STUDIA UNIVERSITATIS MOLDAVIAE Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2021, nr.1(141) CZU: 633.822:581.19 ACTIVITATEA BIOLOGICĂ A ULEIURILOR ESENŢIALE DIN FORMELE AUTOHTONE DE MENTHA SPICATA L. Elena PELEAH, Victor MELNIC, Nicolae CIOBANU*, Marina BEJINARI Universitatea de Stat din Moldova *Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu” Ecotipurile autohtone sălbatice de Mentha spicata L. au fost colectate din opt zone diferite şi a fost analizată compoziția uleiurilor esenţiale. Chemotipurile diferă în compoziţia componentelor uleiul esenţial şi în raportul cantitativ al componentelor. Chemotipurile de mentă au fost impărţite în funcţie de componenta principală – sintetizarea carvonei, linaloolului sau mentolei şi keto-oxizilor. Chemotipurile studiate au arătat o activitate bactericidă şi fungicidă semnificativă. Cuvinte-cheie: Mentha spicata L., componente din uleiuri esenţiale, ecotipuri, chemotipuri, activitate bactericidă şi fungicidă. BIOLOGICAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OILS OF LOCAL FORMS OF MENTHA SPICATA L. Mentha spicata L. collected from eight different regions of Moldova were analysed to determine essential oil constituents. Ecotypes of M. spicata L. did show quantitative and qualitative differences. Three mint chemotypes were found, depending on component composition – synthesising carvon, linalool or menthol and keto-oxides as the main components. The studied chemotypes showed significant bactericidal and fungicidal activity. Keywords: Mentha spicata L. components of the essential oils, ecotypes, chemotypes, bactericidal and fungicidal activity. Introducere Uleiurile eterice sunt cunoscute încă din timpuri străvechi. Ele s-au folosit la produse medicinale, la fumatul aromatizant. Majoritatea uleiurilor eterice se obţin din plantele tropicale şi subtropicale, doar o parte mică din acestea se cultivă în regiunea temperată. Plantele cu uleiuri esenţiale sunt o sursă bogată de compuşi biologic activi şi, prin urmare, extractele lor posedă activităti antimicrobiene [1, p.556; 2, p.76-84; 3, p.14402-14442; 4, p.64-69]. Drept obiect de studiu au servit opt forme de M. spicata L. colectate din flora spontană din Moldova. Toate formele de mentă posedă morfologia tipică a M. spicata L.: frunzele mici lanceolate verde-aprins fără nuanţe de antociani, pe margini dinţato-zâmţate. Inflorescenţele în verticilii dese, formând aglomerări de verticilii la capătul lăstărului; culoarea inflorescenţei variază de la violet-deschis până la violet-închis. Plantele studiate înfloresc în perioada cuprinsă între sfârşitul luni iunie şi începutul lunii august. Studiul include cercetări biologice, morfologice şi biochimice. Caracterizarea biochimică a uleiului eteric extras din ecotipuri de Mentha spicata L. A fost determinată cantitatea de ulei eteric acumulată în biomasă pe parcursul perioadei de vegetaţie şi compoziţia chimică a lui în plantele de M. spicata L. [5, p.60-63]. Uleiurile eterice obţinute din toate ecotipurile de M. spicata L. erau de culoare galbenă-deschis, lichide şi se deosebeau prin caracteristica organoleptică. Numeroase studii au arătat diferenţa în compoziţia uleiului esenţial din speciile de mentă care pot fi legate de ecotip, temperatură, fenophaze, genotip şi de condiţiile agronomice [3, p.14402-14424]. Ecotipurile autohtone de M. spicata L. au fost diverse în compoziţia componentelor uleiului esenţial, diferit semnicativ de cele descrise în literatură [6, p.192-202; 7, p.425-430; 8, p.721-728 ]. Pentru a testa activitatea antimicrobiană a uleiului esenţial de M. spicata L. s-au folosit chemotipuri care diferă în compoziţia componentelor uleiului