GABRIEL ALVES BOLINA LIMITAÇÕES DOS TESTES COM LISADO DE AMEBÓCITO DE Limulus NA IDENTIFICAÇÃO DE PIROGÊNIO Cidade An Cidade Ano Belo Horizonte 2022 GABRIEL ALVES BOLINA LIMITAÇÕES DOS TESTES COM LISADO DE AMEBÓCITO DE Limulus NA IDENTIFICAÇÃO DE PIROGÊNIO Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade Pitágoras de Belo Horizonte - Unidade Guajajaras, como requisito parcial para a obtenção do título de graduado em Ciências Biológicas - Bacharelado. Orientador: Francisco Paulo Caires Junior GABRIEL ALVES BOLINA Belo Horizonte 2022 LIMITAÇÕES DOS TESTES COM LISADO DE AMEBÓCITO DE Limulus NA IDENTIFICAÇÃO DE PIROGÊNIO Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade Pitágoras de Belo Horizonte Unidade Guajajaras, como requisito parcial para a obtenção do título de graduado em Ciências Biológicas. BANCA EXAMINADORA Prof(a). Titulação Nome do Professor(a) Prof(a). Titulação Nome do Professor(a) Prof(a). Titulação Nome do Professor(a) Belo Horizonte, 06/12/ de 2022 BOLINA, Gabriel Alves. Limitações dos Testes com Lisado de Amebócito de Limulus na Identificação de Pirogênio.. 2022. 55 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Ciências Biológicas) – Faculdade Pitágoras de Belo Horizonte – Unidade Guajajaras, Belo Horizonte, 2022. RESUMO Atualmente, a certificação da ausência de contaminação em produtos farmacêuticos e equipamentos de uso parenteral é de extrema importância para a garantia dos padrões de qualidade e de saúde pública, principalmente para a farmacologia e a área hospitalar, uma vez que aparelhos e medicamentos contaminados podem não só causar febre mas também como agravar o quadro clínico do paciente, possibilitando o surgimento de quadros como o de septicemia e até mesmo óbito. Para tanto, a averiguação da contaminação de tais materiais é realizada por meio do teste de pirogenicidade em coelhos (preconizado pela farmacopeia estadunidense) como padrão para servir como identificação. Contudo, nos últimos anos as tentativas de uso de métodos alternativos, incentivada pela premissa dos 3 R’s tem intensificado a procura por métodos in vitro, como os métodos que usam o Lisado de Amebócito de Limulus (LAL) e outros. O presente estudo tem como finalidade abordar, por meio de uma revisão bibliográfica, a eficácia dos métodos alternativos, principalmente os que utilizam LAL em comparação com o método Padrão de pirogenicidade em coelhos (RPT) já preconizado. Foram utilizadas as plataformas de busca Google Scholar, SciElo e ProQuest, obtendo-se 39 resultados abordando metodologias de identificação de pirogênios. Concluiu-se que o teste in vivo possui maior amplitude de aplicação, embora tenha o fator manuseio animal como limitante; o LAL é essencialmente específico, porém eficaz e que o MAT é o principal candidado dos métodos alternativos, tendo a maior amplitude de aplicação que o LAL, porém ainda é preciso ser validado em comparação ao método in vitro com LAL e precisa-se desenvolver uma maior variedade de monócitos reagentes para nivelar sua equivalência ao método in vivo. Constatou-se que o teste de RPT embora seja polêmico pelo manuseio de animais e extrapolação interespécies, ainda é essencial para a certificação dos padrões de qualidade, embora os testes alternativos mais utilizados com LAL e MAT sejam bastante promissores e muitas vezes mais econômicos e viáveis ou mais replicáveis. Palavras-chave: Pirogênios. Endotoxinas. LAL. Lisado de Amebócito de Limulus. Sensibilidade. BOLINA, Gabriel Alves. Limitations of Limulus Amebocyte Lysate tests in Pyrogen Identification. 2022. 55 f.Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Ciências Biológicas) – Faculdade Pitágoras de Belo Horizonte – Unidade Guajajaras, Belo Horizonte, 2022. ABSTRACT Currently, certification of the absence of contamination in pharmaceutical products and equipment for parenteral use is extremely important to guarantee quality and public health standards, especially for pharmacology and the hospital area, since contaminated devices and medicines may not only cause fever but also how to worsen the patient's clinical condition, allowing the emergence of diseases such as septicemia and even death. Therefore, the investigation of contamination of such materials is performed through the pyrogenicity test in rabbits (recommended by the US Pharmacopoeia) as a standard to serve as identification. However, in recent years, attempts to use alternative methods, encouraged by the premise of the 3 R's, have intensified the search for in vitro methods, such as methods using Limulus Amebocyte Lysate (LAL) and others. The present study aims to address, through a literature review, the effectiveness of alternative methods, especially those using LAL compared to the standard method of pyrogenicity in rabbits (RPT) already recommended. Google Scholar, SciElo and ProQuest search platforms were used, yielding 39 results addressing pyrogen identification methodologies. It was concluded that the in vivo test has a greater range of applications, although it has the animal handling factor as a limiting factor; LAL is essentially specific, but effective and the MAT is the main candidate of the alternative methods, having a greater range of application than the LAL, but it still needs to be validated in comparison to the in vitro method with LAL and it is necessary to develop a greater variety of reactive monocytes to level their equivalence to the in vivo method. It was found that the RPT test, although controversial due to animal handling and interspecies extrapolation, is still essential for the certification of quality standards, although the most used alternative tests with LAL and MAT are quite promising and often more economical and viable. or more replicable. Keywords: Pyrogens. Endotoxins. LAL. Limulus Amoebocyte Lysate. Sensitivity. LISTA DE QUADROS Probabilidades de Possíveis Resultados do Ensaio de LAL e Influências________19 Avaliação dos reaultados dos ensaios de LAL_____________________________21 O conceito dos 3Rs__________________________________________________31 Considerçaões do ICCVAM para o método MAT___________________________46 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 3Rs - Replacement; Reduction; Refinement 055:B5 ou 055:B5)/Kg - Unidade padrão de Endotoxina β-glucanos - beta glucanos °C - graus céusios °F - gaus Fahrenheit K -Kelvin ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária BraCVAM - Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos BET - teste de Endotoxina Bacteriana CMC - Carboximetilcelulose CQ - Controle de Qualidade Da - daltons ECVAM - European Centre for Validation of Alternative Method - Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos ao Uso de Animais EP/FE - European Pharmacopeia - (Farmacopéia Europeia) E. coli - Escherichia coli EU/UE ou IU/UI- Unidade de endotoxina UEE - Unidade de Equivalência de Endotoxina UE/ml ou UI/ml - Unidade de Endotoxina por mililitro UE/Kg ou UI/ml- Unidade de Endotoxina por quilograma ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Ensaio de imunoadsorção enzimática FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz FDA - Food and Drug Administration - Administração de Alimentos e Medicamentos GM ou MG - Média Geométrica ICCVAM - Comitê Organizador Interagências para Validação de Métodos Alternativos INCQS -Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde IL-1β - Interleucina 1 beta IL-6 - Interleucina 6 IFN-α - Interferon alfa IFN-γ - Interferon gama IFN-g - Interferon beta INCQS - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Kg -quilograma kDa - quilodaltons K/M - Limite de Tolerância por Dose Máxima por Hora LPS - Lipopolissacarídeo LAL - Lisado de Amebócito de Limulus LER - Baixa Recuperação de Endotoxina - Low Endotoxin Recovery LPS - Lipopolissacarídeo MAT - Monocyte Activation Test - Teste de Ativação de Monócitos MG - Média Geométrica MM6 ou MM-6 - Linhagem Celular Monocítica Humana denominada MONOMAC-6 NEP - Non-Endotoxin Pyrogen - Pirogênio Não Endotoxina mL - mililitro ng - nanograma nm - nanômetro pg - picogramas PG - Peptideoglicano pH - Potencial Hidrogeniônico PAMAM - Carboxy-terminated Polyamidoamine - Poliamidoamina Terminada em Carbono PMLA - Prepharmaceutical and poly(malic acid) - Pré Farmacêutico e poli(ácido maleico) PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cell - Células mononucleares Isoladas de Sangue Periférico PG - Peptideoglicano pH - Potencial Hidrogeniônico pNA - p-nitroanilina QCL-Cinético - Método Cromogênico Cinético RENAMA - Rede Nacional de Métodos Alternativos rFC - fator C recombinante RPT - Rabbit Pirogen Test - teste de pirogenicidade em coelho SNVS - Sistema Nacional de Vigilância Sanitária SUS - Sistêma ùnico de Saúde SNVS - Sistema Nacional de Vigilância Sanitária SUS - Sistêma ùnico de Saúde TNF-α - Fator Cancerígeno Tumoral alfa/ Fator de Necrose Tumoral alfa UEE - Unidade de Equivalência de Endotoxina UE/ml ou UI/ml - Unidade de Endotoxina por mililitro UE/Kg ou UI/ml- Unidade de Endotoxina por quilograma USP - United States Pharmacopeia - Farmacopeia dos Estados Unidos VIT - Variação Individual de Temperatura SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO____________________________________________________10 2 RELEVÂNCIA SANITÁRIA DOS PIROGÊNIOS NOS PRODUTOS FARMACÊUTICOS__________________________________________________13 3 CAPÍTULO 2_____________________________________________________16 3.1 IDENTIFICAR AS VARIAÇÕES DO MÉTODO LABORATORIAL QUE UTILIZAM LAL COMO REAGENTE NA LITERATURA ABORDADA_____________________16 3.1.1 Máxima Diluição Válida e Sensibilidade _____________________________17 3.1.2 Validação do Teste______________________________________________17 3.2.1 Método de Gel Coágulo__________________________________________19 3.2.2 Método Cromogênico QCL - Quantitativo Cromogênico em Limulus_______21 3.2.3 Método Turbidimétrico__________________________________________22 3.2.4 Método Eletroquímico___________________________________________23 3.2.5 Método Nefelométrico___________________________________________24 3.2.6 Método Colorimétrico de Proteína de Lowry__________________________24 4 CAPÍTULO 3_____________________________________________________26 4.1 AVALIAR OS DIFERENTES MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE LAL ENCONTRADOS NA LITERATURA_____________________________________26 4.1.1 Teste de Pirogênio in vivo _______________________________________26 4.1.2 Teste de Ativação de Monócitos (MAT)_____________________________28 4.1.3 Ensaio Fator C recombinante_____________________________________29 5 ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE OS MÉTODOS ENCONTRADOS NA LITERATURA______________________________________________________30 5.1 O Conceito dos 3 Rs na Experimentação Animal _______________________30 5.2 Prós e Contras do Método in vivo ___________________________________32 5.3 Prós e Contras do Método in vitro com LAL____________________________35 5.4 Sensibilidades do Substrato e Interferências __________________________40 5.5 O uso do Limulus na Indústria e os problemas éticos da experimentação animal____________________________________________________________42 5.6 Prós e Contras do Método de Ativação de Monócitos - MAT_______________42 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS__________________________________________48 REFERÊNCIAS_____________________________________________________52 ANEXO A_________________________________________________________55 10 1. INTRODUÇÃO Segundo Fukumori (2008), há mais de 2000 anos que os estudos sobre a febre, seus causadores e mecanismos de ativação já vem sido contemplados. Como citado por Brum (2009), a febre era considerada por muitos como uma das principais doenças a serem combatidas, entretanto outros médicos gregos mais tarde acreditariam que esta não deveria ser tratada como uma patologia (NOGUEIRA, 2009; FINGOLA, 2018). Somente durante a decorrência do século XVIII, que estudos mais aprofundados das causas da febre foram realizados, surgindo a partir de associações de febre entre homens e animais quando materiais orgânicos em putrefação foram injetados de forma intravenosa. Em 1892, Richard Pfeiffer, após observar a natureza da bactéria Vibrio cholerae, voltou os olhares do estudo da febre para causas microbiológicas quando notou que a desintegração da parede celular desta por células mononucleares resultava ‘toxina’, a qual foi identificada como endotoxina. A endotoxina é um pirogênio termo-resistente, capaz de resistir aos principais métodos de esterilização do mercado, como calor úmido, e no organismo desencadeia reações que liberam citocinas de resposta imunolígica, como Interleucina 1β (IL1β), Interleucina 6 (IL-6), Interferon-α (IFN-α), Interferon-g (IFN-g) e Fator de Necrose Tumoral (TNF)”. (SILVEIRA, et al, 2004, MELANDRI, et al, 2010). Tais citosinas ativadas instigam reações como apoptose e colapso celular em altas doses. Um grave problema de saúde pública é a contaminação pirogênica, que leva muitos pacientes a quadros clínicos como sepse e até mesmo óbito, e por isso o controle da qualidade desses produtos é tão importante. A detecção de tais substâncias é imprescindível para o Controle de Qualidade e biosegurança industrial. Um teste altamente presente nos laboratórios das empresas que fabricam tais produtos ou terceiros para avaliarem a incidência de contaminação de nos materiais são ensaios