UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I (BC-3181)

Práctica 5. Ácidos Nucleicos.

Nairobi Escalona 17-10174; Valeria Gutierrez 17-10246; Jesús Rodríguez 17-10543

RESUMEN

Se realizó la purificación de ADN genómico de una planta y de ADN plasmídico de

E. coli. Los resultados de la relación DO260/280 fueron para genómico de 1.36 para 2 µl y
1.43 para 4 µl; y 1.7 y 1.6 tanto para 2 µl y 4 µl de las muestras de ADN plasmídico. La
concentración de ADN genómico obtenido fue de 0,57 µg/µl, y de plasmídico 0,719µg/µl y
1,032 µg/µl. Con estos datos se realizaron soluciones con la enzima de restricción EcoRI (D),
y sin enzima (SD), para aplicarlas en los bolsillos del gel de agarosa de la electroforesis. En
la corrida del ADN genómico se obtuvo que todas las muestras cargadas migraron hasta una
distancia prácticamente igual, tanto las muestras SD y D, todas con un barrido inferior; se
concluye que las muestras podrían estar contaminadas de grupos fenólicos, ARN,
carbohidratos y/o proteínas. En el caso de ADN plasmídico, en los carriles SD la banda con
menor desplazamiento corresponde a plásmidos de conformación OC y la segunda banda
corresponde a la conformación superenrollada. Para los carriles D, la banda con menor
desplazamiento pertenece a la conformación lineal de los plásmidos bacterianos. Finalmente,
el tamaño del plásmido para las medidas de 1 y 2 µg es de 8406 pb, y para 4µg es de 10251
pb. La diferencia entre estos dos valores se debe a las diferentes distancias medidas.

INTRODUCCIÓN

El ADN es la molécula donde se codifica la información genética que permite el

desarrollo y funcionamiento de los seres vivos. Al tratarse de un ácido nucleico, su unidad
estructural es el nucleótido, constituido por una base nitrogenada (guanina, adenina, citosina
y timina), un fosfato, y una desoxirribosa. La formación sucesiva de enlaces entre el grupo
fosfato unido al carbono 5´de la ribosa de un nucleótido, y el -OH en el carbono 3´de la
ribosa de otro nucleótido da origen a largos polímeros de ADN monocatenario (Pierce y col.,
2016). Debido a la complementariedad de bases nitrogenadas, la unión de dos hebras
complementarias provoca el apareamiento de sus bases mediante puentes de hidrógeno,
creando un ADN bicatenario con hebras antiparalelas. El ADN bicatenario adquiere una
conformación de doble hélice cuyas bases hidrofóbicas se encuentran en el interior y el
esqueleto de fosfatos se encuentra en el exterior, permitiendo que la molécula sea soluble en
agua. Esta estructura tan estable, junto con la ausencia de un grupo hidroxilo en el carbono 2´
de la desoxirribosa de cada nucleótidos, hace que el ADN sea una molécula ideal para el

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almacenamiento de información, además de que permite su paso a las siguientes generaciones
con alta fidelidad (Herráez, 2012).

Otra molécula similar al ADN es el ARN, cuyas diferencias consisten en que su

pentosa es una ribosa, por lo que tienen el grupo hidroxilo en el carbono 2´ de la
desoxirribosa, la timina es sustituida por el uracilo, y se encuentra de forma monocatenaria.
Debido a su menor estabilidad estructural, no cumple funciones de almacenamiento de
información (a excepción de algunos virus), sino que van orientado a la síntesis de proteínas,
como ARN mensajeros, de transferencia o ribosómico, o para regular la expresión génica,
como por ejemplo los ARN de interferencia (Pierce y col., 2016).

Los seres vivos pueden contener diversos tipos de ADN. Los organismos eucariotas
tienen cromosomas lineales de gran tamaño confinados en el núcleo, las células animales
adicionalmente tienen ADN mitocondrial de menor tamaño y circular, mientras que las
células vegetales además del ADN mitocondrial también tienen ADN circular en los
cloroplastos (Lodish y col., 2016). En cambio, las bacterias tienen un cromosoma circular,
ubicado en el nucleoide en el citoplasma, junto con los plásmidos, que son pequeños ADN
circulares que se pueden replicar independientemente del cromosoma de la bacteria, no son
esenciales para su supervivencia, pero pueden conferirles ventajas como la resistencia a un
antibiótico (Pierce y col., 2016).

