EXTRACCIÓN DE LIGNANOS DE CARBÓN LEONARDITICO POR LOS

METODOS SOSA- CLORURO DE SODIO Y RUN-CANG SUN Y

DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

KELLY JOHANNA REINOSO

JUAN FERNANDO VELASCO

Trabajo de grado para optar por el titulo de Químico

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES ´´U.D.C.A´´

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA
QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2012
EXTRACCIÓN DE LIGNANOS DE CARBÓN LEONARDITICO POR LOS
METODOS SOSA- CLORURO DE SODIO Y RUN-CANG SUN Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

KELLY JOHANNA REINOSO

JUAN FERNANDO VELASCO
Trabajo de grado para optar por el titulo de Químico

TRABAJO DE GRADO

M.Sc. CAMILO ANDRES MAHECHA

Asesor

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES ´´U.D.C.A´´

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA
QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2012
 Nota de aceptación

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

Firma del presidente del jurado

_______________________________

Firma del jurado

_______________________________
 TABLA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de carbones.......................................................................... 3

Tabla 2. Calidad de carbones............................................................................... 7-8

Tabla 3. Composición del carbón de muestra ....................................................... 29

Tabla 4. Solubilidad de extracto Run Cang Sun .................................................... 31

Tabla 5. Solubilidad de extracto Sosa – NaCl ...................................................... 32

Tabla 6. Solubilidad de extracto Run Cang Sun derivatizada .............................. 32

Tabla 7. Solubilidad de extracto Sosa – NaCl derivatizada .................................. 33

Tabla 8. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Sosa

Orgánico parcialmente derivatizado ...................................................................... 40

Tabla 9. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Run Cang

Sun totalmente derivatizado .................................................................................. 41

Tabla 10. Bandas características de los IR ........................................................... 49

Tabla 11. Datos para la curva de calibración con trólox ...................................... 50

Tabla 12. Datos para la curva de calibración con Vitamina C .............................. 51

Tabla 13. Resultados de actividad antioxidante en términos de inhibición de DPPH

de los extractos ..................................................................................................... 53

Tabla 14. Resultados de actividad antioxidante equivalente a trólox (TEAC) de de

los extractos .......................................................................................................... 54

Tabla 15. Capacidad antioxidante de los extractos expresada en términos de

TEAC .................................................................................................................... 55
 TABLA DE FIGURAS

Esquema 1. Clases y usos del carbón .................................................................... 4

Diagrama 1. Cadena del carbón.............................................................................. 5
Figura 1: Lignanos simples ........................................................................................... 11

Figura 2. Ciclolignanos ............................................................................................ 11

Figura 3. Neolignanos .............................................................................................. 12

Figura 4. Lignanos mixtos (estibenolignanos, cumarinolignanos y xantonolignanos) ............... 12

Figura5. Estructura de la lignina ............................................................................ 13

Figura 6: Cubebina ..................................................................................................... 13

Figura 7: lignanos furofuranos y flavona ......................................................................... 13

Diagrama 2. Proceso de extracción por Run Cang Sun ................................................... 22

Diagrama 3. Proceso de extracción por Sosa - NaCl ..................................................... 23
Diagrama 4. Proceso de derivatización parcial ................................................................ 24

Diagrama 5. Proceso de derivatización total .................................................................... 25

Figura 8. Extractos iniciales................................................................................... 33

Figura 9. Extractos derivatizados .......................................................................... 28
Gráfico 1. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun antes de derivatizar ............................ 34
Gráfico 2. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun despues de derivatizar ........................ 35
Gráfico 3. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun Derivatización Total en THF ................ 35

Gráfico 4. Espectro UV-Vis Extracto NaOH - NaCl totalmente derivatizado en Piridina .......... 36

Gráfico 5. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun totalmente derivatizado en Piridina ........ 36

Gráfico 6. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización parcial en THF ....................................... 37

Gráfico 7. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Total en THF ............................. 37

Gráfico 8. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización Total en THF .......................................... 38

Gráfico 9. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Parcial en EtOH ......................... 38
Cromatograma 1. Sosa Orgánica parcialmente derivatizada ................................ 39
Cromatograma 2. Run Cang Sun Acuoso totalmente derivatizado ....................... 41
Cromatograma 3. Pico 1 (tetrahidro -2- furanol) .................................................... 42
Esquema 2. Rompimiento de masas (Tetrahidro – 2 – furanol) ........................... 42
Cromatograma 4. Pico 2 (Dimetilsulfoxomonio formilmetiluro) .............................. 43
Esquema 3. Rompimiento de masas (Dimetilsulfoxomonio formilmetiluro) ........... 43
Cromatograma 5. Pico 3 ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano) ................................. 44
Esquema 4. Rompimiento de masas ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano) .............. 44
Espectro IR 1. Run Cang Sun Acuoso Totalmente Derivatizado........................... 46

Espectro IR 2. Run Cang Sun Orgánica Totalmente Derivatizado ........................ 47

Espectro IR 3.Sosa - NaCl Acuoso Totalmente Derivatizado ................................ 48

Gráfica 10. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs concentración

Trólox ................................................................................................................... 51
Gráfica 11. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs Vitamina C ...... 52
 GLOSARIO

Ácido ascórbico: La vitamina C, enantiómero (L) del ácido ascórbico o

antiescorbútica, es un nutriente esencial para los mamíferos.
Ácido húmico: molécula orgánica compleja formada por la descomposición de
materia orgánica vegetal.
Ácido fúlvico: molécula orgánica compleja formada por la descomposición de
materia orgánica vegetal, poseen menos carbono mas hidrógeno que los ácidos
húmicos.
Antioxidante: molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras
moléculas.
Fenilpropanoides: estructuras moleculares contienen al menos un grupo fenol,
un anillo aromático unido al menos un grupo funcional
Leonardita: es una forma de ácidos húmicos encontrada exclusivamente en
Dakota del Norte.

Lignina: polímero presente en las paredes celulares de las Plantas y de un tipo

de bacterias conocidas como Dinophytas.
Lignito: carbón que se forma por compresión de la turba, es de estructura frágil y
en él se pueden reconocer algunas estructuras vegetales. Es de color negro o
pardo y frecuentemente presenta una textura similar a la de la madera de la que
procede.
Quelato: Estructura molecular en la que los iones metálicos se hallan unidos a un
compuesto orgánico.
Sosa: El hidróxido de sodio (NaOH) o hidróxido sódico
Radical libre: átomo que tiene un electrón (e-) desapareado en capacidad de
aparearse, por lo que es muy reactivos
Splitless: sistema de inyección para cromatografía de gases masas, se utiliza
para analizar muestras muy pequeñas.
Trolox: Derivado soluble de la vitamina E.
 ABREVIATURAS

ABTS•+: (ácido 2,2'–azino–bis–(3–etillbenzotiazolin–6–sulfonico) agente oxidante

de diversos compuestos químicos.
ASTMD: American Society for Testing.
DPPH: Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.
GS: Cromatografía de gases masas
HPLC: Cromatografía de alta resolución (por sus siglas en ingles).
IR: Infrarrojo.
KRAFT: (ácido 2,2'–azino–bis–(3–etillbenzotiazolin–6–sulfonico)
MT-CNH2: Tetrametil-silil-diazometano
R2 : coeficiente de correlación estadístico lineal.
RMN: Resonancia Magnética Nuclear
TEAC: Capacidad antioxidante equivalente a trolox (por sus siglas en ingles)
UV: Ultravioleta.
μM: micro molar.
 DEDICATORIA

A Dios.

Por darme la fuerza para alcanzar este sueño y por darme salud para lograr
mis objetivos.

A mi madre Luz Daris.

Por su amor, apoyó, consejo, motivación y ejemplo, que han sido mi

fortaleza y refugio en momentos de dificultad.

A mí amado Lucas.

Por estar este tiempo con migo y por su amor y apoyo permanente.

A mis familiares.

A mis hermanas Alejandra y Sharon, por ser mi fuente de inspiración, a mis

hermanos, mis primas y primos por ser ejemplo de tenacidad y valentía

A todos aquellos que participaron directa o indirectamente en la elaboración

de esta tesis.

¡Gracias a ustedes!

A mi maestro.

Lic. Camilo Mahecha Mahecha por su apoyo y motivación para la

culminación de mis estudios profesionales.

Kelly Johanna Reinoso

 DEDICATORIA

Dedico la presente trabajo a los seres que más amo en este mundo: mis
padres, Mariluz Forero y Segundo Velasco que día a día se han esforzado
por sacarme a delante, agradezco todo su apoyo y fe en mí; por ser la fuente
de mi inspiración y motivación para superarme cada día más y así poder
luchar para que la vida nos depare un futuro mejor.

Juan Fernando Velasco Forero

 AGRADECIMIENTOS

A Dios, a mi madre y a Lucas, fuente de alegría e inspiración para alcanzar

todos mis sueños. Gracias por el amor y la fe que siempre me han
profesado.

Kelly Johanna Reinoso

Primero y antes que nada, dar gracias a mi mamá Mariluz Forero, por estar
conmigo, por fortalecer mi vida y brindarme todo su apoyo; al profesor y
amigo el M.Sc. CamiloAndres Mahecha porque sin él no habría sido posible
la realización de este trabajo ya que su apoyo y dedicación fueron un pilar
fundamental en esta investigación, nuevamente gracias por todo lo que hizo
por nosotros este trabajo no es solo un logro de los autores sino también de
nuestro asesor.

Gracias a mi amiga y colega Vanessa Penagos que durante toda esta

carrera a sido mi compañera de estudios y de trabajo gracias por toda su
colaboración.

Doy gracias a mi tía Soraya Forero a la cual le debo mi ingreso a la

educación superior ya que sin su apoyo y cariño no hubiese comenzado este
camino de vida.

En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que han
vivido conmigo la realización de esta carrera, no necesito nómbralas porque
tanto ellas como yo sabemos que desde los más profundo de mi corazón les
agradezco el haberme brindado todo el apoyo, colaboración, ánimo y sobre
todo su cariño y amistad.

Juan Fernando Velasco Forero

 INTRODUCCIÓN

El carbón ha proporcionado a la civilización importantes beneficios tanto el

campo energético como en el económico, fue descubierto en la prehistoria. En la
antigüedad se manufacturaba por medio de la combustión incompleta de
materiales orgánicos. Lavoisier 1772 demostró que en la reacción de combustión
del diamante se producía CO2.

Los primeros compuestos de carbono se identificaron en la materia viva a

principios del siglo XIX, y por ello el estudio de los compuestos de carbono se
llamó química orgánica.

En la actualidad se sabe que del carbón se obtienen sustancias húmicas, como

ácidos húmicos, ácidos fúlvicos o lignanos. Estas fracciones se definen
basándose estrictamente en su solubilidad ya sea en ácido o álcali. Todas ellas
son parte de un sistema supramolecular extremadamente heterogéneo y las
diferencias entre estas subdivisiones son debido a variaciones en la acidez, grado
de hidrofobicidad, o a la autoasociación de moléculas por efectos entrópicos.