esenţial, acestea fiind colectate din populaţiile naturale din aproprierea satelor Logăneşti, Slobozia şi Bahmut (Tab.1). Tabelul 1 Principalele caracterictici ale uleiurilor esenţiale de ecotipuri de M. spicata L. Denumirea Ponderea Componentul principal, % ecotipului de ulei, % monoterpeni linalool carvonă mentol piperiton-oxid piperitenon-oxid „Logăneşti” 1.1 10.3 62,5 „Slobozia” 1.92 3.2 10.0 14.8 53.6 „Bahmut” 2.02 9,6 80.3 116 Seria “{tiin\e reale [i ale naturii” Științe biologice ISSN 1814-3237 Determinarea activităţii antimicrobiene a uleiului extras din plantele genului Mentha La evaluarea activităţii antimicrobiene am recurs la metoda alveolelor [9, p.464]. Aceasta se efectuează pe mediu solid, în cutii Petri, pe care s-a însămânţat cultura bacteriană; apoi pe suprafaţa mediului formăm alveole cu diametrul standard de 10 mm, în care se introduce cantitatea de soluţie pe care dorim să o testăm, astfel că în jurul alveolelor se va realiza un gradient de concentraţie prin difuziunea locală a antibioticului. În imediata vecinătate a alveolei realizându-se o concentraţie mai mare de antibiotic care descreşte în urma îndepărtării de alveolă [10, p.152-154]. Datele experimentale au fost prelucrate cu determinarea mărimilor statistice medii. Cultivarea micromicetelor a fost efectuată în cutii Petri pe mediu mineral agarizat Chapek cu următoarea compoziţie (g /L): NaNO3 – 2,0; K2HPO4 –1,0; MgSO4 x 7H2O – 0,5; KCl – 0,5; FeSO4 x 7H2O – 0,01; glucoză – 20,0; apă distilată până la 1 L, pH 5,5 – 5,7. Cultivarea bacteriilor a fost efectuată în cutii Petri pe mediu agar nutrient – 28 g la 1 L apă distilată (pH 6,3 – 6,5). Interpretarea se face în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie, care au fost măsurate cu rigla incluzâd şi diametrul alveolei. Valorile citite în mm se compară conform gradaţiei Birgher [9, p.464], tulpinile bacteriene şi fungice apreciindu-se ca sensibile, intermediar sensibile şi rezistente la antibiotic. Diametrul zonelor de liză a celulelor în jurul alveolelor depinde de gradul sensibilităţii test-culturilor la antibiotice conform gradaţiei Birgher [9, p.464; 10, p.152-154]. Pentru testarea activităţii biologice a uleiului esenţial din plantele de mentă am recurs la un set de microorganisme fitopatogene: Bacterii: 1. Xanthomonas campestris (care produce bacterioza verzei); 2. Corynerbacterium michiganense (care produce cancerul bacterian la tomate); 3. Agrobacterium tumefaciens (care produce cancerul radicular la viţa-de-vie şi la pomii fructiferi); 4. Ervinia carotovora (care produce putregaiul moale bacterian). Micromicete: 5. Fusarium graminearum (care produc înroşirea şi sterilitatea spicelor de cereale); 6. Alternaria alternata (care produce deprimarea plantelor). În calitate de antibiotic am cercetat: 1. Uleiul extras din plantele de Mentha spicata L. (sat. Logăneşti) cu componentul principal linalool; 2. Uleiul extras din plantele de Mentha spicata L. (sat. Slobozia) cu componentul principal ceto-oxizi; 3. Uleiul extras din plantele de Mentha spicata L. (sat. Bahmut) cu componentul principal carvonă. 4. Uleiul extras din plantele soiului de mentă „USIGEN” cu componentul principal mentol. 