PROTEIN ANALYSIS

Protein

• Complex Nutrition compound that containsof

Nitrogen molecule, composed from amino
acids with peptide bond.
• Protein has amina group (NH2) ->
distinguished from Carbohydrate and Lipid
• Synthesize in plant and animal tissue
Protein
Protein
Protein Function

1. Essential for growth and tissuecare

2. Essential compound precursor (enzyme,
hormone, hemoglobin, neurotransmitter
3. Control body liquid balance (intracellular
liquid, extracellular liquid andintravascular
liquid)
Protein Function

4. Maintain accumulation of acid/base

5. Stimulate antibody production
6. Nutrient transporter (carrier protein)
7. Energy source (4kkal/gr)
Protein Classification

Source :
1.Endogen protein : body tissue
2.Eksogen protein : diet
Synthesize :
3. Essential protein
4. Non essential protein
Protein Classification

• Essential :
Leu, Ile, Val, Trp, Phe, Thr, Lis, His, Met
• Conditional Essential :
Pro, Ser, Arg, Cys, Gly, Tyr
• Non Essential :
Ala, Gln, Glu, Asp, Asn
Protein Classification

Amino Acid Precursor

• Met, Ser : Cys
• Phe : Tyr
• Glu, Gln, Asp : Arg
• Glu : Pro
• Ser : Gly
Protein Classification

Amino Acid Function :

• Incomplete protein
ex. Zein (jagung)
• Complete protein
ex. Glisin (soy), glutenin (wheat), animal prot
• Partially complete protein
ex. Gliadin (wheat), legumin (beans)
Protein Classification

Protein Form:
• Fibrous : higher mechanical stress, low
solubility
ex. Collagen, elastin, keratin, miosin
• Globular : more soluble, easy
denatured
ex. Albumin, globulin, histon, protamin
• Conjugated protein (bounded to
prosthetic groups)
ex. Lipoprotein, phosphoprotein,
nucleoprotein
Protein Structure
Protein Denaturation

Denaturation
• is a process in which proteins lose the tertiary
structure and secondary structure then present
in their nativestate,
• by application of some external stress or
compound such as a strong acid or base, a
concentrated inorganic salt, an organic solvent
(e.g., alcohol or chloroform), or heat
• Increase the protein digestibility
Nutrition Value of Protein

Based on :
• Essential amino acid
• Amino acid balance
• Fitness to purpose
• Digestibility
• Protein content
 Protein Digestibility

Influenced by :
• Processing technique
• Anti-nutrition compound
• Reaction between protein and
another compound
 Nilai Gizi Protein

1. Amino acid
• Essential Amino Acid
• Amino acid balance
• Limiting Amino Acid
Nuts : metionin, Cerealia : lisin
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein
1. Teoritis
nilai biologis suatu protein dibatasi oleh proporsi
relative asam amino esensial yang terkandung di
dalamnya
• Skor AsamAmino
membandingkan kandungan AA antara bahan uji
dengan protein patokan (AA yg paling defisien)
• PDCAAS(Protein Digestibility Corrected Amino Acid
Score )
Peringkat kualitas protein ditentukan dengan cara
membandingkan profil asam amino protein dari
makanan tertentu terhadap standar profil asam amino
 • Skor Asam Amino
= mg AA per gram protein uji x 100
mg AA yang sama per gram protein patokan

•PDCAAS= Skor AAE terendah x DCprot sejati

Protein PER Digestibility AAS PDCAAS

Egg 3.8 98 121 118

Cow’s milk 3.1 95 127 121
Beef 2.9 98 94 92
Soy 2.1 95 96 91
Wheat 1.5 91 47 42
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein
2. In Vitro
Uji invitro : murah,singkat
• Penentuan aktivitas antitripsin dan antikimotripsin
(Berdasarkan penurunan aktivitas hidrolisis tripsin
pada suatu substrat)
• Penentuan aktivitas hemaglutinin
(aktivitas hemaglutinin ekstrak kacang-kacangan
didasarkan pada kemampuannya untuk mengaglutinasi
sel darah merah)
• Penentuan daya cerna protein
(pepsin-tripsin, pepsin-pankreatin dan teknik
multienzim : tripsin, kimotripsindan peptidase)
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein

3. In Vivo
Uji invivo : hewan coba & manusia
(biologis)
• Protein Efficiency Ration (PER)
• Net Protein Ratio (NPR)
• Biological Value (BV)
• Net Protein Utilization (NPU)
• Daya Cerna Sejati (DC Sejati) / True
digestibility
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein
PER
• Metode ini dikembangkan oleh Osborne,
Mendel dan Ferry tahun 1919, merupakan
evaluasi nilai gizi protein yang banyak
digunakan.
• Telah ditetapkan sebagai metode resmi FDA
untuk penetapan mutu protein dalam
nutrition labelling.
• PERdilakukan selama 28 hari pada hewan
coba tikus, menggunakan jenis pakan
standart (AIN/ANRC).
Evaluasi Nilai Gizi
Protein
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein

PER
• PERsampel = perub BB / jumlah protein konsumsi
• PER kasein terkoreksi = 2.5 / PERkasein teranalisis
• PERterkoreksi = PERsampel / PERkaseinterkoreksi
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein
NPR
• NPRdikembangkan untuk memecahkan masalah teoritis
pada PER,dimana dalam penetapan PERsemua protein
yang dikonsumsi diasumsikan digunakan semua untuk
pertumbuhan, tidak mengantisipasi fungsi protein
pemeliharaan.
• Pelaksanaan NPRsama dengan PER,hanya terdapat
grup tikus yang diberi ransum non protein dan lama
waktu NPRhanya 10hari
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein

BV, DCdanNPU
• Metode ini dikembangkan untuk
mengevaluasi protein secara
biologis dengan menggunakan
subjek manusia, namun pada
perkembangan selanjutnya
metode BV ini diadopsi untuk
dilakukan pada hewan coba tikus
Evaluasi Nilai Gizi
Protein
 Evaluasi Nilai Gizi
Protein

NPU
perbandingan antara jumlah nitrogen
yang diretensi dalam tubuh dengan
jumlah nitrogen yang dikonsumsi.

NPU = N konsumsi – (N feses - N metabolik)-(N urine – N endogen) x 100

N yang dikonsumsi
 Analisis Protein

Prinsip:
• Pengukuran jumlah atau kadar N dalam bahan
pangan
• Reaksi spesifik suatu senyawa/reagen dengan
ikatan peptida
Metode:
• Kualitatif : Biuret, Ninhidirin
• Kuantitatif : Kjeldahl, Biuret, TitrasiFormol
 Metode Kjeldahl

• Analisis protein kuantitatif protein tak

langsung
• Penentuan protein kasar (crude protein)
• Pengukuran kadar N dalam bahan pangan
• Tahapan : destruksi, destilasi, titrasi
• Kadar Protein = Kadar N x faktor konversi
• Faktor konversi : 100/16 = 6.25 (umum)
Metode Kjeldahl
 Metode Kjeldahl

Kelemahan
• Senyawa lain selain protein yangmengandung
N terukur sebagai protein
• Misal senyawa bernitrogen: asam amino
bebas, urea, amonia, asam nukleat, nitrit,
nitrat, amida, purin, pirimidin
 Metode Kjeldahl

1. Tahap Destruksi
• Tujuan : melepaskan nitrogen dari protein
• Sampel dipanaskan dalam larutan asam sulfat
pekat
• Unsur Cdan H teroksidasi menjadi H2O, CO2, CO
• Unsur N berubah menjadi amonium sulfat
(NH4)2SO4
• Asam sulfat juga mendestruksi KHdanlemak
 Metode Kjeldahl

1. Tahap Destruksi
• Diperlukan katalisator untuk mempercepat
proses destruksi
• Tujuan : Mempertinggi titik didihasam sulfat,
Suhu destruksi lebih tinggi (370-410 C)
Jenis:
• Campuran Na2SO4 dan HgO (20:1)
• K2SO4
• CuSO4
 Metode Kjeldahl

2. Tahap Destilasi
• Dilakukan dengan menambahkan NaOH
• Pada tahap ini amonium sulfat dipecah
menjadi amonia
• Amonia yang dibebaskan ditampung dalam
larutan asam standar biasanya HCl atau asam
borat 4% yang jumlahnyaberlebihan
 Metode Kjeldahl

3. Tahap titrasi
• Jika larutan asam penampung yang digunakan HCl, sisa
asam klorida yang tidak bereaksi dengan amonia
(membentuk NH4Cl) dititrasi dengan NaOH
• Jika digunakan indikator PPakhir titrasi adalah
perubahan larutan menjadi merah mudapermanen
(dari asam ke basa)
• atau jika digunakan indikator MR larutan berubah
menjadi kuning
• Buat titrasi untuk blanko (tanpasampel)
 Metode Kjeldahl

