o

ACTIVIDAD N 3: ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN

Temario: Interacción de la radiación con la materia. Absorción de radiación. Ley de

Lambert-Beer.

Introducción
Durante mucho tiempo se ha utilizado el color como una ayuda para la identificación de
sustancias en ciencias químicas. La espectrofotometría se puede considerar como la
“extensión de la inspección visual” en donde un estudio más detallado de la absorción de
energía radiante por las especies químicas permite una mayor precisión en su
caracterización y en su cuantificación. Al reemplazar el ojo humano con otros
detectores de radiación podemos estudiar la absorción fuera de la región visible del
espectro y con frecuencia podemos realizar los experimentos espectrofotométricos en
forma automática.
El término espectrofotometría sugiere la medición de la cantidad de energía radiante
que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, así
como las mediciones por separado a una longitud de onda determinada. En otras
palabras, el término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las
concentraciones de sustancias químicas.
Los cuerpos luminosos como el sol o una lámpara eléctrica, emiten radiación en un amplio
espectro que comprende muchas longitudes de onda. Aquellas longitudes de onda que
están asociadas con la luz visible son capaces de afectar la retina del ojo humano y con
ello dan origen a las impresiones subjetivas de la visión. Pero gran parte de la radiación
que emiten los cuerpos calientes, caen fuera de la región donde el ojo humano es
sensible, hablamos de las regiones ultravioleta e infrarrojo ubicadas a ambos lados de la
región visible del espectro. El espectro electromagnético completo está clasificado en
forma aproximado como se muestra en la Figura I.

Figura I: Espectro electromagnético

La parte de la molécula a la que se debe la absorción de la luz se llama cromóforo.

Cualquier sustancia que absorba luz visible se verá coloreada cuando refleje la luz
blanca o cuando ésta, se transmita por ella. La sustancia absorbe ciertas longitudes
de onda de la luz
1
blanca y el ojo humano detecta las longitudes de onda no absorbidas (reflejadas). En la
Tabla 1 se presenta una guía de colores aproximada. El color observado es el
complementario del color que se absorbe. Por ejemplo, el azul de bromofenol presenta
un máximo de absorbancia visible a 614 nm y su color observado es el azul.

Tabla 1: frecuencia y longitud de onda correspondiente a cada color del espectro

visible

La teoría ondulatoria de la luz explica de forma satisfactoria varios fenómenos ópticos

como reflexión, refracción y difracción. Sin embargo, otros resultados experimentales
como el efecto fotoeléctrico son mejor interpretados si la luz es considerada de
naturaleza corpuscular, como un haz de fotones que viajan a la velocidad de la luz y cuya
energía está relacionada con la frecuencia de la radiación según:
E=h
-34
donde h es la constante de Planck (h = 6,62608 x 10 J s) y  es la frecuencia de la
radiación. Esta forma de energía como radiación, puede ser absorbida por las moléculas
bajo determinadas condiciones.
Además de la energía de movimiento de traslación, una molécula posee energía interna
que puede subdividirse en tres clases. Primero, la molécula puede rotar en varios ejes y
poseer cierta cantidad de energía rotacional. Segundo, los átomos o grupos de átomos
que están en la molécula pueden vibrar, esto es, moverse periódicamente unas con
respecto a otras en sus posiciones de equilibrio, lo que da a la molécula una energía de
vibración. Por último, una molécula posee energía electrónica, que es la energía asociada
con la posición y distribución de los electrones alrededor de los núcleos de los átomos.
En general, la energía traslacional de una molécula puede tomar cualquier valor, pero no
sucede lo mismo con las otras formas de energía. Uno de los resultados fundamentales
de la teoría cuántica es que una molécula sólo puede estar en ciertos estados de energía.
Por lo tanto, las tres formas de energía mencionadas arriba están cuantizadas; esto es,
cada molécula posee su propio conjunto de niveles de energía a los que es posible
acceder. Para que una molécula pase a otro nivel energético, debe absorber una cantidad
de energía correspondiente a la diferencia entre dichos niveles. Dicho de otro modo, si
la diferencia entre dos niveles de energía próximos de una molécula es, por ejemplo 3
eV, ésta no puede absorber energía de 1,5 eV ya que no existe el nivel de energía
correspondiente.

