Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia.
Laboratorio de Microbiología General
Presentado por: Maria Paula Salamanca Martinez
PRACTICA 1. MICROSCOPIA (Preparaciones en fresco y tinciones simples)
Objetivo Principal: Identificar la microscopía como herramienta principal para la
observación y evaluación de diferentes organismos (procariotas, eucariotas, virus, hongos,
y parásitos).
Objetivos específicos:
Identificar y comparar las diferentes microscopías existentes, identificando sus
distintas utilidades para la visualización de diversos microorganismos.
Reconocer y comparar las diferentes preparaciones de muestras (preparaciones en
fresco y tinciones simples) para la observación de distintos microorganismos.
Resultados y discusión:
El microscopio es uno de los elementos indispensables en un laboratorio de microbiología,
pues sin ayuda de esta herramienta viviríamos ignorando un gran porcentaje de la vida
existente en el planeta y que nuestros ojos por sí solos no alcanzan a distinguir. El
microscopio es indispensable para la observación de microorganismos, así como de sus
propias estructuras; en un principio partimos de instrumentos ópticos más sencillos, pero
actualmente se han desarrollado tecnologías cada vez más sofisticadas que nos han
permitido entender cada vez más a estos seres diminutos.
Los microscopios se pueden clasificar básicamente en dos tipos: microscopios de luz
(ópticos) y microscopios electrónicos, y ambos difieren en principio debido a su poder de
resolución. Para ambos tipos de microscopios se requiere de una correcta adecuación de
la muestra que se va a observar, por lo cual existen diversas técnicas que apuntan a
diferentes utilidades, dependiendo de que es lo que se quiere observar, determinar y/o
investigar.
En el microscopio óptico de campo claro que es el más común, tenemos básicamente un
área que se encuentra bien iluminada, de modo que los objetos pueden ser visualizados
debido al contraste existente entre aquellos que absorben o dispersan la luz y el medio en
el que se encuentran, sin embargo la mayoría de microorganismos es difícilmente
identificable haciendo uso de este microscopio debido a que no son muy contrastables en
el medio en el que se encuentran, por lo cual tenemos distintas técnicas de preparación de
muestras y de microscopía usadas para aumentar el contraste, para visualizar mejor a los
microorganismos y ciertas estructuras de estos. En este caso discutiremos principalmente
acerca de dos preparaciones de muestra: la preparación en fresco y la tinción simple.
La preparación en fresco o técnica lamina laminilla, consiste en colocar una gota de fluido
que contenga a los microorganismos entre un portaobjetos y un cubreobjetos, mientras que
en la técnica de tinción simple la muestra se coloca en un portaobjetos y se fija
generalmente por calor para proseguir con la tinción añadiendo una gota de solución
colorante al portaobjetos. A continuación, podemos evidenciar dos micrografías que
evidencian las diferencias entre estas preparaciones:
Figura 1. Micrografía de microorganismos en Figura 2. Micrografía de células bacterianas
una gota de agua identificadas por tinción simple
Debido a como se realizan las dos preparaciones podemos saber de entrada qué vamos a
determinar dependiendo de que técnica usemos, ya que como se puede observar en la
figura 1, en las preparaciones en fresco podemos diferenciar a grandes rasgos entre
microorganismos (por ejemplo, aquellos que se puedan encontrar en una gota de agua
eucariotas y procariotas), podemos visualizar su movilidad, color y tamaño básicamente sin
alteraciones de su medio natural. Sin embargo encontramos un limitante en la observación
de estas células, ya que el protoplasma de los microorganismos posee un índice de
refracción cercano al del agua, por lo que las células más pequeñas (bacterias) y sus
estructuras no podrán llegar a diferenciarse, en este caso el uso de colorantes como el azul
de metileno, safranina y cristal violeta nos sirven de gran ayuda para que estas células
puedan ser distinguidas al microscopio haciendo uso de la técnica de tinción simple como
se observa en la figura 2.
Para la técnica de tinción simple, el fijado de por sí mata a la célula debido a que muchos
colorantes solo son efectivos después de esto se realiza, de modo que no podemos llegar
a ver aspectos como su movilidad, además los colorantes usados son generalmente
básicos, ya que presentan afinidad con zonas de las bacterias que presentan un
comportamiento de ácido, la interacción entonces entre colorante y las partes afines de la
célula provocan la alteración de esta impidiendo su correcto funcionamiento y llevándola
también a la muerte, se pueden usar ciertos colorantes en muy bajas concentraciones para
intentar mantener viva a la célula, pero de igual modo la tinción simple sigue siendo una
técnica que a pesar de matar a la célula nos permite distinguir su estructura y estudiarla a
fondo.
Con la finalidad de realizar diferentes observaciones a nivel de microscopia óptica, tenemos
la microscopia de fluorescencia que se usa para obtener imágenes de muestras que
fluorescen ya sea por su naturaleza o por colorantes usados para este fin, esta microscopía
resulta muy útil para marcar ciertas zonas, tejidos u organelos, de modo que podemos
darnos cuenta de ciertos aspectos funcionales de los microorganismos que estamos
visualizando. Otra de las microscopías usadas por medio de una técnica más sofisticada es
la microscopia confocal, en esta se hace uso de un laser que excita una delgada capa de
la muestra de modo que se recoge solo la luz emitida por la capa del objetivo, produciendo
una imagen y sin la interferencia de las moléculas fluorescentes en las capas aledañas
como sucedería con la microscopia de fluorescencia.
Por otro lado para visualizar con mucha mejor resolución a los diversos microorganismos
tenemos una técnica diferente conocida como microscopía electrónica, esta consiste a
grandes rasgos en que usan un haz de electrones para generar la imagen de el espécimen
que se quiera visualizar, estos microscopios no solo se usan para visualizar las estructuras
celulares a grandes rasgos, si no que se pueden evidenciar estructuras subcelulares y los
compartimientos que hay dentro de ellas; sin embargo estas tienen la limitación de que las
muestras a deben estar al vacío y generalmente deben de tener una preparación mediante
un largo proceso de fijación, lo que significa que no es posible observar células vivas.
Tenemos 2 tipos principales de microscopia electrónica: la microscopía electrónica de
barrido (MEB) que nos permite crear imágenes en 3D detalladas de las superficies a
visualizar y la microscopía electrónica de transmisión (MET) que nos sirve para obtener
imágenes detalladas de las estructuras internas de las células.
Como se ha discutido a lo largo de este documento existen diversos tipos de técnicas
microscópicas y de preparación de muestras incluso más allá de las mencionadas cuando
se trata de realizar observaciones microbiológicas, cada una tiene sus ventajas, utilidades
y desventajas, y es nuestro deber conocerlas y aplicarlas a lo que buscamos como
investigadores.
Conclusiones:
A lo largo de los años se han desarrollado diferentes tecnologías y técnicas
microscópicas que nos han permitido investigar cada vez mas profundamente a los
diversos microorganismos existentes y que se acomodan a nuestras necesidades
como investigadores.
Dependiendo de como se realice la preparación de una muestra para ser observada,
podemos visualizar diferentes aspectos de los especímenes observados como la
morfología, el color, la movilidad y las estructuras básicas.
La microscopía desde su origen nos ha abierto un mundo nuevo que se sigue
estudiando a fondo y desarrollando nuevas y sofisticadas tecnologías con la
finalidad de entender aquello que no vemos a simple vista y que tiene tanta
influencia en nuestras vidas, los microorganismos.
Referencias:
Figura 1 tomada de: https://es.dreamstime.com/foto-de-archivo-microorganismo-
unicelular-de-agua-dulce-macro-estupenda-del-zooplancton-image77813581
Figura 2 tomada de: https://raizrevoluta.wordpress.com/2018/01/31/laboratorio-
tincion-simple-y-tincion-diferencial-de-bacterias/
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v=onepage&q=preparaciones%20en%20fresco%20y%20tincion%20simple&f=false
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de la salud y afines. 2.a edición. Madrid, España: Alianza Editorial.
PREGUNTAS:
1. ¿Cómo se encuentra conformado el sistema óptico del microscopio?
Dentro de los elementos que conforman el
sistema óptico de un microscopio se
encuentran todos aquellos que estén
involucrados en la manipulación de la luz y la
formación de la imagen aumentada.
Los dos elementos principales del sistema
óptico de un microscopio corresponden al
objetivo y el ocular además el sistema de
iluminación, el foco, el condensador, el
diafragma y los prismas ópticos.
Objetivo: es el sistema de lentes
situado más cerca de la muestra y
que proporciona una primera imagen
aumentada de la observación.
Ocular: El ocular es el conjunto de lentes a través del cual observamos la muestra
con los ojos y que produce además un segundo aumento de la imagen.
Fuente de luz: La fuente de luz es un elemento esencial de todo microscopio ya
que emite la luz necesaria para iluminar la muestra. Esta luz se dirige a continuación
hacia la muestra y llega a los objetivos en los que se crea la imagen aumentada.
Condensador: El condensador es una parte del microscopio construida a partir de
una combinación de lentes y que dirige hacia la muestra los rayos de luz emitidos
por la fuente de luz o foco. Este elemento está siempre situado entre la platina y la
fuente de luz.
Diafragma: El diafragma es otra pieza esencial para ajustar las condiciones de la
luz que llega a la muestra. Su función es abrir o cerrar una apertura que deja pasar
más o menos luz para así regular el contraste de la observación.
Prisma óptico: El prisma óptico es una pieza presente en algunos tipos de
microscopios concretos que permite dividir en dos el haz de luz incidente, esto es
importante en los microscopios binoculares y trinoculares es necesario dividir estos
rayos de luz para transmitir la misma imagen a cada ocular.
2. ¿En qué consiste el sistema de magnificación?
La capacidad de aumento de un microscopio se denomina magnificación. En el caso del
microscopio óptico compuesto, el aumento de la muestra se produce en dos etapas, primero
en las lentes del objetivo y a continuación en las lentes del ocular; este proceso de aumento
se puede explicar en base a la naturaleza de las lentes, que no son más que cuerpos con
la capacidad de desviar los rayos de luz.
En el caso de las lentes convergentes, los rayos que inciden de forma paralela son
desviados de modo que convergen en un punto llamada foco. Al mirar un objeto a través
de este tipo de lentes, este efecto de convergencia genera una imagen virtual de manera
que el objeto es observado a mayor tamaño que el original. El principio óptico de un
microscopio se basa en aplicar este proceso con dos lentes. La imagen intermedia que se
genera entre el objetivo y el ocular recibe el nombre de imagen real. La siguiente figura
muestra de forma esquemática como se genera la imagen virtual de la muestra que es
observada a través del ocular del microscopio.
3. ¿Qué papel juega el empleo del aceite de inmersión para observar una preparación
al microscopio?
El aceite de inmersión es un compuesto complejo de sustancias orgánicas viscoso y
transparentes que tiene un alto índice de refracción, por este motivo es muy utilizado en las
observaciones microscópicas, ya que brinda la propiedad de concentrar la luz cuando esta
pasa a través del objetivo de 100X del microscopio, lo que hace que este aumente su poder
de resolución. El aceite forma una película viscosa entre el objetivo y el portaobjetos en
donde se encuentra la muestra, de tal modo que cuando la luz llega, este impide que los
rayos de luz se dispersen en el aire y los concentran hacia la muestra. El aceite de inmersión
se usa únicamente con el objetivo de 100X y es indispensable para lograr una buena
resolución al observar una imagen haciendo uso de este.
4. ¿En qué consiste el poder de resolución?
La resolución se puede definir como la menor distancia entre dos puntos en la cual aparecen
como dos puntos distintos en lugar de algo borroso único. La resolución en microscopía
depende de la calidad del sistema óptico del microscopio y la longitud de onda de luz usada
para construir la imagen, ya que longitudes de onda más cortas proporcionan una mejor
resolución. La apertura numérica es la que determina el poder de resolución de un objetivo,
pero la resolución total del sistema de microscopia también depende de otros componentes
como la apertura numérica del condensador, la alineación correcta de todos los
componentes del sistema, y el medio de imagen (vea objetivos de inmersión en agua y
objetivos de inmersión en aceite)
5. ¿Cómo se puede calcular la magnificación total de un microscopio de luz?
El aumento total del microscopio se calcula así:
Aumento ocular * aumento del objetivo usado
En general los oculares poseen diez aumentos (10x) y los objetivos pueden variar 10x
(aumento total, 100x), 40x (total, 400x), y 100x (objetivos de inmersión en aceite; total
1000x).
6. ¿Cuál es el fundamento de las tinciones simples y en que se diferencian con las
preparaciones en fresco?
La técnica de tinción simple consiste en colocar la muestra que se quiere visualizar en un
portaobjetos para fijarla generalmente por acción de calor y luego proseguir con la tinción
añadiendo una gota de solución colorante al portaobjetos que suele ser de carácter básico,
estas preparaciones al contrario de las preparaciones en fresco los organismos más
pequeños y poco diferenciables a simple vista se vuelven más contrastables y visibles por
acción del colorante pero con la desventaja de que perdemos la oportunidad de ver
características como su movilidad, ya que la preparación de esta muestra implica matar a
los microorganismos al contrario de las preparaciones en fresco en donde mantenemos
vivos a los especímenes, pero no logramos distinguir mayor contraste.
7. ¿Cuál es el fundamento de la microscopía óptica y que clases de microscopía
pertenecen a ella?
El microscopio óptico amplía un objeto en dos pasos. En ambos pasos se utilizan sistemas
ópticos que actúan como lentes convergentes de la siguiente manera: el primer paso es
colocar el objeto entre el punto focal simple y doble, de modo que el resultado es una
imagen magnificada, real. Esta lente del microscopio (en realidad un sistema óptico que
consta de varias lentes) se llama el objetivo.
Entonces se utiliza una segunda lente para recoger esta imagen generada exactamente en
su punto focal delantero. Como resultado generamos un haz de rayos paralelos, pero no
una imagen real. Este elemento óptico se denomina ocular. El ojo humano es capaz de
manejar este haz paralelo y genera una imagen sobre su retina. Finalmente, esto es lo que
se puede esperar de un microscopio: los objetos se pueden observar en una escala
ampliada con detalles indetectables a simple vista como ejemplifica la siguiente imagen:
Tipos de microscopía óptica:
Campo claro: El campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz
pasa a través de la muestra o es reflejada del espécimen. Las muestras deben ser
delgadas y muchas veces se usan tinciones diferenciales.
Contraste de Fases: Se basa en el retraso de las ondas de luz al atravesar objetos
de distintos índices de refracción, aprovechando y amplificando dichos retrasos. Las
regiones más densas se ven más oscuras que el fondo.
DIC (Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial): Utiliza luz
polarizada y prismas para exagerar los gradientes de índices de refracción dentro
de una muestra.
Microscopía de Fluorescencia: Se basa en la detección de proteínas o estructuras
marcadas o que son intrínsecamente fluorescentes.
8. ¿Cuál es el fundamento de la microscopía electrónica de transmisión y de barrido?
La Microscopía electrónica de transmisión se basa en un haz de electrones que manejado
a través de lentes electromagnéticas se proyecta sobre una muestra muy delgada situada
en una columna de alto vacío, con el fin de que los electrones del haz atraviesen la muestra
o que por el contrario choquen con un átomo de la muestra y terminen su viaje; de tal modo
que se obtiene información estructural específica de la muestra según las pérdidas
específicas de los diferentes electrones del haz.
El conjunto de electrones que atraviesan la muestra es proyectado sobre una pantalla
fluorescente formando una imagen visible o sobre una placa fotográfica registrando una
imagen latente y así se pueden evaluar detalladamente las estructuras físicas y biológicas
proporcionando unos 120.0000 aumentos sobre la muestra. Existen 2 tipos principales de
microscopia electrónica: la microscopía electrónica de barrido (MEB) que nos permite crear
imágenes en 3D detalladas de las superficies a visualizar y la microscopía electrónica de
transmisión (MET) que nos sirve para obtener imágenes detalladas de las estructuras
internas de las células.
9. ¿Qué otro tipo de microscopía ha sido desarrollado en base a los sistemas de luz y
electrónicos?
Aparte de los tipos de microscopías ópticas antes mencionados, algunos otros existentes
son:
Microscopia estereoscópica: Es un tipo de microscopia óptico de bajo nivel de
magnificación utilizado principalmente para disecciones. Cuenta con dos
mecanismos ópticos y visuales independientes; uno para cada extremo de la
muestra. Trabaja con luz reflejada sobre la muestra en vez de a través de esta.
Permite visualizar una imagen tridimensional de la muestra en cuestión.
Microscopia petrográfica: Utilizad especialmente para la observación y
composición de rocas y elementos minerales, el microscopio petrográfico trabaja
con los fundamentos ópticos de los microscopios anteriores, con la cualidad de
incluir material polarizado en sus objetivos, lo que permite reducir la cantidad de luz
y brillo que los minerales pueden reflejar. El microscopio petrográfico permite, a
través de la imagen magnificada, dilucidar los elementos y estructuras de
composición de rocas, minerales, y componentes terrestres.
Microscopia confocal: Este microscopio óptico permite el aumento de la resolución
óptica y el contraste de la imagen gracias a un dispositivo o espacial que elimina la
luz excedente o fuera de foco que se refleja a través de la muestra, sobre todo si
esta tiene un mayor tamaño que el permitido por el plano focal. El dispositivo o
“pinole” es una pequeña abertura en el mecanismo óptico que evita que la luz
excedente (aquella que no se encuentra en foco sobre la muestra) se disperse sobre
la muestra, disminuyendo la nitidez y el contraste que esta pueda presentar. Debido
a esto, el microscopio confocal trabaja con una profundidad de campo bastante
limitada.
Algunas otras microscopias electrónicas existentes son:
Microscopia de sonda de barrido: Este tipo de microscopio electrónico fue
desarrollado después de la invención del microscopio de efecto túnel. Se caracteriza
por utilizar una probeta que escanea las superficies de una muestra para poder
generar una imagen de alta fidelidad. La probeta escanea, y mediante los valores
térmicos de la muestra es capaz de generar una imagen para su posterior análisis,
mostrada a través de los valores térmicos obtenidos.
Microscopia de efecto túnel: Es un instrumento utilizado especialmente para
generar imágenes a nivel atómico. Su capacidad de resolución puede permite la
manipulación de imágenes individuales de elementos atómicos, funcionando a
través de un sistema de electrones en un proceso de túnel que trabajar con
diferentes niveles de voltaje. Se necesita un gran control del entorno para una sesión
de observación a nivel atómico, así como la utilización de otros elementos en estado
óptimo.
Microscopia de iones en campo: Más que un instrumento, se conoce con este
nombre a una técnica implementada para la observación y estudio del ordenamiento
y reordenamiento a nivel atómico de distintos elementos. Fue la primera técnica que
permitió discernir la disposición espacial de los átomos en un elemento dado. A
diferencia de otros microscopios, la imagen magnificada no está sujeta a la longitud
de onda de la energía lumínica que cruce a través de ella, sino que cuenta con una
capacidad única de magnificación.
Referencias:
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