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MANEJO DE MATERIALES Y PATRONES DE P-ALIM-2

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Ítem Elaboración Revisión Aprobación

Shirley Fuentes /
Personal Gaby Moreno Gaby Moreno
Edward Peñares
Analista de microbiología y
Puesto parasitología / Jefe de Laboratorio Jefe de Laboratorio
Consultor externo

Fecha 2021-Nov-17 2021-Nov-18 2021-Nov-18

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1. OBJETIVO
Definir los pasos para el mantenimiento, conservación y control de la calidad de
los materiales de referencia utilizadas para la evaluación de la performance de los
métodos de ensayos y controles internos.

2. ALCANCE
Se aplica a todos los materiales de referencia utilizados en los Laboratorios ALAB
EIRL.

3. POLITICA
No aplica.

4. DEFINICIONES

4.1. Material de referencia (MR)

Material o sustancia en la cual uno o más valores de sus propiedades son
suficientemente homogéneos y están bien definidos para permitir utilizarlos
para la calibración de un instrumento, la evaluación de un método de
medición, o la asignación de valores a los materiales.

4.2. Material de referencia certificado (MRC)

Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más
valores de sus propiedades están certificados por un procedimiento que
establece su trazabilidad con una realización exacta de la unidad en la que
se expresan los valores de la propiedad y para la cual cada valor certificado
se acompaña de una incertidumbre con la indicación de un nivel de
confianza.

4.3. Material de referencia interno (MRI)

Es el material de referencia preparado por un laboratorio para su propio uso.

4.4. Cepas de referencia (CR)

Microorganismos obtenidos de una colección nacional o internacional
reconocida.

4.5. Cepas de reserva (Cr)

Cepas obtenidas a partir del cultivo de un microorganismo de referencia
conservada por un laboratorio.

4.6. Cepas de trabajo (Ct)

Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva
para ser utilizados en los ensayos que lo precisen.

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5. RESPONSABILIDAD

5.1. Jefe de Laboratorio

Responsable de verificar el cumplimiento del presente documento.

5.2. Supervisor de Laboratorio

Responsable de revisar y asegurar el cumplimiento del presente
documento.

5.3. Analista de Laboratorio

Cumplir con lo establecido e identificar cualquier desviación

6. DESCRIPCIÓN
El mantenimiento y conservación de los materiales y patrones de referencia se
realizan de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

6.1. Manejo de Materiales de Referencia en el Laboratorio Microbiológico

El material de referencia ingresado y verificado en el laboratorio se registra
en:

 F-ALIM-2.1 Lista de cepas de referencia

Asimismo se registra sus datos generales y especificaciones técnicas en:

 F-ALIM-2.2 Ficha técnica de

material de referencia.

6.1.1. Reconstitución De Cepas De Referencia

Las cepas de referencia se almacenan refrigeradas de 2-8º C hasta
su utilización.

Para la presentación en asa (kwik-stik) romper la envoltura y retirar

el asa. Tomar la punta del asa y presionar suavemente para
disgregar el inóculo. Sembrar en los medios y condiciones indicados
para cada tipo de microorganismos. Ver Anexo III.

6.1.2. Obtención de Cepas de Reserva

i. Las cepas de reserva se obtienen de las cepas de referencia
reconstituidas. Tomar el medio enriquecido a partir de la cepa de
referencia para su transferencia a un criovial/tubo previamente
rotulado e indicando el nombre de la cepa, el código, lote
correlativo (1, 2, 3…), la fecha de producción y la fecha de
vencimiento.

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ii. Agregar a 18-20 crioviales, 0.15 – 0.20 ml de glicerol estéril y

completar hasta 1 ml con el cultivo de 24 horas a 35-37ºC obtenido
a partir de la cepa de referencia. Almacenarlos a -20°C ± 5 ºC.

iii. Para algunos microorganismos no es adecuado el modo de

conservación descrito anteriormente, por lo que se seguirá las
siguientes pautas:
 Anaerobios esporulados: Inocular los clostridios en tubos con
medio carne cocida en anaerobiosis e incubar a 37ºC por 24
horas. Conservar en refrigeración de 2-8ºC
 Levaduras y mohos: Inocular los mohos o levaduras en tubos
con OGYE inclinado e incubar a 22ºC entre 3-5 días.
Conservar en refrigeración 2-8ºC.

iv. El tiempo de vida de las cepas de reserva es de 18 meses,

excepto las cepas de reserva de anaerobios esporulados que se
conservan por un periodo máximo de 6 meses. Las cepas de
termófilos se conservan durante 1 mes y se extrae uno de ellos
semanalmente para la cepa de trabajo.
v. Para producir un nuevo lote de cepas de reserva se puede utilizar
un criovial de un lote previamente obtenido en el laboratorio. Se
enriquece el medio de cultivo apropiado para cada
microorganismo con dicho vial y luego se procede siguiendo los
pasos 2 al 4.
vi. Cuando se observe que las cepas de reserva no cumplan con sus
características morfológicas, bioquímicas y/o serológicas el
laboratorio deberá adquirir una nueva cepa de referencia.

