PARCIAL DE BIOQUMICA
OSCAR JAVIER MONTIEL CULMAN
UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA.
1. La absorbancia indica la desaparicin del NADH sustrato. En este
caso la estequimetra de la reaccin implica que por cada evento
de reaccin, una molcula de NADH desaparece y, por tanto, lo
que necesitamos hacer para calcular la velocidad es determinar el
Cambio de absorbencia del NADH por unidad de tiempo, para
luego convertirlo a cambio de concentracin de NADH mediante la
ley de Lambert-Beer.
A= cl c = A/(e l)
de donde se sigue que
A = c l c/t = (A/t)/( l)
Al graficar la absorbencia contra el tiempo transcurrido, la pendiente de la curva
descrita por la grfica ser (y2-y1)/(x2-x1) = A/t. La que en este caso ser
numricamente negativa (por tratarse de la desaparicin de un producto). Sin
embargo, podremos notar en la figura inmediata inferior, que la relacin no describe
una recta perfecta, por lo que es necesario considerar tan slo el periodo inicial, en
el que las concentraciones de sustratos y productos no han cambiado
apreciablemente y, por tanto, los punto se aproximan razonablemente a una recta.
con una pendiente inicial de -0.3297 Uabs/min y una longitud para el paso de luz
de la celda del espectrofotmetro de 1 cm (l) se obtiene una velocidad de
desaparicin de NADH de 5.310-5 M min-1, lo que en 3 mL del volumen de cubeta
representa (5.310-5 mol L-1 min-1) (310-3 L) = (1.5910-7 mol min-1).
Las unidades internacionales (UI) de actividad enzimtica son moles de producto
formado o reactante consumido por minuto, de modo que si 1 mol equivale a 106
mol, la velocidad ser (v = 1.5910-1 mol min-1) 0.159 UI.
Finalmente, la actividad especfica es l actividad enzimtica dividida por la
concentracin de protena, es decir a.e. = 0.159 UI/35 ng, pero debido a que la
concentracin de protena suele expresarse en mg: a.e. = 0.159 UI / 3510-6 mg =
4543 UI/mg de protena.
2. En este problema se nos pide determinar grficamente la relacin entre la velocidad
de la reaccin catalizada, vs. la cantidad de solucin de protena aadida al ensayo y
luego se nos pide calcular el cociente de la velocidad ( actividad de la enzima) y la
cantidad de solucin deprotena aadida al ensayo. Los resultados de tal
representacin se muentran en la siguiente figura.
En el panel inferior, apreciamos que la velocidad aumenta linealmente con la
concentracin de protena, esto es lo que cabra esperar, debido a que, si tomamos
como referencia la ecuacin de Michaelis-Menten, notaremos que la velocidad es
proporcional a la Velocidad mxima y a su vez la Vmax es proporcional a la
concentracin total de enzima aadida, i.e.:
Dado que en cada una de las dos series de determinaciones la concentracin de
sustrato se mantuvo constante, el factor kCAT S / (KM + S) se mantiene constante y,
por tanto, podemos decir que mientras se emple la misma concentracin de
sustrato en todas las medidas, v = constante ET. Consecuentemente, cuando se
grafica el cociente v/[E] el resultado es una constante (vease panel superior de la
figura anterior), mientras la concentracin de sustrato no sea modificada.
Lo anterior significa que la velocidad de una reaccin enzimtica es proporcional a
la concentracin de enzima, lo que constituye la base terica de las mediciones de
actividad enzimtica como una estimacin de la cantidad de esta enzima presente en
un fludo biolgico. Este principio tiene, por ejemplo, mucha importancia en la
prctica clnica, ya que nos permite determinar alteraciones en los niveles de
diversas enzimas, que pueden relacionarse a diversos estados patolgicos. Tambin
es importante en aplicaciones en la industria de alimentos, ya que permite evaluar la
cantidad de ciertas enzimas presentes en los alimentos, cuya actividad puede ser
indeseable, o bien, puede ser aadida ex professo para modificar las propiedades de
los preparados alimenticios. Todo ello, mediante un ensayo enzimtico,
generalmente sencillo, que tan slo requiere como condicin que la concentracin
de sustrato empleada, as como otras condiciones (pH, temperatura, etc.), sean
estandarizadas adecuadamente.