Debido a que el ADN se encuentra dentro de las células y esta contiene varios tipos de
ácidos nucleicos, las técnicas de purificación son esenciales para obtener muestras
concentradas del ADN de un organismo que pueden ser usadas para clonación celular o PCR,
identificación de genes, estudios forenses o evolutivos, diagnóstico de enfermedades, entre
otro sinfín de aplicaciones (Brown, 2016). La purificación de ADN consiste en varias etapas
que van desde la toma de una muestra de tejido, la disociación de las células, el estudio de
viabilidad y caracterización celular, la lisis de las células, el fraccionamiento subcelular y la
separación del conjunto de lípidos, proteínas u otras moléculas utilizando compuestos
químicos con los que se puede alterar selectivamente la solubilidad de las moléculas y hacer
que precipiten. Procesos similares pueden ser usados para el aislamiento de ARN, teniendo
un especial cuidado debido a la frecuente contaminación con ARNasas (Herráez, 2012).

La evaluación de la pureza y concentración del ADN aislado puede realizarse con

facilidad al medir su absorbancia mediante espectrofotometría a las longitudes 260 y 280 nm
del espectro UV. Los ácidos nucleicos tienen un pico de absorción a 260 nm debido a los
anillos aromáticos de sus bases nitrogenadas, mientras que el pico de absorción de las
proteínas es a 280 nm. Al medir la absorbancia de una muestra de ADN a esas dos longitudes
de onda, se considera como pura si la relación A260/A280 es de 1.8, mientras que valores
inferiores indican la presencia de contaminantes (Brown, 2016). La concentración se puede
calcular sabiendo que 1 D.O equivale a 50 µg de ADN por mililitro (Ganske, 2014).

Por último, las nucleasas son enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster de los
polímeros de ácidos nucleicos, pudiendo clasificarse en exonucleasas si remueven un
nucleótido a la vez en los extremos de la molécula, o endonucleasas si cortan en secuencias

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internas específicas (Herráez, 2012). Con el tratamiento de una muestra de ADN con enzimas
de restricción se puede, por ejemplo, crear fragmentos que pueden ser insertados en un vector
de clonación mediante técnicas de ADN recombinante, o separar estos fragmentos mediante
electroforesis en gel, atraídos por su carga negativa, para crear mapas de restricción que
permitan la identificación de polimorfismos.

METODOLOGÍA

1. Primera sesión: extracción del ADN plasmídico y genómico. Estimación de su

concentración y pureza mediante absorción de luz en el espectro UV.

Para la extracción de ADN genómico se colectaron dos hojas para macerarse en 1000
µl de buffer de extracción frío (50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoetanol). Se
vertió en una tubo eppendorf de capacidad 1,5 ml estéril. Se adicionaron 66 µl de 20% SDS y
se agitó en vortex hasta mezclarse. Luego se incubó a 62 grados centígrados por diez
minutos.

Pasado ese tiempo, se añadieron 320 µl de 5 M acetato de potasio pH 4,5 y se mezcló

por inversión. Se centrifugó por 10 minutos a 10.000 rpm. Posterior a esto, se recolectó 0,5
ml del sobrenadante para llevarlo en un tubo estéril de microcentrífuga de capacidad 1,5 ml.
Se le agregó 250 µl de etanol absoluto.

Luego, se centrifugó por 10 minutos a 10.000 rpm y se lavó el precipitado con 1 ml de

70% etanol. Se volvió a centrifugar a 10.000 rpm por cinco minutos, se descartó el
sobrenadante y se resuspendió el pellet en 500 µl de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH
8). Se precipitó la muestra con acetato de sodio 3 M pH 5,2 (1/10 del vol.) y 2,5 vol. de
etanol absoluto. De nuevo se centrifugó por 10 minutos a 10.000 rpm. Por último, se dejó
secar el pellet por 5-10 minutos para finalmente disolverse en 50 µl de TE.