Sin embargo y pese a que el carbón ha sido ampliamente estudiado, aun falta
descubrir y explotar muchas cualidades de este producto que es abundante en
Colombia y que contiene dentro de su matriz grandes secretos que pueden ser
utilizados para beneficio de la humanidad.
Este trabajo busca extraer de dicha matriz ácidos húmicos por el método de Run
Cang Sun, y el método de sosa – cloruro de sodio, una vez extraídos,
fragmentarlos y solubilizarlos para determinar su poder antioxidante.
Ya que es conocido que una vez fragmentado los ácidos húmicos se obtienen
lignanos y estos poseen grandes cualidades que prestan beneficio a la salud
humana. En el presente estudio se hace una breve descripción del estado del arte,
sobre los ácidos húmicos, la descripción de las características del carbón objeto
de estudio; finalizando con una descripción de la metodología empleada para el
desarrollo del estudio, los resultados obtenidos y las conclusiones a las que se
llegó.
 1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo general:

Extraer sustancias húmicas de un carbón leonarditico por los métodos de sosa
– cloruro de sodio y Run-Cang Sun, derivatización y determinación de actividad
antioxidante por el método de DPPH• comparando con Trolox.
1.2 Objetivos específicos:

1.2.1 Extraer ´´lignina - ácidos húmicos´´ de carbón leonarditico por los

métodos de sosa- cloruro de sodio y Run-cang Sun.
1.2.2 Derivatizar los extractos de sustancias húmicas para la obtención de
lignanos.
1.2.3 Realizar pruebas físicas y químicas que permitan corroborar la
presencia de lignina, Ácidos húmicos, lignanos.
1.2.4 Determinar si las fracciones obtenidas de la extracción y separación
poseen actividad antioxidante.

1
 2. JUSTIFICACIÓN

Los antioxidantes son moléculas capaces de prevenir o retardar la oxidación de

otras moléculas, capturando radicales libres u oxidándose ellos mismos. Por lo
general estos antioxidantes se encuentran en las plantas ya sea como aceites o
metabolítos secundarios. Estas moléculas han empezado a tomar importancia en
el sector de la salud ya que ya pueden anular los efectos perjudiciales de los
radicales libres en las células previniendo enfermedades.

En el proceso de formación del carbón estas moléculas se van degradando por

vía microbiana y/o metamórfica, la duración de estos proceso son los que dan la
variedad de carbones existentes, siendo los de mayor tiempo los carbones
antracita y los de menor tiempo la turba (lignito o leonardita).

Colombia es un país que posee grandes reservas de carbón de alto y bajo rango,
sin embargo han sido los carbones de alto rango como sub-bituminosos y
bituminosos , los que han cobrado mayor importancia por su uso en la industria
como fuente para obtención de energía, convirtiéndose en un producto importante
de exportación para nuestro país generando un amplio índice de regalías y
beneficios para el mismo1; los carbones de bajo rango como el lignito aunque
también son empleados en la industria energética, tienen un uso más frecuente
en la agronomía, en donde son utilizados como fertilizantes directamente o a
través de sus extractos dependiendo del nivel de oxidación de la muestra y
aunque su incursión en esta industria ha sido bueno, es importante conocer los
componentes que hacen parte de este tipo de carbones, extraerlos y estudiarlos
de manera adecuada con el fin de darles un uso distinto al agrícola que permita
diversificar su empleo y aprovechar todas las propiedades químicas y físicas que
poseen.

Una propiedad importante que se ha determinado para algunos lignanos extraidos

de plantas es su capacidad antioxidante2; por tanto es necesario determinar si un
carbón de bajo rango posee este tipo de moléculas y por ende verificar su
capacidad antioxidante empleando la técnica de decoloración del DPPH• y
comparando contra Trolox.

2
 3. ESTADO DEL ARTE

3.1 Mineral: Sustancia natural homogénea, de origen inorgánico, con

composición química definida y en general con estructura cristalina, excluyendo a
esta definición las sustancias generadas por la transformación de materia orgánica
en ambientes reductores como carbón, petróleo y resinas fósiles. Varios autores a
clasifican estos materiales como hidrocarburos como minerales; sin embargo,
resulta más adecuado referirse a éstos como materiales energéticos.3

3.2 Carbón: Compuesto principalmente por carbono, hidrógeno, nitrógeno,

oxígeno y azufre, se origina en transformaciones físicas y químicas de grandes
acumulaciones vegetales depositadas en ambientes palustres (pantanos),
lagunares o deltaicos.
Una de las clasificaciones más utilizadas es la de American Society for Testing
and Materials (ASTMD-388-777), mostrada en la Tabla 1, que lo divide en cuatro
clases según las propiedades referidas a la composición de los vegetales y las
condiciones de presión y temperatura (grado de metamorfismo) a que fueron
sometidos durante su formación.3

Tipo Carbono Material Contenido Poder Poder Poder

Fijo (%) Volátil (%) Humedad Calorífico Calorífico Calorífico
(%) (Btu/lb) (MJ/Kg) Kcal/Kg
Antracita 86 - 98 1 < 15 >14.000 >32.6 >7.780
Bituminoso 45 - 86 32 15 - 20 10.500- 24.5 - 32.6 5.800-
14.000 7.780
Sub 35 - 45 50 20 - 30 7.800 - 18.2 - 24.5 4.300-
bituminoso 10.500 7.780
Lignito y 25 - 35 96 > 30 4.000 - 9.3 – 18.2 2.200 –
Turba 7.800 4.300

Tabla 1.
Clasificación de carbones
Fuente: American Society for Testing and Materials (ASTMD-388-777)
Tomado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón. [en línea]. [Consultado
12 de marzo de 2012]. Disponible en: < http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>

3
 • Carbón duro, con alto contenido de carbono (86% al 98%), bajo
Aumenta contenido de materia volátil y poder calorífico superior a 32.6
poder MJ/Kg. Usado como combustible en generación de calor o vapor
calorífico
Antracita en la industria térmica y siderúrgica, también se usa en la
fabricación de goma sintética, colorantes y purificación de agua
para consumo humano (filtros).

• Carbón posee un menor contenido de carbono y menor poder

Hulla calorífico que los carbones antracíticos. Por su forma de uso se
conocen como carbones coquizables, usados en procesos de
Bituminosa obtención del acero, y carbones térmicos, usados en la
producción de vapor para generación de energía.

• Carbón un menor poder calorífico que los carbones

Hulla Sub- bituminosos, su composición en carbono está entre 35% y
45%, tiene un elevado contenido de material volátil, algunos con
bituminosa poder coquizable. Es empleado en la generación de energía
eléctrica y en procesos industriales.

• Carbones con alta humedad y alto contenido de ceniza y de

material volátil, lo cual hace que posean un bajo poder calorífico.
Es empleado para la generación de calórica
Aumenta Lignito y turba (calefacción), energía eléctrica, para algunos procesos
material industriales en donde se requiere generar vapor y más
recientemente se han fabricado briquetas de turba y lignito para
volátil quemarlas en hornos.

Esquema 1.
Clases y usos del carbón
Fuente: Unidad de Planeación Minero Energética
Tomado, modificado y creado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón.
[en línea]. [Consultado 12 de marzo de 2012]. Disponible en:
< http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>

Reservas carboníferas: Colombia cuenta con carbón de excelente calidad, siendo

participe del mercado mundial por largo tiempo. Las reservas medidas son de
7.063,6 Mt, ubicadas principalmente en la Costa Atlántica, donde se encuentra el
90% del carbón térmico que a su vez corresponde al 98% del carbón nacional.
El 95% de las reservas se ubica en los departamentos de La Guajira, Cesar,
Córdoba, Norte de Santander, Cundinamarca, Boyacá, Antioquia, Valle del Cauca
y Cauca.3

4
 Diagrama 1.
Cadena del carbón
Fuente: Unidad de Planeación Minero Energética
Tomado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón. [en línea]. [Consultado
12 de marzo de 2012]. Disponible en: < http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>

Calidades del Carbón Colombiano: La calidad de los carbones está referida a las
propiedades físicas y químicas, que son las que finalmente determinarán el uso
final del material.

Humedad: Se presenta como humedad total, inherente o de equilibrio, superficial,

agua de hidratación o agua de descomposición. Su importancia es contratos de
compraventa, en evaluación, control de procesos industriales, en manejo y
pulverización del carbón.

Cenizas (Cz): Residuo no combustible de origen orgánico e inorgánico.

5
Materias volátiles (Mv): Se determina los rendimientos del coque y sus productos;
es criterio de selección del carbón para gasificación y licuefacción.

Carbono fijo (CF): Es la medida del material combustible sólido y permite clasificar
los carbones y definir los procesos de combustión y carbonización.

Azufre total (St): Parámetro para definir gases tóxicos de los procesos de
gasificación y licuefacción.

Poder Calorífico (PC): Representa la energía de combustión del carbono e

hidrógeno y del azufre. Es el más importante en la definición de los contratos de
compraventa de carbones térmicos y en la clasificación de los carbones por
rango.3

En la Tabla 2 se presenta la calidad de los carbones colombianos discriminada por

regiones.

De acuerdo con los estudios de caracterización adelantados en las zonas

carboníferas del país, en la cordillera Oriental se encuentran los mejores carbones
bituminosos para uso térmico y metalúrgico junto con carbones antracíticos, tanto
para el consumo interno como de exportación; en la cordillera Occidental se hallan
carbones bituminosos y sub-bituminosos en Córdoba, norte de Antioquia, Valle del
Cauca y Cauca; en la cordillera Central existen carbones bituminosos en las zonas
carboníferas de Antioquia y Antiguo Caldas y, menos conocidos, en Huila y
Tolima.3

6
Tabla 2 Calidad de carbones en Colombia:

Continúa en la siguiente página

7
 Tabla 2.
Calidad de carbones
Fuente: Ingeominas (2004)
Tomado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón. [en línea]. [Consultado
12 de marzo de 2012]. Disponible en: < http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>

8
3.3 Leonardita: Forma de ácidos húmicos encontrada por primera vez en
Dakota del Norte. Es llamada así en homenaje al Dr. A.G. Leonard, el cual fue
primer director del Servicio Geológico del Estado de Dakota del Norte y científico
que estudió sus propiedades.

La leonardita se forma en la era carbonífera del Paleozoico, cerca de 280 millones

de años atrás. La amplia vegetación existente entonces en lo que es hoy Dakota
del Norte fue destruida y carbonizada, pero en ese proceso fueron exprimidos los
ricos jugos orgánicos formando originalmente lagunas de poca profundidad que
también se carbonizaron dando origen a la leonardita. La masa fibrosa se
transformó en carbón encima del cual se formó la delgada capa de leonardita. A
través de los millones de años de su formación, la leonardita ha estado sujeta a
toda clase de acciones físicas y químicas, como también microbiológicas, para
llegar a su forma actual.