2
La radiación puede considerarse formada por fotones de energía determinada (h) y de
este modo, la energía molecular está cuantizada. Cuando una molécula es irradiada con
luz de distintas longitudes de onda, sólo serán absorbidas por la molécula las longitudes
de onda correspondientes a los fotones cuya energía es igual a la de una transición
permitida entre estados de la molécula, el resto será simplemente transmitido y pasará
sin atenuarse. O sea que cuando se irradian las moléculas con muchas longitudes de
onda, del haz incidente sólo se sustraerán aquellas longitudes de onda que correspondan
a los fotones de energía apropiados para permitir las transiciones de energía molecular,
y las demás longitudes de onda sencillamente serán emitidas.
Los niveles de energía rotacional de una molécula están muy cercanos. Las transiciones
rotacionales puras requieren relativamente poca energía y se inducen por medio de
radiaciones de baja frecuencia (longitud de onda larga). Es en las regiones de Infrarrojo
lejano y de microondas del espectro en donde las absorciones de radiación están
correlacionadas con cambios en la energía rotacional únicamente.
Los niveles de energía vibracional están más separados. Se necesitan fotones más
energéticos. En la región del Infrarrojo del espectro se observa la absorción debida a
transiciones de vibración (las transiciones de rotación se sobreponen en ellas).
La absorción de luz visible y de radiación ultravioleta aumenta la energía de una
molécula. Esto es, la energía de los fotones permite que los electrones puedan vencer un
poco de la fuerza que los mantiene unido al núcleo y que se muevan hacia orbitales de
mayor energía. Los efectos de vibración y de rotación se sobreponen al cambio
electrónico, pero la región de la absorción está determinada por los niveles de energía
electrónica de la molécula.
Una molécula posee un espectro de absorción característico que corresponde a la
absorción de longitudes de onda tales que coinciden con las transiciones propias de la
molécula. Como se mencionó antes, la absorción de luz ultravioleta y visible
corresponde a la excitación de niveles de energía electrónicos. La presencia de niveles
de energía vibracionales y rotacionales superpuestos con los estados electrónicos de una
molécula hace que su espectro de absorción de radiación UV-visible sea complejo. Si la
especie se encuentra en solución se suma la interacción del solvente. Estos efectos
hacen que el espectro de absorción de una especie en solución sea una curva que varía
continuamente con uno o más picos a ciertas longitudes de onda.

Aspectos cuantitativos. Ley de Lambert-Beer

Cuando un haz de luz de determinada longitud de onda incide sobre una muestra pueden
ocurrir dos cosas: que la luz sea transmitida en toda su intensidad (en cuyo caso implica
que la muestra es transparente a esa longitud de onda), o que parte de la luz sea
absorbida. El espectro de absorción de una sustancia es indicativo de las regiones del
espectro electromagnético en las cuales la muestra es o no transparente. Dicho en otras
palabras, es indicativo de las regiones del espectro electromagnético en las que la
muestra absorbe radiación.
Si un haz de luz de intensidad Io y de longitud de onda  incide sobre una celda o cubeta
transparente (cuarzo) de espesor b, que contiene una solución de concentración C de una
sustancia que absorbe luz a esa longitud de onda, parte de la radiación será absorbida
y parte transmitida  I < Io.

3
 
Io I

Figura II

La transmitancia (T) de una solución se define como:

T = (I / Io)

El porcentaje de transmitancia (%T) se define como % T = (I / I o) x 100 y da idea de la

fracción de luz absorbida por la muestra de concentración C, a dicha longitud de
onda. La fracción de luz absorbida depende de la distancia que el haz de luz atraviesa en
la celda donde se encuentra la muestra; a esta distancia se la denomina paso óptico
(indicada como b en la Figura II). Si b es mayor, la intensidad de luz transmitida es
menor.
La fracción de luz absorbida también depende de la concentración de la solución. Se
observa que, si la solución es más concentrada, la intensidad de luz transmitida también
es menor. Existe una dependencia de la transmitancia con la concentración y el paso
óptico para una dada sustancia a una dada longitud de onda:

T = f (C, b)

La transmitancia NO ES una función lineal de la concentración ni del paso óptico,

pero el logaritmo de la transmitancia sí lo es:
- log T = log(Io/I)
- log T =  b C

Se define Absorbancia (A)

A = -log T

como: O lo que es lo mismo,

Es decir que la absorbancia es proporcional
A =  ab la
C concentración y al paso óptico de la
solución  ley de Lambert-Beer que relaciona la absorbancia con la concentración de
la solución y con el paso óptico de la celda.
A partir de esta ecuación se puede determinar la concentración de una especie en
solución, midiendo la absorbancia a una dada longitud de onda, para un paso óptico b
constante. El coeficiente  es llamado coeficiente de absortividad molar o de
extinción y depende de la sustancia en particular y de la longitud de onda de trabajo.
Sabiendo que T = %T / 100, la absorbancia también puede escribirse como:
A = 2  log (%T)

4
La medición espectrofotométrica
Si bien el ojo humano es capaz de apreciar variaciones muy pequeñas de intensidad de
luz, no es adecuado cuando se trata de medir la absorción de luz en forma cuantitativa.
Para esto, se utiliza un espectrofotómetro. La Figura III muestra un esquema simple de
los componentes básicos de un espectrofotómetro.

El espectrofotómetro consta de:

a) Una fuente de radiación, que para las mediciones realizadas en la zona visible del
espectro es simplemente una lámpara de tungsteno alimentada por una fuente
estabilizada para evitar fluctuaciones en la luz;
b) un monocromador encargado de producir la separación de las distintas longitudes de
onda y así seleccionar la correspondiente al análisis que se desea realizar;
c) un portacelda donde se coloca una celda con la muestra a analizar y cuya naturaleza
dependerá del tipo de radiación del espectro electromagnético que se esté empleando;
d) un detector, que mide la cantidad de luz que sale de la celda luego de atravesar la
muestra y la transforma en una señal eléctrica que es finalmente, registrada por un
dispositivo de lectura. La señal producida por el detector es medida a través de un
dispositivo de lectura analógico o digital que da el % de transmitancia o la absorbancia.

Io I
Detector
Lectura
monocromador
Fuente
de luz Celda de
muestra
Figura III

Ajuste del cero eléctrico

En los aparatos más antiguos, previo a la medición espectrofotométrica es necesario el
ajuste del cero del dispositivo de lectura o cero eléctrico, el que se realiza bloqueando
totalmente el paso de luz, a fin de que ésta no llegue al detector. Como resultado, si la
lectura no es exactamente cero, se traslada la aguja o lector a este valor con los
controles que el aparato tiene para ese fin. En los instrumentos más modernos (como el
que se usará en el trabajo práctico) esta etapa no es necesaria.

Ajuste del cero de absorbancia

A continuación se describe la primer etapa a realizar cuando se utilizan los
espectrofotómetros modernos. Inicialmente se debe ajustar el 100 % de transmitancia
(o cero de absorbancia) a cada una de las longitudes de onda a las que se desea medir. A
tal fin se debe preparar una solución blanco, la cual contiene todos los reactivos
empleados para preparar la solución a analizar, menos la especie que se está por
analizar mediante espectrofotometría. Con esta solución se ajusta en el dispositivo de
lectura, la máxima transmitancia posible % T = 100 (absorbancia igual a cero, A = 0). Una
vez realizado este paso, se coloca la solución con el analito en la celda, y se lee la

5
transmitancia o absorbancia correspondiente. Obviamente, la cantidad de luz
transmitida es, en este caso, menor que en el blanco ya que esta solución sí contiene el
analito.

Curva espectral
El primer paso que se debe realizar cuando se va a efectuar la determinación de la
concentración de un dado compuesto por espectrofotometría UV-visible, es la selección
de la longitud de onda de trabajo, para lo cual se debe construir una curva espectral
(gráfico A vs ). A tal fin se debe usar una solución del compuesto de interés de
concentración intermedia (no demasiado concentrada) y se debe medir la absorbancia
para cada longitud de onda en un amplio intervalo de longitudes de onda. Una vez
obtenido el espectro de este compuesto se selecciona la longitud de onda adecuada,
teniendo en cuenta que se debe llegar a una situación de compromiso entre dos
aspectos: la longitud de onda seleccionada tendrá que ser tal que se corresponda
con un máximo de absorbancia, pero ésta debe corresponder a una zona donde la
absorbancia no varíe demasiado con  (ver Figura IV).
Mientras se efectúa el barrido de longitudes de onda se está trabajando con una misma
celda de un determinado paso óptico b y con una solución de una dada concentración C.
Debido a esto, lo único que se está modificando es la absorbancia para las distintas
longitudes de onda, es decir, la absortividad molar del compuesto. De esta forma, la
curva espectral da información acerca de cómo varían las absortividades molares del
compuesto con la longitud de onda.

Figura IV

Curva de trabajo o de calibración

Si se va a efectuar la determinación cuantitativa de un dado compuesto, es necesario
conocer además de la longitud de onda de trabajo, su absortividad molar () a fin de
poder emplear la ecuación que surge de la ley de Lambert y Beer (A =  b C). Por lo
tanto, será necesario conocer la absortividad molar () de dicho compuesto a la longitud
de onda de trabajo seleccionada.
Para poder calcular la absortividad molar del compuesto se deberá construir una curva
de calibración o de trabajo (Figura V)  gráfico de absorbancia (a una dada
longitud de onda) en función de la concentración de soluciones estándar del

6
compuesto que se

7
está analizando (A vs C). Se deben preparar varias soluciones estándar (de
concentración perfectamente conocida) del compuesto en estudio (al menos 5) y luego
se debe efectúa la determinación de la absorbancia de cada una, a la longitud de onda
seleccionada, con lo cual se tendrá un conjunto de valores de absorbancia para cada una
de las soluciones preparadas. Si se grafica A vs C utilizando varias concentraciones
estándar (en unidades M), en un cierto intervalo de concentraciones se obtiene una
recta cuya pendiente es igual al valor de  x b. Este tipo de gráfico puede ser utilizado
para determinar la concentración incógnita de una solución a partir de una lectura de
absorbancia de dicha solución.

Figura V

Concentración (μM)

Es importante destacar que, dependiendo del sistema de trabajo puede haber

desviaciones del comportamiento esperado según la ley de Lambert-Beer, las que se
discutirán en profundidad en otra asignatura de la carrera. De todos modos, es
-1 -1
necesario destacar que el coeficiente de absortividad molar (, unidades = M cm )
se calcula a partir de la pendiente de la porción lineal de la curva de calibración.

8
 o
Actividad teórico-práctica N 2: Cuestionario de orientación

1- a) Indicar los límites de longitud de onda de la radiación visible en el espectro

electromagnético.
b) Calcular la longitud de onda expresada en nm y Å correspondiente a las siguientes
9 -1 15 -1
frecuencias: 1.97 x 10 s y 4.86 x 10 s
c) Calcular la energía de un mol de fotones de 261.5 nm.

2 - a) Enuncie la ley de Lambert-Beer.

b) Indique J.S.R. de qué factor/es depende la absortividad molar ().

3- a) Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de

porcentajes de transmitancia:
I) 0 % II) 10% III) 100%

b) Calcular el % T que corresponde a cada uno de los siguientes valores de

absorbancia: I) 0,0 II) 0,20 III) 2,00

4- Indique J.S.R. porqué es necesario realizar un blanco cuando se realizan mediciones

espectrofotométricas.

5- Indique J.S.R. cómo se construye una curva espectral y la información que se

obtiene a partir de ella.

6- Indique J.S.R. cómo se construye una curva de calibración (o de trabajo) y la

información que se obtiene a partir de la misma.

7- Indique J.S.R. cuál es el criterio que emplea para decidir si una dada solución
cumple con la ley de Lambert y Beer.

8- El Índigo es un compuesto orgánico con un distintivo color azul. Se utiliza

industrialmente como colorante para la tinción de telas, entre ellas el Denim (jean).

A. A continuación, se presenta el espectro de absorción UV-Vis (o curva espectral) de

Índigo disuelto en agua.

9
 máx= 280
nm

máx=
239 nm máx= 615 Indigo
nm
máx= 337
nm

a. Señale en la curva espectral que variable se mide en el eje X y en el eje Y.

Escríbalo sobre las líneas punteadas.
b. ¿Cuántos máximos de absorción muestra el espectro de absorción de índigo?
c. Si necesitara determinar la concentración de índigo en una solución acuosa ¿Qué
longitud (o longitudes) de onda seleccionaría para hacerlo? ¿Por qué?

B. En la siguiente tabla se presentan los valores de absorbancia (Abs) de soluciones

acuosas de índigo de concentración conocida (soluciones testigos) a dos longitudes
de onda, que corresponden a máximos de absorción (máx). Las lecturas de
absorbancia se obtuvieron con una cubeta de 1 cm de paso óptico. Con los datos de la
tabla construya la curva de calibración (o curva de trabajo) a 280 nm y a 615 nm.
Para ello utilice las cuadrículas que se encuentran a continuación.

NOTA: poner especial énfasis en confeccionar las escalas numéricas completas y

correctas.
Concentración (M) Abs 280 nm Abs 615 nm
-5
0,5 x 10 0,170 0,100
-5
1,0 x 10 0,340 0,200
-5
1,8 x 10 0,603 0,360
-5
3,0 x 10 1,000 0,600
-5
3,5 x 10 1,170 0,700
-5
5,0 x 10 1,500 1,010
-5
7,0 x 10 1,650 1,410
-5
9,0 x 10 1,700 1,500
-5
10,0 x 10 1,690 1,520

d. En la curva de calibración:
i) ¿Qué variable es representada en el eje X y en el eje Y? Escríbalas en las
líneas punteadas de las cuadrículas.
ii) Indique a que longitud de onda corresponde cada curva de calibración.
iii) Complete correctamente la escala numérica de cada curva de calibración.

10
ACTIVIDAD EXPERIMENTAL Nº 3: ESPECTROFOTOMETRÍA UV/VISIBLE.
ACTIVIDAD VIRTUAL
SE RECOMIENDA ESTUDIAR LAS CONSIDERACIONES TEÓRICAS DE LOS
TEMAS QUE INCLUYE EL TRABAJO PRÁCTICO Y OBSERVAR LOS VIDEOS
CORRESPONDIENTES.
1) LEY DE LAMBERT Y BEER
En este experimento virtual se estudiarán las variables involucradas en la absorción UV-
Vis de diferentes soluciones. Para ello se accederá a la página web:
https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-lab_en.html
Allí seleccione la opción que muestra la pantalla principal del programa como la que se
representa a continuación:

Utilizando este simulador, se realizarán las siguientes actividades:

- Encienda la fuente de luz presionando el botón rojo. ¿Empieza a medir algo el detector?
- Tilde “preset” (equivale a seleccionar automáticamente la máxima absortividad de la
solución elegida).
- Desplazar la regla hasta la parte inferior de la celda espectrofotométrica para medir
el paso óptico.
- Mueva el detector fuera del camino del haz de luz, luego parcialmente y finalmente
déjelo centrado en el haz. Discuta con su docente lo observado.
- Modifique el ancho de la celda usando las flechas de la parte inferior y observe el
efecto sobre la absorbancia y luego seleccione transmitancia y repita el proceso.
Comente los resultados observados.

11
- Ajuste el ancho de la celda en 1 cm y seleccione 100 mM de cloruro de níquel (II).
Luego, registre la longitud de onda del máximo de absorbancia y el valor de la misma.
Cambie la longitud de onda a “variable” y seleccione la longitud de onda de 545 nm. ¿Qué
observa en los valores de absorbancia? ¿Cuáles son los colores de la solución y del haz
de luz? Explique.
- Seleccione 100mM de sulfato de cobre (II). Registre la longitud de onda máxima
(“preset”) y la absorbancia de la solución. Calcule y compare el valor de épsilon a la
longitud de onda de absorción máxima de esta solución con la solución de cloruro de
níquel (II). Cambie la longitud de onda a “variable” y seleccione la longitud de onda de
490nm. ¿Qué observa en los valores de absorbancia? ¿Cuáles son los colores de la
solución y del haz de luz? Explique.
- Seleccione 300 mM de permanganato de potasio y tilde longitud de onda “variable”.
Luego, lleve el cursor hasta 400 nm y registre la absorbancia. Repita la medición
realizando incrementos de 20 en 20 nm hasta 780 nm. Dibuje el espectro obtenido y
observe como va cambiando el color de la luz conforme cambia la longitud de onda del
haz y de forma simultánea como cambia la absorción de la solución frente a cada haz de
luz. Comente los resultados obtenidos con su docente.

2) OPERACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
En este experimento virtual se realizan las operaciones básicas de manejo de un
espectrofotómetro, preparación de diluciones, selección de longitud de onda y usos de
muestras blanco. Para ello se accederá a la página web:
http://biomodel.uah.es/lab/abs/espectro.htm
La pantalla principal del programa se muestra a continuación:

Utilizando este simulador, se realizarán las siguientes actividades:

12
Leer detenidamente la pestaña “Instrucciones” en la cual se detalla el uso del simulador
como el manejo de la pipeta Pasteur, cargado de soluciones en las cubetas, descarte de
residuos y operación del espectrofotómetro. Mientras esta pestaña esté seleccionada,
el espectrofotómetro virtual no podrá producir una curva espectral.
1) Seleccione la pestaña "A y conc”. Tilde con el ratón la subpestaña “Actividad 1 -
Relación entre absorbancia y concentración”. En esta actividad y en las siguientes podrá
realizar curvas espectrales. Comente a su docente si presenta alguna dificultad o duda
al realizar los procedimientos solicitados y discuta los resultados obtenidos al realizar
este ejercicio.
2) Seleccione la pestaña "Pigmentos” y luego “espectros patrón”. Realice las actividades
solicitadas en la página.
3) Posteriormente, complete secuencialmente las actividades “extractos”. Discuta con
su docente los resultados obtenidos.
4) Complete las actividades en la pestaña “curva de calibrado”. Discuta con su docente
los resultados obtenidos.

3) CURVA DE CALIBRACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

Para desarrollar esta parte del trabajo práctico, el estudiante debe tener resuelto el
problema 8 del cuestionario de orientación, de manera que pueda confrontar los
resultados obtenidos de forma manual y la planilla de Excel con la que trabajará durante
el TP.
Para el procesamiento de datos correspondientes a una curva de calibración
espectrofotométrica, la determinación de la recta de calibrado y posteriormente el
cálculo de la concentración de muestras incógnita se utilizará la hoja de cálculo Excel
que se muestra a continuación:
https://docs.google.com/spreadsheets/d/1qBU22qXBsHv46NK7ulV66OTqzq8x-
AnN/edit?usp=sharing&ouid=113417300402784406321&rtpof=true&sd=true

13
Utilizando esta hoja de cálculo prediseñada, se realizarán las siguientes actividades:

1) Ingresar en la planilla las concentraciones y absorbancias de muestras patrón que le

dictará su docente (entre 5 y 10 puntos). Observe y discuta si algunos de los puntos
deben ser descartados por pérdida de relación lineal.
2) Una vez seleccionados los puntos, registre las constantes de la curva de regresión y
el coeficiente de correlación. Discuta con su docente los resultados obtenidos.
3) Ingresar en la planilla las absorbancias de las muestras incógnitas y calcule con la
planilla los valores de concentración de las mismas. Vuelva a ingresar alguno de los
valores descartados y observe su efecto sobre la curva de calibrado, coeficiente de
correlación, la estimación de la concentración de la muestra incógnita y su error
porcentual. Explique.

14
INFORME DE ACTIVIDAD EXPERIMENTAL Nº 3: ESPECTROFOTOMETRÍA
UV/VISIBLE.

Nombres: Montesino Ariana

Giovannini Malbran Fiama
Comisión: 4B Fecha: 14/09/23

1) LEY DE LAMBERT Y BEER

a) De acuerdo a la experiencia realizada en el simulador se observó que la
absorbancia es (directamente/inversamente) proporcional a la sección de la celda
o paso óptico y (directamente/inversamente) proporcional a la concentración.
Además, la absortividad es (independiente/dependiente) de la composición de la
solución, siendo (independiente/dependiente) de la longitud de onda. Lo mismo es
observado en la transmitancia, la cual (aumenta/disminuye) al incrementar el paso
óptico y (aumenta/disminuye) al utilizar una solución de menor concentración.
b) Respecto a las soluciones A) cloruro de níquel (II) y B) sulfato de cobre (II), se
observó que:
 Λmax (A): 433nm  (A): 5,3x 10-3M-1 CM-
 Λmax (B):780n  (B):9,6x10-3 M-1 Cm-1
 Abs A (b=1cm, c=100mM, Λmax): 0,53 Abs B (b=1cm, c=100mM, Λmax):0,96
 Abs A (b=1cm, c=100mM, Λ545nm):0,01 Abs B (b=1cm, c=100mM, Λ490nm):0,01
 Por lo tanto, las soluciones A y B expuestas a haces de luz de igual color
respectivamente, presentan (baja/alta) absortividad molar. J.S.R.
Si utilizamos un haz de luz del mismo color que la solución la absorbancia
disminuirá a tal punto de ser 0, porque es el color que se refleja.
c) La curva espectral obtenida con el simulador para la solución de permanganato de
potasio es la siguiente:

15
2) OPERACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
a) En la operación experimental simulada del espectrofotómetro se observó que se
debe respetar el Volumen mínimo de solución en la celda para realizar la lectura y
siempre Cerrar la tapa del instrumento. Al realizar diluciones se debe Vaciar la celda
antes de medir. Asimismo, se debe llevar a C e r o la absorbancia utilizando una
celda denominada Solución Blanco , la cual contiene agua o solo los reactivos en
ausencia del analito.
Las diluciones se realizan utilizando una pipeta del tipo Pasteur , para la curva
de calibración
b) De acuerdo a la actividad 1 - Relación entre absorbancia y concentración, los
resultados obtenidos de la medición de las diluciones de paranitrofenol (pNF) son las
siguientes:
Abs (1): Abs (2): Abs (3):  (pNF):
c) De acuerdo a la actividad – Pigmentos - Espectros patrón, si las muestras tienen una
concentración de 1 mg/mL, indique:

Compuesto Λmax local 1 1 Λmax local 2 2

Clorofila a
Clorofila b
Beta-caroteno

d) De acuerdo a la actividad – Pigmentos – Curva de calibrado, indique:

Muestra Abs ( ) Abs ( ) C clorofila a C beta-caroteno

nm nm (mg/mL) (mg/mL)
Fracción 1
Fracción 2
¿Qué puede concluir de cada una de las fracciones a partir de los resultados obtenidos?

3) CURVA DE CALIBRACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

Se introdujeron inicialmente_____puntos en la curva de calibrado, obteniendo un
2
coeficiente de correlación R de _ _ _ _. Se descartaron por lo tanto_____puntos
debido a__________________________________________________________.
2
Luego de seleccionar las muestras que presentan adecuada respuesta, se obtuvo un R
de _ _ _ _ y la siguiente ecuación de la recta de calibrado:_____________________.
Se determinó la concentración de las muestras incógnitas observando que el error antes
y después de descartar los puntos de la curva de calibrado: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
____________________________________________
También se observó que al calcular las concentraciones de las muestras incógnitas el
error (aumentaba/disminuía) si la absorbancia estaba situada en extremos de la curva
de calibración.

16