Practica 1.- Modelado por homología.
1.- Caso de estudio.
La proteasa del VIH-1, se encarga de cortar los precursores proteicos virales durante la
etapa final del ciclo de replicación del virus. Su actividad inicia el ensamble, donde las
proteínas cortadas e individuales interactúan con el RNA mensaje, generando los virus
maduros con potencial infeccioso.
Con un EC number 3.4.23.16, es clasificada como una aspartil proteasa, una enzima capaz
de catalizar la hidrolisis del enlace peptídico utilizando residuos de aspartato para dicho fin.
Los monómeros de la proteasa del VIH-1 tiene un peso molecular de alrededor de 10.64 kDa
con 99 residuos en su estructura. Esta enzima solo tiene actividad como dímero.
La proteasa del VIH-1 es un objetivo principal en el tratamiento del VIH/SIDA. Los inhibidores
de la proteasa son una clase importante de fármacos antirretrovirales utilizados en terapias
combinadas para suprimir la replicación del VIH y prevenir la progresión de la enfermedad.
Figura 1.- proteasa del VIH-1, estructura 3D.
2.- identificación de templados (15 min)
El primer paso en el modelado por homología es identificar la estructura templado, que
daremos como referencia a alpha fold para predecir el modelo tridimensional de nuestra
proteína de interés. Vayamos a la página de NCBI blastp
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins), este algoritmo realiza alineamientos
locales múltiples sobre bases de datos, otorgando porcentajes de identidad (similitud) y
puntajes de comparación entre la secuencia problemas y las proteínas detectadas con mayor
similitud durante el proceso.
Una vez en la página, copiaremos la secuencia de aminoácidos de la proteína VIH-1, la cual
encontraran en la carpeta del día 1, con el nombre HIV-1.fst. Pegamos la secuencia en el
apartado Enter Query Sequence. Además, pediremos al programa que realice los
alineamientos únicamente con proteínas con estructura resuelta, para ello fijaremos al
“Protein Data Bank” como la base sobre la cual se realizaran los alineamientos en la sección
Standar > Database. Para evitar obtener como templados los cristales ya revelados de esta
proteína, agregaremos en la sección Standard > Organism los 3 organismo que se
especifican en la figura 1, al finalizar presionamos en BLAST.
Figura 2.- Pagina de Blastp configurada para buscar templados para HIV-1.
Pasado un tiempo, deberíamos ver una ventana similar a la de la figura 3, con los resultados
del alineamiento. Hemos identificados 4 potenciales estructuras en le Protein Data Bank que
nos podrían servir como templados, en todos los casos los porcentajes de identidad rondan
el 50%, un escenario muy común en las investigaciones reales.
Figura 3.- Resultados del Blastp sobre la HIV-1
Corregiremos ahora los porcentajes de identidad, realizando alineamientos globales, para
ellos descargaremos las secuencias encontradas en el blastp, con la opción Download >
FAST (complete sequence), con ello deberíamos descargar un archivo usualmente de
nombre seqdump.txt o con esa extensión. Nos dirigimos al servidor en línea de Clustal
Omega (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo), deberíamos observar y configurar la
ventana del programa, similar a lo mostrado en la figura 4. Para esto apegaremos en en
Input sequence, las secuencias obtenidas con el Blastp y nuestra secuencia problema.
Como formato de salida escogemos ClustalW en la sección Parameter. Finalmente damos un
título al tabajo de alineamiento en la sección Submit > Title. Por último damos click en Submit
para iniciar los alineamientos globales.
Figura 4.- Página principal de Clustal Omega.
Al finalizar los alineamientos obtendremos una ventana de resultados similar al de la figura 5.
En ella nos dirigimos a la pestañan Result Files y descargamos la matriz de porcentajes de
identidad.
Figura 5.- Ventana de resultados Clustal Omega.
El archivo descargado contiene la matriz de los porcentajes de identidad de los alineamientos
globales, la cual debería verse como la mostrada en la figura 5. Con ella escogeremos al
mejor templado, siendo aquel que presento la similitud más, es decir el porcentaje de
identidad mayor entre las 4 referencias, para el caso de este ejemplo fue la estructura con
PDB-ID 1SIP, correspondiente a la proteasa proveniente del Virus de inmunodeficiencia de
los simios.
Figura 7.- Matriz de identidad.
3.- Preparación del templado (5 minutos).
Una vez identificado el templado, el siguiente paso es descargarlo y refinarlo para usarlo en
el modelado. Esto consiste en quitarle moléculas de agua estructural, cosolventes y ligandos
ajenos a la molécula de proteína. Para ello utilizaremos el programa Quimera UCF, abrimos
el software y nos dirigimos a la sección File > Fetch by ID. En la ventana emergente
seleccionaremos PDB (ya está preconfigurado así) y escribiremos el PDB ID 1sip, damos clic
en Fetch y como resultado deberíamos ver a la estructura de la proteína en el visualizador.
Figura 8.- Templado seleccionado.
Con la estructura cargada seleccionamos las aguas con la opción Select > Residue > HOH y
procedemos a eliminarlas con Actions > Atoms/Bonds > delete. El resultado debería ser una estructura
limpia como la mostrada en la figura 6. Guardamos la molécula con la opción File > Save PDB.
Figura 9.- Templado limpio.
4.- Construcción del modelo por homología.
Nos dirigimos a la herramienta en línea de Alphafold2
(https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb).
Configuramos la pagina agregando la secuencia de la HIV-1 presente en nuestra carpeta de
trabajo en formato fasta. Agregaremos la secuencia dos veces separando las cadenas con
dos puntos. Agregaremos el nombre que deseemos, configuraremos para obtener una
estructura relajada con num_relax: 1 y para poder usar un templado seleccionamos
template_mode: custom. Al final deberíamos obtener una página configurada similar a la
presentada en la figura 7.
Figura 10.- Página principal del Alpha fold.
Para ejecutar el programa nos dirigimos a Entorno de ejecución > Ejecutar todo, confirmamos
la ejecución en la ventana emergente. Algunos segundos después se activará la opción para
cargar el templado, cargamos la estructura limpia con PDB-ID 1sip previamente creada.
Dejaremos que el programa genere el modelo, al finalizar se activara automáticamente una
descarga que contendrá los resultados del modelado.
