Universidad Autnoma de Ciudad Jurez

Instituto de Ciencias Biomdicas

Clase: Biologa molecular

Profesor: Jos Luis Castellanos

Alumno: Luis Roberto Medrano Ginez, 161598

Manual de uso
de tcnicas de
biologa
molecular.
Introduccin.

La biologa molecular busca estudiar procesos de un organismo desde vista molecular,

a partir de molculas encontradas como es el ADN y ARN.
 Agradecemos al profesor Jos Luis Castellanos por inculcar las tcnicas y la
importancia de a` biologa molecular a generaciones de futuros mdicos.

- Luis Roberto et al.

Extraccin de cidos nucleicos.

Introduccin:

Los cidos nucleicos forman las macromolculas de ADN (cido

desoxirribonucleico) y ARN (cido ribonucleico); dichas molculas estn formado de
una pentosa (desoxirribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una base nitrogenada
(adenina, guanina, citosina, timina y uracilo) y un grupo fosfato.

Para manejar muestras con la finalidad de extraccin de cidos nucleicos

existen precauciones que se deben tomar dentro del laboratorio.

Precauciones:

Para trabajar con cidos nucleicos es importante mantener un rea limpia para
evitar cualquier tipo de contaminacin. Se recomienda usar cido clorhdrico (10%) y/o
etanol (70%) para limpiar las superficies de su rea de trabajo 1. Al igual, se requiere el
usar guantes para proteccin personal y usar instrumentos estriles 1. Se recomienda
someter el material a radiacin ultravioleta para degradar cidos nucleicos presentes 1.

Objetivo:

Extraer cidos nucleicos (en forma de ADN) de la muestra obtenida.

Procedimiento(s):

Extraccin de ADN por Lisis Alcalina2.

1.-Crecimiento de bacterias:

- Se agregan de 20 L de bacterias de E. coli transformadas por el plsmido

pBR322 (molcula con ADN circular) y se depositaran en 3 ml de medio LB
suplementado con ampicilina (100 L/mL) contenido en un tubo con tapa y estril.
- El medio inoculado y un grupo control de 3 ml sin bacterias se incuban a 37C
con agitacin constante por 12 18 hrs para permitir un crecimiento de bacterias.

2.- Aislamiento de ADN:

- Centrifugar 1.5 mL de la muestra a 14,000 g por 20 segundos. Decantar el
sobrenadante y el precipitado (botn o pellet) se resuspende en 100 L de solucin
GTE.
- Agregar 200 L de solucin de NaOH/SDS y agitar suavemente. Pasar por
hielo frap durante 5 minutos y agregar 150 L de acetato de sodio, mantener en el
hielo. Agitar en vortex y regresar al hielo 5 minutos.
- Centrifugar a 14,000 g por 3 minutos. Agregar 0.8 mL de etanol, agitar por
inversin y mantener a -70C para precipitar el ADN. Centrifugar a 14,000 g por 10
minutos y decantar el sobrenadante para poder lavar el pellet con 1 mL de etanol
(70%).
- Centrifugar a 14,000 por 5 minutos, decantar el sobrenadante y eliminar el
etanol por aspiracin con vaco. Al pellet se le agrega 20-50 L de TE pH 80 (que
aporta a la estabilidad del ADN para conservacin a largo plazo.

Corte del plsmido con enzimas de restriccin 3:

Las enzimas de restriccin son enzimas que cortan la cadena de ADN con dos
tipos de cortes, cohesivos (es un corte asimtrico) y romos (corte recto).

- Preparar la solucin con ADN, RNAsa A, Enzima de restriccin, Buffer de

digestin y ddH2O. Incubar sin agitacin a 37C por lo menos 30 minutos. Agregar 1 L
d e0.2 M EDTA para desactivar la enzima de restriccin.
- Tomar la muestra de digestin y agregarle el buffer, al igual agregar bromuro de
sodio. Se prepara equipo para electroforesis. En los pozos del gel se coloca ADN
cortado y ADN sin cortar, al realizar la electroforesis se obtiene bandas para comparar,
unas con ausencia y otras con presencia de enzimas.
NOTA: el bromuro de sodio es un compuesto altamente reactivo y cancergeno,
se debe manejar con proteccin.