3. Tahap titrasi
• Jika larutan asam penampung yang digunakan HCl, sisa
asam klorida yang tidak bereaksi dengan amonia
(membentuk NH4Cl) dititrasi dengan NaOH
• Jika digunakan indikator PPakhir titrasi adalah
perubahan larutan menjadi merah mudapermanen
(dari asam ke basa)
• atau jika digunakan indikator MR larutan berubah
menjadi kuning
• Buat titrasi untuk blanko (tanpasampel)
 Metode Kjeldahl

3. Tahap titrasi
• Jika larutan penampung adalah asam borat/HBO3
(asam lemah), banyaknya asam borat yang bereaksi
dengan amonia dapat diketahui dengan titrasi dengan
HCl 0.1N dengan indikator MR+BCG
• HCl akan mentitrasi amonium-borat menjadi
amonium klorida sehingga pada akhir titrasi terjadi
kelebihan HCl/asam kuat
• Akhir titrasi ditandai dengan perubahan larutandari
biru/hijau menjadi merah muda
Metode Kjeldahl
 Metode Kjeldahl

Perhitungan
• %N= ml NaOH (blanko-sampel) XN NaOH X14.008 X100%
berat sampel (g) X1000
• Kadar protein : %N x faktor konversi
Metode Kjeldahl
 Metode Biuret

• Pengukuran jumlah ikatan peptida dalam protein

• Semakin tinggi kadar protein bahan, jumlah ikatan
peptida semakin banyak
Prinsip analisis:
• bahan yang mengandung ikatan peptida dua atau
lebih membentuk kompleks berwarna ungu dengan
ion Cu2+/kupri pada kondisi alkali
 Metode Biuret

Keunggulan
•Pengukuran kadar protein (direct method)
•Mendeteksi ikatan peptida protein (spesifik)
•Tidak mendeteksi nitrogen dr senyawa non peptida
•Sederhana, cepat, murah
Tahapan analisis:
• Pembuatan kurva standart, preparasi,
penetapan sampel dg spektrofotometer,
perhitungan
 Metode Biuret

Keunggulan
• Pengukuran kadar protein (direct method)
• Mendeteksi ikatan peptida protein (spesifik)
• Tidak mendeteksi nitrogen dr senyawa non peptida
• Sederhana, cepat, murah
 Metode Biuret

Pembuatan kurva standar

• Buat larutan standar BSAatau kasein dalam air dengan konsentrasi 0.5
mg/ml.
• Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8.dan
1.0 ml larutan protein standar. Tambahkan air sampai volumetotal
masing2 sebanyak 4 ml.
• Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing2 tabung reaksi. Campur
rata.
• Simpan tabung pada suhu 37°C selama 10 menit atau pada suhu kamar
selama 30 menit sampai terbentuk warna ungu yangsempurna.
• •Ukur absorbansi pada panjang gelombang 520nm.
 Metode Biuret

Preparasi sampel
• Timbang sampel padat. Hancurkan sampel padat dengan
menggunakan waring blender. Hancuran yang diperoleh disaring
lalu disentrifugasi.
• Supernatandidekantasi untuk dipergunakan selanjutnya (protein
yang terdapat dalam supernatan adalah soluble protein).
• Sampel cair yang berupa protein konsentrat, isolat yang tidak
keruh, maka persiapan sampel cukup dengan pengenceran saja.
Jika cairannya keruh atau mengandung bahan-bahan yang
menganggu seperti glukosa maka harus dilakukan perlakuan
sebagai berikut:
 Metode Biuret

• Timbang ekstrak. Ekstrak dimasukkan ke dalam

tabung reaksi seperti pada waktu penetapan
standar, kemudian tambahkan air sampai volume
total masing-masing 1 ml.
• Tambahkan 1 ml TCA(Tri Chloroacetic Acid) 10%
pada masingmasing tabung reaksi sehingga protein
akan terdenaturasi.
• Sentrifusa pada 3000 rpm selama 10 menit sampai
protein yang terdenaturasi mengendap, supernatan
dibuang dengan cara dekantasi.
 Metode Biuret

• Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur

merata lalu sentrifusa kembali untuk menghilangkan
residu TCA.Biarkan mengering pada suhukamar.
• Ke dalam endapan kering ditambahkan air 4 ml,
campur merata.
• Tambahkan 6 ml pereaksi biuret, alkali dalam
pereaksi ini akan melarutkan endapan yang tersisa
• 0.1-1.0 ml sampel (dipipet tepat) dimasukkan ke
dalam tabung reaksi, kemudian diperlakukan seperti
penetapan standar