La leonardita es una forma de ácidos húmicos. Lo que todos los ácidos húmicos
tienen en común es que son el producto final de la descomposición de materias
orgánicas (principalmente vegetales). Pero, lógicamente, el material de origen ha
sido diferente en cada caso. También ha sido diferente el proceso de formación y
su duración. En contraste se citan los ácidos húmicos encontrados en La Florida
que provienen de una muy reciente (máximo 50.000 años) formación de turba.
Aunque tratándose en ambos casos de “ácidos húmicos”, hay una gran diferencia
en su estructura molecular y sobre todo en sus propiedades biológicas.4

3.4 Lignanos: Grupo de metabolitos secundarios muy difundidos entre las

plantas, tanto entre las Gimnospermas como entre las Angiospermas, aunque son
más frecuentes en las Pináceas, Podofiláceas, Rutáceas y Lauráceas. Se
presentan hasta en un 6,4% de los aceites extraídos de las raíces de las plantas,
como Sesamum angolense (Pelalacieae), y alrededor del 35% de los aceites
esenciales de las semillas de algunos cultivares del falso hinojo indio, Anethum
sowe. Son menos abundantes en las Asteráceas, los lignanos son suficientemente
frecuentes para poder utilizarlos con fines taxonómicos.5

Comprenden una clase de productos naturales de plantas que se derivan de

derivados de ácido cinámico y que están relacionadas bioquímicamente a la
fenilalanina.

9
3.4.1 Tipos de lignanos:

Los lignanos se pueden dividir en 4 grandes grupos:

a) Lignanos simples: Presentan únicamente una unión carbono carbono en las

posiciones β y β’ de sus cadenas laterales. En función de si el oxígeno es o
no incorporado a la cadena lateral y del modo en que lo hace, se
establecen 4 subtipos (Figura 1)6:

• Derivados del dibencilbutano

• Derivados de la dibencilbutirolactona (lignanólidos)
• Derivados del tetrahidrofurano (epoxilignanos)
• Derivados del furofurano (bisepoxilignanos)

b) Ciclolignanos: Son el resultado de la formación de otro enlace adicional

carbono – carbono, dando lugar a un nuevo anillo; dando como resultado 4
subtipos (Figura 2)6:

• Ariltetrahidronaftalenos
• Arildhidronaftalenos
• Arilnaftalenos
• Dibencilciclooctadienos

c) Neolignanos: Son dímeros de unidades C6C3que no poseen enlace β y β´

(Figura 4).6

d) Dímeros mixtos: Son heterodímeros mixtos resultantes del acoplamiento de

lignanos o neolignanos con otras sustancias como flavonoides, cumarinas,
xantonas, etc., formándose de esta manera los denominados
flavonolignanos, cumarinolignanos, estilbenolignanos, xantonolignanos, etc.
(Figura 5).6

10
 Figura 1: Lignanos simples
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>

Figura 2: Ciclolignanos
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>

11
 Figura 3: Neolignanos
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>

Figura 5: Lignanos mixtos (estibenolignanos, cumarinolignanos y xantonolignanos)

Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>

12
Muchos lignanos muestran una actividad fisiológica, como las podofilotoxinas que
son inhibidores tumorales. Esta actividad específica conduce a la interferencia con
la división celular por dos mecanismos diferentes en animales, incluyendo seres
humanos.

Por otra parte se han realizado estudios que muestran que algunos lignanos son
activos en la supresión del sistema nervioso central y la inhibición de la
fosfodiesterasa de AMP cíclico; además se utilizan para el tratamiento de la
hepatitis viral y la protección del hígado.7

3.5 Lignina: Es un polímero complejo, tridimensional, globular, irregular,

insoluble y de alto peso molecular (>10000g/mol), formado por unidades de
fenilpropano cuyos enlaces son relativamente fáciles de hidrolizar vía química o
enzimática. Ésta molécula tiene diferentes tipos de uniones aromáticas de
fenilpropano.

Figura 6: Estructura de la Lignina

Tomado de: e-limbo.org. Lignina, EAU de biblioteca [en línea]. [Consultado 12 de marzo de 2012].
Disponible en: < http://www.e-limbo.org/articulo.php/Art/3290>

13
En las planta, la lignina se encuentra químicamente unidad a la hemicelulosa y
rodeando a las fibras compuestas por celulosa. Es responsable de la rigidez de las
plantas y sus mecanismos de resistencia al estrés y a ataques microbianos. Es
especialmente abundante (20-30 % del peso de la pared) en células conductoras
(vasos xilemáticos) y estructurales (fibras) con engrosamiento secundario.
En cuanto a su biosíntesis, se sabe que los precursores de la lignina se forman
por conducto de la ruta correspondiente al ácido shiquímico. Este ácido, formado
por una unión del ácido fosfoenolpirúvico y eritrosa-4-fosfato, se convierte en el
principal escalón de la biosíntesis de los aminoácidos L-tirosina y L-fenilalanina,
que están formados por aminación reductiva. Las enzimas desaminantes
convierten a continuación los dos aminoácidos en sus respectivas contrapartes de
ácido de shiquímico.
La hidroxilación en etapas por hidroxilasa, y en su momento la metilación por o-
metil-transferasas, transforma los ácidos para hidroxi-shinámicos conocidos como
precursores de lignina.8

3.6 Extracción de lignina: Existen otros trabajos relacionados con la lignina,

los más investigados son los procesos para su eliminación en el blanqueo de la
pulpa de madera.

Existen artículos que reportan características de diferentes procesos para la

obtención de un tipo particular de lignina, debido a que la lignina varía según el
método de extracción y separación así como de la materia prima de la cual
proviene.

Según en el trabajo de grado Extracción de lignina proveniente de

residuos agroindustriales para su empleo en procesos de gasificación
dan a conocer los usos de la lignina como materia prima de la
gasificación existen 3 procesos de extracción como subproducto y la
lignina se clasifica según este proceso::

Lignina de sulfito: Proviene del líquido residual sulfitado (solución de

bisulfito y anhídrido sulfuroso) de las fábricas de pulpa, la cantidad de
lignina que se desprende de la pulpa de madera es de 50 –60%.

Lignina alcalina (Kraft): Obtenida del líquido residual (licor negro) de

los procedimientos al sulfato y a la sosa (mezcla de hidróxido de
sodio y sulfuro de sodio) en la fabricación de la pasta para papel. Por
lo general la cantidad de lignina que se obtiene es del 50 – 75% del
contenido en la madera.

14
Lignina comercial: Se obtiene como subproducto de procesos
relacionados con la celulosa u otros productos primarios;
generalmente se nombran de acuerdo al fabricante: Benaloid®,
Binderine®, Furafil®; Glutrin®; Goulac®; Indulin®; Isofil®;
Marasperse®; Maratan®; Maratex®;Meadol®; Silvacon®;
TomLinite®.

En el trabajo de grado Extracción de lignina proveniente de residuos

agroindustriales para su empleo en procesos de gasificación dan a
conocer los usos de la lignina como materia prima de la gasificación,
pero no es el único proceso en el que se puede emplear lignina en la
industria de la gomas, en calidad de relleno y antioxidante, y
demostrando que solo la lignina sulfática (Kraft) sirve para este fin.

Otra aplicación es como surfactante, debido su característica lipofilica

de la lignina, mencionan que la lignina es la mejor alternativa para la
elaboración de estos.

Por otra parte en esta misma investigación se describe diversas

metodologías para la extracción de lignina proveniente de maderas,
utilizando una mezcla de solventes tolueno/etanol a una relación
volumétrica de 2:1 y su posterior separación con ácido sulfúrico al
72%. Otro método es Run-Can Sun basado en medio ácido describe
la delignificación de tallos de maíz, mostrando diferentes formas de
caracterizar éste tipo de lignina; donde se realiza la extracción de
lignina proveniente de paja de cebada por métodos alcalinos
caracterizándolo por IR.

Rojas Aguilar describe dentro de su trabajo formas de caracterización

de la lignina que se realiza mediante técnicas como: NMR, HPLC, IR;
de estos análisis se obtienen resultados de tipo cuantitativo y
cualitativo aportando información útil por la cual se reconocen
especies a nivel atómico o molecular, deduciendo características
estructurales y/o reconociendo en la muestra la presencia de
determinados grupos funcionales como en el caso del espectro UV
concluye que la lignina posee una longitud de onda característica
situada a los 280nm.9

15
3.7 Ácidos Húmicos: Polímeros complejos de alto peso molecular con núcleos
periféricos (grupos radicales) que permiten capturar iones del medio circundante o
una mayor polimerización. Hay dos tipos: pardos y grises. 10

3.7.1 Ácidos húmicos pardos: Provienen de la oxidación de la lignina. Son poco

estables, pobres en nitrógeno en forma amínica (-NH2) y floculan poco en
presencia de calcio. 10

3.7.2 Ácidos húmicos grises: Se forman por acción de microorganismos del suelo.
Tiene mayor contenido de nitrógeno, floculan rápidamente en presencia de calcio
y forman complejos órgano-minerales (arcillas-humus) muy estables.10

3.8 Antioxidante: Es toda sustancia que retrasa o previene el deterioro, daño o

destrucción provocados por una oxidación. Durante muchos años, los químicos
han tenido conocimiento de que la acción oxidante de los radicales libres puede
ser controlada, o incluso prevenida por una serie de sustancias antioxidantes.11

3.9 Radical libre: Es una molécula con uno o más electrones no ligados en su
órbita externa. Los electrones libres, o no ligados, proveen una mayor carga
energética.

Tal molécula es inestable y tiende a reaccionar activamente con otras moléculas

para ligar los electrones libres y generar moléculas estables. Es precisamente esta
marcada reactividad y su tendencia a iniciar reacciones redox en cadena lo que
constituye un papel citotóxico central en la casualidad de lesiones de células y
tejidos.12

16
 4. ANTECEDENTES

4.1 Estudios de actividades biológicas y antioxidantes de ácidos húmicos:

En estudios realizados sobre ácidos húmicos se ha determinado que inducen la

apoptosis en células HL-60 (relacionadas con la leucemia), deteniendo su
proliferación y crecimiento, en concentraciones de 50-400 µg / mL13, de igual
modo se ha comprobado su efecto antitumoral, también por vía apoptosis, en
combinación con As2O3, sobre Adenocarcinoma cervical humano, en líneas
celulares HeLa y SiLa, generando una reducción en la CL50 obteniendo
resultados de 57,62% a 73,52% (300 µg HA / mL) y 79,03% a 83,67%
(500 g de HA / mL), respectivamente.14
También se ha logrado probar su activad antimutagenica en células de ovario de
hámster chino en combinación con mutágenos como la mitomicina C y La
Hidrazida maleica.15
Se han realizado estudios in vitro en líneas celulares de cáncer de las
mitocondrias del hígado, probando ácidos húmicos de una fuente seleccionada en
Eslovaquia; los resultados obtenidos mostraron un potencial prometedor de este
tipo de sustancias como agentes para mejorar la inmunidad.16
En otros estudios se ha comprobado que al generar complejos con otras
sustancias permiten un mejor transporte de las mismas a través de distintos
tejidos, mejorando su efecto, como sucede con el complejo Carbamazepina- Acido
húmico (1:2), que mejora la permeabilidad y acceso de la sustancia en el cerebro,
potencializando su efecto anticonvulsivo.17
En cuanto a la actividad antioxidante se ha determinado esta propiedad a través
de la técnica ABTS, en términos de TEAC, para dos muestras de sustancias
húmicas, dando como resultado 57,130 ± 0,091 y 22,212 ± 0,059 µmoles de trolox
por gramo de peso seco ± la desviación estándar para ambas respectivamente,
comparando con 5,671 ± 0,032 µmoles de trolox por gramo de acido ascórbico
que fue empleado como sustancia de referencia.18