Resultado:
 Anlisis:

1.- Para determinar el nmero de cortes

hechos por la enzima, se observa el
resultado de las bandas despus de la
electroforesis.
2. - La suma de los pesos moleculares
debe dar aproximadamente igual al del
ADN intacto.

Purificacin de ADN por centrifugacin en columna 4.

1. - Preparacin de la columna:
1.- Desprender la tapa del tubo para
microcentrfuga de 1.5 mL al ras.

2. - Desprender la tapa del tupo del

microcentrfuga de 0.5 mL y con una aguja
hacer un orificio en el fondo del mismo.

3. La punta amarilla deber tener

empaquetado al fondo un pedazo de
algodn. Se coloca el tubo de 0.5 mL.

2. - Purificacin por centrifugacin:

- Introducir el gel de muestra obtenido de un corte de plsmido por enzimas
de restriccin en el orificio ms amplio de la punta amarilla. Congelar dispositivo a
-70C por 15 minutos.

- Centrifugar por 12,000 g por 10 minutos y recuperar el lquido obtenido en el

tubo tipo Eppendorf de 1.5 mL. Para precipitar el ADN, medir el volumen del lquido con
una micropipeta. Agregar un volumen de acetato de sodio 3M igual a la dcima parte
del volumen medido y 1 mL de etanol absoluto. Agitar por inversin y congelar el tubo a
-70 C por 10-30 minutos.
- Centrifugar el tubo a 14,000 x g por 10 minutos. Se descarta el sobrenadante
por aspiracin con vaco. Resuspender el precipitado en 10-50 con TE para cargar con
gel de agarosa.
- Electroforesis.

Resultado:

Para observer AND purificado, se puede

ver las bandas 5, 6 y 7 en donde se ve
una banda bien definida. La banda 1 es
para control de peso molecular, mientras
que el carril 4 y 8 no tienen muestra.

El carril 2 y 3 es ADN no purificado, se

hace la comparacin entre el purificado.
Enzimas que modifican cidos nucleicos.

La unin internacional de bioqumica y biologa molecular crea un sistema de

nomenclatura para enzimas, agrupndolas por reaccin que catalizan. Por ejemplo, EC
1.1.5 (enzima oxidoreductasa)5

1.- EC 1.-.-, Oxido-reductasas,

- El cdigo EC 1 se refiere a enzimas que catalizan reacciones de xido-
reduccin. Aquellas enzimas que catalizan la transferencia de electrones entre un
donante y un receptor. Entre las enzimas principales estn 6, 7:

* Deshidrogenasas: sustraen tomos de hidrgeno y los transfieren a un

receptor que no es oxgeno.

* Amino oxidasa: oxidan sustratos mediante el oxgeno, receptor de

electrones.
 * Hidroxilasas: catalizan funciones hidroxilo en sustratos utilizando
oxgeno como el donante.

2.- EC 2.-.-, Transferasas,

- El cdigo EC 2 se refiere a enzimas que catalizan la transferencia de un grupo
funcional de un donante a un receptor. Entre las enzimas principales estn 6, 7:

* Quinasas: catalizan reacciones de transferencia de grupos fosfatos.

* Al igual, los grupos que se encuentran dentro de esta enzima se

clasifican por el grupo funcional que alteran.
3. - EC 3.-.-, Hidrolasas,
- El cdigo EC 3 se refiere a enzimas que catalizan la ruptura de enlaces con la
participacin de molculas de H2O.

4. - EC 4.-.-, Liasas,
- El cdigo EC 4 se refiere a enzimas que catalizan reacciones las cuales
producen la adicin o sustraccin de grupos qumicos con doble enlaces.

* Hidratasa: aquellas que adicionan H2O con enlaces dobles.