com o reagente Lisado de Amebócito de Limulus (LAL). Fukumori (2008) explicita que o reagente LAL é um extrato aquoso da principal célula sanguínea da hemolinfa azul caranguejo ferradura Limulus polyphemus, o amebócito, composto de enzimas que reagem com a presença de pequenas quantidades de endotoxina. Embora o LAL seja um dos principais reagentes para a indústria farmacêutica atualmente, ganhando muita importância com o decorrer do tempo nesses últimos anos desde a descoberta de Jack Levin e Frederik B. Bang (1964) a respeito da hemolinfa sensível do limulus na década de 60, ainda levanta certas discussões quanto ao seu uso e aplicabilidade no cenário farmacológico atual. Apesar do reagente e 11 métodos subjacentes que utilizam o mesmo serem preconizadas pelas principais instituições sanitárias, os mesmos polarizam opiniões entre diversos estudiosos e cientistas do ramo, questionando a sua aplicabilidade no geral em comparação a outros métodos também desenvolvidos para a mesma finalidade, a identificação de endotoxinas em produtos farmacológicos. Assim sendo, foram abordados para análise comparativa entre as suas propriedades diferentes métodos de identificação de endotoxinas com LAL e métodos alternativos retratados pela literatura. Desde 1964 com os trabalhos de Levin e Bang até hoje, é natural que esforços para o refinamento do reagente LAL e o desenvolvimento de várias outras técnicas utilizando o mesmo tenham diversificado a implementação do método em várias opções, todas elas com o mesmo princípio e objetivo (divergindo apenas em execução). Entretanto, a divergência entre elas observada pela própria aplicação do método, materiais, recursos e tecnologia as tornam bastante distintas entre si por si só, com algumas exigindo bastante recursos e mão de obra qualificadamente adequada para operar equipamentos complicados e saberem analisar os resultados fornecidos pelas máquinas. Não muito longe disto, os outros métodos de identificação de endotoxinas também exigem determinado grau de conhecimento para aplicação e execução, protocolos que fazem diferença no orçamento, planejamento e gerenciamento de um projeto e desenvolvimento de pesquisa. Muitos materiais acadêmicos contendo informações valiosas para equipes laboratoriais sobre o modo operandis de várias técnicas estão disponíveis pelas diversas plataformas científicas na internet, e a cada ano mais e mais artigos reportando resultados em pesquisas que utilizaram dos mesmos vem sendo publicados. Levando em conta a dispersão desta data e com o crescente aumento da relevância do teste de pirogênio em materiais farmacêuticos no geral, torna-se prudente a comparação entre os protocolos, ensaios e aplicabilidades de cada método, providenciando uma melhor noção de aplicabilidade e gerenciamento de recursos para o desenvolvimento de projetos de pesquisa no mercado diante a constante crescente demanda por testes pirogênicos e presença na indústria atual. Dessa forma, quais são as vantagens e limitações do uso do LAL para a detecção de toxinas produzidas por bactérias sobre os outros métodos de identificação de pirogênios? O presente trabalho tem como objetivo principal compreender quais são as vantagens e as principais limitações dos testes com uso de LAL em relação a outros métodos de detecção de endotoxinas e, especificamente, 1) entender a preocupação e relevância sanitária dos pirogênios para a área da saúde; 2) identificar as variações do 12 método laboratorial que utilizam LAL como reagente na literatura abordada e, por fim, 3) avaliar os diferentes métodos alternativos ao LAL encontrados na literatura. A metodologia da pesquisa foi a Revisão de Literatura, buscando trabalhos publicados nos últimos 15 anos, sendo estes dissertações e teses, utilizando-se das plataformas de busca ProQuest, SciELO e Google Scholar, os critérios serão 1-pertinência ao tema do trabalho, 2-estar dentro da janela de tempo de publicações estabelecida, 3-artigos que citaram brevemente alguma limitação do LAL e/ou métodos alternativos com uso de LAL; 4-artigos que abordam brevemente a relevância dos pirogênios e a importância do LAL como questão de saúde; aceitando resultados em Inglês, Português e Espanhol. Os seguintes critérios de inclusão foram designados para as respectivas plataformas estão registrados no anexo A do documento. A monografia está estruturada em capítulos, cada um abordando um objetivo específico, aprofundando conhecimentos com enfoque no tópico abordado. Sendo o capítulo 1 contendo informações sobre quais são os efeitos das endotoxinas no organismo humano e reiterando, dessa forma, qual é a importância de se manter produtos livres de pirogênios como este. O capítulo 2 aborda o principal ensaio laboratorial cujo utiliza LAL coo reagente e também os vários outros métodos, desenvolvidos ao longo dos anos, que foram desenvolvidos para preencherem diferentes nichos da identificação de pirogênios na farmacologia e imunologia, como alta precisão, monitoramento em real-time e quantificação de endotoxinas por amostra. Por último, o Capítulo 3, apresenta uma avaliação dos diferentes métodos alternativos ao LAL encontrados na literatura, para que assim, na totalidade, plena noção das vantagens e as principais limitações dos testes com uso de LAL em relação a outros métodos de detecção de endotoxinas sejam alcançadas. 13 2. RELEVÂNCIA SANITÁRIA DOS PIROGÊNIOS NOS PRODUTOS FARMACÊUTICOS Conforme Lopes (p. 5, 2010), a presença dos LPS é indesejável para a indústria farmacêutica e para a área da saúde no geral. Tal molécula é capaz de, devido sua potente atividade biológica, causar diversos efeitos patofisiológicos em pacientes. “Em condições de exposição aos LPS, mesmo em concentrações muito baixas (<1,0 UE/mL), uma resposta inflamatória sistêmica pode ocorrer, levando a múltiplos efeitos fisiopatológicos, tais como choque endotóxico, lesão tecidual, e morte”. Como mencionado por Moreira (2019), a destruição de endotoxinas pelo sistema imune causa a liberação de inúmeras citosinas que instigam resposta febril e representam um risco ao organismo do hospedeiro. O fato de gram-negativas poderem colonizar água destilada, endotoxinas possuírem elevada potência tóxica e também serem altamente estáveis a condições de calor elevado tornam a presença destes contaminantes bastante comum em diversas etapas na fabricação de produtos hospitalares no geral e ainda mais significativo para produtos de via parenteral. Apenas uma quantidade mínima de endotoxinas já é o suficiente para causar resposta pirogênica no organismo humano (cerca de uma dose de 1-10 ng/kg) (MORALES, 2004). Os sintomas do hospedeiro podem ir além da hipertermia, citados por Lopes (2010, p. 10) como “calafrios, febre, fraqueza, dores generalizadas e, em alguns casos, choque (…), morte tecidual causada pela formação de pequenos coágulos”, dentre outros. Brum (2009) cita que uma das maiores preocupações na indústria biofarmacêutica atual de um modo geral é a questão da contaminação por endotoxinas (LPS), pois devido a seus efeitos biológicos in vivo e in vitro, sua detecção e remoção são essenciais para a administração parenteral segura dos produtos injetáveis. De acordo com Fukumori (2008, p. 16), “as endotoxinas são tóxicas à maioria dos mamíferos. Estudos têm demonstrado que a injeção de células de bactérias Gram-negativas vivas ou mortas, ou LPS purificados causa uma série de reações patofisiológicas”. Tais reações são um reflexo do combate do organismo frente a contaminação por antígenos, porém, Brum (2009) também salienta que devido as altas concentrações ou a maior sensibilidade, as ações dos sistemas de defesa tornam-se incontroláveis e, ao invés de contribuir para remediar o problema, muitas destas respostas acabam sendo deletérias ao paciente, podem ir desde a redução da contagem de células de defesa, hipotensão, coagulação intravascular disseminada até quadros mais severos, como septicemia, hemorragia cerebral por ruptura da barreira 14 sanguínea e potencialização de outros efeitos colaterais neurológicos adversos da vacinação com DTP célula inteira e até mesmo falecimento. O lipídeo A, anteriormente citado por ser a parte responsável pela atividade biológica de toxicidade e também responsável por desencadear a gelificação do Lisado de Amebócito de Limulus, desencadeia uma série de efeitos negativos no organismo, tais como: pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose, fenômeno de Shwartzman, necrose da medula óssea, reabsorção do osso embrionário, ativação do complemento, queda de pressão sanguínea, agregação plaquetária, ativação do fator de Hagemen, indução do fator plasminogênio, toxicidade aumentada pelo pré-tratamento com BCG, toxicidade aumentada pela adrenalectomia, reatividade dérmica aumentada à epinefrina, indução de síntese de lgG em camundongos neonatos, indução à produção de interferon, indução à produção de fator de tumor necrótico, indução à produção de quinase-piruvato em fígado de camundongo, hipotermia em camungondos, (…). (FUKUMORI, 2008, p. 17) Destaque para substâncias como interferon e fator de necrose tumoral (TNF-α), que são citocinas participantes do processo de apoptose. Além destes, outros sintomas, citados por Brum (2009), como a liberação de fatores antagonistas a glicocorticóide, fatores insulinalike, fatores coagulantes, coagulação de capilares, prostaglandinas, óxido nítrico (indutor de vasodilatação sistêmica e hipotensão no choque endotóxico), superóxidos e enzimas lisossômicas induzidos por macrófagos do Sistema Retículo Endotelial também são efeitos produzidos pela contaminação/ infecção por endotoxinas. A intoxicação por endotoxina, portanto, não só é notória por efeitos primários mas também pela desestabilização de várias outras funções gerais do organismo como efeitos secundários, como por exemplo citados por Silva: “dependendo da dose apresentada, ativar o sistema de coagulação, alterar o metabolismo de carboidratos, ativar o sistema complemento, causar agregação plaquetária, liberar aminas vaso-ativas, causar choque e morte” (SILVA, 2015, p. 34). Além destes efeitos, as consequências de uma infecção por tais substâncias também interagem de outras formas com o organismo, como por exemplo, pelas próprias substâncias que os monócitos naturalmente excretam em casos de resposta imune, como as interleucinas, são liberadas em quantidades não comuns e induzem uma cascata de outras respostas não programadas no organismo, como a por exemplo, os efeitos biológicos da IL-1 decorrente de uma infecção pirogênica; dentre eles: hipertermia, “a neutrofilia (ação na medula óssea), a proliferação de colágeno (estímulo de fibroblastos), 15 a liberação de aminoácidos dos músculos, a produção de IL-2 (ação nas células T)”, dentre outros (LOPES, 2010, p. 10) Entretanto, um ponto levantado por Fingola (2011) sugere que as contaminações por bactérias gram negativas não apresentam apenas aspectos pejorativos, deixando implícito que as quantidades mínimas de endotoxinas liberadas durante o ciclo de vida destas ao se multiplicarem podem ser importantes na estimulação da imunidade natural. Contudo, em comparação com a quantidade exacerbada que liberam ao serem fagocitadas e degradadas por células mononucleares e com isso inúmeros efeitos negativos, é presumível concluir, de acordo com o suficiente número de evidências encontradas na literatura abordada, que há mais efeitos negativos do que positivos relacionados à presença de endotoxinas em qualquer ambiente/superfície/organismo. Inúmeros esforços têm sido realizados para se produzir proteínas terapêuticas para protegerem o organismo de intoxicações por LPS, todavia, sem sucesso, principalmente devido a vasta variedade de conformações estruturais para o LPS e seus agregados (como citados anteriormente, devido a características como o caráter anfifílico dos LPS que o permite estruturar-se em macromoléculas de composições variadas). Dessa forma então podemos entender o porquê dos principais órgãos reguladores internacionais exigirem o controle de endotoxinas, seja pelo método de LAL ou outros, para a aprovação e comercialização de grande parte dos produtos farmacêuticos e biotecnológicos, principalmente os administrados por via parenteral, como citado por Morales (2004), uma vez percebendo que como os malefícios dos quais as endotoxinas podem proporcionar, a correta identificação destas como parâmetro do Controle de Qualidade é totalmente compreensível, e para tal, a utilização do LAL como substrato e suas metodologias demonstram-se imprescindíveis. 