17
4.2 Estudios de actividades biológicas y antioxidantes de los lignanos:

Los lignanos deben sus características una gama amplia de estructuras dando asi
una gran diversidad de actividades biológicas. Los lignanos son moléculas muy
estudiadas y se conocen algunos con propiedades anti-tumoral, antimitótica,
antiviral y pueden inhibir específicamente ciertas enzimas, además de ser toxicas
para hongos e insectos.19
Estas sustancias húmicas son constituyentes de alimentos unidos a estrógeno
y con actividad anti-estrógeno, lo que contribuye a la prevención de cánceres
hormono-dependientes, osteoporosis, enfermedad cardiovascular y síntomas de la
menopausia. Esta actividad anti-estrogena a sido evaluda en mamiferos,
examinado si lignanos naturales y semi-sintéticos poseen estas
caracteristicassiendo los lignanos vegetales los de mayor actividad; mientras que
los norlignanos semi-sintéticos eran moderadamente activos lo que apoya la idea
de lignanos vegetales que tienen función fitoestrógeno.20
Existen varias explicaciones posibles para las bioactividades observados,
incluyendo la participación en el metabolismo hormonal o disponibilidad, la anti-
angiogénesis, anti-oxidación y la supresión de un gen. Por otra parte, las
concentraciones fisiológicamente relevantes del enterolignano se ha demostrado
que conducir a la "in vitro" e "in vivo" la activación de los receptores estrogénicos.
La Lychnophora ericoides es una planta brasileña que está disponible
comercialmente como un agente analgésico y antiinflamatorio. El extracto de las
raíces, produjo 10 lignanos, que mostraron actividad analgésica en el test de
contorsiones del ratón. El lignano cubebina(Figura 7), fue uno de los más activos,
mostro capacidad anti-inflamatoria y antipirética. Además de dos derivados
metilo previamente desconocidas.

Figura 7: Cubebina
Tomado de: Medycyna dawna i współczesna. Lignany w ziołach i ich znaczenie [en línea].
[Consultado 7 de abril de 2012]. Disponible en: < http://rozanski.li/?p=1737>

18
Los lignanos vegetales son convertidos en lignanos mamíferos al ser absorbidos
por él organismos y en ocasiones estan presentes en el suero y la orina. Se ha
investigado que algunos lingnanos vegetales poseen actividad antitumoral y
endocrino modulador de lignanos vegetales, con el fin de aclarar las relaciones
estructura-actividad. Como en el estudio de la 7-hidroximatairesinol (HMR) que se
convierte en el ENL, y ambos HMR y ENL pueden inhibir el crecimiento de7,12-
dimetil[a] antraceno (DMBA) inducida por cáncer mamario. Otras investigaciones
sobre el papel de los lignanos como los enterolignanos, lariciresinol, pinoresinol,
medioresinol, syringaresinol, arctigenina y sesamina consumidos en la dieta
inhibiendo o mostrando efectos beneficiosos en el cáncer de mama, colon y
próstata. .
Estudios recientes muestran que diversos lignanos mostraron inhibir la Vit C
/ NADPH inducida por la peroxidación lipídica (la formación de malondialdehído
(MDA)) de los microsomas de hígado de rata. Estos compuestos,
schisanhenol (Sal), S (-) schizandrin C (S (-) sen C) y S (-)schizandrin B
(S (-) sen B) muestran ser más potente que la vitamina E en
la misma concentración. El Sal y (S (-) sen B) fueron capaces de inhibir la
gosipol inducida por la generación de anión superóxido en microsomas de
hígado de rata. Además, la administración oral de Sal y (S (-) sen B) reduce
notablemente la formación de MDA hígado inducida por etanol, 15 mL/kg
en ratones, y aumento de la superóxido dismutasa y las actividades de catalasa en
el citosol de hígado de rata. Este trabajo concluye que algunos lignanos,
como Sal, tienen una fuerte actividad antioxidante.19, 20
Otrs estudios en el cual después del aislamiento y la identificación de seis
conocidos lignanos furofuranos: eudesmin(1), magnolin(2), epimagnolin A(3),
aschantin(4), kobusin(5), sesamina(6) y una flavona artemetina(7). Se
evaluaron in vitro para su citotoxicidad en un panel de selección que consta
de varias líneas de células tumorales de mamíferos, por su actividad contra la
malaria resistente a la cloroquina contra el Plasmodium falciparum (FcB1 cepa) y
para su citotoxicidad contra células murinas normales (CFU-GM). Si bien no hay
una citotoxicidad prometedora contra las células tumorales humanas se notó,
potencia marginal y la selectividad se encontró para los compuestos 1-5 contra el
colon murino . Además, los compuestos 2-7 mostró leves actividad antiplasmodial,
6 y 7 son los compuestos más activos (IC50 3,37 y 3,50 g / mL,
21
respectivamente).

19
 Figura 8: lignanos furofuranos y flavona
Tomado de: Journal Ethonopharmacology. Furfuranlignans and a flavone from Artemisia gorgonum
Webb and their in vitro activity against Plasmodium falciparum, ScienceDirect [en línea].
[Consultado 7 de abril de 2012]. Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874111007100>

20
 5. METODOLOGÍA

Esta investigación se abordó desde 2 aspectos; el químico el cual consistió en la

extracción de sustancias húmicas del carbón leonarditico por los métodos de Run
Cang Sun y Sosa – Cloruro de sodio y su posterior derivatización para la
obtención de lignanos. El segundo aspecto abordado en esta investigación es la
biológica la cual consistió en la determinación de la actividad antioxidante de los
extractos obtenidos con la técnica de DPPH• dando a conocer esta capacidad
antioxidante en equivalentes a trolox.

5.1 Extracción de la lignina:

5.1.1 Método de Run Cang Sun:

A una muestra de 200 g de carbón leonarditico, se realizó una extracción soxhlet,

con 500 mL de solvente propuesto en el método de Run Cang Sun y
colaboradores (tolueno/etanol en relación 2:1)22, a una temperatura de operación
de 100°C. El tiempo de extracción de 24 Horas, al terminar el proceso de
extracción la mezcla de solventes se recupera en un rotavaporador para así
facilitar la separación de las sustancias húmicas, posteriormente al residuo se le
agregara agua en proporción 4:1, manteniendo en agitación constante por una
hora a 60°C, posteriormente la mezcla se filtra al vacío con papel filtro
Whatman No. 40, lavando el producto con 50 mL de Etanol / Agua 2:1 y secando
por 10 minutos a 70°C en una estufa. Para eliminar el exceso de agua en la
muestra se filtra de nuevo al vacío si es necesario y se calienta a 50° C por 1 hora.

21
 A una muestra de 200 g de carbón leonarditico, se
realizara una extracción soxhlet, con 500 mL de solvente
propuesto (tolueno/etanol en relación 2:1) a una
temperatura de operación de 100°C.

El tiempo de extracción de 24 Horas, al terminar el

proceso de extracción la mezcla de solventes se recupera
en un rotavaporador

Posteriormente la mezcla se filtra al vacío lavando el

producto con 50mL de Etanol / Agua, relación 2:1.

Secando por 10 minutos a 70°C en una estufa. Para

eliminar el exceso de agua en la muestra se filtra de
nuevo al vacío si es necesario y se calienta a 50° C por 1
hora.
Diagrama 2. Proceso de extracción por Run Cang Sun.
Fuente: Autores

5.1.2 Método Sosa – Cloruro de sodio:

El lignito seco y molido (400 g) se mezcla con 2L de una solución de NaOH 2M –

1M de NaCl y se agita durante 3 horas, luego la mezcla se pasa por el
ultrasonido, la solución se filtra a través de un filtro de celulosa 60 micrómetros y
el filtrado se acidifica por adición de HCl concentrado a pH 1.
El precipitado se lava varias veces con una mezcla de HCl 0,25 M y agua
destilada hasta que quede libre de cloro y se seca hasta peso constante a 50 °C.

22
 Muestra (400 g) en solución de NaOH
2 M- 1 M de NaCl agitar por 3 horas

Se pasa por el ultrasonido, se filtra a través de

un filtro de celulosa 60 µmetros.

Acidificar por adición de HCl concentrado hasta

pH 1.

El precipitado, se lava con una mezcla de HCl 0,25 M

y agua destilada agua hasta que quede libre de cloro
y se seca hasta peso constante a 50 ° C.

Diagrama 3. Proceso de extracción por Sosa - NaCl.

Fuente: Autores

5.2 Derivatización Parcial:

a) La derivatización de la muestra se hará de acuerdo al método realizado por

S. Amir el en 2006.22Al extracto obtenido se le agrega solución Cloruro de
acetilo. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente y luego se agita
suavemente durante la noche.
b) Después de eliminar el disolvente por evaporación rotatoria, el residuo se
disuelve en 25 mL de dioxano / ácido acético / agua (05:04:01, v / v / v), se
añade Zn en polvo (500 mg) a la solución agitando bien; se continua la
agitación durante 30 min.

23
 Extracto

Adiciona AcCl

Disolver en dioxano/ác.
acético/ agua y adicionar
Zn

Adicionar una sln CH2Cl2

/NH4Cl y separa fase
acuosa y fase orgánica

DERIVATIZACIÓN
PARCIAL

Diagrama 4. Proceso de derivatización parcial.

Fuente: Autores

5.3 Derivatización total:

a) Luego la mezcla se transfiere cuantitativamente a un embudo de

separación con CH2Cl2 (50 mL) y una solución saturada de NH4Cl (50 mL).
b) La solución se mezcla vigorosamente, y las fases orgánica y acuosa se
separan.
c) La fase acuosa se extrae con CH2Cl2 (2/10 mL).
d) La fase orgánica se combina y se seca sobre MgSO4 y, después de
adicionar una cantidad conocida de patrón interno (n-undecano en CH2Cl2),
el disolvente orgánico se evapora a presión reducida.
e) El residuo se acetila durante 40 minutos en 1,5 mL contiene CH2Cl2 0,2 mL
de anhídrido acético y 0,2 mL de piridina.
f) La fase acuosa se acidifica a un pH <3 con HCl. El filtrado se evapora a
presión reducida antes de acetilación y la metilación con
trimetilsilidiazometano (MT-CHN2).Todos los componentes volátiles se
eliminan por completo por evaporación con EtOH a presión reducida.

24
 Fase Fase
Sólido
orgánica Acuosa

Acetilar con Solubilizar

CH2Cl2/Anhidrido Acidular con HCl DMS/Dioxano/Piridi
acético/Piridina na

DERIVATIZACIÓN Acetilar con MT- DERIVATIZACIÓN

TOTAL CHN2 PARCIAL

DERIVATIZACIÓN
TOTAL

Diagrama 5. Proceso de derivatización total.