5. Neomicina – antibiotic cu activitate puternică asupra bacteriilor gram-pozitiv şi gram- negativ. În calitate de martor a fost utilizată apa distilată. Descrierea experienţei Am testat 3 uleiuri eterice extrase din plantele de Mentha spicata L. chemotipuri autohtone şi soiul de mentă „USIGEN” cu diferite componete principale, şi anume: mentol, ceto-oxizi, carvonă şi linalool. Cultura tânără (18-20 zile) de bacterii fitopatogene (Xanthomonas campestris, Corynebacterium michiganense, Agrobacterium tumefaciens, Ervinia carotovora) a fost însămânţată pe mediu nutritiv lichifiat. Din eprubeta cu cultură a fost luată o cantitate de biomasă şi s-a făcut o suspensie cu o concentraţie apropiată de standard de turbiditate 10 (aproximativ 1 miliard de celule pe 1 mililitru de suspensie). Suspensia a fost adăugată în balonul de sticlă cu mediu nutritiv lichifiat şi răcorit până la temperatura de 37-40°C, după care se omogenează prin rotire şi se toarnă pe placa Petri. După solidificarea mediului agarizat se fac alveolele cu diametrul de 10 mm. Într-o cutie Petri s-au facut câte 6 alveole în care s-au plasat: 1 – martorul, apă distilată; 2  ulei eteric de mentă 100%. Cantitatea de substanţă introdusă într-o alveolă a constituit 0,1 ml. Experienţa a fost efectuată în 3 repetiţii. După introducerea soluţiilor, cutiile Petri au fost plasate în camera de refrigerare pentru 16-18 h pentru difuzia preparatului în mediu. După această perioadă de timp cutiile Petri au fost transferate în termostat la temperatura de 28°C. Zonele de inhibiţie a bacteriilor fitopatogene au fost măsurate după 24 de ore şi 192 de ore (aceste măsurări au permis evidenţierea efectului de durată) de incubare. 117 STUDIA UNIVERSITATIS MOLDAVIAE Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2021, nr.1(141) Sensibilitatea microorganismelor fitopatogene la uleiul esenţial extras din plantele de M. spicata L. peste 24 de ore de incubaţie Sensibilitatea, mm Ecotipul Ecotipul„ Ecotipul Soiul Tulpina „Logăneşti” Ervinia carotovora Xanthomonas campestris Corynebacterium michiganense Agrobacterium tumefasiens Fusarium graminearum Alternaria alternata i.c. – inhibiţie completă 15,6 ±0,5 17,0 ±1,0 19.0 ±0,0 15,3 ±0,5 i.c. i.c. „Slobozia” 28,2 ±3,1 32,1 ±0,7 34,5± 2,5 32,0 ±1,0 i.c i.c. „Bahmut” 15,0± 0,0. 16,0 ±0,0 17,1 ±1,6 16,0± 1,3 i.c. i.c. „USIGEN” 14,5 ±0,5 15,0± 0,2 16,8± 0,7 13,8± 0,7 i.c. i.c. Tabelul 2 Martorul 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Conform datelor din Tabelul 2, o activitate inhibitorie după 24 de ore de incubaţie a microorganismelor au prezentat toate uleiurile eterice extrase din plantele de mentă. Însă, cel mai puternic efect bactericid a prezentat uleiul extras de M. spicata L. (sat. Slobozia), urmat de uleiul din M. spicata L. (sat. Logăneşti şi sat. Bahmut); o activitate bactericidă mai puţin semnificativă a prezentat uleiul eteric din mentă „USIGEN”. Uleiul eteric extras din M. spicata L. ecotipul „Slobozia” a prezentat cea mai puternică activitate antimicrobiană faţă de toate culturile testate, diametrul zonelor de inhibiţie variind de la 28,2±3,1 mm până la 34,5±2,5 mm. Uleiul esenţial de M. longifola (L.) Huds, cu principalele componente oxizi de piperitone şi piperitenone are, de asemenea, un efect bactericid [2, p.76-84]. Cea mai rezistentă cultură la acest ulei a fost Ervinia carotovora, cea mai sensibilă la acest ulei eteric a fost cultura de Corynebacterium michiganense (34,5±2,5 mm). Acest ulei eteric a prezentat o activitate bactericidă la doar 24 h depăşind antibioticul de referinţă în medie cu 4-5 mm; deci, uleiul eteric poate fi folosit ca ingredient la fabricarea biopreparatelor de uz fitosanitar. O activitate bactericidă puternică a prezentat şi uleiul eteric extras din M. spicata L. chemotipul „Logăneşti”, cea mai rezistentă cultură la acest ulei fiind cultura de Ervinia carotovora (15,6±0,5 mm), rezistență a prezentat şi cultura de Agrobacterium tumefaciens (15,3±0,5 mm), iar cele sensibile fiind tulpina de Xanthomonas campestris (17,0±1,0 mm) şi de Corynebacterium michiganense (19,0±1,0 mm). Rezultate mai puţin semnificative au fost înregistrate la uleiurile extrase din plantele