó por primera vez en los retrovirus cualquier extremo monocatenario y
5 AAAAAAA 3 Doble cadena
(consulte el Capítulo 1). Se utiliza en la 3 TTTTTT 5 ADNc se agregan conectores a los extremos
investigación de eucariotas para eliminar los del dsDNA.

intrones y generar una versión de un gen que

ENLACE DE LIGADO Cortar sitio
Los enlazadores tienen sitios de
consta únicamente de una secuencia de CON SITIO DE CORTE
enzimas de restricción convenientes
codificación ininterrumpida.
para la clonación en un vector de
Enlaces expresión.
Por el contrario, las bacterias tienen muy
poco ADN no codificante y sus genes no son
AAAAAAA
interrumpidos por intrones; por lo tanto, el TTTTTT
ADN genómico puede usarse directamente en
bibliotecas de expresión. DIGERIR CON
Cortar sitio

ENZIMA RESTRICTIVA
El ADN eucariótico primero se convierte en
ADNc para construir una biblioteca de
expresión (Fig. 3.21). Para producir ADNc,
AAAAAAA
el ARN mensajero se aísla del organismo TTTTTT
de interés uniéndolo a una columna que
final pegajoso
contiene poli(T) (es decir, una hebra de
ADN que consta de minas ti repetidas). LIGAR EN VECTOR
Esto aísla solo el ARNm porque la poli(T)
se hibrida con la cola poli(A) del ARNm
eucariótico.
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Tecnologia de ADN recombinante

FIGURA 3.22 Immu El ARNm se convierte en ADNc usando transcriptasa

Cribado nológico de una inversa, que sintetiza un complemento de ADN para
Proteína
expresión Y el ARNm. Luego, una enzima elimina la parte de
Unido
Biblioteca
B a la membrana ARNm del heterodúplex ARNm/ADNc, y la ADN
Bacterias que expresan
r

Y
polimerasa produce la segunda hebra de ADN (ver
los genes se cultivan en
Fig. 3.21). El producto final es una copia de ADN de
una placa de agar, se
transfieren a una membrana y se lisan.
doble cadena de la secuencia de ARNm.
Las proteínas liberadas se unen a
AGREGAR ANTICUERPO
la membrana. Esta figura muestra
ESPECÍFICO PARA LA PROTEÍNA OBJETIVO
solo una proteína unida, aunque
en realidad están presentes muchas
Luego, el ADNc se liga en un vector de expresión con
proteínas diferentes. Estos incluyen secuencias que inician la transcripción y traducción del
inserto. En algunos casos, el inserto tendrá su propio
Y
tanto clones de biblioteca
B
expresados como proteínas r sitio de inicio de traducción (por ejemplo, un cDNA de
bacterianas. La membrana se Y
longitud completa). Si el inserto no contiene un comienzo
incuba Proteína Anticuerpo 1
de traducción, entonces el marco de lectura se convierte
con un anticuerpo primario
en un problema.
que se une solo a la proteína
de interés. Para detectar esto Debido a que el código genético es un triplete, cada
complejo proteína:anticuerpo, AGREGAR UN SEGUNDO ANTICUERPO QUE inserción se puede traducir en tres marcos de lectura
se añade un segundo anticuerpo SE UNE AL PRIMER ANTICUERPO diferentes. Se puede producir una proteína para los tres
con un sistema de detección marcos de lectura, pero solo un marco producirá la
como la fosfatasa alcalina. La proteína correcta.
Detección
colonia bacteriana que expresa
sistema Para garantizar la obtención de insertos con el marco
la proteína de interés se volverá Y de lectura correcto, cada ADNc se clona en los tres
azul cuando
marcos de lectura mediante el uso de enlazadores
B
Se añade X-Phos. Esto permite r

el vector con la correcta Y con varios sitios de restricción diferentes. Por lo tanto,
Proteína Anticuerpo 1
insertar para ser aislado. aumenta el número de transformantes para cribar una
86 proteína de interés.