6.1.3. Obtención de Cepas de Trabajo

i. Las cepas de trabajo se obtendrán a partir de las cepas de reserva que
son extraídas mensualmente (4 cepas de trabajo por mes).
ii. Para las cepas de reservas guardadas en criovial, descongelar a
temperatura ambiente o incubadora controlada (35ºC o 37ºC) por 15
minutos.
iii. A partir del criovial descongelado transferir el cultivo al medio BHI-fluido
(0.8-1%). Incubar a 35ºC o 37ºC por 24 horas. Los crioviales con cepas
de reserva descongelados no deben volver a congelarse y deben ser
autoclavados y descartados.
iv. Para las cepas conservadas en refrigeración tomar el tubo de reserva y
repicar a un medio nuevo de mantenimiento: para el caso de los
anaerobios esporulados repicar a caldo tioglicolato e incubar a 35ºC o
37ºC por 24 horas y para las levaduras y mohos repicar a un medio OGYE
inclinado en incubar a 22ºC entre 3-5 días.

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v. Conservar los cultivos obtenidos en medio semisólido a 2-

8ºC.Semanalmente extraer un tubo para el trabajo rutinario. Descartar al
concluir la semana.

6.1.4. Obtención de Cepas de Trabajo

vi. Las cepas de referencia se verifican según lo especificado en el Anexo II.
vii. Cada cuatro meses se realiza el control de las cepas de reserva.
viii. Mensualmente se verificará las características morfológicas de las cepas
de trabajo en medios característicos. Esta verificación puede ser hecha
en base al control de medios de cultivo, controles de ensayo o de manera
independiente.
ix. Registrar los resultados obtenidos en:
 F-ALIM-2.3 Verificación de cepas.

6.1.5. Eliminación
Una vez pasada la fecha de vencimiento de las cepas de referencia, trabajo
o de reserva, los crioviales o tubos serán autoclavados, a 121ºC x 30
minutos, para una adecuada eliminación.

7. FORMATOS

Tiempo de
Código Documento Custodia-
Registros
F-ALIM-2.1 Lista de cepas de referencia 4 años

F-ALIM-2.2 Ficha Técnica de Material de Referencia 4 años

F-ALIM-2.3 Verificación de cepas 4 años

8. REFERENCIAS NORMATIVA
No aplica.

9. REFERENCIAS

9.1. Guía para la acreditación de laboratorios de microbiología de alimentos.

Alicia Irene Cuesta. FAO.
9.2. Conservación bacteriana por método simple a temperatura ambiente: una
alternativa viable. Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y
Microbiología. Revista Cubana Higiene y Ed 2005; 43(2).

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9.3. La conservación de cepas microbianas. María Dolores García López y

Federico Uruburu Fernández. Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
Universitat de Valencia. 46100 Burjasso.
9.4. Gestión interna de las cepas utilizadas como material microbiológico de
referencia en un laboratorio de servicios acreditado bajo norma ISO/IEC
17025. CEQUIMAP
9.5. Instructivo material referencia cepas bacteriana (material de referencia
terciario). IT-211.00-02. ISP Chile
9.6. Aseguramiento de calidad. CULTIVOS DE REFERENCIA. Norma ISO
17025. Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO.
9.7. Aseguramiento de la Calidad en las Coleciones de Cultivos Microbianos.
CENSA, La Haban. Cuba. Lic. Nivian Montes de Oca Martinez y col. 2006.
9.8. Manual de control de calidad en microbiología. Lic. Eric Caballero.
9.9. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 22 nd Ed.
Part 9020. Quality Assurance.
9.10. Microbiologics. Recommended grotwh requirements.

10. ANEXOS

10.1. Anexo N°1: Flujograma de Manejo de Cepas

10.2. Anexo N°2: Características de Control de Cepas.
10.3. Anexo N°3 Medios y Condiciones para la Reconstitución de Cepas de
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ANEXO N°1
FLUJOGRAMA DE MANEJO DE CEPAS

Cepa de referencia
(CR)

Reconstitución de cepas de
referencia. Verificación.

Obtención de cepas de reserva.Cr.

Verificación.