de M. spicata L. ecotipul „Bahmut” şi din soiul de mentă „USIGEN”, diametrul zonelor de inhibiţie variind în limite foarte mici – de la 13,8± 0,7 mm până la 17,1 ±1,6 mm. Datele examinării relevă faptul că toate extractele au prezentat activitate fungicidă puternică în masă asupra culturilor de microfungi Fusarium graminearum şi Alternaria alternata. Cultura în care a fost plasat martorul a prezentat o activitate vitală normală (Fig.1,2). Fig.1. Efectul fungicid produs de uleiurile eterice din M. spicata L. asupra micromicetelor Alternaria alternata. Uleiul extras din plantele de M. spicata L.: 1 – ecotipul „ Slobozia” cu componente principale oxizi de piperitonă şi piperitenonă; 2 – ecotipul „Bahmut” cu componentul principal carvonă; 3 – ecotipul „Logăneşti” cu componentul principal linalool; 4 – martor, apă distilată. 118 Seria “{tiin\e reale [i ale naturii” Științe biologice ISSN 1814-3237 Fig. 2. Efectul fungicid produs de uleiurile eterice din M. spicata L. asupra micromicetelor Fusarium graminearum: 1 – ecotipul „ Slobozia”, cu componente principale oxizi de piperitonă şi piperitenonă; 2 – ecotipul „Bahmut” cu componentul principal carvonă; 3 – ecotipul „Loganeşti” cu componentul principal linalool; 4 – martor, apă distilată. După 192 de ore de incubare a microorganismelor schimbări semnificative nu au fost înregistrate. Diametrul zonelor de inhibiţie s-a micşorat nesemnicativ – în medie cu 0,5-1,0 mm. Tabelul 3 Sensibilitatea microorganismelor fitopatogene la uleiul eteric de M. spicata L. peste 192 de ore de incubaţie Tulpina Sensibilitatea, mm Ecotipul Ecotipul Ecotipul Soiul Martorul „Logăneşti” „Slobozia” „Bahmut” „USIGEN” Ervinia carotovora 16,0± 1,59 27,00± 6,75 14,33± 0,92 12,00 ±0,00 0,0 Xanthomonas campestris 18,0± 3,18 32,00± 1,59 16,33± 0,92 20,33± 6,02 0,0 Corynebacterium michiganense 20,33± 0,92 34,00± 3,18 17,00± 0,00 12,67± 3,31 0,0 Agrobacterium tumefasiens 31,33 ±0,92 14,00± 1,59 13,67± 1,84 0,0 20,00 ±0,00 Fusarium graminearum i.c. i.c. i.c. i.c. 0,0 Alternaria alternata i.c. i.c. i.c. i.c. 0,0 i.c. – inhibiţie completă Mici excepţii au fost înregistrate la acţiunea uleiului extras din M. spicata L. (ecotipul „Logăneşti”), diametrul zonei de liză s-a extins cu 5 mm. La fel a fost înregistrată acţiunea de durată la uleiul eteric din soiul „USIGEN” asupra tulpinii de Xanthomonas campestris, diametrul zonei de liză s-a extins de la 15,0±0,2 mm până la 20,33± 6,02 mm. La micromicete nu a fost înregistrată nicio schimbare, activitatea vitală fiind inhibată totalmente. Conform datelor noastre, cea mai rezistentă cultură la uleiuri eterice a fost Erwinia carotovora, cele mai sensibile culturi fiind Corynebacterium michiganense şi Agrobacterium tumefaciens. Sensibilitate medie a prezentat tulpina de Xanthomonas campestris la toate uleiurile eterice de chemotipuri de M. spicata L. Deci, aceste uleiuri pot fi utilizate pe parcurs în cercetările de câmp pentru combaterea microorganismelor fitopatogene care atacă culturile agricole. Rezultatele prezentei investigaţii sugerează că cele mai multe dintre plantele studiate pot fi o bună sursă de agenţi antibacterieni, în special faţă de tulpini bacteriene fitopatologene, putând constitui alternative ale antibioticelor în tratamentul infecţiilor cu aceste tulpini. Concluzii 1. A fost stabilit că compoziţia chimică a uleiurilor eterice nu depinde de condiţiile pedoclimatice. Forme din diferite zone ecologice sintetizează uleiuri eterice cu o compoziţie chimică identică, şi invers: forme din aceeaşi zonă se deosebesc după setul de terpenoizi. 