Fuente: Autores

5.4 Caracterización por Espectrofotometría UV:

Se utilizara un espectrofotómetro UV-VIS marca Jenway modelo 6405 serial

número 4063 para realizar la caracterización de la lignina, verificando la banda
característica 280 a 290 nm.

5.5 Caracterización por Espectroscopía IR:

Los espectros de infrarrojo (IR) son tomados en película de Bromuro de potasio

utilizando un equipo Shimadsu IR Infinity 1.
Estos análisis fueron realizados en el laboratorio de instrumental 2 de la
Universidad Francisco José de Caldas, y son de tipo cualitativo. Para ello se
ajustaron las variables instrumentales como velocidad, ganancia y velocidad del
peine (actividades realizadas por el laboratorista de la universidad)
Para analizar las muestras se utilizo el método de KBr, relación en peso 1:100
muestra /KBr.

25
5.6 Caracterización por Espectrofotometría Gases – Masas (GM-MS):

El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases Shimadzu GC 2010plus

equipado con un puerto de inyección splitess.

Se utilizó una columna capilar de dimetilpolisiloxano, (Restek Rxi GC Columns

EE.UU.) de 30 m x 0,25 mm (d.i.) x 0,25 μm (df), con fase estacionaria 5% fenilo.
La programación de temperatura del horno fue de 50 ºC (2 min) @ 15 ºC/min,
hasta 200 ºC (2 min) @ 10 ºC/min, hasta 300°C (10 min).

Los espectros de masas se obtuvieron por impacto de electrones (EI) de energía

de 70 eV. Las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de
transferencia fueron de 230 y 325 ºC, respectivamente. El gas de arrastre utilizado
fue helio (99,995%, Aga Fano, S.A, grado 5), con flujo constante de 1,2 mL/min.
Los espectros de masas y corrientes iónicas reconstruidas (TIC) fueron adquiridos
usando un analizador cuadrupolar, por medio de barrido automático de frecuencia
(full scan), a 4,75 scan s-1, en el rango de masas m/z 40-400.

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES BIOLÓGICAS

A los ácidos Húmicos, lignina, lignanos obtenidos por aislamiento y extracción se
les determinara su actividad antioxidante.

5.7 Actividad antioxidante:

La capacidad de las muestras para captar radicales libres se midió con el método
DPPH• modificado.23 A 2,0 mL de una solución metanólica de DPPH•, ajustada
hasta tener una absorbancia de 0,9 se le añaden 1,0 mL del extracto acuoso u
orgánico de la muestra. Se midió la absorbancia a 517 nm hasta que la reacción
se estabilizó aproximadamente 15 min.

La actividad se midió en un espectrofotómetro jenway modelo 6405 serial N. 4063,

usando cubetas de cuarzo.

26
La metodología desarrollada fue la siguiente:

5.7.1 Preparación de soluciones:

• Preparación del radical DPPH•: Se peso 3.9 mg de DPPH• en un matraz

aforado previamente tarado y se disolvió en 100 mL de metanol, el matraz
se cubrió con papel aluminio como protección contra luz.

• Preparación de Trolox: Se preparó una solución stock 800 µM disolviendo

2 mg de acido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2- carboxílico 97% (Trolox)
de Aldrich Chemical Co, en 10 mL de metanol, luego se prepararon
diluciones con rangos de concentración entre 100 µM y 700 µM, con el fin
de realizar la curva de calibración. Como blanco de calibración del equipo
se empleó metanol.

• Preparación del Acido Ascórbico: Se preparo un solución stock 0,1 µg/mL

disolviendo 5µg de acido ascorbico en 50 mL de metanol, luego se
prepararon diluciones con rangos de concentración entre 0,005 y 0,06
µg/mL, como blanco del equipo se preparo metanol.

5.7.1.1 Preparación de la curva de calibración: A 2,0 mL DPPH•· se le

adicionaron 0,1 mL de cada una de las diluciones de Trolox; la medición se
realizó a 517 nm, y el porcentaje de inhibición se calculó con base en la siguiente
ecuación 1:

A inicial − A final
% 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑖𝑖𝑖𝑖ℎ𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖ó𝑛𝑛 = 𝑋𝑋100
A inicial
Ecuación 1.

El porcentaje de inhibición representa la pérdida del color violeta del radical

DPPH•, cuando le es agregado un compuesto antioxidante, disminuyendo así la
absorbancia de la solución, que es medida a 517 nm; la absorbancia inicial se
toma en el minuto cero sin adición de trolox, la absorbancia final se toma 8
minutos después de agregar el trolox .

5.7.1.2 Medición de la inhibición generada por el patrón: A 2,0 mL DPPH•· se

le adicionaron 0,1 mL de cada una de las diluciones de Ácido ascorbico; la
medición se realizó a 517 nm, y el porcentaje de inhibición se calculó con la
misma ecuación empleada para realizar la curva de calibración.

27
5.7.1.3 Medición de la actividad antioxidante de los extractos: En una celda
de cuarzo se agregó 2,0 mL del radical DPPH• se midió la absorbancia a 517nm,
luego se adicionaron 1 mL de la dilución del extracto y nuevamente se midió la
absorbancia final a la misma longitud de onda 15 minutos después.

5.7.1.4 Determinación de la actividad total equivalente a trolox(TEAC): La

actividad antioxidante total frente al catión radical DPPH• fue calculada mediante
la ecuación 2; el TEAC equivale a decir la concentración de Trolox en µM/mL,
con una capacidad antioxidante equivalente a la de una concentración 1 µM/mL de
la sustancia problema. Para efectos de comparación se calculo el TEAC.24
X
µM Eq.Trolox/mL muestra=
(m ∗ mL muestra ∗ 1000)

Ecuación 2

m: pendiente de la ecuación de la curva de calibración

X: Abs inicial – Abs final

28
 6. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Esta investigación fue abordada desde dos aspectos, el químico que consistió en
conocer el rendimiento de extracción, que características fisicoquímicas, el análisis
espectrofotométrico y el análisis espectroscópico de las muestras obtenidas; por
otra parte el biológico que consistió en la actividad antioxidante de las muestras
dando las a conocer este resultado en µM equivalentes a trolox.

6.1 Toma de muestra de carbón leonardítico:

La muestra de carbón lignito (leonardita), analizada fue aportada por la empresa

BIOTROPIC LTDA, de una mina de su propiedad que se encuentra en
inmediaciones de la frontera noroccidental entre Boyacá y Santander, la muestra
fue entregada pulverizada, tamaño de partícula de 250 µm (tamiz No.60), lista
para ser analizada, en la tabla No 3 se describen los resultados obtenidos en
cuanto a su composición de la muestra analizada.

Parámetro evaluado Resultado obtenido

Carbono Fijo 47%
Materia Volátil 38%
Humedad 15%
Nitrógeno 1,2%
Tabla 3. Composición del carbón de muestra
Fuente: Instituto Agustin Codazzi

29
6.2 Análisis Químico:

Este trabajo se realizó dos metodologías diferentes de extracción que consistían

una por solventes orgánicos y otra por medio básico. Dando como resultado los
siguientes resultados:

• El método de Run Cang Sun obteniéndose un extracto seco de 13,58g y un

rendimiento del 6,79%.

• El método de NaOH – NaCl el extracto seco fue de 14,78g y su rendimiento

fue de 4,93%.

En la siguiente imagen se muestra como son los extractos sólidos los cuales son
de un color marrón oscuro a negro que se observa en la figura 2.

Extracto inicial Run Cang Sun Extracto inicial NaOH – NaCl

Figura 2. Extractos iniciales

Fuente: Autores

30
A estos se le realizaron unas pruebas de solubilidad que se muestran en las
siguientes tablas 3 y 4:

6.2.1 Solubilidad de extractos:

Extracto Run Cang Sun

Solvente
Etanol Suspensión
Diclorometano Parcialmente soluble
Acetona Insoluble
Tolueno Insoluble
Benceno Insoluble
1,4 Dioxano Parcialmente soluble
Dimetilsulfoxido Parcialmente soluble
Piridina Parcialmente soluble
Diclorometano – 1,4 dioxano Parcialmente soluble
Tetrahidrofurano Soluble
Dimetilsulfoxido – piridina Parcialmente soluble
Diclorometano – dimetilsulfoxido – Parcialmente soluble
piridina
Diclorometano – dimetilsulfoxido – Parcialmente soluble
piridina – 1,4 dioxano
Tabla 4. Solubilidad de extracto Run Cang Sun
Fuente: Autores

Como se aprecia en la Tabla 4 el extracto obtenido por el método de Run Cang

Sun es una mezcla poco soluble en diferentes solventes orgánicos de polaridad
media alta, dificultando los ensayos de propiedad antioxidantes, por esta razón se
realiza una derivatización para mejorar la solubilidad asi reduciendo la complejidad
por ende mejorando su solubilidad.

El extracto total del método de Run Cang Sun es un extracto de baja polaridad lo
hace poco soluble en todos los solventes orgánicos más utilizados.

31
 Sosa – NaCl
Extracto

Solvente
Diclorometano Suspensión
1,4 Dioxano Parcialmente soluble
Dimetilsulfoxido Insoluble
Piridina Insoluble
Etanol Insoluble
Tolueno Parcialmente soluble
Piridina – Dimetilsulfoxido – 1,4 Parcialmente soluble
Dioxano
Tetrahidrofurano Soluble
Tabla 5. Solubilidad de extracto Sosa - NaCl
Fuente: Autores

En la tabla 5 se apreciar que el extracto por el método de Sosa – NaCl también es

un extracto de baja solubilidad como el del método utilizado de solventes
orgánicos esto se debe a que las moléculas extraídas son polímeros orgánicos de
alto peso molecular y de polaridades muy bajas lo que dificulta su solubilidad en
diferentes solventes.

A los extractos derivatizados se les realizo pruebas de solubilidad dando como

resultado las siguientes tablas 5 y 6:

Extracto Run Cang Sun Derivatizada

Solvente
Etanol Parcialmente Soluble
Diclorometano Insoluble
Acetona Insoluble
1,4 Dioxano Soluble
Piridina Parcialmente soluble
Tetrahidrofurano Soluble
Tabla 6. Solubilidad de extracto Sosa – NaCl derivatizada
Fuente: Autores

32
 Extracto Sosa – NaCl Derivatizada

Solvente
Etanol Parcialmente Soluble
Diclorometano Insoluble
Acetona Insoluble
1,4 Dioxano Insoluble
Piridina Soluble
Tetrahidrofurano Soluble
Tabla 7. Solubilidad de extracto Run Cang Sun derivatizada
Fuente: Autores

Se puede apreciar una mejora en solubilidad de estos extractos derivatizados ya

que es soluble en solventes de polaridad media alta como el THF, la piridina y el
etanol, esto permitió realizar pruebas antioxidantes cuyos resultados se mostraran
más adelante.

Extracto Sosa Acuoso Extracto Run Cang Extracto Sosa Extracto Run Cang
Totalmente Sun Acuoso totalmente Orgánico Totalmente Sun Parcialmente
derivatizado. derivatizado. derivatizado. derivatizado.
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

Figura 3. Extractos derivatizados

Fuente: Autores

33
6.2.2 Características espectrales UV-Vis de lignanos:

Una característica espectral de algunas moléculas es que producen rotación

especifica de la luz polarizada, esto se debe a las conjugaciones con los anillos
aromáticos; en un espectro UV generalmente aparecen dos señales de similar
intensidad entre 230 – 240 nm y entre 280 – 290 nm. Una característica
importante de los lignanos, es que todos producen rotación específica de la luz
polarizada. Las insaturaciones conjugadas con los anillos aromáticos originan
desplazamientos de las señales.

A los extractos obtenidos se les realizo este ensayo espectrofotométrico

(gráfica 1 – 9) con el fin de conocer si existían moléculas con estas características
espectrales dando como resultado positivo desde el primer extracto hasta su
correspondiente derivatización viéndose picos de absorbancia en las longitudes de
onda mencionadas anteriormente; conociendo la procedencia del carbón nos
permite asegurar que estos extractos son ricos en moléculas de carácter
polifenólicos es decir lignina, ácidos húmicos y/o fúlvicos.25

Extracto Run Cang Sun antes de derivatizar

4
Absorbancia

3
2
1
0
200

Longitud de onda (nm)

Gráfico 1. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun antes de derivatizar

Fuente: Autores

34
 Extracto Run Cang Sun despues de derivatizar
3,5
3
2,5
Absorbancia

2
1,5
1
0,5
0
200

Longitud de onda (nm)

Gráfico 2. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun despues de derivatizar

Fuente: Autores

Extracto Run Cang Sun Der Total en THF

1

0,8

0,6
Absorbancia

0,4

0,2

0
200

500

-0,2
Longitud de onda (nm)

Gráfico 3. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun Derivatización Total en THF
Fuente: Autores

35
 Extracto NaOH - NaCl totalmente derivatizado en
Piridina
2

1,5
Absorbancia

0,5

0
200

-0,5
Longitud de onda (nm)

Gráfico 4. Espectro UV-Vis Extracto NaOH - NaCl totalmente derivatizado en Piridina

Fuente: Autores

Extracto Run Cang Sun totalmente derivatizado

en Piridina
2

1,5
Absorbancia

0,5

0
200

-0,5
Longuitud de onda (nm)

Gráfico 5. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun totalmente derivatizado en Piridina
Fuente: Autores

36
 Sosa Derivatización parcial en THF
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
Absorbancia

0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
200

350

500
-0,2
Longitud de onda (nm)

Gráfico 6. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización parcial en THF

Fuente: Autores

Run Cang Sun Derivatización Total en THF

3,5
3
2,5
Absorbancia

2
1,5
1
0,5
0
200

350

500

Longitud de onda (nm)

Gráfico 7. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Total en THF

Fuente: Autores

37
 Sosa Derivatización Total en THF
3,5
3
2,5
Absorbancia

2
1,5
1
0,5
0
200

350

500
Longitud de onda (nm)

Gráfico 8. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización Total en THF

Fuente: Autores

Run Cang Sun Derivatización Parcial en EtOH

3,5
3
2,5
Absorbancia

2
1,5
1
0,5
0
200

350

500

Longitud de onda (nm)

Gráfico 9. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Parcial en EtOH

Fuente: Autores

38
6.2.3 Análisis de gases – masas de los extractos obtenidos:

Las sustancias húmicas se extrajeron del carbón leonarditico empleando las

técnicas Run Cang Sun y sosa de acuerdo con la metodología descrita en los
numerales 5.1.1 y 5.1.2: la derivatización se efectuó de acuerdo a lo establecido
en el numeral 5.2.

En la siguiente figura se observa el perfil cromatográfico característico de las

sustancias húmicas obtenidas por la técnica sosa, con derivatización parcial. En
la tabla 8 se encuentran los compuestos identificados por comparación con la
biblioteca NIST 2,0 a través de la base de datos MSD Chemstation
G1701DAD.03.00611; se reportaron los compuestos que por comparación
presentaban más de un 90% de coincidencia con el espectro de la biblioteca,
también se presentan las concentraciones de cada uno de los componentes del
extracto obtenidos por comparación con el patrón interno.

Cromatrograma 1. Sosa Orgánica parcialmente derivatizada

Fuente: Autores

39
N° Compuesto Tiempo R Área ppm
1 Tetrahidro-2-furanol 4,103 111322126 2109040,9
2 Dimetilsulfoxamonio formilmetiluro 4,473 8067876 153468,1
3 (S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano 4,555 3571612 68311,6
4 1,3-Propanodiol, 2-(hidroximetil)-2-nitro 5,021 2666384 51167,1
5 Nonano 5,192 3255648 62327,4
6 2-Metoxitetrahidrofurano 5,421 17882361 339348,5
7 Ácido - 4-hidroxi butanoico 5,543 5456800 104015,9
8 Undecano (patrón interno) 6,577 291360529 5518859,2
9 2-(metoximetil)- tetrahidrofurano 8,263 630245 12603,8
10 Acido tetrahidro – 2 – furanil metil 8,359 18848923 357654,6
11 Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico 8,551 4956755 94545,3
12 Anhidrido Butanoico 8,744 15490493 294047,9
13 2-(metoximetil)- tetrahidro Furano 8,945 574392 11546,0
14 2-(metoximetil)- tetrahidro Furano 10,264 959183 18833,7
15 Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico 11,774 580012 11652,4
16 Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico 18,118 1580192 30595,3
17 Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico 18,194 1106543 21624,6
18 Hexatriacontano 19,492 3363107 64362,6
19 Tetratriacontano 21,264 2608550 50071,7
20 Hexatriacontano 22,783 1213490 23650,2
Tabla 8. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Sosa Orgánico
parcialmente derivatizado

El siguiente cromatograma muestra el perfil característico de las sustancias

húmicas obtenidas por la técnica Run Cang Sun, totalmente derivatizado. En la
tabla 9 se encuentran los compuestos identificados por comparación con la
biblioteca NIST 2,0 a través de la base de datos MSD Chemstation
G1701DAD.03.00611; se reportaron los compuestos que por comparación
presentaban más de un 90% de coincidencia con el espectro de la biblioteca.
También se presentan las concentraciones de cada uno de los componentes del
extracto obtenidos por comparación con el patrón interno.

40
 Cromatograma 2. Run Cang Sun Acuoso totalmente derivatizado
Fuente: Autores

N° Compuesto Tiempo R Área ppm

1 Tetrahidro – 2 –furanol 4,104 104468207 1979231,91
2 Dimetilsulfoxonio formilmetiluro 4,470 8944382 170068,563
3 (S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano 4,547 4099833 78315,7405
4 1,3-Propanediol, 2-(hidroximetil)-2-nitro 5,013 2497437 47967,3314
5 3,7 – Dimetil undecano 5,192 3243093 62089,6042
6 2-Metoxitetrahidrofurano 5,417 19394498 367987,426
7 3-Hidroxipropil oxirano 5,535 4775058 91104,0928
8 Undecano (patrón interno) 6,540 228384621 4326133,7
9 2,10 – Dimetil undecano 6,577 67260076 1274532,46
10 2-Etoxitetraidrofurano 8,263 750139 14874,5663
11 Ácido tetrahidro – 2 – furanil metil butanoico 8,355 20233263 383873,127
12 Ácido tetrahidro – 2 – furanil metil butanoico 8,548 5518583 105186,006
13 Anhidro butanoico 8,741 17309356 328496,1
14 Tetrahidro -2 – metoximetil furano 8,942 753438 14937,0473
15 Tetrahidro -2 – metoximetil furano 10,283 2002490 38593,3352
Tabla 9. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Run Cang Sun totalmente
derivatizado

41
En los esquemas 2, 3 y 4, se puede observar las posibles rutas de fragmentación
de tres de los compuestos identificados por la biblioteca; el tetrahidro-2- furanol, el
dimetil sulfoxonio formilmetiluro y el ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano).

Cromatograma 3.Pico 1(Tetrahidro – 2 – furanol)

Fuente: Autores

Esquema 2. Rompimiento de masas (Tetrahidro – 2 – furanol)

Fuente: Autores

42
 Cromatograma 4.Pico 2 (Dimetilsulfoxonio formilmetiluro)
Fuente: Autores

Esquema 3. Rompimiento de masas (Dimetilsulfoxonio formilmetiluro)

Fuente: Autores

43
 Cromatograma 5.Pico 3 ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano)
Fuente: Autores

Esquema 4. Rompimiento de masas ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano)

Fuente: Autores

La cromatografía de gases y el uso de ionización química en espectrometría de

masas (GC-MS) revelaron patrones de fragmentación diastereoespecíficos que
sirvieron para diferenciarlos.
A pesar de que los resultados de las muestras por infrarrojo, corroboraron la
presencia de grupos funcionales alcohol y acido ligados a anillos aromáticos, el
corrimiento de estas mismas por gases masas no confirmo los datos, esto puede
ser debido a que la columna utilizada era de polaridad media baja y lo ideal era
contar con una columna polar ya que las sustancias allí encontradas tenían estas
características de polaridad alta según las pruebas de solubilidad realizadas en el
laboratorio, además de esto al contar con sustancias tan altamente polares el

44
analista del laboratorio determinó que la forma de análisis adecuada de las
muestras sin poner en peligro la columna era dejar correr el solvente
(tetrahidrofurano) por 4 min antes de empezar la identificación de la muestra,
acción que abre la posibilidad a que moléculas importantes hayan salido unidas al
solvente antes de ser identificadas.

6.2.4 Características espectrales IR de extractos obtenidos:

El análisis de los extractos obtenidos por las técnicas Sosa y Run Cang Sun en el
infrarrojo se realizó de acuerdo al numeral 5.4, en las siguientes graficas se
encuentran los espectro IR obtenidos para los extractos de Run Cang Sun total y
parcialmente derivatizados y de Sosa totalmente derivatizado.

45
Espectro IR 1. Run Cang Sun Acuoso Totalmente Derivatizado
Fuente: Autores

46
Espectro IR 2. Run Cang Sun Orgánica Totalmente Derivatizado
Fuente: Autores

47
Espectro IR 3.Sosa - NaCl Acuoso Totalmente Derivatizado
Fuente: Autores

48
En la tabla 10 se puede observar de manera resumida las principales bandas
identificadas en los anteriores espectros infrarrojos, así como los grupos
funcionales atribuibles a tales bandas

Muestra analizada Pico Característico para

1197 c-o-c,
1400 C(CH3)3
1637 C=C
Run cang sun acuoso derivatizado 1656 C=C
2850 Anillo aromatico
2953 C-H
3448 O-H

1002 S=O
1172 Sulfonatos -
sulfonamidas
1637 C=N, NO2
Run cang sun orgánico derivatizado 2850 Anillo aromatico
2920 RCO-O-COR'
3037 Anillo aromatico
3446 O-H

1095 S=O
1139 Sulfonatos -
sulfonamidas
Sosa acuosa derivatizada 1400 C=N, NO2
3035 Anillo aromatico
3138 RCO-O-COR'

Tabla 10. Bandas características de los IR.

Fuente: Autores

Al realizar la comparación de las bandas obtenidas en los espectros de las

muestras analizadas, con espectros IR reportados en artículos científicos26 para
lignanos como el matairresinol, arctigenina, pinoriesinol, entre otros, se confirma la
presencia de bandas características, correspondientes a los grupos funcionales
como lactona, sulfona, grupos aromáticos, alcoholes, dobles enlaces entre otros.

49
6.3 Análisis Biológico:

6.3.1 Determinación de la capacidad antioxidante:

La actividad antioxidante se determinó de acuerdo a los parámetros establecidos

en el numeral 5.6.1.

6.3.1.1 Preparación de curvas de calibración y comparación:

Con el fin de expresar los resultados de actividad antioxidante en términos de µM
equivalentes de trolox/mL (ecuación 1), se realizo la curva de calibración con
soluciones de trolox en concentraciones de 100 a 800 µM y se realizó la medición
del porcentaje de inhibición empleando la ecuación 2. Los resultados de la
medición del porcentaje de inhibición se encuentran en la tabla 11 corroborando
una efectividad del trolox entre un 19% y un 79% para las concentraciones
evaluadas.

TROLOX µM Absorbancia Absorbancia % de

inicial (ƛ 517 Final (ƛ 517 inhibición
nm) nm)
100 0,903 0,729 19,0
200 0,910 0,691 24,0
400 0,907 0,522 42,0
600 0,899 0,345 62,0
800 0,907 0,187 79,0
Tabla 11. Datos para la curva de calibración con trolox
Fuente: Autores

Partiendo de los datos obtenidos de la inhibición de DPPH•, por parte del trolox,
se construyó una curva de calibración (Gráfica 10) que permite verificar la
dependencia lineal del % de inhibición del radical Vs. la concentración del trolox
obteniéndose un R2 de 0,996.

50
 1 Inhibición DPPH (%)
0,8 y = 0,000x + 0,080
R² = 0,996

Inhibición %
0,6

0,4

0,2

0
0 200 400 600 800 1000
TROLOX µM

Gráfica 10. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs concentración Trólox

Fuente: Autores

Se determinó la actividad del ácido ascórbico (vitamina C) en concentraciones de

0,005 a 0,06 µg/mL (tabla 12), para tomarlo como patrón de comparación en
cuanto a porcentaje de inhibición.

6.3.1.2 Determinación de la actividad antioxidante de Vitamina C frente a DPPH•:

Vitamina C Vitamina C Absorbancia Absorbancia Inhibición

(µg/mL) (ppm) Inicial (ƛ 517 Final (ƛ 517 DPPH• (%)
nm) nm)
0,005 5 0,902 0,603 33,1
0,01 10 0,891 0,527 40,9
0,02 20 0,908 0,443 51,2
0,04 40 0,910 0,186 79,6
0,06 60 0,900 0,016 98,2
Tabla 12. Datos para la curva de calibración con Vitamina C
Fuente: Autores

51
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de la actividad antioxidante de la
vitamina C se elaboro la gráfica 11, que nos permite corroborar un
comportamiento lineal de la misma.

Inhibición DPPH (%)

120,0
100,0
Inhibicón (%)

80,0

60,0
40,0
20,0

0,0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
Vitamina C (µg/ml)

Gráfica 11. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs Vitamina C

Fuente: Autores

6.3.2 Actividad antioxidante de los extractos:

En la tabla 13 se encuentran los resultados obtenidos de la actividad antioxidante

de los extractos, en ella se describe el tipo de extracto, concentración inicial,
diluciones evaluadas, el cálculo del porcentaje de inhibición obtenido de las dos
replicas para cada dilución, el promedio y la desviación estándar correspondiente.

52
 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4
Concentración % de Concentración % de Concentración % de Concentración % de
(µg/mL) inhibición (µg/mL) inhibición (µg/mL) inhibición (µg/mL) inhibición

1200 92,0 1200 99,5 1200 79,1 1200 79,5

90,3 98,7 80,5 80,0
Promedio 91,2 Promedio 99,1 Promedio 79,8 Promedio 79,8
Desviación 0,9 Desviación 0,4 Desviación 0,7 Desviación 0,3
estándar estándar estándar estándar
600 41,0 600 56,2 600 34,8 600 44,2
42,8 54,3 35,9 43,8
Promedio 41,9 Promedio 55,3 Promedio 35,4 Promedio 44,0
Desviación 0,9 Desviación 1,0 Desviación 0,6 Desviación 0,2
estándar estándar estándar estándar
300 27,5 300 34,2 300 19,3 300 24,3
26,0 32,7 17,9 25,0
Promedio 26,8 Promedio 33,5 Promedio 18,6 Promedio 24,7
Desviación 0,8 Desviación 0,8 Desviación 0,7 Desviación 0,4
estándar estándar estándar estándar
150 15,8 150 21,8 150 11,6 150 12,3
14,7 22,6 12,9 12,7
Promedio 15,3 Promedio 22,2 Promedio 12,3 Promedio 12,5
Desviación 0,6 Desviación 0,4 Desviación 0,7 Desviación 0,2
estándar estándar estándar estándar
Tabla 13. Resultados de actividad antioxidante en términos de inhibición de DPPH• de los
extractos.
Fuente: Autores

Nota: Muestra 1. Sosa acuosa derivatizada totalmente, Muestra 2. Run Cang Sun
acuoso totalmente derivatizado, Muestra 3. Sosa orgánica totalmente derivatizada,
Muestra 4. Sosa orgánica parcialmente derivatizada

6.3.2.1 Determinación de la actividad antioxidante equivalente a trolox de los

extractos (TEAC).

La actividad antioxidante total, se calculó de acuerdo al numeral 5.6.1.4, según la

ecuación 2, tomando como base la ecuación de la recta de calibración:
y = 0,0009x + 0,0809, los resultados son plasmados en la tabla 14 y se reportan
en equivalentes trolox/mL de muestra.

53
 Muestra 1 Muestra 2
Concentración % de µM equivalente a Concentración % de µM equivalente a
(µg/mL) inhibición trolox/mL (µg/mL) inhibición trolox/mL

1200 92 0,85 1200 98,7 0,96

600 41 0,29 600 54,3 0,59
300 26 0,16 300 34,2 0,27
150 14,7 0,07 150 21,8 0,15

Muestra 3 Muestra 4
Concentración % de µM equivalente a Concentración % de µM equivalente a
(µg/mL) inhibición trolox/mL (µg/mL) inhibición trolox/mL

1200 79,1 0,71 1200 79,5 0,71

600 34,8 0,31 600 44,2 0,33
300 19,3 0,08 300 24,3 0,16
150 11,6 0,02 150 12,3 0,03
Tabla 14. Resultados de actividad antioxidante equivalente a trolox (TEAC) de los extractos.
Fuente: Autores

Los valores de Inhibición y TEAC calculados para los extractos obtenidos por
ambas técnicas son similares en todos los puntos evaluados, siendo un poco más
altos los obtenidos para la técnica Run Cang Sun extracto acuoso totalmente
derivatizado (muestra 2).

En la tabla 14 se realiza una comparación del valor calculado de TEAC para la

dilución que presento el mayor porcentaje de inhibición de cada uno de los
extractos, con valores de TEAC reportados en la literatura para flavonoides con
alta capacidad antioxidante como la quercitina27, o ácidos fenólicos de mediana
capacidad antioxidante como el ácido cafeico.28 Se puede deducir que la
capacidad antioxidante de los extractos expresada en términos de TEAC es
media, esto debido a la presencia de derivados de fenilpropanoides, fenoles o
sustancias donadoras de protones en la composición de los extractos.
Comparando el porcentaje de inhibición logrado por los extractos contra la
inhibición obtenida por el patrón de ácido ascórbico, los resultados obtenidos por
las muestras analizadas fueron un poco bajas, sin embargo se debe tener en
cuenta que el ácido ascórbico es una sustancia con una gran capacidad
antioxidante, y las muestras analizadas no se encontraban en estado puro, es
decir aquellas sustancias que podrían haber tenido capacidad antioxidante,
pueden estar ligadas a otras que pueden interferir con esta propiedad.

54
 Extracto TEAC (µM)
Muestra 1 0,85
Muestra 2 0,96
Muestra 3 0,71
Muestra 4 0,71
Quercitina 4,70
Ácido Cafeico 1,26
Tabla 15. Capacidad antioxidante de los extractos expresada en términos de TEAC
Fuente: Autores

En este trabajo se utilizo el método de decoloración del DPPH• para la

determinación de la actividad antioxidante, la cual es una técnica efectiva para la
búsqueda de nuevas sustancias o mezclas antioxidantes. Sin embargo, la
efectividad de un antioxidante depende de una variedad de factores que, incluyen,
la polaridad, solubilidad y la actividad quelante de metales, entre otros, por esta
razón, es necesario evaluar las posibles sustancias antioxidantes a través de
diferentes metodologías, con el fin de poder descartar una sustancia como
antioxidante de manera definitiva.

55
 7. CONCLUSIONES

• Partiendo de los resultados obtenidos podemos afirmar que el método de

Run Cang Sun es más eficiente que el método Sosa en cuanto a eficiencia,
sin embargo para valorar un resultado hay que tener en cuenta otros
aspectos importantes, como lo son los reactivos empleados en la
extracción, el costo de los mismos; en cuanto estos dos últimos factores el
método de Run Cang Sun es más costoso y peligroso debido a que uno de
los componentes principales de la mezcla extractora es el tolueno

• Por medio de análisis espectrofotométricos de UV-Vis se identificaron

bandas características reportadas en la literatura para sustancias húmicas
permitiendo corroborar de cierto modo la presencia de las mismas,
permitiendo así continuar con la investigación, cuyo enfoque principal era
la comprobación de la capacidad antioxidante de las mismas.

• El análisis infrarrojo realizado a los extractos permitió realizar

comparaciones entre las señales identificadas con otras bandas reportadas
en estudios realizados sobre lignanos y derivados fenólicos con
características antioxidantes, las cuales mostraron gran similitud
reconociendo así la presencia de sustancias con características
antioxidantes, información que pudo ser corroborada luego por los
resultados obtenidos de esta actividad.

• El proceso de derivatización fue efectivo permitió romper los polímeros

aromáticos aumentando su solubilidad y permitiendo separación de sus
sustancias constituyentes por cromatografía de gases.

• Las sustancias separadas por cromatografía de gases e identificadas por

masas a través de comparación con biblioteca NIST, no poseen actividad
antioxidante importante esto debido a que las sustancias antioxidantes que
pueden extraerse de la matriz del carbón, (derivados de sustancias
húmicas) poseen un carácter bastante polar, siendo estos poco
incompatibles con la columna empleada, por tanto se identificaron en el
carbón aquellas sustancias que fueron más compatibles con la columna y
fueron separadas por ella de manera más adecuada.