5. - EC 5.-.-, Isomerasas,
- El cdigo EC 5 se refiere a las enzimas que catalizan reacciones de
interconversin de ismeros.

* Mutasas: aquellas que interconvierten ismeros de posicin.

6. - EC 6.-.-, Ligasas
- El cdigo EC 6 catalizan reacciones de unin de sustratos que requieren de
energa aportada por el ATP.

Tcnicas bsicas de gel.

Estimacin de la concentracin de ADN en placas de gel de agarosa.

Concepto:
- Gel de agarosa8: polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se extrae
de algas.

Procedimiento:

- Preparar agarosa al 1% en amortiguador NET, adicionar 2.5 mg/ml de bis-

Bencimida. Fundir agarosa a ebullicin y dejar enfriar.
- Gotear con una pipeta de Pasteur la agarosa en un portaobjetos hasta cubrirlo
completamente y dejar que soldifique. Preparar muestras de ADN en diferentes
concentraciones y gotear 1 ml de las muestras y dejar aproximadamente 1 hr. Se
observa finalmente la luminiscencia bajo luz ultravioleta.

Tincin del ADN en los geles de agarosa.

Concepto:
- Bromuro de etidio9: el mtodo ms usado, el bromuro de etidio es un colorante
fluorescente del ADN, lo intercala y lo permite observar bajo irradiaciones de luz
ultravioleta. Al igual es un potente mutgeno que debe ser tratado con extremo cuidado
y con proteccin personal para ambos el bromuro de etidio y la luz ultravioleta.
Tcnica alternativa para tincin del ADN, Stains ALL.

Concepto:
- Funciona para colorear ADN, ARN y protenas que conforman la muestra.

Procedimiento:
- Se prepara la concentracin de Stains ALL al 0.1% del colorante en
formamida con un pH de 7.3 a 7.4. Se deja el gel en la solucin y se deja por 1 hora. Al
final, se destie con agua destilada.

Manejo de muestras de ADN en geles nativos de acrilamida.

Concepto:
- Las muestras pueden ser visualizadas en geles no desnaturalizantes de
Acrilamida-bis acrilamida teida en plata 10, lo cual permite la visualizacin de menores
cantidades de ADN, tiene un rango de separacin mayor y con mayor resolucin.

Procedimiento:
- Colocar gel en solucin fijadora por 20 minutos (solucin que permitir adjuntar
tinte), decantar la solucin y aadir el tinte; al igual dejar por 20 minutos. Lavar con
agua des ionizada por 15 minutos y aadir solucin reveladora para observar tinte.
Nota: procedimiento derecho es tincin por medio de
bromuro de etidio, procedimiento izquierdo es tincin por
tincin de plata.

Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida (PAGE).

Concepto11:
- La matriz de poliacrilamida se forma mediante polimerizacin de acrilamida y
bis-acrilamida, ocurriendo con un agente iniciador (TEMED) y un catalizador. Las
protenas del gel sometidas a un campo elctrico en el estudio de electroforesis
presentan movimiento en base a su peso molecular y carga neta.
- El kit de trabajo difiere a uno de electroforesis con gel de agarosa, ya que el
material de trabajo se presenta de
manera vertical con la presencia de dos
pozos, uno de soporte y otro para la
corrida.
Electroforesis.

Concepto:
- La electrofresis12 es el estudio del movimiento de polmeros biolgicos
cargados sometidos a una carga elctrica. Se hace por medio de soporte de geles,
principalmente el gel de agarosa 8, 13, producto obtenido de algas marinas que funcionan
como matriz gelatinosa.
- La separacin de los fragmentos se debe a su peso molecular, su carga neta y
conformacin del polmero. Los fragmentos con carga negativa se arrastran hacia la
carga positiva y los fragmentos pequeos atraviesan con mayor velocidad; al igual, si
se tie la muestra se ve como bandas 14. Usualmente, para obtener un aproximado del
peso molecular de la muestra se aplica en el primer pozo y al correr se compara con un
marcador de tamao molecular15.