Para el aislamiento del ADN plasmídico se transfirió estérilmente 1,5 ml del cultivo
de Escherichia coli con vector de expresión y marcador de ampicilina en medio LB con
ampicilina 100 µg/ml, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de capacidad y se centrifugó a
13.000 rpm por 2 minutos para concentrar las bacterias. Se descartó el sobrenadante y se dejó
el pellet libre del medio de cultivo. Luego, se resuspendió el pellet en 100 µl de solución I
fría (lisozima (2mg/ml), 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0 y 50 mM Glucosa)
con la pipeta. La muestra quedó en hielo por 10 minutos.

Después, se agregó 200 µl de solución II (0,2 M NaOH y SDS al 1%) a temperatura

ambiente. Se mezcló por inversión y la muestra reposó por 10 minutos a temperatura
ambiente. Se añadió 150 µl de solución III (Acetato de potasio 5 M a pH 4,5) y se dejó en
hielo por 20 minutos.

Se centrifugó por 15 minutos a 13.000 rpm. Se transfirió 400 µl de sobrenadante a

otro tubo y se le colocó 800 µ de etanol 100% frío. Se mezcló lentamente y se dejó precipitar.
Luego, en una cava con hielo (-20°C) se guardó la muestra por 10 minutos y se centrifugó
nuevamente por 10 minutos a 13.000 rpm en la microcentrífuga.

3
 Después de descartar el sobrenadante se le agregó 400 µl de etanol 70% frío. Se
centrifugó por 5 minutos a 18.000 rpm y se eliminó el sobrenadante. Este procedimiento se
realizó dos veces. Al finalizar, se dejó secar el precipitado y se disolvió el ADN en 50 µl
buffer TE para su almacenamiento.

En la siguiente actividad se determinó la concentración y pureza en la extracción del

ADN plasmídico y genómico, para cada uno se realizó lo siguiente: en el espectrofotómetro,
se dispusieron 2 µl de la preparación de ADN en una cubeta de cuarzo más 750 µl de agua
destilada. La lectura de la solución se realizó a 260 y 280 nm. Se repitió el mismo paso pero
añadiendo 2 µl más de la preparación de ADN.

Luego se hizo una curva de calibración para calcular la concentración de la muestra.

Y se verificó la pureza de la preparación calculando DO260/DO280

2. Segunda sesión: Digestión con enzimas de restricción. Elaboración de geles de

agarosa. Separación electroforética de fragmentos de ADN. Tinción con bromuro de
etidio y visualización del ADN.

Tabla 1. Cantidades de ADN que se necesitan en la corrida electroforética en el gel de agarosa.

Tipo de ADN ADN Genómico ADN plasmídico. 1 ADN plasmídico. 2

Cantidad 2 µg 2 µg 4 µg

Tres tubos se marcaron como SD denotando las muestras sin enzima de restricción, y
aparte tres tubos eppendorf se les marcó una D haciendo referencia a las muestras con la
enzima de restricción EcoRI y el buffer de digestión.

Se prepararon las muestras de ADN genómico y plasmídico con las cantidades de

ADN que se expresan en la tabla anterior. En función de esto, se determinaron los volúmenes
de muestra de ADN necesarios según su concentración. A las muestras SD se completó con
agua destilada hasta los 20 µl, mientras que para las muestras D se les añadió 0,2µl de la
enzima, 2µl del buffer de digestión y se completó con agua destilada hasta los 20 µl. Los
volúmenes de muestra de ADN y agua destilada para cada caso se resumen en la siguiente
tabla:

Tabla 2. Volumen de ADN y agua destilada de cada muestra para la electroforesis.

Tipo de ADN Muestra de ADN Volumen de agua

Genómico 3,51 µl 16,5 µl

Plasmídico 2 2,78 µl 17,22 µl

SD

Plasmídico 2 3,88 µl 16,12 µl

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 Genómico 3,51 µl 14,5 µl

D Plasmídico 1 2,78 µl 15,22 µl

Plasmídico 2 3,88 µl 14,12 µl

SD: sin digerir. D: digerir.