Detección Los genes clonados se transforman en bacterias,

sistema
que expresan el ADN extraño.
Las bacterias se cultivan en agar y luego las
colonias se transfieren a una membrana de nailon
y se lisan. Las proteínas liberadas se adhieren a las membranas de nailon y se analizan de diversas formas. En la
mayoría de los casos, se utiliza un anticuerpo contra la proteína de interés (consulte el Capítulo 6). Este reconoce la
proteína y puede identificarse utilizando un anticuerpo secundario que se conjuga con un sistema de detección. Por lo
general, la fosfatasa alcalina se conjuga con el anticuerpo secundario. El complejo completo se puede identificar porque
la fosfatasa alcalina escinde X-Phos, dejando un color azul donde la colonia bacteriana expresó la proteína correcta
(Fig. 3.22). E. coli no puede realizar la mayoría de las modificaciones postraduccionales que suelen sufrir las proteínas
eucariotas. Por lo tanto, las proteínas no siempre se encuentran en su forma nativa. No obstante, los anticuerpos
apropiados pueden detectar la mayoría de las proteínas de interés.

El ADN complementario o ADNc se construye aislando ARNm y haciendo una copia de ADN con transcriptasa inversa.

Las bibliotecas de expresión expresan el inserto de ADN extraño como una proteína porque los vectores de expresión contienen

secuencias tanto para la transcripción como para la traducción. La proteína de interés se identifica incubando la biblioteca con un anticuerpo

contra la proteína de interés.

CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES DE EXPRESIÓN

Debido a que la proteína extraña puede ser tóxica para E. coli, especialmente si se produce en grandes cantidades,
el promotor utilizado para expresar el gen extraño es fundamental. Si se produce demasiada proteína extraña, la
célula huésped puede morir. Para controlar la producción de proteínas, los vectores de expresión tienen promotores con
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Capítulo 3

interruptores de encendido/apagado; por FIGURA 3.23

lo tanto, se permite que la célula huésped Los vectores de expresión
Transcripción
crezca y luego, después de que se Sitios de clonación terminadores
tienen promotores
YD Y Y
gramo norte

CLEl estrechamente regulados

norte

produzcan cantidades suficientes de Laca UV

promotor Un vector de expresión
bacterias, se activa el gen de interés. Un
contiene secuencias aguas
promotor de uso común es una versión arriba del gen clonado que
mutante del promotor lac , lacUV, que controlan la transcripción y
impulsa un nivel muy alto de transcripción, EXPRESIÓN
traducción del gen clonado. El
pero solo en condiciones inducidas (fig. VECTOR vector de expresión que se

3.23). Tiene los siguientes elementos: un muestra utiliza el promotor

lacUV, que es muy fuerte,
sitio de unión para la ARN polimerasa, un A pero inducible. Para estimular
sitio de unión para la proteína represora
LacI y un sitio de inicio de la transcripción.
El vector tiene fuertes sitios de parada de
r I
L
la transcripción se añade el
inductor artificial IPTG. IPTG
se une a la proteína represora
la transcripción aguas abajo de la región LacI, que luego se separa del
del polienlazador. El vector también tiene ADN. Esto permite que la

el gen para LacI, por lo que se producen ARN polimerasa transcriba el

gen. Antes de agregar IPTG,
altos niveles de proteína represora, lo que mantiene reprimidos los genes clonados. Como todos los
el represor LacI evita la
vectores, existe un origen de replicación y un gen de resistencia a antibióticos para la selección en bacterias.
expresión del gen clonado.
Cuando se clona una biblioteca de genes detrás de este promotor, los genes no se expresan debido a los altos
niveles del represor LacI. Cuando se agrega un inductor, como IPTG, se libera LacI del ADN y la ARN
polimerasa transcribe el gen clonado.

Otro promotor común en los vectores de expresión es el promotor izquierdo lambda o PL. Tiene un sitio
de unión para el represor lambda. El gen de interés o el fragmento de la biblioteca no se expresa a menos
que se elimine el represor. En lugar de utilizar su inductor natural, se ha aislado una versión mutante del
represor que libera su sitio de unión a altas temperaturas.
Entonces, cuando el cultivo se cambia a 42°C, el represor se desprende del ADN y la ARN polimerasa transcribe 87
los genes clonados.

Otro sistema de expresión utiliza un promotor cuyo sitio de unión a la ARN polimerasa reconoce únicamente la
ARN polimerasa del bacteriófago T7. La ARN polimerasa bacteriana no transcribirá el gen de interés. Este
sistema está diseñado para funcionar solo en bacterias que tienen el gen de la polimerasa de ARN T7 integrado
en el cromosoma y bajo el control de un promotor inducible.

Algunos vectores de expresión contienen un pequeño segmento de ADN que codifica una etiqueta de proteína.
Estos se utilizan principalmente cuando el gen de interés ya está clonado, en lugar de bibliotecas de detección.
El gen de interés debe clonarse en marco con el ADN para la etiqueta de proteína. La etiqueta puede ser de
muchas variedades, pero las etiquetas 6HIS , Myc y FLAG® son tres formas populares (Fig. 3.24).
6HIS es un tramo de seis residuos de histidina colocados al principio o al final de la proteína de interés. Las
histidinas se unen fuertemente al níquel. Esto permite aislar la proteína etiquetada al unirse a una columna con
níquel adjunto. Myc y FLAG® son epítopos que permiten purificar la proteína expresada al unirse al anticuerpo
correspondiente. Los anticuerpos pueden unirse a una columna, usarse para un Western blot o verse in vivo
tiñendo las células con versiones marcadas con fluorescencia de los anticuerpos Myc o FLAG®. (La etiqueta
de histidina también se puede reconocer con un anticuerpo específico, si se desea).

La característica más importante de los vectores de expresión es una región promotora estrictamente controlada. Las proteínas de la
biblioteca de expresión se expresan solo bajo ciertas condiciones, como la presencia de un inductor, la eliminación de un represor o
un cambio de temperatura.
Las etiquetas pequeñas se pueden fusionar en la proteína de interés utilizando vectores de expresión. Estas etiquetas permiten la
proteína de interés para ser aislada y purificada.
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Tecnologia de ADN recombinante

FIGURA 3.24 Uso de etiquetas 6SU DÍA

para aislar proteínas C El
L norte
YD gramo
Y Y
norte

HIs
6r TYr
_ I
metro

Algunos vectores de expresión tY

El
atElr
norte

metro

r El
tienen secuencias de ADN que
SuHisHisHisHisHis
codifican etiquetas de proteínas cortas.

La etiqueta 6HIS (A) codifica seis

residuos de histidina. Cuando se TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN
fusiona en marco con la secuencia

codificante del gen clonado, la

etiqueta se fusiona con la proteína.

La etiqueta 6HIS se une 6Su

específicamente a los iones de níquel;

por lo tanto, la unión a una columna

de iones de níquel aísla las proteínas

marcadas con 6HIS.

Además, los anticuerpos contra la

etiqueta 6HIS también se pueden usar

para aislar las proteínas etiquetadas.

Otras etiquetas, como Myc o Se une al anticuerpo 6His

FLAG® (B), son epítopos de A o se une a una columna de níquel

anticuerpos específicos que funcionan

de manera similar. Las proteínas

ETIQUETA MYC O BANDERA
etiquetadas con Myc o FLAG®
pueden aislarse o identificarse
C El
L norte
YD gramo
Y Y
norte
C El
L norte
YD gramo
Y Y
norte

yC FLA
GRAMO

uniéndose a anticuerpos contra Myc METRO TYr TYr

r I
metro

atElr r I
metro

atElr
tY tY
norte norte

o FLAG®, respectivamente. El El
metro metro

rEl El
r
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

88

Mi c BANDERA

Anticuerpo contra Myc utilizado para detectar Anticuerpo contra FLAG utilizado para detectar
B proteína expresada proteína expresada

LA RECOMBINACIÓN AUMENTA LA VELOCIDAD DE LA CLONACIÓN DE GENES

Ensamblar nuevos vectores de ADN con diferentes genes de interés puede resultar difícil cuando el
gen es largo, ya que puede ser difícil identificar enzimas de restricción únicas compatibles con un
polienlazador que no corte dentro del gen. Se pueden crear grandes vectores de ADN recombinante
usando recombinación homóloga, un proceso llamado recombinación (Fig. 3.25).
Para facilitar la recombinación, las enzimas del fago lambda llamadas RED están diseñadas para
ser expresadas por una cepa específica de bacterias huésped. Reconocen secuencias homólogas y
las recombinan para formar una sola molécula. Estas proteínas son tan eficientes que tan solo una
región de homología de 45 pares de bases es suficiente para iniciar la recombinación. En la práctica,
E. coli tiene los genes de las proteínas RED bajo el control de un promotor inducible por calor. El gen
de interés se electropora en bacterias que tienen las proteínas lambda RED activas en el citoplasma.
Reconocen los extremos del gen de interés y encuentran sus secuencias homólogas. En esta figura,
las secuencias homólogas se encuentran en el BAC, o cromosoma artificial bacteriano. Las enzimas
rompen el BAC en el lugar apropiado
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Capítulo 3

GEN DE INTERÉS

Secuencia Gene Secuencia

de 30 a 50 de 30 a 50
pb homóloga a pb homóloga a
BAC BAC

ELECTROPORAR PARA OBTENER GEN

FRAGMENTO EN BACTERIAS

cromosoma de E. coli
Gen para la
recombinasa ÿ RED ÿ ROJO

Promotor
sensible a la temperatura

Cromosoma artificial
bacteriano (BAC)

gen de interés

Secuencia homóloga a los

extremos del gen de
interés

cromosoma de E. coli

ÿ ROJO

89

BAC

ÿ PROTEÍNAS ROJAS
FRAGMENTO INTEGRADO

cromosoma de E. coli

Cultivar a 32°C
BAC recombinado
para detener la
producción de proteína RED

FIGURA 3.25 Recombinación Un gen de

interés está flanqueado por secuencias homólogas al BAC. Una vez dentro de la bacteria, las proteínas RED reconocen los
extremos del gen de interés y facilitan la recombinación homóloga entre el BAC y el gen de interés. Las proteínas RED se producen
solo cuando las bacterias se exponen a altas temperaturas, ya que sus genes están controlados por un promotor inducible por calor.
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Tecnologia de ADN recombinante

ubicación y agregue el gen de interés. El BAC diseñado se elimina de esta cepa de E. coli para evitar que
cualquier proteína RED residual inicie una recombinación adicional.

Identificar qué E. coli tiene el gen de interés es diferente para la recombinación porque las bacterias
tienen el vector, independientemente de si el inserto se recombina o no. En lugar de utilizar un esquema
de selección positiva como la resistencia a los antibióticos, se utiliza un esquema de selección/
contraselección para identificar el vector recombinado que contiene el gen de interés (fig. 3.26). Primero,
el vector contiene un gen para galK, o galactosa quinasa, un gen esencial para el crecimiento en galactosa.
Las bacterias producen galactosa quinasa y pueden crecer en medios mínimos que contienen solo
galactosa como fuente de carbono. La proteína GalK también convierte la 2-desoxigalactosa (2-DOG)
en una sustancia tóxica, por lo que las bacterias que expresan GalK mueren cuando se cultivan en 2-DOG.
Después de que ocurre la reacción de recombinación, las bacterias se colocan en placas en medios
mínimos que solo tienen 2-desoxigalactosa. Si alguna bacteria todavía tiene galK, la galactosa quinasa
crea una toxina a partir de la 2-desoxigalactosa y la bacteria muere. Cuando galK se reemplaza con el
gen de interés, no se produce toxina y la bacteria crece.

FIGURA 3.26 REGIONES DE HOMOLOGÍA

Selección y CON INTERÉS GÉNICO 2-DESOXIGALACTOSA
Contraselección en
Recombinación GRAMO
aL A Y Y
gramo
norte

Los vectores de recombinación

utilizan un método de selección
VECTOR no crezcas
y contraselección para identificar SIN GEN
qué bacteria alberga el vector DE INTERÉS
que contiene el gen de interés. BACTERIAS CON
En la parte A, el gen de galK GALK MEDIOS MÍNIMOS DE GALACTOSA
90 codifica una galactosa quinasa. Antibiótico
Cuando las bacterias que resistencia
Crecer
expresan GalK se cultivan en 2- gene

desoxigalactosa (2-DOG), se
produce una toxina que mata a
las bacterias (placa superior).
GalK también permite que las A
bacterias crezcan en medios gen de interés
mínimos de galactosa (placa
inferior). En la parte B, la
RECOMBINACIÓN
recombinación reemplaza el gen
galK con el gen de interés y, por
lo tanto, las bacterias ya no
2-DESOXIGALACTOSA
Y Y I tYrY
pueden crecer en medios ElF
norte
norte

GRAMO

st
mínimos de galactosa (placa
inferior). La falta de GalK permite
VECTOR
que las bacterias crezcan en 2-
CON GEN Crecer
DOG (placa superior). DE INTERÉS

Antibiótico BACTERIAS CON

resistencia GEN DE INTERÉS
MEDIOS MÍNIMOS DE GALACTOSA
gene Hacer

no crecer

B
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Capítulo 3

FAGO FIGURA 3.27

VECTORES DE CLONACIÓN GATEWAY®
GOTA
Integración del ADN
Un sistema de clonación más nuevo utiliza los Lambda
sitios de integración y escisión del fago lambda El ADN del fago tiene una

para clonar genes de un vector a otro (fig. 3.27). secuencia de unión llamada
attP. El ADN bacteriano tiene
El fago lambda existe como fago pero también se
una secuencia de unión llamada
integra en el cromosoma de E. coli en el sitio attB
att PAGS
attB. El ADN bacteriano y el ADN
para formar un profago. La reacción de integración PAGS
EL
PAGS'

del fago ÿ se alinean en la región

ocurre cuando la integrasa hace cortes escalonados
BACTERIANO "O" de las secuencias de unión.
en el centro del fago attP. GOTA attB Durante la integración, la proteína
sitio y en el centro del sitio bacteriano attB. bb'EL int induce dos roturas de doble
Luego, los extremos se conectan para que el ADN cadena que se resuelven, lo que

del fago se integre, pero observe que las secuencias da como resultado la integración
del ADN del fago en el ADN
son diferentes a las originales. Estos se denominan
bacteriano. El proceso es reversible
attL y attR después de la integración. Esta reacción EXCISIÓN
y requiere proteína int y proteína
se puede revertir, pero dado que los dos sitios son INTEGRACIÓN REQUIERE
xis para escindir el ADN del fago
REQUIERE INT y XIS
diferentes después de la integración, otra enzima del ADN bacteriano.
EN T
llamada Xis, o excisiónasa, elimina el ADN insertado
y relega el ADN roto. Observe que el sitio "O" del
ADN del fago integrado está
Los vectores de clonación Gateway aprovechan flanqueado por un lado del fago
el sistema de integración/escisión del fago lambda y un lado de la bacteria. Estos
para estudiar un gen de interés. Los vectores se denominan sitios attL y attR.

incluyen secuencias para expresar el gen de interés

B' EL
en proteína, agregar una etiqueta de proteína, B
transportar el gen entre diferentes organismos
modelo o secuenciar el gen. El primer paso del
sistema es colocar el gen de interés entre dos sitios
91
attL (fig. 3.28). Esto se puede hacer clonando el gen
en un sitio de multiclonación que se encuentra en el
clon de entrada. El clon de entrada tiene un gen
attL atr
llamado ccdB en el medio del sitio de clonación BP'
EL PB'
EL
múltiple, que codifica una toxina que mata al huésped PROFAGO
cuando se expresa. Cuando este gen se expresa en
E. coli, la bacteria muere, lo que asegura que FIGURA 3.28 Puerta
SITIO DE CLONACIÓN MÚLTIPLE
cualquier bacteria que albergue el vector original muera. Clon de entrada way®
Cuando el gen de interés reemplaza al gen ccdB , las bacterias pueden NSP
V xmn
yo nco
yo sal
yo bamh
yo EcoR
I EcoR
I Yo
no Xho
yo EcoR
V
El clon de entrada para el
CCDB
crecer. (Una cepa especial de E. coli con una antitoxina para el producto El sistema Gateway® tiene un

del gen ccdB permite a los investigadores mantener el clon de entrada antes att L1 att origen de replicación para
T2 L2
de clonar el gen de interés en el vector). 1 crecer en bacterias, un gen de
T
resistencia a antibióticos para
GATEWAY®
Una vez que el gen está en el vector de entrada, dos reacciones diferentes seleccionar bacterias con el vector,
CLONACIÓN
lo mueven entre los diferentes clones de destino (Fig. 3.29). La reacción VECTOR DE ENTRADA
A un sitio de multiclonación que

LR elimina el gen de interés cortando en los sitios attL y lo mueve a los

sitios attR1 y attR2 en el vector de destino. Esto da como resultado un clon
I rEl
I contiene el gen ccdB
entre dos sitios attL

(attL1 y attL2). El gen de interés

de expresión que tiene el gen de interés flanqueado por attB1 y attB2. El
reemplaza al ccdB
vector de entrada ya no tiene el gen de interés, que se sustituye por el gen
gen durante la clonación
de la toxina, ccdB. Cualquier bacteria que reciba este vector muere. Las únicas bacterias supervivientes son estándar usando sitios únicos
aquellas que tienen el gen de interés en el vector de destino. de enzimas de restricción. El gen
Al igual que con el fago lambda, la reacción es reversible. La reacción de BP elimina el gen de interés del ccdB produce una toxina que mata
a la bacteria huésped a menos que el
vector de destino y puede volver a colocarlo en cualquier vector con sitios attL . La facilidad con la que el gen
bacteria tiene un gen
clonado puede moverse entre vectores hace que este sistema sea muy adaptable a diferentes investigaciones.
correspondiente para una antitoxina.
Existen vectores de clonación Gateway® para la expresión de proteínas en bacterias, añadiendo diferentes
etiquetas como HIS6; expresar el gen de interés en células de insecto, humano o ratón; o secuenciar el gen
de interés.
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Tecnologia de ADN recombinante

Gen de interés CCDB Gen de interés CCDB

attL1 attL2 attR1 attR2 attB1 attB2 attP1 attP2

clonasa LR
ENTRADA + DESTINO DESTINO + ENTRADA
VECTOR VECTOR VECTOR VECTOR
clonasa BP

KanR AmpR AmpR KanR

FIGURA 3.29 Reacciones Gateway® BP y LR

Mover un gen de interés del clon de entrada al vector de destino se realiza en la reacción LR. Las enzimas exisionasa e integrasa funcionan para eliminar el gen de
interés en el clon de entrada al cortar en los sitios attL y attR del clon de entrada y el vector de destino. El gen de interés y el ccdB intercambian posiciones, cambiando
así el sitio att para convertirse en attB y attP. La reacción de BP funciona a la inversa, moviendo el gen de interés de vuelta al clon de entrada.

Resumen
La tecnología del ADN recombinante es la base de casi toda la investigación biotecnológica. Comprender
estas técnicas equivale a comprender el resto del libro de texto. Primero, el ADN debe aislarse del organismo
para identificar nuevos genes, recuperar nuevos vectores recombinantes o purificar un nuevo gen. El ADN se
aísla de los componentes celulares utilizando enzimas seguido de centrifugación, digestión del ARN con ARNasa
y precipitación con etanol. Cada organismo requiere adaptaciones especiales de este proceso básico para
eliminar los componentes celulares y extracelulares.

El ADN purificado se puede manipular de muchas maneras diferentes. Las enzimas de restricción cortan el
esqueleto de fosfato del ADN en fragmentos más pequeños, que pueden visualizarse mediante electroforesis en
92 gel. Las piezas específicas de ADN se visualizan utilizando nucleótidos marcados radiactivamente, seguido de
autorradiografía. Para evitar el uso de radiactividad, los investigadores pueden sintetizar ADN con digoxigenina o
nucleótidos unidos a biotina, que luego se unen a un anticuerpo contra la digoxigenina o la estreptavidina,
respectivamente. Para visualizar el anticuerpo o la estreptavidina, los investigadores vinculan uno con un fluoróforo
o una enzima indicadora que convierte un sustrato en luz o en un precipitado coloreado. La hibridación de
secuencias relacionadas es una técnica clave para FISH, transferencias Southern, transferencias Northern y
transferencias puntuales, así como la selección de una biblioteca genómica para una secuencia particular.

El capítulo también describe las características clave de los vectores, incluidos los plásmidos, los vectores de
bacteriófagos, los cósmidos y los cromosomas artificiales. Estos elementos genéticos extracromosómicos varían en
sus usos, pero son muy importantes para lograr que un gen extraño se exprese en un organismo huésped.
Los vectores requieren una región que sea conveniente para agregar una pieza extraña de ADN, como un sitio
de clonación múltiple, necesitan un gen para la selección y necesitan una forma fácil de identificar si el vector
contiene la pieza extraña de ADN.

Una biblioteca genómica simplemente contiene todo el ADN del organismo de interés, cortado en fragmentos
más pequeños y clonado en un vector. Luego, los vectores recombinantes de la biblioteca se devuelven a una
célula bacteriana huésped para que solo quede un fragmento del ADN original dentro de cada bacteria.
Las bibliotecas de expresión comienzan con ARNm en lugar de ADN genómico. El ARNm se convierte en ADNc
con transcriptasa inversa. Las bibliotecas se analizan en busca de secuencias de ADN particulares de interés
mediante la hibridación de secuencias de ADN relacionadas. En el caso de las bibliotecas de expresión, la bacteria
convierte cada una de las piezas de ADN en proteína. Estas proteínas luego se examinan utilizando anticuerpos.

La clonación de genes usando los digeridos de enzimas de restricción tradicionales puede ser muy difícil para
genes grandes, ya que es probable que el gen tenga los sitios de enzimas de restricción. Para superar este
obstáculo, la recombinación utiliza la recombinación entre secuencias de ADN homólogas para insertar el gen de
interés en un vector. La recombinación también se usa en el sistema de clonación Gateway®, pero en lugar de usar
regiones de homología, estos vectores usan el fago lambda attB, attP, attR y attL
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Capítulo 3

secuencias de reconocimiento y las enzimas integrasa y exisionasa. En ambos sistemas, el vector tiene un gen que
produce una toxina (ccdB) o convierte un sustrato específico en una toxina (galK). Si el gen de interés no reemplaza
a ccdB o galK, la bacteria huésped muere. Si el gen de interés se recombina en el vector, la bacteria huésped vive y
propaga el vector recombinante.

Preguntas de fin de capítulo

1. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre el aislamiento de ADN de E. coli no es correcta?

una. La extracción química con fenol elimina las proteínas del ADN.
B. El ARN se elimina de la muestra mediante tratamiento con ARNasa.
C. El detergente se utiliza para romper las células vegetales para extraer el ADN.
D. La lisozima digiere el peptidoglicano en la pared celular bacteriana.
mi. La centrifugación separa los componentes celulares en función del tamaño.

2. ¿Cuál de los siguientes es importante para que funcione la electroforesis en gel?

una. Ácidos nucleicos cargados negativamente para migrar a través del gel.
B. Bromuro de etidio para proporcionar un medio para visualizar el ADN en el gel.
C. Agarosa o poliacrilamida para separar el ADN en función del tamaño.
D. Estándares de peso molecular conocidos.
mi. Todo lo anterior es importante para la electroforesis en gel.

3. ¿Cómo se utilizan las enzimas de restricción y la ligasa en biotecnología?

una. Las enzimas de restricción cortan el ADN en lugares específicos, produciendo extremos que
puede volver a ligarse con ligasa.
B. Solo las enzimas de restricción que producen extremos romos después de cortar el ADN pueden ser
ligado con ligasa. 93
C. Solo las enzimas de restricción que producen extremos cohesivos en el ADN pueden ligarse
con ligasa.
D. Las enzimas de restricción pueden tanto cortar el ADN en sitios específicos como volver a
ligarlos.
mi. Las enzimas de restricción cortan aleatoriamente el ADN y los fragmentos cortados se
pueden volver a unir con ligasa.

4. ¿Cuál de los siguientes es un método apropiado para detectar ácidos nucleicos?

una. Medición de la absorbancia a 260 nm.
B. Autorradiografía de ácidos nucleicos radiomarcados.
C. Quimioluminiscencia de ADN marcado con biotina o digoxigenina.
D. Medición de la luz emitida después de la excitación por ácido nucleico marcado con fluorescencia
ácidos en un fotodetector.
mi. Todos los anteriores son métodos apropiados para detectar ácidos nucleicos.

5. ¿Por qué el contenido de GC de una molécula de ADN en particular afecta la fusión de las dos hebras?

una. El enlace G y C solo requiere dos enlaces de hidrógeno, por lo que requiere un
temperatura más baja para “fundir” el ADN.
B. Debido a que el emparejamiento de bases G y C requiere tres enlaces de hidrógeno y un
se requiere una temperatura más alta para "derretir" el ADN.
C. El porcentaje de As y Ts en la molécula es más importante para la temperatura de fusión que el
porcentaje de Gs y Cs.
D. No es importante conocer el contenido de nucleótidos de una molécula de ADN para
investigación en biotecnología y biología molecular.
mi. Ninguna de las anteriores.

(Continuado)
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Tecnologia de ADN recombinante

6. ¿Cuál es la diferencia entre las hibridaciones del Sur y del Norte?

una. Las transferencias Southern hibridan una sonda de ADN con una muestra de ADN digerida, pero
las transferencias Northern hibridan una sonda de ADN con, por lo general, ARNm.
B. Las transferencias Southern usan una sonda de ARN para hibridarse con el ADN, pero las transferencias Northern
use una sonda de ARN para hibridar con ARN.
C. Las transferencias Southern determinan si se está expresando un gen en particular, pero las
transferencias Northern determinan la homología entre el ARNm y una sonda de ADN.
D. Las transferencias de Southern determinan la homología entre el ARNm y una sonda de ADN, pero las
transferencias de Northern determinan si se está expresando un gen en particular.
mi. Las transferencias Southern y Northern son esencialmente la misma técnica por
formadas en diferentes hemisferios del mundo.

7. ¿Cuál podría ser un uso para la hibridación in situ con fluorescencia (FISH)?
una. Para la identificación de un gen específico en una extracción de ADN por hibridación a
una sonda de ADN.
B. Para la identificación de un gen específico por hibridación con una sonda de ADN dentro
células vivas cuyo ADN ha sido desnaturalizado por el calor.
C. Para la identificación de un ARNm dentro de una extracción de ARN por hibridación a
una sonda de ADN.
D. Para la identificación de ARNm y ADN en extractos celulares utilizando un
sonda de ARN.
mi. Ninguna de las anteriores.

8. ¿Cuáles de las siguientes son características útiles de los vectores de clonación?

una. Un gen de resistencia a antibióticos en el plásmido para la selección de células que contienen el
plásmido.

94 B. Un sitio que contiene secuencias de enzimas de restricción únicas y agrupadas para clonar ADN
extraño.
C. Un plásmido de alto número de copias para que se puedan obtener grandes cantidades de ADN.
D. Complementación alfa para determinar si el ADN extraño se insertó en el sitio de clonación.

mi. Todos los anteriores son rasgos útiles.

9. ¿Cuál de los siguientes vectores contiene las piezas más grandes de ADN?
una. plásmidos
B. bacteriófago
C. YAC
d. PACs
mi. cósmidos

10. Además de una descarga de alto voltaje, ¿cuál es otro método para hacer que E. coli sea competente
para captar ADN “desnudo”?
una. altas concentraciones de iones de calcio seguidas de alta temperatura
B. altas concentraciones de iones de calcio y varias horas en hielo
C. grandes cantidades de ADN añadidas directamente a un cultivo bacteriano que crece a 37 °C
D. altas concentraciones de minerales seguidas de alta temperatura
mi. Una descarga de alto voltaje es la única forma de hacer que E. coli sea competente.

11. ¿Por qué se construyen las bibliotecas de genes?

una. Para encontrar nuevos genes.

B. Secuenciar genomas completos.

C. Comparar genes con otros organismos.
D. Crear un “banco” de todos los genes de un organismo.
mi. Todo lo anterior.
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Capítulo 3

12. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre las bibliotecas de genes es correcta?
una. Los genes de una biblioteca se pueden comparar con genes de otros organismos mediante
hibridación con una sonda.
B. Una biblioteca de genes solo es necesaria para mantener genes conocidos.
C. Cada gen de la biblioteca debe secuenciarse primero para comparar los genes de la biblioteca
con los genes de otros organismos.
D. Las bibliotecas de genes solo se crean para organismos eucariotas.
mi. Las bibliotecas de genes solo se pueden crear en procariotas.

13. ¿Por qué se debe usar la transcriptasa inversa para crear una expresión eucariótica?
¿Biblioteca?

una. La transcriptasa inversa solo se usa para crear bibliotecas de expresión procariotas.
B. La transcriptasa inversa crea ADNc a partir de ARNm en procariotas.
C. La transcriptasa inversa asegura que el gen esté en la orientación correcta dentro
el vector de expresión para crear proteína.
D. La transcriptasa inversa crea ADNc a partir de ARNm porque los genes en eucariotas tienen
un gran número de regiones no codificantes.
mi. No se utilizan otras enzimas para crear bibliotecas de expresión excepto restricción
enzimas

14. ¿Cuáles de las siguientes son características comunes de los vectores de expresión?
una. Pequeños segmentos de ADN que codifican etiquetas para la purificación de proteínas.
B. Sitios de inicio y finalización de la transcripción.
C. Un promotor estrictamente controlado que solo puede ser inducido bajo ciertas circunstancias.

D. Gen de resistencia a antibióticos.

mi. Todas las anteriores son características comunes de los vectores de expresión. 95

15. ¿Qué método se usa para construir vectores recombinantes grandes cuando las enzimas de restricción
polienlazadoras no son útiles?
una. recombinación
B. PESCADO

C. bibliotecas de genes
D. YAC

mi. hibridación

16. ¿Qué afirmación sobre la clonación de Gateway® no es cierta?

una. Los vectores de clonación Gateway® explotan un sistema de recombinación de bacteriófagos.
B. La integrasa corta dentro de los sitios attB y attP .
C. El gen ccdB produce una toxina dentro de las células huésped que portan el gen de
interesar.

D. Excisionase regoniza los sitios attL y attR para eliminar el fragmento de ADN recombinado.

mi. La clonación en el vector de entrada es necesaria para generar sitios attL en los extremos del gen
de interés.

Otras lecturas
Clark, DP (2013). Biología molecular (2ª ed.). San Diego, CA: Elsevier Academic Press.

Shlien, et al. (2010). Un mecanismo molecular común subyace a dos síndromes de microdeleciones 17p13.1
fenotípicamente distintos. Revista estadounidense de genética humana, 87, 631–642.