Procedimiento:
- El gel se coloca en una cmara en el cual en un extremo est conectado el
lado positivo y en el otro est conectada la carga negativa. El cuerpo principal de la
maquinaria se llena de solucin con sales para poder conducir la corriente.

- La corriente elctrica inicia a correr por el gel, los grupo fosfato del esqueleto
de azcares-fosfato le otorgan carga negativa a las molculas de ADN por lo que
comienzan a moverse por el matriz del equipo.
- Cuando el gel se tie se puede observar
bandas luminiscentes bajo luz UV. Una lnea de
ADN se llama banda.

Resultados:

Electrofresis zoneal15.
Concepto:
- Tcnica en la que se aplica un campo elctrico a un soporte estabilizante (en
vez de fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo. Se utiliza para
separar componentes complejos.

- El mtodo tiene resultados favorables al aplicar una cantidad pequea de

protena a una zona estrecha y tiene un campo para correr de mayor longitud.
PCR (Polymerase Chain Reaction).

Concepto:
- La Reaccin en Cadena de la Polimerasa 16 es una tcnica de la biologa
molecular que sirve para hacer mltiples copias de una determinada regin del ADN.
Depende de un ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa) y requiere de
cebadores de ADN diseados para cierta regin de ADN.
- Por lo general, se usa para reproducir suficiente ADN de la regin para poder
analizar. El ADN ampliado por el PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis
en gel o clonar en un plsmido.
- Taq polimerasa17: Thermus aquaticus, polimerasa obtenida de una bacteria
tolerante al calor en donde es utilizado el PCR. Por explicacin vista en clase, se usa la
polimerasa de la bacteria ya que al realizar todas las reacciones se genera mucho
calor. Al tener una polimerasa resistente al calor, no se desnaturaliza el ambiente y
sigue la reaccin sin problemas.
- Cebador18: la Taq polimerasa requiere de un cebador. Se agregan secuencias
que harn que se unan
cadenas opuestas al
molde de ADN solo en
los extremos de la
regin a copiar.

Procedimiento19:
- Desnaturalizacin
(96C): la reaccin se calienta para separar las cadenas de ADN. Proporciona moldes
para la Taq polimerasa y poder agregar el cebador.
- Templado (55-65C): la reaccin se enfra para que los cebadores se unan a
las secuencias.
- Extensin (72C): la temperatura de la reaccin se eleva para que el Taq
polimerasa extienda los cebadores y sintetice ADN.

- La reaccin se repite de 25 a 35 veces, por un periodo de 2 a 4 horas. Se

pueden producir miles de millones de copias a partir de unas cuantas reproducciones
de la regin blanco (regin a sintetizar).
PCR en tiempo real (RT - PCR).

Concepto20:
- Se ha desarrollado debido a la necesidad de cuantificar diferencias en la
expresin del ARN mensajero. La disponibilidad de cantidades pequeas de ARN
mensajero en algunos procedimientos.
- Permite cuantificar el cido nucleico 21. El PCR permite evaluar y registrar en
todo momento la cintica de la reaccin y sus productos. PCR - RT es una variante que
obtiene ADN complementario a partir del ARN. El ADNc es luego usado para observar
la cantidad de ARN mensajero presente.

PCR anidada.

Concepto21:
- Variante de PCR, el producto es una amplificacin es utilizado como molde
para realizar una segunda amplificacin con iniciadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada.

PCR in situ.

Concepto22:
- Una PCR que se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjeto, esto
debido a que el producto se puede visualizar el sitio de la amplificacin. Se usa para
detectar cantidades pequeas de material gentico.

PCR multiplex.

Concepto23:
- PCR que amplifica ms de una secuencia de una misma reaccin. Consiste en
combinar en una reaccin todos los pares de iniciadores de sistemas que queremos
amplificar y correrlos a la vez.
Aplicaciones de PCR.