Se incubaron los tubos con el ADN a digerir por 1 hora a 37 oC.

Mientras tanto, se prepararon dos geles de agarosa para las muestras de ADN
plasmídico y uno para las muestras de ADN genómico. En las bandejas niveladas de plástico
se colocaron los peines de acuerdo al número de bolsillos requeridos para la corrida
electroforética.

Se preparó un gel 0,8% para ADN genómico pesándose en una fiola 0,4 g de agarosa
para diluirlo en 49 ml de agua pura y un 1 ml de solución madre 50x TAE (2M Tris-base pH
8 con ácido acético glacial y 50 mM EDTA). Para la preparación del gel de 1.2% de agarosa
para ADN plasmídico, se pesaron 1,2 g de agarosa y se diluyó en 98 ml de agua y 2 ml de
50x TAE. La primera fiola tuvo un peso de 168 gramos y la segunda de 231 gramos.

Ambas soluciones se calentaron en el microondas de 30 segundos en 30 segundos

hasta que la agarosa se disolviera por completo. Se volvieron a pesar las fiolas y se llevó al
peso original con agua: a la primera se le agregó 2 ml de agua destilada y a la segunda se le
añadió 5 ml de agua destilada también. A cada fiola se le colocó una gota de bromuro de
etidio.

Las muestras se enfriaron levemente para colocarlas en las bandejas niveladas. Se

esperó a que solidificaran para retirar el peine. Se colocó el buffer de corrida en la cámara y
una vez solidificado el gel, se puso en la cámara de corrida quedando sumergido.

Las muestras fueron mezcladas con buffer de carga a una concentración final 1X
conteniendo 10% glicerol, 0,002% azul de bromofenol y TAE 1X. Para ello se usó el buffer
5X, agregando 1 µl por cada 4 ul de muestra. En total se usaron 5 µl.

Se cerraron las cámaras y se conectaron a la fuente de poder. Se corrieron las muestras

a 100 V por media hora o hasta que el azul de bromofenol llegara al final del gel.

Una vez finalizada la corrida, se apagó la fuente de poder y se abrió la cámara. Se

retiró el gel y se llevó a un transiluminador con lámpara UV. Se tomaron fotografías de los
resultados.

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RESULTADOS

Extracción del ADN genómico.

Mientras se realizaba el procedimiento de purificación se observó que al agregar el

buffer de extracción la muestra se tornaba turbia y más clarificada en cuanto a su color,
anteriormente era verde. Por ende, en las primeras etapas de centrifugación se vió un pellet
denso que cada vez se volvía más pálido. De ese modo, cuanto se precipitó el ADN con
etanol absoluto se visualizaron hilos transparentes hasta el punto de compactarse como una
única mancha en las paredes del tubo eppendorf.

Entonces, despues de agregarle 50 µl de TE y leer la absorbancia en 260 y 280 nm, se

obtuvo las siguientes lecturas:

Tabla 3. Datos de absorbancia de la extracción del ADN genómico.

Volumen de Abs 260 nm Abs 280 nm DO260/DO280
muestra

2 µl 0.034 0.025 1.36

4 µl 0.060 0.042 1.43

Figura 1. Regresión lineal del ADN genómico

La relación DO260/DO280 para un ADN purificado es 1.8, y se obtuvo que a mayor

volumen de muestra, lo cual corresponde a una mayor concentración de ADN, la relación
varió de 1.36 para 2 µl a 1.43 para 4 µl, traduciéndose en que la muestra no está
completamente pura.

6
 Con los datos de la Tabla 3, se construyó la curva de calibración y la ecuación de la
recta dio como resultado Y= 0,015*X + 1,33E-3. Entonces, al calcular la concentración total
de la muestra se tomó como ejemplo 10 µl de volumen en X, y la absorbancia resultante fue
0,1513. Ahora bien, conociendo que 1 DO equivale a 50 µg de ADN/ml, 0,1513 DO son
7,57 µg de ADN/ml. Como la cubeta usada es de 0,750ml, la cantidad de ADN total ha de ser
5,7 µg. Antes se tomó como ejemplo 10 µl de muestra, así que se divide la cantidad de ADN
resultante entre ese volumen, y finalmente la concentración de ADN genómico fue de 0,57
µg/µl.

Con esta concentración se calculó la cantidad de muestra necesaria para agregar en el

bolsillo del gel de electroforesis. Como se indicó en la sección de metodología, se requería 2
µg de ADN genómico, así que el volumen que se añadió fue 3,51 µl tanto para la muestra que
no iba a digerirse como para la muestra que contenía la enzima de restricción.

Y se logró el siguiente gel:

Figura 2. Gel de electroforesis de ADN genómico.

Se observa el marcador de peso molecular a la izquierda,

carril 1. Este corresponde a Lambda DNA/HindIII el cual produce
bandas entre 0.125 kb y 23 kb. El marcador se compone de 8
fragmentos de ADN individuales purificados (en pares de bases):
23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 (Biotools B&M
Labs.S.A., 2014). Lo observado en la Figura 1 son los fragmentos
de 23130, 9416, 6557 y 2322, 2027.

La franja señalada por la flecha roja es la muestra de ADN

digerido correspondiente del equipo 5 (carril 1). Es importante
explicar que el vacío en el gel significa que las muestras añadidas
en esos bolsillos se salieron al momento de agregar la muestra, y
una de ellas fue la del ADN no digerido del equipo 5. Entonces se

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trabajarán con las muestras adyacentes del ADN no digerido de los equipos 2, 3 y 4. Todas
las muestras obtuvieron un barrido en el gel.

Cabe destacar que no se calcularon las cantidades de pares de bases de las muestras
SD y D porque se está trabajando como moléculas de ADN cromosómicos grandes y
altamente enrolladas, así que no se obtendrá una estimación real del tamaño de este ADN.

Extracción de ADN plasmídico

Similar al ADN genómico, en el caso del plasmídico las muestras se tornaron turbias
al agregar el buffer de extracción, por lo que al centrifugar se pudo observar el pellet pálido
de cada una. Se visualizaron los hilos formados en la precipitación del ADN en ambas
muestras, de menor tamaño que el genómico y con apariencia mucosa blanquecina. Después
de agregarle 50 µl de TE a cada uno y medir la absorbancia se obtuvo la siguiente tabla:

Tabla 4. Datos de absorbancia de la extracción del ADN plasmídico.

Muestra Volumen de Abs 260 Abs 280 DO260/DO280
muestra

2 µl 0,035 0,020 1,75

Plasmídico 1
4 µl 0,077 0,044 1,75

2 µl 0,055 0,033 1,66

Plasmídico 2
4 µl 0,110 0.0654 1,68

Con los datos de la Tabla 4, se construyeron las curvas de calibración de cada muestra
de ADN plasmídico:

Figura 3. Regresión lineal del ADN plasmídico 1.

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 Figura 4. Regresión lineal del ADN plasmídico 2.

Mediante estas rectas, con el mismo procedimiento descrito para ADN genómico, se
determinó que la concentración de ADN plasmídico en la muestra 1 fue de 0,719 μg/μl,
mientras que para la muestra 2 fue de 1,032 μg/μl.

Con los valores obtenidos se calculó el volumen necesario para realizar la corrida
electroforética. Como se indica en la Tabla 1, la cantidad de AD correspondiente para la
muestra 1 fue 2 μg y para la muestra 2 fue 4μg. Resultó el siguiente gel:

Figura 5. Gel de electroforesis de ADN plasmídico 2022.

En la Figura 5 se muestra la corrida de electroforesis de muestras de 1, 2 y

adicionalmente 4 µg de ADN plasmídico. A la izquierda se encuentra el marcador de peso
molecular Lambda HindIII con el mismo patrón de la Figura 2, pero en este caso sí se ve la
banda de 564 pb. Utilizando estos datos se construyó la siguiente curva de calibración:

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 Figura 6. Curva de calibración de marcadores de peso molecular 2022.

Se puede observar que para las muestras de 1 y 2 µg de ADN se identifica una sola
banda con el mismo desplazamiento, tanto para digerido como para no digerido. Con los
datos de los marcadores de peso molecular se obtuvo una gráfica con ecuación y =-0,0431*x
+ 5,39, y un R2 de 0,923. Asumiendo el carril digerido como el correspondiente a ADN
lineal, con esta curva se determinó que el tamaño del plásmido es de 8406 pb.

En cuanto a la muestra con 4 µg de ADN, en el carril sin digerir se puede ver dos
bandas, lo que corresponde a ADN con diferentes configuraciones. Para el carril con el
plásmido digerido con configuración lineal, en este caso sí se observa un ligero
desplazamiento, y el cálculo de su tamaño es de 10251 pb. La diferencia entre este valor y el
anterior se debe a las diferentes distancias medidas.

En la Figura 7 se encuentra otra electroforesis de un aislamiento de ADN plasmídico.

Se ven dos bandas en los carriles con el plásmido digerido, mientras que en los carriles no
digeridos se observa tres bandas. En algunos carriles de este gel se les agregó ARNasa a las
muestras, por lo que no se ven las bandas grandes al final del gel como en los otros carriles y
las muestras de la Figura 5.

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 Figura 7. Gel de electroforesis de ADN plasmídico, año desconocido.

Con los marcadores de peso molecular se graficó la siguiente curva de calibración,

considerando que en este caso sí se observaron siete bandas características del marcador
Lambda HindIII, a excepción de la de 125 pb.

Figura 8. Curva de calibración de marcadores de peso molecular 2022.

Se obtuvo una curva de calibración con ecuación y= -0,0256*x + 5,03 y un R2 de

0,994. Usando esta curva se calculó que el tamaño de los dos fragmentos de los carriles
digeridos es de 4188 pb y 714 pb. De las bandas del carril sin digerir, la segunda corresponde

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a ADN plasmídico lineal, por lo que con su distancia podemos saber el tamaño total del
plásmido, que es de 6327 pb. La suma de 4188 pb más 714 pb da 4902 pb, significativamente
alejado del valor calculado para el plásmido completo, lo cual se puede deber a que el
desplazamiento de los fragmentos no fue uniforme en proporción a sus tamaños..

Con esta información se construyó el siguiente mapa de restricción:

Figura 9. Mapa de restricción del plásmido.

Como se puede ver en la Figura 9, el plásmido tiene dos sitios de restricción para la
enzima TOPO, lo que provoca que se formen los dos fragmentos que se pueden identificar en
el gel.

DISCUSIÓN

Como se ha visto en prácticas anteriores, la espectrofotometría se basa en el paso de

un haz de luz en una solución con moléculas suspendidas, que mide la intensidad de luz
absorbida de las mismas. En el caso del ADN y ARN presentan una absorbancia máxima a
una longitud de onda de 260nm, es decir en el espectro UV. Mientras mayor luz absorba la
muestra, mayor concentración de ácidos nucleicos y mayor será el valor de la absorbancia.
Esto se puede medir mediante unidades de densidad óptica (DO), que tiene valores
particulares para cada molécula específica en una determinada longitud de onda por unidad
de distancia. Para los ácidos nucleicos, y como se ha mencionado anteriormente, una OD de 1
a 260 nm equivale a 50 μg/ml de ADN doble cadena (Rodríguez y Rizo, 2011)

Es conocido que el ADN está acompañado de proteínas que ayudan en su

compactación y su adecuado funcionamiento, por lo que es casi imposible obtener una
muestra de ADN 100% libre de proteínas. Entonces para medir la pureza en una muestra de
ADN se usa la proporción 260/280; debido que el espectro de absorción de las moléculas es
particular de cada molécula se divide la absorbancia obtenida a 260 nm entre la obtenida a
280 nm, ya que las proteínas (en particular los aminoácidos aromáticos) absorben luz a dicha
longitud de onda. La presencia de proteínas en una muestra hará disminuir el valor de dicha
relación. El valor de pureza óptimo es 1,8, menor a 1,6 se considera que la muestra está
contaminada. Si el valor es mayor a 2,0 se considera que la muestra está pura pero también
indica una rotura de las cadenas de los ácidos nucleicos, y se considera que es un ácido
nucleico de calidad insuficiente (Rodríguez y Rizo, 2011; Departamento de control de calidad
del Banco Nacional de ADN, 2010).

Castro y col (2013) indican que el mayor rendimiento en la obtención de ADN

genómico se consiguen en las hojas de las plantas debido a la gran cantidad de células

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nucleadas que las conforman (epidermis, hipodermis, mesófilo y los tejidos del floema),
además que poseen paredes celulares delgadas. Alejos y col (2014) explican que los tejidos
foliares jóvenes tienen más células por unidad de peso que un tejido viejo y contienen menos
polisacáridos y polifenoles. Sin embargo, al purificar el ADN la relación DO260 / DO280 fue
menor a 1.8, lo que indica presencia de contaminantes, como proteínas en la muestra (Clark,
2005; Alejos y col, 2014).

Alejos y col (2014) también mencionan que si la relación 260/230 es menor al rango
2.0-2.2 se entiende como presencia de fenoles y carbohidratos. Debido a que no se realizó
este análisis no es posible determinar con exactitud la presencia de estos componentes. Pero,
según el estudio de Azmat y col (2012), los polisacáridos y fenólicos pueden coprecipitar con
los ácidos nucleicos, bajando así el rendimiento de purificación del ADN (Sika y col, 2015).
Para mejorar la pureza se podrían utilizar en experimentos posteriores tejidos foliares
jóvenes.

Para poder observar los resultados de la electroforesis se utiliza un colorante

fluorescente, que en este caso es el bromuro de etidio. Es una sustancia que se intercala en la
doble hélice del ADN cambiando su conformación. Al ser irradiado con luz UV fluoresce de
color naranja; su longitud de onda de absorción es 254nm y tiene una longitud de emisión a
366nm. Su sensibilidad permite detectar aproximadamente 30 pg (picogramos) de ácido
nucleico por banda. El inconveniente de este colorante es que es altamente teratogénico,
mutagénico y cancerígeno, por lo que actualmente se ha sustituido con otros colorantes como
SYBR Green, el cual presenta un bajo nivel de mutagenicidad comparado con el bromuro de
etidio y es 25 veces más fluorescente. Es un fluoróforo que se une con gran afinidad al surco
menor del ADN bicatenario. Puede detectar 60 pg de ADN doble cadena por banda, 1-2 ng
oligonucleótidos, y 100 a 300 pg de ARN o ADN monocatenario por banda, gracias a su
epiiluminación de 254 nm (Rodríguez y Rizo, 2011; Echeverry y col, 2013).

Al evaluar la muestra del carril 1 en la electroforesis en el gel de agarosa con el uso de

la enzima restricción EcoRI, se observó como parte de la muestra migró pero sin
diferenciarse en franjas, sino que se creó un barrido bajo una banda de alta intensidad. Esto
significa que la muestra se fragmentó por acción de la enzima (Alejos y col, 2014). Lo mismo
se observó para las demás alícuotas de los otros equipos. Guzmán y col (2018) mencionan
que ese barrido puede significar DNA degradado, fragmentado o presencia de RNA
contaminante. También puede tratarse de los fenoles, polisacáridos y otros metabolitos
secundarios que conllevan a un bajo rendimiento de ADN mediante la modificación de
enzimas, como las de restricción (Friar, 2005). Muchas plantas producen metabolitos
secundarios que les aportan resistencia hacia patógenos, entre estos están los compuestos
fenólicos (Pérez, 2017), así que no es de extrañar que sí se presentó contaminación de
compuestos fenólicos estos reaccionaron con la enzima EcoRI perteneciente a la bacteria
E.coli.

Por otra parte, es importante considerar que la distribución de los fragmentos en el gel
de agarosa implica un contenido de ADN bastante significativo, más o menos puro, como
resultado de una alta calidad del ADN extraído (Huang y col, 2013).

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 Se destaca que todas las muestras obtuvieron bandas de intensidades similares y
puede ser debido a que todos los grupos tomaron muestras de la misma planta. Y, como se
explicó con anterioridad, no se calcularon las cantidades de pares de bases de las muestras SD
y D porque se está trabajando con moléculas de ADN cromosómicos grandes y altamente
enrolladas, donde en las muestras D migró un ADN super compactado y en las muestras SD
migraron moléculas de ADN grandes y pequeñas en diferentes conformaciones originadas del
corte realizado por la enzima de restricción, por lo que la estimación real del tamaño del
ADN será imposible con los datos reflejados en la figura 2.

En el caso de ADN plasmídico la relación 260/280 fue de 1,66 y 1,75, que de acuerdo
al Departamento de control de calidad del Banco Nacional de ADN (2010) se considera una
pureza aceptable. Para ambas muestras el coeficiente de correlación da como resultado un
valor cercano o igual a uno, lo que indica la linealidad entre las variables y, por lo tanto, que
el proceso de purificación fue realizado exitosamente (Rodrigo, 2016).

Los plásmidos son elementos pequeños circulares de ADN presentes en bacterias que
pueden existir en varias conformaciones: cerradas covalentemente (Covalently Closed
Circular, CCC), abiertas circulares (Open Circular, OC) o lineales (L), donde estas últimas
son consecuencia de la ruptura de la cadena de ADN (Coll y col, 2005). En el caso del carril
SD de la muestra de 4 µg de la Figura 5, la banda con menor desplazamiento corresponde a
plásmidos de conformación OC, y la segunda banda corresponde a la conformación
superenrollada, donde los plásmidos están más empaquetados y pueden desplazarse con
mayor facilidad en el gel, razón por la cual no se ve una migración uniforme y se puede
interpretar erróneamente como una diferencia en el peso molecular (Yábar, 2003). Cabe
destacar, que en el carril de 4µg las bandas se visualizaron con mayor intensidad, más
detalladas a simple vista, debido a la mayor cantidad de ADN plasmídico agregado. En el
carril D, donde se añadió la enzima de digestión EcoRI, la banda con menor desplazamiento
pertenece a la conformación lineal de los plásmidos bacterianos (Hintermann, 1981). Por
último, las bandas difusas que se observan al final son moléculas de ARN que se encontraba
en la muestra, pudiéndose ver el aumento de la intensidad a medida que aumenta la
concentración (Novogene, s.f).

Por último, una variable importante que podemos identificar al ver un gel de agarosa
es la intensidad de las bandas. Un ejemplo es en la Figura 5, donde las bandas de las muestras
con 1 y 2 μg de ADN tienen menor intensidad que cuando se utilizó 4 μg. Utilizando
estándares con concentración conocida, se puede hacer una estimación de la concentración de
las muestras de ADN que se está trabajando (Promega Corporation, s.f). Así, conociendo el
volumen de muestra cargado en la electroforesis, se puede obtener un valor aproximado de su
concentración comparando la intensidad de las bandas. Sin embargo, para más exactitud lo
ideal es utilizar.

CONCLUSIONES

El ADN puede ser aislado de muestras de tejido, como de hijas de plantas, o cultivos
de bacterias. De acuerdo al tipo de ADN que se busca aislar, sea genómico y plasmídico, y

14
según la procedencia de la muestra, se aplica un conjunto de métodos físicos y químicos para
la eliminación de los otros compuestos celulares.

A pesar de que con estos métodos se logra obtener muestras concentradas de ADN,
estas pueden estar contaminadas. La relación DO260/DO280 permite conocer el grado de
pureza de una muestra, y se consiguió que la pureza fue mayor al aislar ADN plasmídico en
bacterias, debido a que al extraer ADN genómico de plantas es normal la contaminación con
grupos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos. Con la densidad óptica también se pudo
determinar la concentración de estas muestras.

Mediante electroforesis en gel de agarosa se puede analizar una muestra de ADN,

usando o no enzimas de restricción. El ADN genómico, debido a su gran tamaño, se ve como
un barrido a lo largo de la columna, mientras que en los plásmidos, que son elementos
genómicos de menor tamaño, sí identifican bandas aisladas.

Utilizando marcadores de peso molecular se pudo determinar el tamaño del plásmido.

Para esto fue necesario tomar en cuenta las diferentes conformaciones de los plásmidos, y
utilizar la conformación lineal, cuyo plásmido ha sido cortado con la enzima, como la que
representa el tamaño correcto del plásmido.

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