Obtención de cepas de trabajo Ct.

Verificación

Utilización de Ct en ensayos
de rutina

Vencimiento y
descarte.

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ANEXO N°2
CARACTERÍSTICAS DE CONTROL DE CEPAS.

CEPA PRUEBA RESULTADO ESPERADO

Tinción GRAM Bastones rectos gram negativos.

Colonias verdosas con brillo metálico y

Crecimiento en agar EMB
centro negro
Escherichia coli ATCC 25922
Fluorescencia en EC MUG Fluorescencia fuerte

IMViC ++--

Caldo LST/EC/BRILA Turbidez abundante y gas

Tinción GRAM Bastones rectos gram negativos.

Colonias verdosas con brillo metálico y

Crecimiento en agar EMB
centro negro
Escherichia coli NCTC 13216
Fluorescencia en EC MUG Fluorescencia débil

IMViC ++--

Caldo LST/EC/BRILA Turbidez abundante y gas

Tinción Gram Bastones rectos gram positivos.

Colonias (5 mm) rojas, rugosas y secas,

Crecimiento en agar MYP con halo de precipitación sobre fondo
rosa-púrpura

Crecimiento en caldo-lisozima Positiva

Bacillus cereus ATCC 14579
Reducción del nitrato Positiva

Descomposición de la tirosina Positiva

Fermentación anaerobia de la
Positiva
glucosa
Reacción de Voges Proskauer Positiva

Cocos gram positivos unicelulares, en

Tinción Gram
pares o en cadenas

Colonias negras de 2-3mm con brillo y

Crecimiento en Agar Baird
rodeada de dos halos (uno opaco
Parker
adyacente y uno claro externo)
S. aureus ATCC 25923
Prueba de la Coagulasa Positivo
Fermentación anaerobia de
Positivo
Glucosa

Crecimiento Caldo Giolliti Ennegrecimiento del medio en el fondo

Cantoni o en toda la columna del tubo.

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Células levaduriformes gram positivas

Tinción Gram
ovales o esféricas.
Colonias cremosas no menores a 2.5
Crecimiento en agar OGYE
S. cerevisiae ATCC 9763 mm
Asimilación de glucosa Positivo

Asimilación de ramnosa Negativo

Tinción Gram Bastones rectos gram positivos

Crecimiento en agar TSC/SPF Colonias negras.

Licuefacción de la
C. perfringens ATCC 13124 Positivo/Positivo.
gelatina/Asimilación de lactosa.

Reducción de nitratos Positivo

Movilidad Negativa.

Tinción Gram Bastones rectos gram negativos

Colonias negras con halo y brillo. (ojo de
Crecimiento en SB
pescado)
Crecimiento en XLD Colonias rosadas con centro negro

S. typhimurium ATCC 14028 Crecimiento en VB Colonias rosadas y lisas.

Agar TSI K/A H2S positivo

Agar LIA K/K H2S positivo

Antisuero O-Vi Positivo

Antisuero H Positivo
Crecimiento radial filamentoso (blanco-
Aspergillus brasiliensis ATCC Crecimiento en OGYE
amarillento) que se torna negro.
16404
Tinción azul lactofenol Cadenas de pequeñas conidias
Células ovoides gram positivas en pares
Tinción Gram
o en cadenas cortas

Crecimiento en BHI +NaCl 6.5% Positivo

Enterococcus faecalis ATCC
29212 Descomposición de la tirosina Positivo

Asimilación de xilosa Negativo

Asimilación de manitol Positivo

Bastones rectos o curvados gram
Tinción gram
negativos
Crecimiento en A. nutricio Pigmentación verde
Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 Tirosina Positivo

Gelatina Positivo

Citrato Positivo

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Colonias redondas, cremosas, 1-2 mm

Crecimiento en Agar nutricio
de diámetro.

Colonias rosadas, cremosas, 1-2 mm de

Crecimiento en MYP
diámetro sin halo

Crecimiento en caldo-lisozima Negativo

Brevibacillus laterosporus ATCC
64 Reducción del nitrato Negativo

Descomposición de la tirosina Negativo

Fermentación anaerobia de la
Negativo
glucosa

Reacción de Voges Proskauer Negativo

Bastones cortos gram positivos con

Tinción Gram
bordes redondeados
Colonias pequeñas, oscuras, con halo
Crecimiento en agar Oxford
oscuro sobre fondo claro.

Asimilación de maltosa Positivo

Listeria monocytogenes ATCC Asimilación de manitol Negativo

19111
Asimilación de xilosa Negativo

Asimilación de ramnosa Positivo

Β-hemólisis β-hemólisis suave.

Catalasa Positiva

Bastones cortos gram positivos con

Tinción Gram
bordes redondeados

Colonias pequeñas, oscuras, con halo

Crecimiento en agar Oxford
oscuro sobre fondo claro.

Crecimiento en agar Cromo Colonias pequeñas, azul/verde

génico rodeadas de un halo blanco opaco

Listeria monocytogenes ATCC Asimilación de maltosa Positivo

19115
Asimilación de manitol Negativo

Asimilación de xilosa Negativo

Asimilación de ramnosa Positivo

Β-hemólisis β-hemólisis suave.

Catalasa Positiva

Bastones cortos gram positivos con

Listeria ivanovii ATCC 19119 Tinción Gram
bordes redondeados

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Colonias pequeñas, oscuras, con halo

Crecimiento en agar Oxford
oscuro sobre fondo claro.
Asimilación de maltosa Positivo

Asimilación de manitol Negativo

Asimilación de xilosa Positiva

Asimilación de ramnosa Negativa

Β-hemólisis β-hemólisis fuerte e intensa.

Catalasa Positiva
Bastones cortos gram positivos con
Tinción Gram
bordes redondeados
Colonias pequeñas, oscuras, con halo
Crecimiento en agar Oxford
oscuro sobre fondo claro.
Asimilación de maltosa Positivo

Listeria innocua ATCC 33090 Asimilación de manitol Negativo

Asimilación de xilosa Negativo

Asimilación de ramnosa Positivo

Β-hemólisis β-hemólisis negativa.

Catalasa Positiva
Bastones cortos gram positivos con
Tinción Gram
bordes redondeados
Colonias pequeñas, oscuras, con halo
Crecimiento en agar Oxford
oscuro sobre fondo claro.
Asimilación de maltosa Positivo

Listeria seeligeri ATCC 35967 Asimilación de manitol Negativo

Asimilación de xilosa Positivo

Asimilación de ramnosa Negativo

Β-hemólisis β-hemólisis positivo

Catalasa Positiva

Tinción Gram Bastones y cocos gram positivos.

Crecimiento en agar nutricio o Colonias cremosas de 1-2mm que

tripticasa soya tornan naranjas-rojas a las 72-96 h.

Asimilación de manitol Negativo

Rhodococcus equi ATCC 6939
Asimilación de xilosa Negativo

β -hemólisis β-hemólisis negativa.

Catalasa Positiva

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Tinción GRAM Bastones rectos gram negativos.

Colonias púrpuras rosadas con halo

Crecimiento en agar VRBA
Klebsiella pneumoniae ATCC ligero
13883 IMViC -- ++

Crecimiento y turbidez. Sin

Caldo EC-MUG
fluorescencia bajo luz UV a 366 nm.

Tinción GRAM Bastones rectos Gram positivos

Crecimiento en agar MYP Colonias amarillas

catalasa Positiva
Bacillus coagulans ATCC 7050
Reducción del nitrato Negativo

Indol Negativo

Tinción Gram Bastones rectos Gram positivos

Crecimiento en agar TSC/SPF Colonias negras.

Clostridium perfringens tipo A Licuefacción de la
NCTC 8237 Positivo/Positivo.
gelatina/Asimilación de lactosa.
Reducción de nitratos Negativo.

Movilidad. Negativo.

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ANEXO N°3
MEDIOS Y CONDICIONES PARA LA RECONSTITUCIÓN DE CEPAS DE
REFERENCIA

Cepa de referencia Medio/Condiciones.

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Escherichia coli ATCC 25922 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Escherichia coli NCTC 13216 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Bacillus cereus ATCC 14579 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

S. aureus ATCC 25923 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

S. cerevisiae ATCC 9763

Caldo glucosa + extracto de levadura/20ºC-
24ºC/72-120 h
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Clostridium perfringens ATCC 13124 Caldo Carne cocida/35ºC o 37ºC/18-24h

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

P. aeruginosa ATCC 27853 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Brevibacillus laterosporus ATCC 64 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Listeria monocytogenes ATCC 19111 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Listeria monocytogenes ATCC 19115 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Listeria ivanovii ATCC 19119 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Listeria innocua ATCC 33090 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Listeria seeligeri ATCC 35967 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24 h

Rhodococcus equi ATCC 6939 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/72-96 h

Klebsiella penumoniae ATCC 13883 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/18-24

Bacillus coagulans ATCC 7050 Caldo BHI o TS/35ºC o 37ºC/48-72h

Clostrium perfringens NCTC 8237 Caldo Carne cocida/35ºC o 37ºC/18-24h

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