3. En este problema se nos d el valor de la velocidad como funcin de la cantidad de
sustrato aadido a tres diferentes niveles de concentracin de enzima. El valor de
Vmax y Km puede calcularse a partir de estos datos de diversas maneras. La manera
directa, aunque no muy precisa, consiste en graficar los datos y estimar el valor de
Vmax a partir del valor al que tiende la velocidad cuando la concentracin de
sustrato es muy elevada. Como en realidad este valor es el lmite superir de la curva,
pero esta se aproxima indefinidamente a l sin llegar a tocarlo, estimar este techo
resulta un poco impresiso. Con el valor obtenido, es posible calcular el valor de la
Km, ya que este representa la concentracin de sustrato a la que 50% de los sitios
activos de la enzima estn ocupados con sustrato y 50% estn vacos. En estas
condiciones, la velocidad observada deber ser igual a la Vmax/2. (vase panel A de
la figura que sigue a este prrafo). Como se describi en el problema anterior,
aumentar la concentracin de enzima resulta en un incremento en la Vmax, ya que v
= VMAXET. Por tanto, las tres curva son semejantes en su forma, pero a mayor
cantidad de enzima tenemos curvas ms elevadas. Como es de esperar, cuando
dividimos la velocidad por la concentracin de protena empleada, la tres curvas se
superponen (ver panel B de la figura), dado que aqu la velocidad ya slo depender
de la concentracin de sustrato. Esta es una manera comn de representar las curvas
de saturacin por su sustrato de las reaccines enzimticas, ya que no su forma es la
misma sin importar cuanta enzima se emple en el experimento.
Los pneles de la derecha en la figura anterior (C,D) son representaciones de
Linewaver-Burk, en esta representacin se grafica 1/velocidad vs. 1/[sustrato], por
lo que tambin se le conoce como la grfica de dobles recprocos. Los valores de
1/v frente a la 1/S describen una lnea recta, cuya pendiente es numricamente igual
a KM/VMAX y que intesecta al eje "Y" en un valor numrico igual a 1/VMAX y si la
recta se prolonga a travs del cuarto cuadrante intersecta al eje "X" en un valor
numrico igual a -1/KM. En la figura, el panel derecho inferior (C) muestra que la
KM es independiente de la concentracin de enzima aadida. Esto puede deducirse
del hecho de que la concentracin de enzima es casi siempre mucho menor que la
de l sustrato (vease problema 1), por lo que la cantidad de sustrato requerida para
ocupar el 50% de los sitios activos slo depende de la afinidad relativa entre la
enzima y el sustrato, propiedad que no cambia con la concentracin total de enzima.
Esto mismo puede deducirse de la ecuacin de Michaelis-Menten, ya que en ella, la
concentracin de ET y la de sustrato no son interdependientes. El panel superior
dereho (D) reitera que al dividir la velocidad por la concentracin de enzima
empleada las tres lneas se superponen.
Si ahora graficamos velocidad mxima obtenida contra la cantidad de enzima
aadida en mol, asumiendo que cada molcula de enzima posee un slo sitio
activo, la pendiente de la grfica ser:
Este valor nos dice que una molcula de enzima es capz de convertir 33300
molculas de sustrato a poducto por segundo y es equivalente a la actividad
especfica de una enzima pura (VMAX/[Protena]), excepto por la unidades
empleadas. Dado que para determinar este ltimo nmero no necesitamos una
estimacin exacta del peso molecular de la enzima, no del nmero de sitios activos
por molcula de protena, este valor es el ms frecuentemente reportado en diversas
tablas de parmentros cinticos y propiedades de enzimas. Sin embargo, cuando la
preparacin no es pura el denominador de este conciente ser mayor, debido a la
contribucin de los contaminantes a la cantidad total de protena, en consecuencia,
la actividad especfica disminuir. De este modo, la actividad especfica es un buen
indicador del grado de pureza de una preparacin enzimtica.
4. En este problema se nos pide determinar la actividad como fraccin de la VMAX para
la enzima invertasa, la manera ms simple de proceder es reordenar la ecuacin de
Michalis y Menten como sigue:
Lo que nos indica que se alcanza el 33% de la VMAX, como VMAX = kCAT ET , se tiene vel =
175 min-1 2.5 10-6 mol 0.33 = una actividad de 0.00146 mol min-1. Ahora, segn lo
abtenido arriba, para obtener un 95 % de la VMAX bastar con que S/(KM + S) = 0.95, de
donde al despejar S tendremos S= KM 0.95/(1-0.95) = 19 KM. Lo que significa que habr
que aadir 19 x 0.5 mM = 9.5 mM de sacarosa para que la actividad alcance este valor.
Este problema sugiere que la cantidad de sustrato es uno de los factores importantes a
considerar cuando se desea emplear una enzima para aplicaciones inductriales. En otras
palabras, si el producto a tratar, que en este caso podra ser un almibar hecho a base de
sacarosa, posee un cancentracin de sustrato muy baja, o sea que nuestro jarabe est muy
diludo, deberemos aadr mucha ms enzima, puesto que sta estara trabajando muy por
debajo de su capacidad mxima. Por otro lado, una alternativa para ahorrar enzima, sera
tratar el jarabe concentrado y luego aadir el agua y los otros componentes de su almibar,
para tener el producto final.