119 STUDIA UNIVERSITATIS MOLDAVIAE Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2021, nr.1(141) 2. Toate formele autohtone de Mentha spicata L. studiate posedă aspect morfologic tipic speciei Mentha spicata L., în timp ce după setul de terpenoizi pe care îi sintetizează au fost împărţite în 3 grupe: a) cu component principal linalool şi linalilacetat; b) cu carvonă şi derivaţii ei; c) cu mentol, menton şi ceto-oxizi (piperiton-oxid şi piperitenon-oxid). 3. Testarea activităţii biologice a uleiurilor eterice din plantele studiate Mentha spicata L. (colectate din sat. Logăneşti, Slobozia şi Bahmut) şi din soiul de mentă „USIGEN” a demonstrat că acestea prezintă activitate fungicidă şi bactericidă puternică. 4. Uleiul eteric extras din ecotipurile autohtone de M. spicata L. studiate poate fi folosit ca ingredient la fabricarea biopreparatelor de uz fitosanitar, cosmetic şi a produselor chimice de uz casnic. Referinţe: LAURENCE, M. Mint – the Genus Mentha. Medicinal and Aromatic Plants – industrial profiles. CRC Press Taylor and Fransis group, 2007. 556 p. 2. SHAROPOV, F.S., SULAIMONOVA, V.A., SETZER,W.N. Essential Oil Composition of Mentha longifolia from Wild Population Grouing in Tajicistan. In: J. of Medicinally Activ Plants, 2012, vol.1, no.2, p.76-84. 3. SNOUSSI, M., NOUMI, E., TRABELSI, N., FLAMINI, G., PAPETTI, A., DE FEO, V. Mentha spicata Essential oil: Chemical Composition, Antioxidant and Antibacterial Activities against Planktonic and Biofilm Cultures of Vibrio ssp. Strains. In: Molecules, 2015, vol.20, no.8, p.4402-14424. 4. BAYAN, Y., KUSEK. Chemical Composition and Antifungal and Antibacterial activiti of M. spicata L. Volatil Oil. In: Cien. Inv. Agr., 2018, vol.45, no.1, p.64-69. 5. PELEAH, E., MELNIC, V., DRAGALIN, I. Polichimismul intraspecific Mentha spicata L. In: Studia Universitatis Moldaviae. Seria Ştiinţe Reale şi ale Naturii, 2020, nr.6 (136), p.60-63. 6. KOKKINI, S., VOKOU, D. Mentha spicata (Lamiacea) Chemotypes Growing Wild in Greece. In: Economic Botany, 1989, no.43, p.192-202. 7. KOKKIMI, S., KARAUSOU, R., LANARIS, T. Essential oils of spearmint (carvon-rich) plants from the island of Creet (Greece). In: Biochem. Syst. Ecol., 1995, no.23, p.425-430. 8. TELCI, I., SAHBAZ, N., YILMAZ, G., TUGAY, M. Agronomical and chemical characterization of spearmint (M.spicata L.) originating in Turkey. In: Econom. Bit., 2004, no.58, p.721-728. 9. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (Под ред. Биргера М.О.), Москва, Медицина, 1982. 464 с. 10. ХАДЖИЕВА, З.Д., ТЕУНОВА, Е.А., КРАХМАЛЕВ, И.С. Изучение антимикробной активности лекарственных препаратов с фитоэкстрактом. В: Fundamental Research, 2010, no.11, p.152-154. 1. Notă: Lucrarea a fost efectuată în cadrul Proiectului instituţional 20.80009.8007.24 Studiul biologic şi fitochimic al plantelor medicinale cu acţiune antioxidantă, antimicrobienă şi hepatoprotectoare. Mulţumim personalului Institutului de Microbiologie şi Biotechnologie al Academiei de Ştiinţe a Moldovei pentru asistenţa metodologică în determinarea activităţii antimicrobiene a uleiurilor esenţiale. Date despre autori: Elena PELEAH, doctor în biologie, cercetător conferenţiar, Universitatea de Stat din Moldova. E-mail: elena.peleah@gmail.com ORCID: 0000-0001-7825-2273 Victor MELNIC, doctor în biologie, cercetător conferenţiar, Universitatea de Stat din Moldova. E-mail: victoras74@mail.ru ORCID: 0000-0002-9625-1693 Nicolae CIOBANU, doctor în ştiinţe farmaceutice, conferenţiar universitar, Universitatea de Stat de Medicină și Farmacie „Nicolae Testemiţanu”. E-mail: nicolae.ciobanu@usmf.md ORCID: 0000-0002-2774-6668 Marina BEJINARI, licenţiat în masterat, Universitatea de Stat din Moldova. E-mail: marina.bejinari@gmail.com ORCID: 0000-0002-0566-7299 Prezentat la 07.04.2021 120