16 3 CAPÍTULO 2 3.1 IDENTIFICAR AS VARIAÇÕES DO MÉTODO LABORATORIAL QUE UTILIZAM LAL COMO REAGENTE NA LITERATURA ABORDADA Segundo Moreira (2019), o monitoramento de endotoxinas afigura-se como a principal função do LAL na indústria farmacêutica. Para avaliar a quantidade presente em uma amostra, foi-se padronizada uma unidade, conhecida como EU ou UE (Unidade de Endotoxina), sendo que tal dose é baseada no limite humano para resposta pirogênica (limiar humano da dose pirogênica de 5,0 UE/kg ou 1,0 ng de E. coli (055:B5)/Kg ) (SILVA, 2017). Ou seja, 1 nanograma de endotoxina (padronizada tendo como referência a mesma substância gerada por E. coli) equivale a 5.000 UE/ frasco ou 5 UE/kg, dessa forma (MELANDRI, et al, 2010, p. 81), 1 UE = 0,2 ng, sendo 1 ng de endotoxina o suficiente para desencadear febre no ser humano (MORALES, 2004). Esta unidade não mede a quantidade de endotoxina presente numa amostra, mas sim, a atividade da endotoxina e baseia-se então na concentração desta ativa no meio. Com base nesta unidade, limites de endotoxina são padronizados em substâncias injetáveis para cada tipo de amostra conforme suas respectivas formas de administração, sendo, em comparação, o menor valor esperado para injeção intratecal. O limite máximo de endotoxinas em preparações parentéricas, definido em função da dose, é igual ao quociente entre o limiar de dose pirogénica [sic] da endotoxina por quilograma de massa corporal (K) e dose a máxima administrada no período de 60 minutos(MOREIRA, 2019, p. 49) Sendo assim, então a definição estabelece K/M c como Limite de Tolerância por Dose Máxima por Hora. Conforme descrito por Brum (2009), Há no mercado 3 métodos mais notórios no mercado que envolvem em seus procedimentos o uso do reagente LAL, e a partir deles, seus derivados: método de gelificação (gel clot), os métodos turbidimétrico e cromogênico (ambos não só fotométricos mas também como quantitativos). A correlação entre os métodos baseia-se na comparação da menor diluição de um determinado produto ao qual a interferência é eliminada. Em geral, há uma correlação moderada entre os métodos quando o reagente LAL é produzido pelo mesmo fabricante e ainda melhor, conforme Morales (2004) se for do mesmo lote, enquanto pode ser muito 17 diferente mesmo para o mesmo método quando o reagente é produzido por diferentes fabricantes. 3.1.1 - Máxima Diluição Válida e Sensibilidade Segundo Lourenço, Kaneko e Pinto (2005), a Máxima Diluição Válida (MDV) é um valor padrão da maior diluição possível de endotoxinas em um reagente para um ensaio de forma que, caso contenha endotoxina, esta possa ser detectada, e tal MDV sendo específica para o respectivo reagente que será administrado durante a execução do ensaio, portanto, dado fornecido pelo fabricante e necessariamente confirmado por testes elo usuário do produto. MDV = L x C / γ onde: L= limite de especificação da monografia; C = concentração do fármaco e γ = sensibilidade do LAL. Pelo visto, para que se posa achar a MDV de um produto, é necessário descobrir a sensibilidade do mesmo em questão. Para isso, segundo Guimarães (2017), são realizadas 4 diluições do reagente do kit (¼ λ, ½ λ, 1 λ e 2 λ) e a média geométrica (MG) das concentrações de ponto final de cada diluição deve estar entre ½ λ e 2 λ. MG = antilog (Σe/f) onde:Σe= somatória do logaritmo dos pontos finais e f= número de réplicas Já o cálculo da concentração de endotoxinas é realizado, segundo Morales e Alejo (2004) é calculada a média geométrica entre os endpoints correspondentes a cada réplica, ou seja, a maior diluição que produz uma resposta positiva no ensaio, e tal valor é multiplicado pela sensibilidade do método do kit. 3.1.2 - Validação do Teste Para todos os métodos com uso de LAL, deve-se realizar de antemão um teste para caracterizar a natureza do produto do kit, independente do fabricante. 18 De acordo com Brum (2009), a ANVISA – Agência Nacional de vigilância Sanitária, exige que as aplicações analíticas (integridade e garantia de funcionalidade) de um produto devem ser asseguradas pelo fabricante para que haja confiabilidade dos resultados. Assim sendo, o LAL de cada fabricante (para todos os métodos que o utilizam) devem caracterizar a natureza do produto através de um teste de validação de interferência antes de iniciar as atividades experimentais. Interferências relacionadas a produto recém adquirido do kit referem-se a β-glucanos, derivados de celulose, cátions metálicos, proteínas tampões, dentro outros derivados de processos fermentativos. Desta forma, como tais substâncias que compõe um reagente podem reagir de diferentes formas em contato com as substâncias a serem analisadas, torna-se justificável a validação de cada ensaio pré experimento para garantir a confiabilidade do produto durante seu uso. Conforme Lourenço, Kaneko e Pinto (2005), a validação que “é realizada através da inibição ou potencialização da reação de formação do gel”. Nada mais é do que a verificação da plena funcionalidade do produto. Para isso, inicia-se com a formação de duas amostras, uma controle positivo e outra controle negativo, são preparadas de antemão (já sabendo-se da sensibilidade e da MDV), tais amostras são inoculadas com uma quantidade conhecida de endotoxina. No controle positivo, conform e Guimarães (2017), reagente LAL + endotoxina e no controle negativo água apirogênica + endotoxina, ambas postas para incubação por um determinado período de tempo até que a manifestação da endotoxina seja ativada no controle positivo. Assim sendo, testa-se a inibição ou potencialização do reagente. Inibição é quando há quantidade de endotoxina considerada suficiente para ativar a reação em cascata e logo determinar um resultado positivo, entretanto, ocasionar em negativo; e potencialização é quando não há quantidade suficiente de endotoxina para ocasionar resultado positivo, entretanto o mesmo ocorre, socorrendo em situações em que a quantidade de endotoxina está abaixo da capacidade mínima de detecção do ensaio (endotoxina está muito bem diluída para o padrão do ensaio ou alguma substância extra que interferiu na leitura), ocasionando assim um resultado falso. Tais resultados, conforme demonstrados por Lourenço, Kaneko e Pinto (2005), correspondem a 2 dos 4 parâmetros avaliados possíveis de uma validação: 19 Quadro 1 - Probabilidades de possíveis resultados do ensaio de LAL e influências Fonte: Adaptado de Lourenço, Kaneko e Pinto (2005). Resultados verdadeiramente positivos são aqueles em que, tendo uma quantidade suficiente de endotoxina, ocorreu formação de gel. Os resultados falsopositivos, são aqueles nos quais na prática ocorreu formação de gel, porém não havia quantidade de endotoxina suficiente (potencialização), resultados falso-negativo são aqueles em que, apesar de ter uma quantidade de endotoxina suficiente, não ocorre formação de gel (inibição) e por último, resultados verdadeiramente negativos são aqueles em que não ocorreu formação de gel porque não havia quantidade de endotoxina suficiente para tal. Todos os resultados, tanto verdadeiros quanto falsos são determinados em função da média geométrica (MG). Em diluições, a floculência ou presença de precipitado é indício da presença de endotoxinas na mistura, todavia em quantidade inferior à sensibilidade do método (potencialização e/ou resultado falso positivo), conforme Morales e Alejo (2004). Caso isso ocorra no controle negativo, pode indicar que a água apirogênica ou destilada utilizada para realização do ensaio está contaminada com níveis baixos de endotoxinas. Se tais níveis de endotoxinas forem adicionados ao substrato LAL, o método parecerá mais sensível do que deveria quando a curva padrão for executada. 3.2.1 Método de Gel Coágulo O método mais básico é conhecido como gel-clot/gel clot ou gel-coágulo, do qual é baseado essencialmente na mesma reação que acontece in vivo na hemolinfa do 20 caranguejo ferradura ao combater endotoxinas, onde enzimas coagulina são liberadas em detrimento da reação em cadeia do sistema imune do Limulus, dependentes da concentração de endotoxina, temperatura e pH. 1- Pró-enzima + Endotoxina → Enzima (limulus clotting) 2- Coagulina + Enzima → coágulo gelatinoso Conforme Moreira (2019), tal método verifica a presença de endotoxinas pela formação de um coágulo quando o reagente entra em contato com a amostra. Segundo Fukumori (2008), uma mistura entre o reagente e a amostra é feita e incubada em banho maria a 37° por uma hora, até que, para verificação do resultado diante do ponto final, há inversãp do frasco da amostra em 180º para confirmação do mesmo. O resultado negativo é avaliado quando a integridade do gel não se altere. Caso haja a presença de um gel que se mantém firme durante a eversão do frasco é considerada como um resultado positivo à presença de contaminantes e quanto mais firme for o gel, maior é a quantidade de endotoxina em atividade (ou seja, o teste é binário, positivo ou negativo, e também tanto qualitativo quanto semiquantitativo). O teste é realizado somente após a sensibilidade do reagente do fabricante ter sido descoberta pela validação, e os resultados são considerados (em comparação com os controles) conforme Moreira (2019) nos tópicos abaixo, comparando suas respectivas quadruplicatas “A”, “B”, “C” e “D”, sendo A, a substância testada em questão; B, o controle positivo. Solução C, endotoxina em água apirogênica ou destilada e D, reagente LAL em água apirogênica ou destilada (GUIMARÃES, 2017). 21 Quadro 2 - Avaliação dos Resultados dos ensaios de LAL Fonte: Do autor. Essa técnica é padronizada para detectar concentrações de 0,05- 0,25 UE/mL de LPS de E. coli, com pH entre 6 e 8 e sob exigências específicas de salinidade, como cátions divalentes como Mg2+ e Ca2+, por exemplo. (LOPES, 2010). 3.2.2 Método Cromogênico QCL - Quantitativo Cromogênico em Limulus Conforme Lopes (2014), a metodologia cromogênica é quantitativa, utilizando-se de um substrato cromóforo para detecção colorimétrica de endotoxinas ativas e baseiam-se na quantificação do corante ativado durante uma reação, que é proporcional à concentração de endotoxinas. Essa metodologia, conforme Silva (2015), permite quantificações precisas da toxina bacteria presente no ensaio testado e assim como os métodos turbidimétricos, possui variações, como o cromogênico de ponto final ou endpoint, cromogênico cinético (QCL-Cinético). O teste de end-point analisa o resultado final de um período de incubação mediante a relação quantitativa entre a quantidade de cromóforo liberada em detrimento da concentração de endotoxina presente. Conforme Fukumori (2008), tal método quantitativo funciona de acordo com reações enzimáticas em cascata de coagulação (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) substrato-endotoxina. 1- Pró-enzima + endotoxina → Enzima 2- Substrato + água + enzima → Peptídeo + pNA No caso, um substrato cromogênico sintético incolor, que funciona da seguinte maneira: o substrato composto por um peptídeo, ligado pela arginina C-terminal, a uma 22 molécula cromófora p-nitroanilina (pNA). Quando a reação é ativada pelo contato do lisado de amebócito à endotoxinas, a enzima coagulina provoca a liberação de pNA de cor amarela. A concentração da cor é proporcional a quantidade de endotoxina na amostra, cujo pode ser monitorado a 405 nm no aparelho espectrofotômetro. Este é um método quantitativo e específico para enzima de coagulação ativada. O teste requer mistura de 0,1 mL do LAL com 1,0 mL da amostra, incubando-se por 8 minutos. Depois de devida incubação, adiciona-se 0,5 mL de substrato cromogênico na solução e incuba-se novamente por 3 minutos. Para finalizar a reação, utiliza-se 0,1 mL de ácido acético glacial em água, a 25% v/v e, em espectrofotômetro, lê-se a densidade óptica (GUIMARÃES, 2017, p. 33) Fukumori (2008) e Moreira explicam que no teste cinético mede-se o tempo necessário para que a mistura atinja uma absorbância pré estabelecida e o desenvolvimento da cor (relacionada à concentração). Já fingola (2011), complementa, dizendo que o tempo necessário para a coração é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina presente na amostra, ou seja, quanto maior for a quantidade de endotoxina, mais rápido é a reação (dando um tempo total menor até completar); logo, quanto menos endotoxina, mais demorará para ser realizada. O outro método também cromogênico, de acordo com Morales (2004), conhecido como opção diazo, é variação do resultado pNA, funcionando como se fosse uma extensão do método, onde a pNA é derivatizado para formar um diazocomposite colorido. O derivado magenta brilhante conhecido como "corante azo" tem um espectro de absorção diferente com um pico de absorção máxima de 540 nm e um coeficiente de alta extinção, e a sua principal vantagem é que é possível evitar interferências produzidas por amostras amarelas, por exemplo, fluidos corporais e alguns meios para a cultura celular, porém, esta opção não se aplica ao modo cinético. 3.2.3 Método Turbidimétrico A metodologia turbidimétrica utiliza a turbidez da amostra como parâmetro analisado. Segundo Guimarães (2017), exige ser realizado em um espectrofotômetro com incubadora e leitor de placas, uma vez que a temperatura de incubação recomendada é de 37 ºC ± 1 ºC. Consoante a Morales (2004), existem 2 metodologias turbidimétricas: turbidimétrico de ponto final ou turbidimétrico end-point e turbidimétrico cinético. Medidas quantitativas de endotoxinas são obtidas por análise da concentração destas diluídas num reagente em um espectrofotômetro (com leitura a 340 nm, segundo Lopes (2010). O 23 método turbidimétrico de ponto final utiliza a relação quantitativa entre a concentração de endotoxina e a turbidez como parâmetro, uma vez que, segundo Fukumori (2008), devido à precipitação de proteínas coagulogênio no lisado, o aumento da concentração de proteínas provocará proporcionalmente aumento da turbidez do reagente. Há-se então, leitura da densidade óptica de várias diluições e depois comparação destas com uma curva padrão. Já no método Turbidimétrico Cinético, conforme Moreira (2019), analisa-se a velocidade de desenvolvimento da turbidez, mais precisamente, observa-se o tempo necessário para que um ensaio leva para alcançar uma absorbância pré estabelecida. De acordo com Fukumori (2008), aparentemente o método Turbidimétrico Cinético tem seu uso mais presente nos últimos tempos concomitantemente com o desenvolvimento tecnológico aplicado às técnicas de identificação, uma vez que, na época em que Levin e Bang propuseram tal método, era pouco utilizado, já que requisitava equipamentos capazes de manipular várias amostras simultaneamente e sob temperatura monitorada, tecnologia que provavelmente era escassa na época. Atualmente tais equipamentos possuem modificações para se adequarem as necessidades do método, como uma incubadora a 37°, leitor de microplacas de alta resolução (essencial para analisar a variação da turbidez/tempo), softwares especializados em lidar com o processamento e análise de dados dos leitores e formulações do lisado de amebócito como reagentes mais sensíveis, tal qual explicitado por Lopes (2010), “otimizado para ser linear de 0,01-100,0 UE/mL”. 3.2.4 Método Eletroquímico Segundo Moreira (2019), o recente método eletroquímico foi criado como uma alternativa aos métodos mais conhecidos de teste de endotoxina bacteriana (BET) préestabelecidos. Baseia na correlação entre a formação de coagulina e a interferência desta na diferença de potencial entre dois polos, mais precisamente, a diferença de corrente antes/depois da corrente é proporcional a quantidade de endotoxina na amostra. A cascata de coagulação que forma a coagulina transforma o LAL em coágulo, e quanto mais endotoxina, mais consistente a coagulação do sistema. Os coágulos interferem nos eletrodos do sistema, mais precisamente, bloqueando o contato entre o principal eletroquímico presente, o ferrocianeto de potássio, e os eletrodos do equipamento, de tal forma que ao ter sua interação com os eletrodos gradativamente perdida conforme a quantidade de coágulo aumenta, menor vai se tornando a diferença de potencial (por 24 causa do bloqueio) e menor torna-se a corrente eletroquímica do circuito. Como outrora dito, a quantidade de coágulo formado é proporcional a quantidade de endotoxina na amostra, logo, a potência da corrente é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina no meio em contato com o reagente LAL. “Mediante a construção de uma curva de calibração é possível a relacionar a variação do fluxo de difusão com a quantidade de endotoxina presente na amostra”. (MOREIRA, 2019, p. 52) 3.2.5 Método Nefelométrico O método nefelométrico é uma metodologia alternativa com foco majoritário em participar de leituras com grande quantidade de endotoxina em soluções parenterais. Conforme Guimarães (2017) e Fukumori (2008), a diferença deste para os métodos que utilizam espectrofotômetros é justamente o aparelho, um nefelômetro a laser, que invés de medir a densidade óptica de uma solução, mede a diferença de luz relativa dispersa. Obviamente algumas substâncias também são alteradas para se adaptarem ao método, como uso de Carboximetilcelulose (CMC) para estabilizar suspensão e o sulfato de dodecil sódico para finalizar a reação enzimática após o período de 1 hora de ensaio. 3.2.6 Método Colorimétrico de Proteína de Lowry Este método é bastante similar ao método gel clot; baseia-se em concentrações crescentes de endotoxina proporcionais às quantidades de coagulina de uma amostra. Todavia, após a incubação da solução a 37° por 1 hora, a mistura é centrifugada e a quantidade de coagulogênio, no sobrenadante, é quantificada através de um espectrofotômetro configurado para leitura a 660 nm e implementação do método de Lowry e então os resultados da leitura são comparados a uma curva padrão, tendo assim, análise de dados com base na discrepância entre curvas (FUKUMORI, 2008). No método colorimétrico, a absorbância é medida durante todo o período da reação e os valores da taxa são determinados naquelas leituras. A reação chega ao seu final pela adição de um agente de enzimas finalizadoras de reações, antes das leituras” (GUIMARÃES, 2017, p. 33) Dessa forma podemos ver então que o LAL como substrato está suprido de diversas opções metodológicas para sua aplicação, que vão desde metodologias mais simples 25 como a de gel coágulo cujo até aplicações com maior complexidade em sua execução, como o acompanhamento, monitoramento e avaliação dos resultados dos métodos colorimétricos e turbidimétricos, além de opções alternativas ainda remetentes ao LAL como o método eletroquímico, por exemplo. Contudo, as variante para o substrato do amebócito de limulus não são as únicas opções viáveis no quesito avaliação de pirogênio livre contaminante para formulações farmacológicas, o que expande ainda mais as possibilidades para instituições responsáveis pelo controle de qualidade e abre um repertório mais variado para opções que correspondam melhor às necessidades de cada uma. 26 4 CAPÍTULO 3 4.1 AVALIAR OS DIFERENTES MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE LAL ENCONTRADOS NA LITERATURA Nos últimos anos, conforme Morales (2004), com o aumento da preocupação pelo controle de qualidade de produtos farmacêuticos, os principais órgãos exigem cada vez mais em suas diretrizes a aplicação dos métodos para detecção de de pirogênios em produtos terminais parenterais. Atualmente, para a aprovação e comercialização de grande parte dos produtos farmacêuticos e biotecnológicos administrados por via parenteral, as farmacopéias exigem o controle de endotoxina pelo método de LAL. Por mais que os métodos com uso de LAL sejam os mais utilizados do mercado atualmente, ainda há estudos para desenvolver mais alternativas aplicáveis. Sejam eles o método em si que antecedeu o LAL como principal teste de pirogênio ou os novos métodos promissores do mercado atualmente. Há-se a liberdade de usar de métodos alternativos para a detecção de pirogênios pelas empresas em seus produtos, uma vez se, conforme Navega (2016), estes apresentarem vantagens em termos de precisão, seletividade, sensibilidade ou outras circunstâncias específicas 4.1.1 Teste de Pirogênio in vivo O teste de pirogênio in vivo, também conhecido também como Teste de Pirogenicidade em Coelhos ou Teste de hipertermia em Coelhos – RPT (Rabbit Pirogen Test) é o teste referência de detecção de pirogênios, principalmente endotoxinas, antecessor aos testes com uso de LAL. Segundo Silva (2017), foi desenvolvido em 1920 pela Food and Drug Administration (FDA) para detecção de LPS, e devido aos acontecimentos desencadeados pela segunda guerra mundial, o teste foi ainda mais requisitado, sendo então incluso sua metodologia na Farmacopéia Estadunidense (United States Pharmacopea - USP) em 1942 para testar soluções medicinais intravenosas. Sua metodologia baseia-se, de acordo com Lopes (2014), na observação da resposta imune de coelhos. É um ensaio qualitativo no qual há-se a injeção intravenosa da solução a ser analisada pela veia marginal da orelha dos animais com acompanhamento da 27 temperatura retal dos mesmos, tanto antes quanto depois de se iniciar o experimento, de acordo com Melandri; et al (2010), a cada 30 minutos por um período de 3 horas. Primeiramente, o acondicionamento dos espécimes à sala do experimento e aos procedimentos de execução do mesmo devem ser preparado em pelo menos uma semana antes do experimento começar. A temperatura do lugar deve estar entre 20 e 23 °C e livre de estímulos externos que possam interferir no bem estar dos coelhos. Apenas animais cujo peso seja igual ou superior a 1,5 k, conforme Guimarães (2017), e de acordo com Fingola (2018), podem ser usados, e com cuidado no manuseio para não interferir na hipersensibilidade dos coelhos, são utilizadas gaiolas de contenção para os animais, sendo 3 destes por produto testado. No dia dos testes, apenas água poderá ser fornecida aos mesmos. É então executado uma simulação, com exceção apenas do produto inoculado. Animais que demonstrarem elevação da temperatura corporal igual ou superior a 0,5 °C em relação a temperatura inicial durante a simulação não deverão utilizados no teste futuro. Segundo Silva (2017, p. 17), “a resposta do coelho a pirogênios apresenta semelhantes padrões de indução da febre em humanos”, sendo que a concentração limite para a resposta de 1ng/kg, o que equivale a 5 UE/kg, também é observada no homem (NOGUEIRA, 2009). Dessa forma, sabendo-se que a duração da inoculação máx seja 10 min, considerando-se substâncias que possam ser toleradas por coelhos e a administração da mesma não seja menor que 0,5 mL/kg e nem exceda 10 mL⁄kg de peso corporal e 1 mL⁄kg para os soros hiperimunes (FINGOLA, 2018, p. 29, grifos nossos), o valor da variação individual de temperatura (VIT) para cada coelho deve ser de 0,5 °C em relação a temperatura inicial. Conforme Guimarães (2017), em no máximo 40 min antes da injeção do real produto a ser avaliado pelo teste, devem ser registradas 2 leituras de temperatura dos animais, com intervalos de 30 min entre cada uma das anotações. A média entre estas 2 leituras por animal será tomada como temperatura média para controle individual, servindo como parâmetro avaliando as variações térmicas subsequentes à inoculação do produto nos animais. De acordo com Silva (2015), a temperatura dos espécimes começa a subir após 45 min e tende a crescer até seu ápice por volta de 60 a 90 min, e por ser de caráter monobásico, após o pico de temperatura tende a decair até a temperatura basal. Em tal teste, caso algum animal do ensaio de seu respectivo produto apresente variação de 28 temperatura igual ou superior a 0,5°C, o ensaio será repetido, desta vez com mais 5 novos coelhos para tal produto. Agora o produto só poderá ser considerado aprovado caso, no máximo, 3 dos 8 animais utilizados para testar o respectivo ensaio apresentarem variações individuais de temperatura iguais ou menor a 0,5 °C, ou no caso se a somatório das VIT dos oito coelhos não for superior a 3,3 °C. Nogueira (2009) indica que caso preciso, a reutilização dos animais deve respeitar um interstício de 48 horas caso o resultado do teste recém-aplicado seja negativo. Caso houvera resultado positivo, este prazo se estende para 1 semana. No geral, “o teste de pirogênio em coelhos deve ser testado somente se o produto é incompatível com o teste de LAL” (SILVA, 2017, p. 18). 4.1.2 Teste de Ativação de Monócitos (MAT) Os monócitos, os maiores leucócitos encontrados em um esfregaço sanguíneo, são células mononucleares de defesa do organismo e “apresentam importantes funções na resposta imunitária sendo os responsáveis pelo reconhecimento dos patogéneos e consequente ativação da fagocitose com produção de pirogénios endógenos” (MOREIRA, 2019, p. 56), como as citocinas pro-inflamatórias fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6). De acordo com Brum (2009), o sobrenadante de uma mistura entre monócitos e o produto testado e incubados juntos é avaliada para verificar a presença de tais citocinas, indicando assim contaminação por endotoxina. Tal método vem sido desenvolvido desde 1988 segundo Silva (2015) e baseia-se na resposta febril humana, mais precisamente no mecanismo da febre e na contagem de mediadores inflamatórios liberados em decorrência de tal processo. Segundo Lopes (2014), “as citocinas liberadas são medidas por kits comerciais através de um ensaio imuno-enzimático” ELIZA - Ensaio de Imunoadsorção Enzimática. Durante a incubação, as citocinas são liberadas por volta de 2 a 3 horas no sangue total e atingindo plateau em 8 horas, contudo o tempo de incubação utilizado em média dura por volta de 16-24 horas por praticidade/rotina laboratorial. A primeira demonstração da equivalência dos monócitos ao RPT e LAL foi feita por Poole et al em 1988, utilizando uma linhagem celular de monócitos cultivada conhecida como MONOMAC-6 (MM6), mostrando que, sob exposição a endotoxinas, liberaram citocinas IL-1β e TNF- α a uma boa quantidade suficiente para se constatar adequada relação concentração-resposta (MELANDRI et al, 2010, p. 75). Um upgrade do método 29 MAT foi o desenvolvimento da criopreservação do material, pois não só elimina o problema da preocupação em ter que coletar sangue e prepará-lo de antemão para sua aplicação no ensaio mas também a necessidade de se buscar doadores toda vez que fosse proposto a realização de um ensaio, mas a padronização da criopreservação também permitiu, segundo Navega, et al (2015), a facilitação da aquisição e validação do sangue e desenvolvimento de kits comerciais para MAT com fornecimento constante de sangue pré testado para possíveis patógenos para laboratórios. Lopes (2014) cita que com o advento da criopreservação de células mononucleares isoladas de sangue periférico (PBMC), criados por Schindler e colaboradores em 2004, não só trouxe praticidade a execução do ensaio, pois permitia que o sangue pudesse ser utilizado imediatamente após o descongelamento sem etapas de lavagem mas também como ocasionou maior segurança ao ensaio por preservar a integridade do material de forma mais competente e permitir maior facilidade do transporte. 4.1.3 Ensaio Fator C recombinante O fator C, segundo Moreira (2019) é uma glicoproteína com massa molecular de 123 kDa importante para a ativação da cascata de coagulação de LAL juntamente com o fator G e a enzima de pró-coagulação. Baseado em tal molécula, uma outra, recombinante, fora criada para o desenvolvimento de um BET simples, sensível e específico que funciona ao redor de tal fator C recombinante (rFC). O rFC atua como uma pró-enzima, ativando-se em contato com endotoxinas e ativamente hidrolisa um substrato específico (o Boc-Val-Pro-Arg-MCA) proporcionalmente a quantidade de endotoxinas presente no ensaio. Dessa forma, é quantificado o volume de substrato hidrolisado para determinar o nível de endotoxina conforme o nível fluorimétrico observado, pois o substrato possui atividade fluorogênica, que é medida a 460 nm. 30 5 ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE OS MÉTODOS ENCONTRADOS NA LITERATURA 5.1 O Conceito dos 3 Rs na Experimentação Animal Os ensaios para detecção de pirogênios com LAL sem dúvidas revolucionaram o mercado farmacológico e industrial imunológico da produção de bens para a saúde, entretanto não foge de alguns problemas apontados pela literatura que abarcam até mesmo suas versões alternativas. Com o passar dos anos, inúmeras polêmicas foram levantadas a respeito do uso de animais para a área científica de testes laboratoriais, impulsionando assim toda uma política voltada para a cessação do uso dos mesmos em experimentos científicos quando possível, sendo conhecido como, de acordo com Moreira 92019), o conceito dos 3Rs: Refine, Reduce and Replace, que significam “aperfeiçoar”, “reduzir” e “substituir” o recurso aos testes em animais na medida do possível, culminando assim em uma mobilização mundial de várias entidades e órgãos regulatórios para um maior engajamento ético nos trabalhos de validação da área toxicológica. Conforme Guimarães (2017) e Silva (2015), tal tendência foi inicializada em 1959 com a publicação do livro “The principles of humane experimental technique”, que baseia-se na “redução do número de animais, refinamento das técnicas experimentais, minimizando o sofrimento do animal e preservando o seu bem estar e, quando possível, a substituição dos testes realizados in vivo por testes in vitro”. A seguir, melhor detalhamento sobre o conteúdo do livro, detalhado por Gon (2017) e Fingola (2011): 31 Quadro 3 - Avaliação dos Resultados dos ensaios de LAL Fonte: Adaptado de Gon (2017) e Fingola (2011). A primeira publicação oficial sobre a aplicação dos 3R’s só surgiu em 1986, quando foi criada na Europa, a Diretiva 86/906/EEC - "Animal welfare guideline", que estabelece: "um experimento não poderá ser executado em animal se outro método cientificamente satisfatório, que não implique na utilização de um animal, seja razoável e possível" e descreve as leis que regem a proteção de animais usados em experimentação científica (GON, 2017, p. 19) “Com o avanço do conhecimento científico tornaram-se mais evidentes as diferenças metabólicas e de respostas que controlam a homeostasia tecidual em animais e humanos, sendo necessários modelos in vitro mais apropriados” (FINGOLA, 2018, p. 22). 32 Torna-se evidente desta forma que é preciso desenvolver métodos válidos alternativos que atendam ao princípio dos 3Rs. No Brasil, de acordo com Silva (2017), medidas de incentivo e desenvolvimento de métodos alternativos são amplamente incentivadas por órgãos como o Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos – BraCVAM, que está ligado ao Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS)/Fiocruz, fomentando efetiva participação na Rede Nacional de Métodos Alternativos (RENAMA). Inclusive, segundo Lopes (2014), conforme estabelecido pelo Decreto n°. 6.889, de 15 de julho de 2009, que regulamenta a Lei de n°. 11.794 de 8 de outubro de 2008, são parâmetros almejáveis para os procedimentos alternativos garantir resultados semelhantes e com reprodutibilidade; visando sempre que possível, a mesma meta dos procedimentos substituídos por metodologias que: A) não utilizem animais; B) usem espécies de ordens inferiores; C) empreguem menor número de animais; D) utilizem sistemas orgânicos ex vivos; E) diminuam ou eliminem o desconforto. 5.2 Prós e Contras do Método in vivo Com tal premissa dos 3Rs, o método in vivo foi gradativamente sendo menos usado para dar destaque as novas tecnologias in vitro emergentes que não só buscavam diminuir o uso de animais mas também como padronizar métodos mais replicáveis laboratorialmente nas bancadas. Entretanto, apesar do grande avanço científico e da importância dos métodos in vitro para a indústria, o LAL, que é exigido para o controle de pirogênios para produtos farmacêuticos e biotecnológicos administrados por via parenteral, demonstra-se, conforme a literatura, incapaz de substituir o uso do método RPT de experimentação animal. Apesar de estar invariável por mais de 40 anos e com sua efetividade pouco questionada, o método in vivo ainda demonstra-se bastante presente e necessário no mercado. Sua ampla sensibilidade a vários, praticamente todos, diferentes tipos de pirogênios devido ao seu mecanismo da febre serve como base para a validação de muitos outros testes recentes, sendo reiterado pelos principais órgãos regulamentadores como padrão de validação e equivalência para novos métodos de identificação de pirogênios. Entretanto, vários pontos negativos foram apontados na literatura, grande parte justamente objetivos a serem contornados pela criação de testes alternativos. Brum 33 (2009), Barth, et al (2007) e Guimarães (2017) listam inconveniências trazidas pela experimentação em coelhos, como a possível baixa sensibilidade causada pela resistência imunológica de alguns indivíduos ou espécies, ausência de quantificação (ponto altamente relevante para laboratórios pois a quantificação endotóxica é um parâmetro altamente relevante para a indústria além do resultado meramente qualitativo), o gasto de tempo, “pois é um teste demorado e trabalhoso, onde se deve medir a temperatura do coelho num intervalo curto de tempo”, custo, pois, segundo Lopes (2014), exige a manutenção de um biotério, inconveniências como a e envolve a variabilidade fisiológica dos animais utilizados e por último mas não menos importante a questão ética do envolvimento de animais nos experimentos. Além disso, observou-se uma disparidade de opiniões no material estudado, com autores como Nogueira (2009) e Silva (2015), citando que o limiar da resposta imunológica à endotoxina é igual ao do homem (1ng/kg, equivalente a 5 UE/kg), entretanto, ideia aparentemente rejeitada por autores como Guimarães (2017) e Silva (2017), que cita argumentos de que a resposta pirogênica nos animais não traduz a resposta humana e tal extrapolação de experimentos de natureza biológica entre animalhomem seja um ponto negativo, pois a variabilidade biológica dos animais e também interferências como estresse natural do bicho a experimentos, ruídos, as diferenças de resposta entre raças de coelhos e a influência de fatores ligados ao sexo afins podem levar a uma resposta falso-positiva ou falso-negativa. “Apesar de ser comummente [sic] praticado e apresentar correlação com a fisiologia humana, a sua utilização acarreta alguma variabilidade inerente aos ensaios com modelos animais” (MOREIRA, p. 40, 2019). Não obstante, com o passar do tempo cada vez mais estudos demonstrando tal diferença salientam tal discrepância sobre os efeitos de certos fármacos ou contaminantes no organismo de animais e do homem, corroborando para o ponto de que o coelho não seja então o representando definitivo dos efeitos de testes farmacológicos de biossegurança. “Devido as diferenças entre as espécies, alguns produtos como os biológicos para uso humano podem causar febre em seres humanos, mas não causar febre em coelhos e vice-versa”. (HARTUNG; et al, 2001 apud NAVEGA, 2016). Em acréscimo a tal ponto, o método de RPT ainda possui algumas limitações como inadequação para determinar pirogênios em medicamentos como os esteróides, quimioterápicos, e outras substâncias orgânicas como substâncias hormonais, dentre outros, demonstrando assim certa limitação do método, como explicado por Guimarães (2017). “O RPT não é adequado para muitos produtos, tais como os medicamentos 34 radiofarmacêuticos, agentes quimioterapêuticos, analgésicos, antipiréticos, citocinas, dopamina e agentes imunossupressores” (NAVEGA, 2016, p. 37) e também outros medicamentos que influenciam nos mecanismos centrais ou periféricos da regulação da temperatura ou ao organismo do animal, como antipirético, frações do plasma e o adjuvante sintético muramil dipeptídeo segundo Guimarães (2017), os já mencionados esteróides e dopamina e substâncias que desencadeiam reações imunológicas, tais como imunoglobulinas, suspensões oleosas ou detergentes e também não se aplica a preparações celulares, tais como componentes do sangue e de células estaminais. “Devido ao seu efeito farmacológico, certos citostáticos, alguns sedativos e anestésicos, corticosteróides, derivados fenotiazínicos e antipiréticos não podem ser avaliados pelo método em coelhos, pois mascaram o potencial pirogênico das amostras.” (MORALES, 2004, p 1). Para alguns medicamentos, cujo quando são testados em coelhos, restringemse a serem aplicados numa proporção de 10 mL/kg, pode-se considerar como um ponto negativo, pois, conforme mencionado por Navega (2016), dependendo das características do medicamento, o limite de detecção resultante para 10 mL/Kg seria de 500 pg por 10 mL ou 50 pg/mL, enquanto que o limiar da febre em humanos encontraria-se cerca de 30 pg/mL , e para muitos medicamentos o volume testado é significativamente menor , ou seja, neste cenário a extrapolação interespécies demonstra-se inadequada. Outro fator a ser relevado sobre ouso do método in vivo, como mencionado por Silva (2015), é que de acordo com dados coletados nos Estados Unidos foram utilizados só em 2002 um total de 243.838 coelhos e na União Europeia um total de 313.000 coelhos, sendo 276.000 usados em pesquisas para produtos farmacêuticos e dispositivos médicos (investigação e de segurança). Estima-se que, no mundo, um grande número de coelhos seja utilizado para todos os fins de investigação e análise e, embora o número de animais usados especificamente para o RPT não tenha sido relatado, é provável que este número seja significativamente alto, incluindo dados reportados no Canadá e no Reino Unido, apresentados por Melandri; et al (2010). Em 2002, um total de 243.838 coelhos foram utilizados nos Estados Unidos e 313.000 coelhos na União Europeia, sendo que, desses, cerca de 276.000 animais foram utilizados para produtos farmacêuticos e dispositivos médicos (investigação e de segurança). O sexto relatório da Comissão Europeia (2010) indica que roedores e coelhos representam 80% dos animais utilizados em experimentos científicos. Além do grande número de animais utilizado nos testes de 35 pirogenicidade, estudos demonstram que apesar de ser classificado como de grau leve, também impõe ao animal dor momentânea e angústia, induzida pela resposta febril e com ela todos os sintomas associados (SILVA, 2015, p. 48-49) 5.3 Prós e Contras do Método in vitro com LAL Sem dúvida, desde 1964 com o desenvolvimento do substrato LAL pelos esforços de Levin & Bang, os métodos de identificação de endotoxinas tornaram-se revolucionários e de extrema importância para as áreas de biossegurança, imunologia e saúde da indústria farmacêutica. Conforme Navega; et al (2015) e Moreira (2019), o LAL e seus métodos são responsáveis, atualmente, por 90% dos testes de pirogênio aplicados no mercado, sendo então a identificação de endotoxinas a principal função do LAL na indústria farmacêutica. Apesar de mais de 58 anos de desenvolvimento e refinamento do substrato e da criação de vários métodos, inúmeras polêmicas circundam tal metodologia que vão desde apontar relativas “falhas” ou limitações do teste para a necessidade de ainda procurar desenvolver uma metodologia tão eficiente quanto mas que exclua as inconveniências apontadas pela tendência dos 3Rs que se dão pelo uso de métodos in vivo. O LAL como substrato sensível a LPS é um grande auxílio para a identificação deste pirogênio, que representa considerável ameaça para a integridade de medicamentos no geral. O método gel coágulo demonstra-se ser o mais versátil entre todos as metodologias de LAL por ser o mais simples, segundo Guimarães (2017) e Morales (2004), sendo menos suscetível a inibição, mais barato, exigindo vidrarias comuns no ambiente laboratorial e de fácil interpretação de resultados. Sua desvantagem em comparação a outros métodos se dá por ser o menos sensível dentre os métodos, detectando apenas até 5 EU/mL conforme Fingola (2011) e Morales (2004), pois para a identificação de quantidades menores de LPS, outras metodologias devem ser usadas, como os métodos cromogênicos ou turbidimétricos. A respeito de tais métodos, houveram divergências entre os autores para apontar quais seriam as metodologias mai sensíveis para identificação de tais substâncias na literatura, com autores como Morales (2004) afirmando que os métodos turbidimétricos seriam os mais sensíveis, capazes de detectar até 0,001 EU/mL, detalhe este confrontado por Lopes (2010), que afere uma sensibilidade de entre apenas 0,01-100,0 UE/mL para o mesmo; enquanto Dobrovolskaia, et al; (2010) afere MDV de 1:1500 (o equivalente a 0,0006); e outros autores como Lopes (2010), Silva (2017) e Fingola (2011) justificaram os métodos cromogênicos como os mais sensíveis, 36 afirmando sensibilidade entre 0,005-50,0 UE/mL . Navega, et al, afirmaram limite de detecção entre 0,03-0,005 UE/mL , entretanto, não especificaram para qual método em sua literatura. Melandri; et al (2010) afirmam que independentemente da monografia abordada de cada produto/kit estes dois métodos são capazes de detectarem endotoxinas na faixa de picogramas por mililitro. No que tange a equipamentos e componentes, segundo Morales e Alejo (2004), “os conjuntos ou kits de reagentes possuem alto custo em moeda estrangeira no mercado internacional e só podem ser adquiridos por importação”; o gel-clot permaneceria como o mais simples, por exigir apenas vidrarias como tubos de ensaio para suporte do gel que irá aferir a validação do ensaio, enquanto os outros métodos, justamente por sua maior sensibilidade, tornam-se mais complexos e demandariam mais aparatos tecnológicos e profissionais treinados para equivaler a tal complexidade ebora tenham a vantagem de serem quantitativos. O método Turbidimétrico end-point tem como desvantagem, segundo Morales (2004) requerimento de um longo tempo de incubação, tendo a necessidade da leitura ser controlada com muito cuidado, uma vez que a reação não para e, portanto, o desenvolvimento de turbidez deve ser avaliado/monitorado continuamente e além disso as amostras só podem ser lidas apenas uma vez em um horário fixo. Hoje em dia é mais usado que o método Turbidimétrico Cinético, entretanto isso não exclui maior aparição do mesmo, que em comparação com sua época de lançamento, está mais presente, uma vez que outrora o desenvolvimento tecnológico limitava o aparato necessário para realização de tal teste, como fora citado por Fukumori (2008) anteriormente. No que tangem os métodos cromogênicos, possuem a vantagem de que seus substratos, em relação ao gel clot, diminuem o tempo do ensaio, eliminam a possibilidade de estruição acidental do gel durante a incubação ou leitura e permitem um rendimento maior por amostra. Sua maior desvantagem ,segundo Morales (2004), se assemelha com a dos métodos Turbidimétricos, exigindo maquinário para leitura relativamente caro, entretanto de uso variado para rotina laboratorial, e mão de obra devidamente qualificada, além do substrato cromogênico do kit sendo o componente mais caro e instável do conjunto ao todo. Vale ressaltar que as desvantagens encontradas para o método Método Colorimétrico de Proteína de Lowry, Método Nefelométrico e Eletroquímico é que o primeiro é a necessidade de acompanhamento, segundo Guimarães (2017), não necessário no gel-clot para assegurar não interferência e ausência de contaminação. No Nefelométrico, por mais que possa ser automatizado, não vem sido reconhecido como promissor para o campo, sendo considerado apenas como uma alternativa a mais para 37 execução de ensaios e quanto ao método Eletroquímico, possui a vantagem de não ser dependente de uma faixa de pH padronizada , entre 06-08 pH segundo Moreira (2019) e Fukumori (2008), entretanto, apesar de ser bastante sensível a endotoxinas e ter custo reduzido, sua falta de especificidade, no que tange natureza do ensaio, apresenta-se como empecilho questões para a detecção de endotoxinas em soluções desconhecidas, pois este é na verdade uma adaptação de uma metodologia para quantificar nitritos em águas de uso doméstico. Com o desenvolvimento da pesquisa, vários tipos de proteínas e substâncias sintéticas com afinidade por LPS foram adquiridos, promovendo a detecção de LPS por sensores eletroquímicos ou óticos. Porém, estes sensores podem se ligar a outros alvos além do LPS, quando a especificidade não é tão alta quanto o esperado, causando uma grande margem de erro no processo de detecção SILVA, 2017, p. 20) Lourenço, Kaneko e Pinto (2005) afirmam que para o método gel-clot há a possibilidade de se obter a estimativa da incerteza para o ensaio, prevendo com uma margem considerável a possibilidade de falsos positivos ou negativos a partir de um procedimento, estabelecendo uma fórmula que usa dados dos resultados obtidos durante a validação do teste para um determinado produto. Até o momento, não se sabe sobre possibilidade similar de aplicação de fórmulas matemáticas para calcular estimativa de erro em outros ensaios como turbidimétricos e cromogênicos, assim sendo, estudos mais aprofundados devem ser desenvolvidos para cobrirem os mesmos, a não ser que a complexidade efetiva destes e de seus equipamentos contorne tais chances ou torne tal possibilidade inviável. Agora quanto a aplicabilidade em si dos métodos e do LAL em relação ao RPT, este substrato apresenta limitações mais impactantes para seu futuro quanto sua reputação como um substituto in vitro para experimentações animais. O LAL tem vantagens sobre o RPT como a capacidade da identificação de substâncias que interferentes ao organismo dos animais, tais, citadas previamente, como radiofármacos e esteroides por exemplo. Este método também consegue detectar proteínas terapêuticas parenterais e imunobiológicas que o método RPT não conseguiria devido a baixa sensibilidade do organismo dos animais a tais moléculas, segundo Brum (2009). Contudo, como derivado do mesmo mecanismo de febre situado na endolinfa do caranguejo-ferradura, o lisado do amebócito do mesmo possui uma especificidade intrínseca com LPS, entretanto, apenas para com LPS/endotoxinas. Enquanto o teste de pirogenicidade em coelhos detecta o 38 pirogênio geral, o teste de LAL somente detecta as endotoxinas oriundas de bactérias gram negativas. Para alguns autores, como Brum (2009), isto pode ser observado como uma vantagem. Como as bactérias gram-negativas são capazes de se multiplicar em ambientes aquosos, pode-se esperar que elas e suas endotoxinas estejam presentes na maioria dos produtos, contaminando comumente as matérias-primas e equipamentos empregados na produção de injetáveis. (BRUM, p. 31, 2009) Entretanto, para outros, como Navega, et al (2015), isto representa uma limitação, pos produtos hemoderivados apresentam uma forte interferência com o teste LAL, sendo dessa forma, necessário o uso do RPT como teste indicado. Os LPS, juntamente de sua forma agregada não pura, correspondem grande parte da resposta pirogênica conhecida causada por contaminação de fármacos, e como a endotoxina é o pirogênio mais relevante para a área de CQ e também o mais encontrado nos lotes de produtos biológicos contaminados devido a sua alta resistência térmica e química, tal característica específica do lisado responder apenas a esta tornaria-se um ponto benéfico. Entretanto, segundo Guimarães (2017), sua incapacidade de detectar Pirogênios Não Endotoxina - Non-Endotoxin Pyrogens (NEP) e sim apenas endotoxinas livres, apesar de diminuir o uso de animais por ser um teste in vitro, significa uma notável preocupação para a identificação total de contaminantes, uma vez que pirogênios também possam ser derivados de componentes de Gram-positivas, micobactérias, fungos, vírus e até outras moléculas. Por mais que as bactérias gram-negativas sejam mais pirogênicas que as gram-positivas e apesar das endotoxinas serem caracterizados como os mais relevantes (como havia sido mencionado por Brum) em produtos injetáveis, de uso humano e veterinário, tal foco negligencia, segundo Silva (2017) os NEP, que apesar de serem encontrados em menor quantidade, ao passarem despercebidos acabam por representarem um problema na saúde pública. As bactérias Gram-positivas merecem atenção especial nos processos de fabricação de biotecnológicos, visto que várias etapas são geralmente contaminadas por espécies ambientais (Schindler et al., 2009). O significado clínico do pirogênio não-endotoxina é provavelmente subestimada, já que sua presença não é normalmente esperada, contribuindo para uma grave subnotificação que poderia ser antecipada com o adequado controle da qualidade. (NAVEGA, et al, 2015, p.77) 39 Outra limitação do LAL é que o ensaio só pode ser realizado com amostras líquidas, sendo para testes realizados com materiais sólidos, como dispositivos médicos, sendo realizados adaptações, que de certa forma demonstram as dificuldades de se avaliar endotoxina adsorvida a materiais, uma vez que para tais o teste é realizado sendo aplicado a apenas soluções de lavagem de tais sólidos. Não obstante, o LAL como substrato sensível exige condições específicas para seu funcionamento correto, tendo sua leitura sujeita a influência de interferências causadas por outras substâncias e até mesmo componentes de certos tipos de medicamentos ou processos de produção. Algumas formulações biofarmacêuticas são incompatíveis com o substrato LAL por motivos como os citados recentemente, tais medicamentos seriam aqueles que contém alto conteúdo proteico, agentes quelantes e certos íons metálicos por exemplo. Substâncias como água e soluções de diálise, componentes fúngicos glucanos e hidróxido de alumínio em vacinas já foram observados como geradores de resultados falso-positivos por autores como Lopes (2010). Outro problema, mencionado por Silva (2015), “reside na capacidade da endotoxina de se ligar às proteínas plasmáticas e não ser normalmente detectada no LAL”. Isto se deve pois o método com substrato LAL apenas identifica LPS livre, segundo Melandri, et al (2010) e a adesão do mesmo a determinadas proteínas plasmáticas acaba por mascarar a presença deste na leitura durante a execução do ensaio, sendo assim, ineficiente para detectar endotoxinas em produtos como soros hiperimunes, vacinas e hemoderivados conforme Lopes (2014). Silva ainda cita que é de difícil detecção quando LPS de baixo peso molecular não agregados a diferentes moléculas e também quando LPS biologicamente atravessam as membranas de diálise in vivo simuladas de testes in vitro em fluidos biológicos. Conforme Lopes (2014), também existem produtos que podem provocar a reação de gelificação da endotoxina pela indução da cascata de coagulação por serem de alto peso molecular, semelhante a endotoxinas, resultando em falsos resultados positivo. Navega (2016) cita que fármacos com ligações de cátions divalentes tais como o ácido etilenodiaminotetracético, citrato, inibidores da protease podem agir como inibidores e outros fármacos com elevado teor de proteínas, proteases agem como potencializadores. Para tais fármacos, Montaño, Alvarado e Burgos (2016) mencionam que o aquecimento seria ideal para a eliminação da interferência, pois resultaria na desnaturação das proteínas responsáveis pela potencialização sem a perda da endotoxina, uma vez que esta é termoresistente. 40 A questão da interferência na cascata de coagulação se estende para além de fármacos com alto teor de proteínas, como demonstrado por Dobrovolskaia, et al, (2010) e Moreira (2019), em que até mesmo nanomateriais podem influenciam em resultados errôneos nos ensaios envolvendo LAL. A nanotecnologia na indústria farmacêutica vem crescendo cada vez mais seja na participação de processos de produção ou como componentes de entrega ativa e direta em medicamentos. Moléculas derivadas dos processos de produção, segundo Moreira, como β-glucanos de filtros de celulose derivados de processos de produção ou de drogas compostas por glucanos foram capazes de ativar o fator G da cascata de coagulação, induzindo resultados falsopositivos. Além destes, nanotubos de carbono foram observadas resultando os mesmos resultados falsos positivos, porém de forma desconhecida. Dobrovolskaia confirmou que não só nanopartículas de ouro eram facilmente contaminadas (tal fenômeno devendo-se a natureza negativa dos LPS, que aderia-se a estas por possuírem carga positiva) , assim mascarando a presença de endotoxinas em ensaios de LAL mas também afirmou que a contaminação por endotoxinas em nanopartículas para formulações destinadas à terapia do câncer podem apresentar efeitos reversos e tornarem-se citotóxicos e, portanto, confundir os resultados dos estudos de eficácia de nanomateriais na área da saúde. Em seus estudos, foi-se comprovada tal efeito mascarador quando, em todos os ensaios contaminados, os ensaios envolvendo dendímetros PAMAM - Poliamidoamina Terminada em Carbono - em ensaios cromogênicos de cinéticos resultaram em falsos positivo em relação aos cromogênicos de ponto final e nos ensaios cromogênicos de ponto final cujo portavam partículas PMLA - Pré Farmacêutico e poli(ácido maleico) - apresentaram resultados falso positivos e nos cromogênico cinéticos, resultados positivos, havendo assim então, uma notável interferência para ser aprofundada sobre a natureza dos nanomateriais e a interação destes com o substrato e o comportamento destes em diferentes metodologias. 5.4 Sensibilidades do Substrato e Interferências O LAL demonstra-se até então, um substrato com especificidade de ativação voltado para endotoxinas, uma vez que é feito com base na substância dos amebócitos da hemolinfa do caranguejo Limulus. Entretanto, sérias questões são levantadas de acordo com a facilidade do ensaio de sofrer interferências que alteram consideravelmente os resultados das leituras. Segundo Moreira (2019), a endotoxina livre, conforme a 41 temperatura e tempo de exposição, perde sua atividade, porém, persiste presente em formulações biológicas e terapêuticas. Tal característica é conhecida como Low Endotoxin Recovery – do inglês, Baixa Recuperação de Endotoxin (LER) – e representa grande preocupação entre alguns especialistas pois a perda de atividade da endotoxina a torna suficientemente indetectável ao substrato de LAL, que acaba por apenas detectar o restante de endotoxina ativa, resultando assim num fenômeno em que certa quantidade d endotoxina passa despercebida pela leitura. Tal fenômeno pode incindir em endotoxinas contaminando formulações biomédicas em armazenamento, significando alguns riscos para a área da saúde e conservação de medicamentos. “A endotoxina é uma molécula grande com regiôes lipofílicas e hidrofílicas permitindo interação com outras moléculas de endotoxina e certas substâncias formando micelas. Com o aumento da agregação molecular, diminui a reatividade do LAL” (FUKUMORI, p. 32, 2008) Em concordância com Fukumori, Moreira ainda explicita a capacidade da molécula de LPS alterar seu estado de agregação com outras moléculas, formando agregados moleculares que mascaram a atividade biológica da endotoxina e impedindo o acesso do LAL a tal substância durante a leitura de um ensaio, dessa forma, possivelmente sendo uma dos fatores que colaboram para o LER, e não obstante, a adição de surfactantes, agentes quelantes e outras matrizes que possam converter o LPS em formas menos reativas poderiam ser um dos fatores contribuintes para esta série de eventos, sendo necessário então que sejam monitorados para não amenizar a presença de tais toxinas bacterianas em formulações. Tal efeito de LER também pode ser observado em nanomateriais, como os apresentados por Dobrovolskaia, et al (2010), criando um efeito de masking e resultando nos possíveis aparecimentos de falsos negativos Além de tal reatividade cruzada observada nos demais tópicos anteriores, ainda podemos ressaltar as interferências em potencial do ensaio causadas por alterações de fatores como o pH ótimo (06-08, pois abaixo ou acima de tal faixa a reatividade do LAL diminui), concentrações não adequadas de cátions divalentes, essenciais para a execução de ensaios cujo utilizam equipamentos eletrônicos, adsorção de endotoxinas, modificação da enzima ou proteína da cascata de coagulação, dentre outros. Os tubos de vidro devem ser de vidro borossilicato para não adsorverem a tão aderente endotoxina, monitorar a quantidade, que deve ser minimamente constante, de cátions divalentes e evitar o uso de anticoagulantes e quelantes orgânicos como heparina sódica, citrato, que ligam-se ao cálcio e inibem o teste de LAL são recomendações sugeridas por Fukumori (2008) para precaver possíveis interferências na execução de um ensaio. Esta também 42 menciona que, como a ativação da coagulação é de natureza enzimática, mais especificamente, envolvendo a participação de serina proteases, evitar usar substâncias oxidantes, antioxidantes, agentes proteolíticos e também inativantes específicos que degradariam tais enzimas ou até mesmo eluições de ativação periférica do LAL, como βglucanos. A sensibilidade do substrato também pode ser questionada, uma vez que é necessário maior sensibilidade que correlação entre equivalência de endotoxinas liberadas por diferentes bactérias: Quando comparada a potência de diferentes LPS no MAT, foi observado que o LPS de Pseudomonas aeruginosa foi 1000 vezes menos potente na indução da liberação de citocinas que o LPS de Escherichia coli ou Salmonella, porém no LAL os LPS se mostraram equipotentes. Isto significa que o conteúdo de pirogênios nas amostras testadas pode estar sendo dramaticamente superestimado ou subestimado (SILVA, 2017, p. 27) 5.5 O uso do Limulus na Indústria e os problemas éticos da experimentação animal Ainda vale ressaltar que, por mais que o teste in vitro do LAL substitua um número considerável de coelhos por ano – ainda sim, sendo cerca de 400 mil animais usados de acordo com Navega, et al (2015) - a fabricação de tal lisado se baseia na extração da hemolinfa do Limulus antes de tudo. Por mais que seja um método alternativo, sua presença na indústria tornou-se ainda maior que o do coelho no RPT e com isso tem sido alvo de críticas por associações e sociedades protetoras dos animais. Por mais que o uso de animais pertencentes a classes “inferiores” como invertebrados não protegidos pela legislação seja incentivada conforme implicado por Gon (2017), e que mesmo que os animais sejam devolvidos a natureza após a coleta de 20% de seu sangue, conforme Silva (2015), cerca de 30 mil animais morrem por ano, fato este que não deve ser ignorado porém é negligenciado devido a importância econômica do ser para a imunologia, o que somado a problemas como isca para pesca, perda de habitat e poluição do habitat natural, acaba por ameaçar, segundo Lopes (2014), consideravelmente a população natural de caranguejos. 5.6 Prós e Contras do Método de Ativação de Monócitos - MAT 43 É sabido então, conforme Moreira (2009), que os monócitos apresentam uma importante função na resposta imunitária por serem os responsáveis pelo reconhecimento dos patógenos e concomitantemente da fagocitose, com produção de pirogênios endógenos, como as prostaglandinas e citocinas pro-inflamatórias. Por usar um mecanismo semelhante ao da febre, o MAT, ao atestar positivo, não está limitado apenas a endotoxinas LPS como no substrato LAL e não obstante, ainda pode ultrapassar a limitação da leitura de LER associada ao LAL. Para Brum (2009), a característica de tais células de liberarem proporcionalmente tais citocinas vêm revolucionado o mercado pelo grande potencial de desenvolvimento de um teste de pirogênio quantitativo com grande aplicabilidade. Outra questão que coloca em discussão a utilização dos testes atualmente mais empregados na indústria farmacêutica (RPT e LAL) é a quantificação correta do conteúdo de LPS e NEP nas amostras testadas. Em contraste ao RPT, o MAT é quantitativo, inclui controles positivos e amplia o espectro de pirogênios detectáveis e produtos aplicáveis (Hartung 2015) e em contraste com o LAL, o MAT reflete a potência de LPS proveniente de diferentes espécies (SILVA, p.27, 2017) Não obstante, também possui a vantagem ser baseado no mesmo mecanismo biológico da resposta imune induzida por pirogênios em humanos, não havendo então a necessidade de comparações extrapoladas entre espécies, conforme Silva (2017). Tal aplicabilidade no geral pode ser resumida, conforme a literatura abordada, em ser abrangente ao ponto de poder detectar pirogênios em substâncias restritas aos testes de RPT e LAL, como a soroalbumina humana, produtos derivados do plasma - que podem interferir com método de LAL e é incompatível com RPT- água e soluções de diálise, componentes fúngicos glucanos, hidróxido de alumínio em vacinas, terapias celulares, dentre outras inúmeras formulações, além de ser promissoramente adequado para a identificação de pirogênios em novos campos como na avaliação do potencial inflamatório de bioaressóis no ar ambiente (SILVA, 2015). Diferentemente do LAL, que só pode ser aplicado a líquidos, a suspensão pode ser colocada em contato com qualquer material, incluindo dispositivos médicos (NAVEGA, 2016) Mesmo assim, o abrangente potencial de aplicação do MAT não está avaliado para substâncias que interagem diretamente com os monócitos, por exemplo, as IL-1, antagonistas do receptor de soluções não fisiológicas, agentes citotóxicos, as proteínas 44 recombinantes com atividade de citocina, tais como IFN-γ, como indicado por Navega, et al (2016), e outras substâncias, como produtos lipofílicos (incompatíveis com LAL), que são testados in vivo. Sobre o reconhecimento do método mundialmente, número de aplicações práticas registradas do Mat para produtos farmacêuticos e bio-industriais vem sendo consideravelmente um dos pontos negativos para maior aprovação desta metodologia sob os olhares dos principais órgãos regulamentadores. Como um volume de dados não suficientemente satisfatórios reportados até o momento, de acordo com Silva (2017), levase a acreditar que o nicho da aplicabilidade do MAT cubra todas as formulações de que o LAL ou RPT não se aplicariam, entretanto, “fatores inerentes à interferência com a matriz, como por exemplo a citotoxidade, ou substâncias indutoras de citocinas podem tornar o produto não susceptível para avaliação pelo MAT”. O MAT está limitado a fatores como o próprio substrato, que possui a desvantagem de que a sensibilidade dos monócitos recentemente isolados, segundo Brum (2009), pode variar de acordo com a resposta imunológica dos doadores, gerando então oscilações que põe em campo a confiabilidade ou dificuldade de se padronizar o método. Um dos maiores problemas atuais do MAT é justamente a dificuldade em padronizar o método, segundo Silva (2015), afirma que “fica evidente a necessidade de se demonstrar a aplicabilidade do MAT para qualquer produto que não foi objeto do estudo de validação” prévia por métodos padrão selecionados pelas principais farmacopéias. Até o momento, seu uso foi validado apenas para alguns medicamentos (NAVEGA, et al (2015), o que levou as farmacopéias a exigirem a validação da aplicabilidade do teste para produtos não contemplados no processo de validação, e portanto, priorizar classes de produtos mais urgentes, o que não colabora para o processo de validação do MAT para produtos já estabelecidos e altamente requisitados internacionalmente, conforme Silva (2015). Devido, então, à falta de informação sobre a plena aplicabilidade do MAT para vários medicamentos, principalmente em produtos biológicos, o RPT e por vezes o LAL ainda são amplamente utilizados e preconizados para a maioria destes produtos de uso parenteral. Silva (2017) menciona que A FDA reconheceu o método em 2009, todavia estabeleceu que este fosse usado apenas para a detecção de endotoxinas oficialmente. Um workshop patrocinado pela ECVAM - Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos ao Uso de Animais - comparou o MAT e sua sensibilidade na identificação de contaminações pirogênicas e concluiu o método como uma promissora metodologia para a necessidade do desenvolvimento de métodos que contornassem as limitações do teste 45 de pirogênio in vivo, mas ressaltou também a necessidade da validação adequada de qualquer novo método de qualquer forma (equivalência) em conformidade com a regulamentação aplicável (GON, 2017, p. 42). Observa-se, de certa forma, que tal ponto é na verdade um fator limitante para todos os métodos alternativos, visto que o fato de que os produtos farmacêuticos, especialmente drogas, são comercializados internacionalmente, há-se a predileção pelas principais organizações regulamentadoras dos métodos mais bem estabelecidos no mercado para a execução do Controle de Qualidade, sendo assim, conforme Silva (2017), apenas testes aceitos em todos os mercados podem ser empregados para a liberação de um lote. “Atualmente o MAT representa menos de 1% do mercado de testes de pirogênio. Isto ocorre porque a utilização de métodos alternativos com aceite internacional não é incentivada pelas agências reguladoras” (SILVA, 2017, p. 26). O ICCVAM - Comitê Organizador Interagências para Validação de Métodos Alternativos - considerou insuficiente o estudo de validação internacional, apontando limitações principais para o MAT, segundo Silva, et al (2018) e Navega (2016): 46 Quadro 4 - Considerações do ICCVAM para o método MAT Fonte: Adaptado de Gon (2017); Melandri, et al (2010); Silva et al (2015) e Navega (2016). Dessa forma, o órgão recomendou que embora nenhuma das cinco variantes do método pudesse ser validada como substituta ao RPT, esse método alternativo poderia ser utilizado para detectar endotoxinas (tal qual a FDA em 2009, como citado anteriormente). No que tange a natureza do substrato, muitos especialistas que defendem o MAT acreditam que problemas como a necessidade de se buscar doadores cada vez que se necessitasse realizar o ensaio, como apontado por Lopes (2014), pudessem ser contornados pelo processo de criopreservação, do qual não só permite uso imediato do sangue pós descongelamento sem a necessidade de etapas de lavagem quanto facilita o transporte e armazenagem. Porém estudos recentes, apresentados por Melandri, et al (2010) apontam que pode existir diferença significativa entre a utilização do sangue fresco 47 e o criopreservado em relação aos níveis de expressão do gene de TNF-α após estimulação com LPS. a diminuição da viabilidade celular devido à criopreservação e à depleção dos níveis de citocinas podem ser atribuidos à baixa expressão de TNF-α no sangue congelado. Os resultados sugerem fortemente que o sangue total fresco é a melhor escolha para estudos de estimulação in vitro na determinação de mediadores inflamatórios (CHEN, et al, 2010 apud MELANDRI, et al, 2010) Além disso, como indicado por Navega, et al (2015), as restrições práticas e regulatórias associadas entre uso de sangue fresco e monócitos da flebotomia, doadores hiporresponsivos ou hiperresponsivos e avaliação prévia de agentes infecciosos são fatores que não podem ser ignorados se tratando de experimentação com fluídos hemoderivados. 48 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS Entende-se então que as endotoxinas, o LPS mais precisamente, são pirogênios fisiopatológicos altamente relevantes para o Controle De Qualidade de produtos farmacêuticos, formulações terapêuticas e principalmente substâncias de administração parenteral, pois seu alto peso molecular, hidrofilia e hidrofobia molecular somados a alta resistência térmica e resiliência as fazem contaminantes constantes em várias etapas dos processos de produção da indústria, fazendo assim que o Lisado de Amebócito do Limulus seja um dos extratos animais mais importantes mundialmente. Sua especificidade reativa enzimática para detectar endotoxinas é um fator chave para manter a integridade da qualidade de remédios e de grande importância para não só a área da saúde mas também como para a questão da ética animal e da diminuição do uso de animais para experimentação por proporcionar a utilização de um método in vitro competente. Entretanto, não se pode deixar de negar que tal produto não esteja isento de imperfeições e polêmicas que o cercam juntamente com todos os benefícios que este traz consigo. Sabe-se que os pirogênios são altamente indesejados nas formulações médicas e a capacidade de não só detectá-los mas também como quantificar a carga toxicológica significa um grande avanço para não só a saúde como também a segurança do consumidor ou do paciente, uma vez que tais substâncias bacterianas trazem vários malefícios que podem até culminar em septicemia e até mesmo em óbito, sendo na maioria das vezes uma sobrecarga do sistema imune que acaba agindo de forma deletéria e auto-imune, portanto, é almejável a ausência de pirogênios principalmente para os medicamentos de inoculação mais invasiva, conforme os principais órgãos regulamentadores. Portanto, o controle de endotoxinas deve ser o mais eficaz possível preventivamente indo desde a água de formulação até o produto acabado, com utilização de materiais apirogênicos devendo ser prioridade nos processos de produção e garantia da ausência ou remoção destes no produto acabado pré comercialização/uso. Também pode-se observar, com o passar dos anos tanto o desenvolvimento quanto o refinamento de novas técnicas, metodologias e produtos que cercam o Lisado e experimentos laboratoriais, com diversificada gama de opções para algumas formulações e com metodologias variadas que possam adequar-se as necessidades ou objetivos de cada instituição, embora estas também possam trazer desvantagens como a complexidade em sua execução, custo de manutenção de equipamentos ou mão de obra qualificada e afins. Pode-se entender então que não existiria de certa forma uma 49 afirmação cabível para determinar qual método seria o melhor, e sim, os mais precisos quantitativamente – os sensíveis métodos turbidimétricos e colorimétricos – e o de maior versatilidade laboratorial, o clássico método de gel coágulo. No que tange ao antecessor do LAL, o método in vivo ainda apresenta-se indispensável para a indústria farmacológica, uma vez que por mais que o substrato LAL seja de alta relevância por sua sensibilidade, perde pontos em seu quesito especificidade para o método RPT, justamente porque o teste de pirogênio in vivo detecta o pirogênio total - pirogênios que não são endotoxinas - e, portanto, não detectáveis pelo método de LAL; demonstrando assim a notável improbabilidade de substituição completa do método in vivo apesar das questões éticas (ainda mais levando em conta que, por mais que as endotoxinas oriundas de bactérias gram negativas sem consistam em grande parte da resposta pirogênica, os NEPs também possuem considerável relevância para o Controle de Qualidade por também desencadearem reações imunológicas tão preocupantes quanto apesar do menor índice de contaminação. Vale ressaltar então que métodos alternativos in vitro validados e aceitos com propósito regulatório de substituir testes realizados in vivo ainda são considerados mais uma meta do que realidade, embora tais conceitos já estejam amplamente incorporados na filosofia de pesquisas por várias organizações não governamentais, agências regulamentadoras biomédicas e afins, consolidando os 3Rs como um conceito de unificação para mais oportunidades de obtenção de benefícios científicos, econômicos e humanitários, embora tais objetivos têm-se demonstrados desafiadores uma vez da grande necessidade da presença de testes in vivo que pode ser observada conforme o passar do tempo pelo o crescente número de animais presentes em experimentação ao redor do globo anualmente. Percebe-se também, que o Método de Ativação de Monócitos demonstra-se promissor e capaz de preencher algumas lacunas que os outros testes possuem ao serem incompatíveis com certas formulações medicinais. Todavia, apesar do grande esforço de inúmeros profissionais que cada vez mais utilizam do método para experimentar sua competência em produtos farmacológicos, ainda ressaltando sua qualidades como a não extrapolação interespecífica do mecanismo de resposta febril, de ser um método in vitro, qualitativo e quantitativo, fácil eliminação de interferências, ter maior faixa de identificação que o LAL, devido a fatores como a sua aplicação e atenção relativamente recente somado a um número não considerado suficiente para fornecer uma grande database de dados a respeito de todas as possíveis aplicações do MAT, este torna-se, aos olhos das 50 principais instituições reguladoras carente de testes que possam comprovar sua equivalência aos métodos já preconizados e mais bem avaliados no mercado (LAL e RPT), além da necessidade de desenvolvimento de variações do MAT como novas linhagens celulares mononucleares para expandir a gama de ensaios possíveis para o método, ficando evidente então a necessidade de se demonstrar a aplicabilidade do MAT para qualquer produto que não fora objeto de estudo de validação previamente, além de, claramente, passar por um processo comum a todos os métodos alternativos que é provar-se não só equivalente, sendo constantemente atualizado e refinado, mas também como em seus estágios primários de ter que ser pareado para ser validado com os outros métodos tradicionais, o que faz com que seja implausível a possibilidade de substituição da presença destes tais consolidados métodos mesmo com várias afirmações de apoiadores do método a respeito de sua confiabilidade. De qualquer forma, qualquer metodologia, in vivo ou in vitro necessita de uma validação formal para que comprovar sua apropriada funcionalidade, fazendo com que o desenvolvimento e disponibilização de métodos alternativos no mercado seja relativamente lento. A até que o uso do método MAT seja devidamente validado e reconhecido pelas principais farmacopéias, a única forma de seguir o preceito dos 3Rs para o método in vivo é reduzindo o uso de animais no teste através da reutilização de coelhos já submetidos à administração prévia desses produtos, mais especificamente, os que participaram de resultados negativos de algum ensaio. Para o método de LAL, permanece como o principal método do mercado e com probabilidades de ainda ser o ensaio majoritário por mais vários anos até que novas metodologias alternativas sejam refinadas e melhor desenvolvidas a fim de cobrirem suas limitações, como sua alta sensibilidade, porém restrita, sua instabilidade para com interferências e a incompatibilidade para com formulações orgânicas e biológicas. 51 52 REFERÊNCIAS BARTH, Thiago. Avaliação de pirogênios em produtos de uso veterinário pelos testes da hipertermia em coelhos e do lisado de amebócitos do Limulus. Ciência Rural, Rio Grande do Sul, Universidade Federal de Santa, n. 1, v. 37, p. 190-194, jan-fev, 2007. BRUM. Ricardo Cristiano de Souza. Padronização e Validação da técnica do Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Semi-Quantitativa e Quantitativa para o Biofármaco Alfainterferona 2b Humana Recombinante. 2009. 97 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos) - Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Rio de Janeiro. 2009. DOBROVOLSKAIA, Marina A; et al. Ambiguities in applying traditional Limulus Amebocyte Lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine, London, United Kingdom, vol. 5, n. 4, jun. 2010, p. 555–562. DOI: 10.2217/nnm.10.29. Disponível em: https://www.futuremedicine.com/doi/10.2217/nnm.10.29. Acesso em: 14 out. 2022. FINGOLA, Fernando Faria. Validação do Ensaio de Endotoxina Bacteriana (LAL) para o Soro Antibotrópico pelo Método Cromogênico Cinético. 2011. 78 f. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional e Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2011. ______________________. Proposta de Substituição deo Ensaio de Pirogênio (in vivo) pelo ensaio do LAL (Método Cromogênico Cinético – in vitro) no Controle de Qualidade dos Soros Anticrotálico, Antiescorpiônico, Antirrábico e Antitetânico. 2018. 117 f. Dissertação (Doutorado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018. FUKUMORI, Neuza Taeko Okasaki. Determinação de Endotoxina Bacteriana (Pirogênio) em Radiofármacos pelo Método de Formação de Gel. Validação. 2008. 77 f. Dissertação (Mestrado em Ciências – Tecnologia Nuclear – Aplicações) – Autarquia associada à Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. GON, Rafaela Küster. Aplicação de Métodos alternativos ao Uso de Animais no Desenvolvimento e Controle da Qualidade de Produtos Imunobiológicos no Brasil. 2017. 126 f. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional e Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017. GUIMARÃES, Dayane Santos. Controle de Endotoxina na indústria Farmacêutica – Análise dos Métodos In Vivo e In Vitro. 2017. 43 f. Dissertação (Especialização Lato Sensu em Tecnologias Industriais Farmacêuticas. - Instituto Nacional e Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017. LOPES, André Moreni. Remoção de Endotoxina Presente em Meio Fermentado contendo Biomoléculas Utilizando Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas. 2010. 147 f. Dissertação (Doutorado em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2010 53 LOPES, Izabela Gimenes. Avaliação do Teste de Ativação de Monócitos na Determinação da Contaminação Pirogênica com Ácido Lipoteicóico em Produtos Injetáveis. 2014. 76 f. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional e Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2014. LOURENÇO, Felipe Rebello; KANEKO, Telma Mary, PINTO, Terezinha de Jesus Andreoli. Estimativa da Incerteza em Ensaio de Detecção de Endotoxina Bacteriana pelo Método de Gelificação. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. n. 4, v. 41, p. 437-443, out/dez., 2005. MELANDRI, Vanessa Cristina Rezende; et al. Utilização de Métodos Alternativos na Determinação da Contaminação Pirogênica no Controle de Produtos Injetáveis Sujeitos à Vigilância Sanitária. Universitas: Ciências da Saúde, Brasília, v. 8, n. 2, p. 69-95, jul./dez. 2010. MORALES, Rolando Perdomo. Ensayo del Lisado de Amebocitos del Limulus (LAL). Revista Cubada de Farmacia, Ciudad de la Habana. v. 8, n. 1, jan/abr 2004. MORALES, Rolando Perdomo; ALEJO, Vivian Montero. Estandarización del Ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL): Método de Gelificación. Revista Cubada de Farmacia, Ciudad de la Habana, Cuba. v. 38, n. 1, jan/abr., 2004 MOREIRA, Bruno Filipe Brites Fernandes. Relatórios de Estágio e Monografia Intitulada “Limulus Amebocyte Lysate: As Suas Aplicações na Biomedicina. 2019. 68 f. Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, a Universidade de Coimbra, Portugal, 2019. MONTAÑO, Dolly E; ALVARADO, Moisés G; BURGOS, Maritza J. Q. Validación del Método de Formación de Coágulo para la Determinación de Endotoxinas Bacterianas en Inmunoglobulinas (IgG) Nacionales. Revista del Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel. Ciudad Universitaria, Caracas, Venezuela. v. 47, n. 1-2, 2016. NAVEGA, Elaine Cristina Azevedo; et al. Métodos Alternativos ao Uso de Animais para a Detecção de Pirogênio: Oportunidades e Desafios no Controle da Qualidade de Produtos Biológicos. Archives of Veterinary Science, Universidade federal do Paraná, n. 4, v. 20, p. 71-81, 2015. NAVEGA, Elaine Cristina Azevedo. Estudo da aplicabilidade do teste de ativação de monócitos na detecção de pirogênios na vacina contra febre amarela. 2016. 124 f. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional e Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2016. NOGUEIRA, Saulo de Tasso Borges. A Reutilização de Coelhos Submetidos ao teste de Pirogênio no Controle de Qualidade de Produtos Biológicos com Enfoque na Vacina Antimeningocócica AC. 2009. 31 f. Dissertação (Especialização em Controle da Qualidade de Produtos, Ambientes e Serviços Vinculados à Vigilância Sanitária) Instituto Nacional e Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2009. 54 SILVA, Cristiane Caldeira da. Avaliação da Contaminação Pirogênica em Soros Hiperimunes e Ambientes Sujeitos A vigilância Sanitária: Comparação dos Métodos in vitro e in vivo Aplicados ao Controle da Qualidade. 2015. 213 f. Dissertação (Doutorado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional de controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2015. SILVA, Vítor Fernandes. Padronização do Teste de Ativação de Monócitos para Detecção de Pirogênios in vitro em Substituição ao Teste in vivo: Verificação da Aplicabilidade do Ensaio à Vacina Meningocócica C Conjugada. 2017. 104 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos) - Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, 2017. SILVA, Cristiane Caldeira da; et al. Métodos alternativos para a detecção de pirogênios em produtos e ambientes sujeitos a Vigilância Sanitária: avanços e perspectivas no Brasil a partir do reconhecimento internacional do Teste de Ativação de Monócitos. Vigil Sanit Debate, Rio de Janeiro, "Rio de Janeiro, Brasil", v. 6, n. 1, p. 137–149, 2018. DOI: 10.22239/2317-269X.01082. Disponível em: https://visaemdebate.incqs.fiocruz.br/index.php/visaemdebate/article/view/1082. Acesso em: 14 out. 2022. SILVEIRA, Rosimar L; et al. Avaliação Comparativa de Testes de Pirogênios em Produtos Farmacêuticos. Brazilian Journal of Microbiology. Rio Grande do Sul, Departamento de Farmácia Industrial, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, n. 35, v. 1-2, p. 48-53, 2004. 55 Anexo A