Concepto24:
- PCR ha sido aplicado en la prctica para la deteccin de enfermedades
infecciosas. Se obtiene una muestra y se reproduce con el objetivo de encontrar un gen
especfico o material gentico de una patologa, as determinando una infeccin.
Ejemplo: se usa para el diagnstico de VIH y VPH, ejemplos vistos en clase.
- Clonar un gen.
- Huella digital.
- Pruebas de paternidad.
- Deteccin de enfermedades dermatolgicas como lo es lepra, oncocercosis y
leishmaniasis.
Northern & Southern

Souther Blot (deteccin de secuencias especficas de ADN).

Concepto25:
- La transferencia de fragmentos producto de electroforesis a una membrana de
soporte, resultando en la inmovilizacin de esos fragmentos de ADN. Una vez obtenido
la falta de movilidad, se puede hacer un anlisis de hibridacin a la muestra.
- Las membranas que proveen de la inmovilidad es nylon o nitrocelulosa, al igual
que se usa radiaciones UV.
- La funcin principal de un Souther blot es encontrar una secuencia de ADN
especfica dentro de una mezcla compleja.
- Tcnica inventada por Edwin Southern, cientfico y bilogo ingls.

Procedimiento26, 27:
- Electroforesis del ADN: primero se tiene que digerir el ADN con una enzima con
una enzima de restriccin para ser seguido con electroforesis de la muestra. Las
molculas separadas se desnaturalizan y aqu se transfieren a las membranas
mencionadas. La transferencia es el mtodo de Southern.
 - Existe una hibridacin con una sonda especfica, para despus remover las
partes de la molcula que no han adherido. Una vez que se tiene la muestra hibridada,
se coloca al lado de rayos X para poder aislarlas con la luz. Lo resultante es conocido
como autorradiografa.

Northern Blot (deteccin de secuencias especficas de ARN).

Concepto28:
- A continuacin se provee una tabla de los tipos de tcnicas de blotting el cual
compara las preparaciones y resultados que se obtienen.
- Se observa como para una muestra de Northern blot no se requiere de una
preparacin de la muestra, ni se requiere de un tratamiento especfico del gel (como en
el Southern al tratar con ADN se tiene que desnaturalizar en la electroforesis).
- La funcin del Northern blot es la deteccin del tamao y cantidad de
fragmento de ARN al igual que su nmero de transcripciones.
Concepto29:
Vectores plsmidos.

Concepto30:
- Los plsmidos son molculas circulares de ADN que se replican de manera
independiente al cromosoma de la clula hospedadora. Se usa como vector para la
clonacin debido a que tiene un sitio de clonacin mltiple para insertar ADN antgeno.

Proceso31:

- Generacin de ADN recombinado: se digiere un vector plsmido (contiene y

alberga pedazos ms grandes de secuencias). Se introduce dentro del plsmido de la
bacteria, usualmente EcoRI para reproducir
los fragmentos del vector.
- Transformacin: incorporacin del
plsmido recombinado a las bacterias.
 - Se identifican las clulas con genes
resistentes a ampicilina, lo que hace a la clula
resistente.

- Para la identificacin de los clones, el sustrato X-gal se

convierte en un producto azul si el gen est intacto y blanco si el
gen muestra aspectos recombinantes.

Secuenciacin de cidos nucleicos y microarreglos.

Concepto32:
- Conjunto ordenado de genes dentro de una superficie pequea (usualmente
10,000 muestras por cm2). Son una herramienta biolgica y su principal aplicacin es
para la informacin obtenida de la secuenciacin de los genomas completos.
- Existen dos tipos principales de microarreglos, los de contacto (que son
impresos depositando las muestras haciendo contacto con la superficie) y los
piezoelctricos (se usa un aplicador ultrasnico para depositar la muestra). Las
muestras son depositadas en membranas de nylon, laminillas de vidrio, o nitrocelulosa.
Las muestras depositadas son controladas por un robot que se mueve en eje X, Y y Z.

- Las superficies contienen recubrimientos como poli-sina, aminas y aldehdos que

permiten la unin qumica con las muestras de ADN.