• El realizar pruebas como la espectrofotometría de masas, UV-Vis y

espectroscopía IR permitió corroborar varios aspectos importantes como
características estructurales de los compuestos, cuantificación de
moléculas existentes, lo que podría permitir la determinación del
rendimiento la extracción de cada uno de los compuestos y nos permite
afirmar algunas moléculas existentes en los extractos.

56
• Los 4 extractos obtenidos poseen una actividad antioxidante muy similar
esto puede ser que tanto el método de extracción como su correspondiente
derivatización se realizaron de manera adecuada obteniendo 2
posibilidades la primera es haber obtenido los mismos compuestos por
ambos métodos y la segunda que las sustancias obtenidas tengan actividad
antioxidante muy cercanas. Los extractos obtenidos presentaron una
actividad antioxidante comparada con la que posee el acido caféico, que es
una sustancia antioxidante de mediana capacidad.

• La muestra N° 2 es la que posee mayor actividad lo que induce a pensar

que es un extracto con un porcentaje mayor de compuestos de tipo fenólico
lo que permite tener obtener este resultado.

57
 8. RECOMENDACIONES

• Para próximas investigaciones se recomienda utilizar el método de NaOH –

NaCl porque es más económico, menos contaminante y su tiempo de
operación es menor que la extracción orgánica. Además el rendimiento del
método inorgánico podría mejorarse realizando ensayos aumentando la
concentración de los reactivos.

• Debido a que el proceso de derivatización empleado fue efectivo y un

proceso netamente químico, se puede plantear otra metodología en la cual
se utilice reactivos de menor contaminación o un proceso físico como la
termoquimolisis.

• Es necesario determinar otra metodología para él análisis por CGM ya que

la utilizada no permitió corroborar la presencia de moléculas con
características antioxidantes.

• Se sugiere realizar otros ensayos que permitan corroborar de manera

definitiva la actividad antioxidante como lo es el método de ABTS.

58
 9. BIBLIOGRAFIA

1. Encolombia.com, El carbón en la sociedad Colombina, [en línea] [10 de

septiembre de 2011] disponible en :
<http://www.encolombia.com/economia/Elcarbon/Elcarbonencolombia.htm>

2. Boluda Carlos J, Duque Beatriz, Gulgas Gergely, Lignanos (3)

enterolignanos y actividad estrogenica, revista de fitoterapia, 2006, Vol 6,
Issue 1, 45-57 p. Revista de Fitoterapia. Fitoterapia.net. Disponible en:
< http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/Lignans3.pdf >

3. MINISTERIO DE MINAS Y ENERGIA. Cadena del carbón [en línea].<

http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf> [citado en 12 de marzo
de 2012]

4. OIKOS SOLUTIONS. ¿Qué es la leonardita? [en línea].

<http://www.oikossolutions.com/noticia/26/LEONARDITA%20editada.pdf>
[citado en 08 de marzo de 2012].

5. REGNAULT-ROGER, Catherine. PHILOGÉNE, Bernard J.R., VINCENT.

Charles. TERRÓN, Urbano, Biopesticidas de origen vegetal, Madrid, Grupo
Mundi-Prensa, 2003. 70 p. ISBN: 84-8476-194-0.

6. BOLUDA. Carlos, DUQUE. Beatriz, Aragón. Zulma. Lignanos (I) estructura

y funciones en las plantas.Barcelona, 2005; Vol 5, Issue 1, 55-68 p. Revista
de Fitoterapia. Fitoterapia.net. Disponible en: <
http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/5568%20RDF%205.1%20LIGNANOS.
pdf>

7. COLECCIÓN DE TESIS DIGITALES UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS

PUEBLA. Aislamiento de levaduras que tengan la capacidad de degradar
lignina y búsqueda de algunos genes implicados en dicha degradación [en
línea].<http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/mbt/olvera_a_p/ca
pitulo5.pdfZ>[citado 12 de marzo de 2012]

59
8. ROJAS AGUILAR, Marcela. Extracción de lignina proveniente de residuos
agroindustriales para su empleo en procesos de gasificación. Ciudad de
México, 2004, 7-9 p. Trabajo de grado (Ingeniera Química).Universidad
Autónoma Metropolitana. Facultad de Ingeniería. Disponible en:
<http://148.206.53.231/UAMI12063.PDF>

9. NUÑEZ SOLÍS, Jorge. Fundamentos de edafología, Costa Rica, Editorial

Universidad Estatal a Distancia San José, 1981. 117p. ISBN: 9977-64-148-x

10. YOUNGSON, Dr. Robert. Antioxidantes y radicales libres, Madrid, Editorial

EDAF S.A, 1994. 113 p. ISBN: 84-414-1230-8.

11. PATIÑO, J.F. Lecciones de cirugía, Bogotá, Editorial Medica Panamericana,

2000. 87 p. ISBN: 958-9181-45-7

12. HSIN-LING. Yang, YOU-CHENG. Hseu, YI-TING. Hseu, FUNG-JOU. Lu,

ELONG. Lin, JIM-SHOUNG. Lai. Humic acid induces apoptosis in human
premyelocytic leukemia HL-60 cells. Taiwan, 2004; Vol. 75, Issue 15, 1817-
1831 p. Life Sciences. SciencieDirect. Elsevier. Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0024320504004874>

13. HUNG-CHIH. Ting, CHENG-CHIEH. Yen, WEN-KANG. Chen, WEN-HUEI.

Chang, MING-CHIH. Chou, FUNG-JOU. Lu, Humic acid enhances the
cytotoxic effects of arsenic trioxide on human cervical cancer cells. Taiwan,
2010; Vol 29, Issue 2, 117-125 p. Environmental Toxicology and
Pharmacology. SciencieDirect. Elsevier. Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S138266890900177X>

14. COZZI. R, NICOLAI. M, PERTICONE. P, DE SALVIA. R, SPUNTARELLI. F.

Desmutagenic activity of natural humic acids: inhibition of mitomycin C and
maleic hydrazide mutagenicity. Roma, 1993; Vol 299, Issue 1, 37-44 p.
Mutation Research/Genetic Toxicology. SciencieDirect. Elsevier. Disponible
en: < http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016512189390117V>
15. VASKOVÁ, J., VELIKÁ, B., PILÁTOVÁ, M., KRON, I., & VASKO, L. Effects
of humic acids in vitro. República Checa, 2011; Vol 47, Issue 5-6, 376-382 p. In Vitro
Cellular & Developmental Biology. US National Library of Medicine National
Institutes of Health. NCBI. Elservier. Disponible en: <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21487922>

60
16. MOHD. Aamir Mirza, NIYAZ. Ahmad, SURAJ PRAKASH. Agarwal,
DANISH. Mahmood, KHALID ANWER. M, IQBAL. Z. Comparative
evaluation of humic substances in oral drug delivery. New Delhi, 2011; Vol
1, Issue 1, 16-26 p. Results in Pharma Sciences. SciencieDirect. Elsevier.
Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211286311000054>

17. MIROSLAW. T., KRZYSZTOF. D., DANUTA. G., BOGDAN. S., HPLC
determination of phenolic acids and antioxidant activity in concentrated peat
extract a natural immunomodulator, Wroclawskie, 2006, Vol 14, Issue 1, 182
– 188 p. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. SciencieDirect.
Elsevier. Disponible en:<
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0731708505007144>

18. MACRAE. W.Donald, TOWERS. G.H.Neil. Biological activities of lignans.

Vancouver, 1984; Vol 23, Issue 6, 1207-1220 p. Phytochemistry.
SciencieDirect. Elsevier. Disponible en:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942200804288>

19. AEHLE. E, MÜLLER. U, EKLUND. Pc, WILLFÖR. Sm, SIPPL. W, DRÄGER.

B. Lignans as food constituents with estrogen and antiestrogen activity.
Halle-Wittenber; 2011; Vol 72, Issue 18, 2396 p. Phytochemistry. NCBI.
Elsevier. Disponible en:< http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21889775>

20. RUN-CANG. Sun. TOMKINSON. J, ZHU. W, WANG. Sq. Delignification of

maize stems by peroxymonosulfuric acid, peroxyformic acid, peracetic acid,
and hydrogen peroxide. Physicochemical and structural characterization of
the solubilized lignins. United Kingdon; 2000; Vol 48, Issue 4, 1253-1262 p.
Journal of agricultural and food chemistry. NCBI. Elservier.1 Disponible en:<
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21889775>

61
21. ORTER. Risoleta, PRADO. Soizic, REGALADO. Erik, VALERIOTE.
Frederick, MEDIA. Joseph, MENDIOLA. Judith, THOMAS. Olivier.
Furfuranlignans and a flavone from Artemisia gorgonum Webb and their in
vitro activity against Plasmodium falciparum. France, 2011; Vol 138, Issue
2, 637-640 p. Journal of Ethnopharmacology. SciencieDirect. Elsevier.
Disponible en: <
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874111007100>

22. GRASSET. Laurent, VLCKOVÁ. Zoja, KUCERIK. Jiri, AMBLÉS. André,

Characterization of lignin monomers in low rank coal humic acids using the
derivatization/reductive cleavage method, 2010; Vol 41, Issue 9, 905 – 909
p. Organic Geochemistry. SciencieDirect. Elsevier. Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0146638010000847>

23. W. BRAND, Williams. M.E, Cuvelier. C, Berset. Use of a free radical method
to evaluate antioxidant activity. LWT - Food Science and Technology.
Francia, 1995; Vol 28, Issue 1, 25 – 30 p. SciencieDirect. Elsevier.
Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643895800085>

24. LEYVA DANIEL. Diana Elizabeth. Determinación de antiocianinas, fenoles

totales y actividad antioxidante en licores y fruto de mora. Oaxaca, 2009, 30
-77 p. Tesis (Ingeniera de Alimentos).Universidad Tecnológica de la
Mixteca. Facultad de Ingeniería. Disponible en:
<http://jupiter.utm.mx/~tesis_dig/10876.pdf>

25. UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA. Facultad de Química Farmaceutica.

Introducción al metabolismo secundario compuestos derivados del ácido
shikimico [en línea]. < http://farmacia.udea.edu.co/~ff/shikimico.pdf>.

26. OPLETAL. Lubomí, SOVOVÁ. Helena, BÁRTLOVÁ. Milena.

Dibenzo[a,c]cyclooctadiene lignans of the genus Schisandra: importance,
isolation and determination. Journal of Chromatography B. Republica
Checas, 2004; Vol 812, Issue 1-2, 357-371 p. SciencieDirect. Elsevier.
Disponible en: <
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570023204006464>

62
27. RICE EVANS. Catherine, J MILLER. Nicholas, PAGANGA. George. Activity
relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and
Medicine. Londres, 1996; Vol 20, Issue 7, 933-956 p. SciencieDirect.
Elsevier. Disponible en:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0891584995022279>
28. GOLDSTEIN. J.L., Changes in tanin in ripening fruits. Phytochem.
Cambridge, 1963; Vol 2, Issue 37, 371-383 p. Phytochemistry.
SciencieDirect. Elsevier. Disponible en:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942200848608>

63