Procedimiento33:
- Se extrae el ARN de la muestra

con la finalidad de poder generar ADNc por medio de mtodos previamente explicados.
Existen distribuidores que vender las muestras de ADN listas para ser impresas en el
microarreglo.

- Pasa a la hibridacin, una vez impreso el microarreglo por medio del brazo
robtico, se tiene que hibridar. Se trata la laminilla con vapor de agua para poder
obtener mejor homogeneidad dentro de la muestra, se agrega el agente de
hibridizacin y se deja por 1 hora. Finalmente, se lava para poder eliminar ADN no
adherido y se cuantifica. Para la cuantificacin se somete a fluorescencia y se cuenta
por medio de lseres confocales que cuentan la cantidad de luminiscencia en la
prueba.

Secuenciacin del cido nucleico.

Concepto34:

- Proceso que determina la secuencia de bases de los nucletidos (As, Ts, Cs y

Gs) de un fragmento de ADN.

Secuenciacin por mtodo de Sanger.

Procedimiento35:
- Primero se calienta la mezcla para desnaturalizar el molde de ADN (separar las
cadenas) y luego se enfra para que el cebador pueda unirse al molde de cadena
sencilla. Una vez que se ha unido el cebador, se eleva la temperatura para que la ADN
polimerasa pueda sintetizar ADN nuevo a partir del cebador.
- La ADN polimerasa aadir nucletidos a la cadena hasta que aleatoriamente
agregue un nucletido didesoxi en lugar de uno normal. A partir de ese momento, no es
posible agregar ms nucletidos y la cadena termina con el nucletido didesoxi.

Chromosome walking.
Procedimiento36:
- Consiste en fragmentar un segmento de ADN grande en pedazos pequeos,
obtener blancos para la insercin de un vector de clonacin y finalmente observar
segmentos traslapados; se repite el ciclo hasta obtener la molcula original de ADN.

Shotgun sequencing.

Procedimiento37:
- Consiste en la secuenciacin de
fragmentos grandes de ADN usando fragmentos
ms cortos obtenidos al azar. Se utiliza un
programa de cmputo para poder identificar
regiones donde se traslapan los segmentos y as
se va ensamblando el segmento original.

Bibliografas:
1. - Extraccin de cidos nucleicos:
1
http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/530/cap16.pdf

2
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/BIOMOLE.pdf

3
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/BIOMOLE.pdf

4
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/BIOMOLE.pdf

2. Enzimas que modifican cidos nucleicos:

5
http://enzyme.expasy.org/

6,7:
http://dspace.ucacue.edu.ec/bitstream/reducacue/5374/4/Tcnicas%20bsicas
%20de%20la%20biologa%20molecular.pdf

3. - Tcnicas bsicas en gel.

8 : https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis

9, 10, 11
: Jorge Eduardo, Zavala Castro. Manual de tcnicas bsicas de biologa
molecular. Universidad Autnoma de Yucatn, 2005.

4. - Electroforesis.

8, 12, 15:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/BIOMOLE.pdf

13, 14:
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis

15:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdf

5. - PCR:

17, 18, 19:

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

20:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf
 21:
http://www.bdigital.unal.edu.co/46636/1/05599317.2014.pdf

22, 23, 24
: http://piel-l.org/libreria/item/1074

6.- Southern blot & Northern blot:

25:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432697

26, 27:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/23IngenGenet1_23749.pdf

28:
http://www.fmed.uba.ar/depto/bioqhum/Seminario%2017%20Biologia
%20Molecular.pdf

29:
http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/gallery/8930

7. - Vectores plsmidos.

30, 31:

http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/Recombinant_DNA_Techn
ology/05t.html

8. - Secuenciacin de cidos nucleicos y microarreglos.

32, 33
:

http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/MensajeBioquimico/Mensaje_Bioq03v27p097_Jorge
_Ramirez.pdf

34, 35:
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/dna-sequencing

36,37:

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf