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WO2021177397A1 - Ｌ－エルゴチオネイン含有組成物 - Google Patents

Ｌ－エルゴチオネイン含有組成物 Download PDF

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WO2021177397A1
WO2021177397A1 PCT/JP2021/008388 JP2021008388W WO2021177397A1 WO 2021177397 A1 WO2021177397 A1 WO 2021177397A1 JP 2021008388 W JP2021008388 W JP 2021008388W WO 2021177397 A1 WO2021177397 A1 WO 2021177397A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
egt
dth
composition
mass
content
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/008388
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
豪 仲谷
菜々実 仲島
Original Assignee
長瀬産業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 長瀬産業株式会社 filed Critical 長瀬産業株式会社
Priority to US17/905,626 priority Critical patent/US12357614B2/en
Priority to CA3170408A priority patent/CA3170408A1/en
Priority to CN202180018596.6A priority patent/CN115209895A/zh
Priority to BR112022017415-2A priority patent/BR112022017415B1/pt
Priority to EP21764176.0A priority patent/EP4115881A4/en
Priority to JP2022504452A priority patent/JPWO2021177397A1/ja
Priority to KR1020227033764A priority patent/KR20220149718A/ko
Publication of WO2021177397A1 publication Critical patent/WO2021177397A1/ja

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    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52—Stabilizers
    • A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing L-ergothioneine (EGT). More specifically, the present invention relates to a composition having enhanced stability of L-ergothioneine (EGT) in the presence of N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine (DTH), and a method for producing the same.
  • ETT L-ergothioneine
  • L-ergothioneine (sometimes referred to as "EGT" in this specification) is a kind of sulfur-containing amino acid, and is known to have various physiological activities including antioxidant ability.
  • Non-Patent Document 1 describes that EGT has an action of improving the effect of immunotherapy with a cancer vaccine consisting of a tumor-related antigen (TAA) and an adjuvant.
  • Patent Document 1 describes that EGT has an action of treating a bacterial infection.
  • TAA tumor-related antigen
  • Patent Document 1 it was confirmed that 5 mM and 50 mM EGT suppressed the growth of Escherichia coli. Therefore, in the suppression of bacterial infection described in Patent Document 1, EGT directly suppresses the growth of bacteria. It can be understood that it is due to suppression.
  • Non-Patent Document 2 production of cytokines (IL-6, IL-12p40, IL-1 ⁇ , IL-10) by mouse bone marrow-derived macrophages under stimulation conditions with tall-like receptor ligands is promoted by 10 mM EGT. It is not promoted by 1 mM EGT, and Th17 polarization of OT-II CD4 + T cells is promoted by 30 mM EGT in co-culture of F4 / 80 macrophages and OT-II CD4 + T cells. Have been described. As described above, Non-Patent Document 2 describes that a high concentration of EGT of 10 mM or more activates macrophages.
  • Non-Patent Document 3 is a review article on the physiological activity of EGT.
  • Non-Patent Document 3 describes that EGT is absorbed and accumulated in the bodies of animals and plants.
  • the present invention provides the compositions listed below.
  • composition containing L-ergothioneine and N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine A composition in which the content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine is reduced.
  • the content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine is 0.0001 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of the L-ergothioneine.
  • the content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine is 0.05 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of the L-ergothioneine.
  • a composition containing L-ergothioneine and N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine The content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine is 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the L-ergothioneine.
  • a composition for suppressing coloring of the composition is 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the L-ergothioneine.
  • the present invention also relates to the following manufacturing methods.
  • a method for producing a composition containing L-ergothioneine and N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine and suppressing coloration comprising a step of reducing the content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine.
  • the present invention also relates to the methods listed below.
  • a composition containing L-ergothioneine and N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine By setting the content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine to 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the L-ergothioneine.
  • a method for imparting a coloring suppressing effect to the composition By setting the content of the N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine to 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the L-ergothioneine.
  • DTH was found as a component that affects the stability of EGT, in the composition in which EGT and DTH coexist, the content of DTH is reduced to improve the stability of the formulation, and the composition. It is possible to suppress coloring.
  • FIG. 1 is a graph showing the stability evaluation results of the composition containing EGT and DTH in Test Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a color suppression test of a composition containing EGT and DTH in Test Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a color suppression test of a composition containing EGT and DTH in Test Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a DTH reduction test in the EGT fermentation method in Test Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a DTH reduction test in the EGT fermentation method in Test Example 3.
  • composition of the present invention contains L-ergothioneine (EGT) and N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine (DTH), and the content of DTH is reduced.
  • ETT L-ergothioneine
  • DTH N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine
  • EGT is a histidine derivative (N, N, N-trimethyl-L-2-thiohistidine), and its structure is represented by the following formula (1).
  • EGT can be obtained by a known method such as a synthetic method, an extraction method, a fermentation method, or a commercially available product can be obtained and used.
  • EGT products examples include L-ergothioneine (manufactured by Tetraedron).
  • DTH N-dimethyl-L-2-thiohistidine
  • DTH can be obtained by a known method such as a synthetic method, an extraction method, a fermentation method, or a commercially available product can be obtained and used.
  • DTH products examples include N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine (manufactured by Tetraedron) and the like.
  • EGT and / or DTH may be in the form of a free form or in the form of a salt.
  • the salt of EGT and / or DTH may be a salt formed of a carboxyl group in these structures, or may be a salt formed of a trimethylamino group or a dimethylamino group.
  • the L-ergothioneine or the L-ergothioneine analog may be a solvate such as a hydrate.
  • the EGT and / or DTH salt is not particularly limited as long as it is a pharmacologically or physiologically acceptable salt, but specifically, an organic acid salt, an inorganic acid salt, a salt with an organic base, etc. Alternatively, a salt with an inorganic base can be mentioned.
  • the organic acid salt include monocarboxylic acid salts such as acetate, trifluoroacetate, butyrate, palmitate, and stearate; fumarate, maleate, succinate, malonate, and the like.
  • Polyvalent carboxylates such as lactates, tartrates and citrates; organic sulfonates such as methanesulfonates, toluenesulfonates and tosylates are exemplified.
  • examples of the inorganic acid salt include hydrochloride, sulfate, nitrate, hydrobromide, and phosphate.
  • Examples of the salt with an organic base include salts with organic amines such as methylamine, triethylamine, triethanolamine, diethanolamine, morpholine, piperazine, pyrrolidine, and ethylenediamine.
  • the salt with an inorganic base examples include various salts such as an alkali metal such as sodium or potassium, an alkaline earth metal such as calcium or magnesium, and a salt with a metal such as aluminum.
  • EGT and / or DTH salts may be used alone or in any combination of two or more.
  • the "pharmaceutically or physiologically acceptable salt” may include a solvate or hydrate of the salt.
  • the present inventors have said that in the composition containing EGT, when DTH coexists, the EGT becomes unstable, and the composition containing the EGT is colored accordingly.
  • the present inventors have found that in a composition containing EGT and DTH, by reducing the content of DTH, the stability of EGT can be enhanced and the coloring of the composition can be suppressed.
  • the mode in which DTH coexists in the composition containing EGT is not particularly limited, and for example, DTH may be added to the composition containing EGT, and impurities in the extraction method, a synthetic method, a fermentation method, etc. It may be contained endogenously due to a by-product or the like in.
  • the fact that coloring is suppressed means that the absorbance at 400 nm is obtained by reducing the DTH content under the same pH conditions with respect to the composition containing EGT and DTH in equal amounts.
  • the reduction in absorbance at 400 nm can be determined using a known spectrophotometer.
  • the reduction of the absorbance at 400 nm is preferably at least 5% reduction rate, more preferably at least 10% reduction rate, for example, with respect to the composition containing equal amounts of EGT and DTH.
  • the content ratio of EGT and DTH is such that the content of DTH is 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of EGT from the viewpoint of suppressing coloration of the composition and the stability of EGT. It is preferably 40 parts by mass or less, more preferably 30 parts by mass or less, particularly preferably 20 parts by mass or less, and most preferably 10 parts by mass or less.
  • the content ratio of EGT and DTH is such that the content of DTH is 0.0001 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of EGT from the viewpoint of production efficiency of the composition. It is preferably 0.001 part by mass or more, more preferably 0.005 part by mass or more, particularly preferably 0.01 part by mass or more, and 0.05 part by mass or more. Is the most preferable.
  • the content ratio of EGT and DTH is based on 100 parts by mass of EGT from the viewpoint of suppressing coloration of the composition, the stability of EGT, the production efficiency of the composition and the like.
  • the content of DTH is preferably 0.0001 to 50 parts by mass, more preferably 0.001 to 40 parts by mass, further preferably 0.005 to 30 parts by mass, and 0. It is particularly preferably 01 to 20 parts by mass, and most preferably 0.05 to 10 parts by mass.
  • the content of EGT is appropriately adjusted and limited depending on the form and use of the preparation, the type and content of other components, and the like, but is not limited, for example, with respect to the total amount of the composition. It can be 0.000001 mass% or more, 0.000005 mass% or more, 0.00001 mass% or more, 0.00005 mass% or more, 0.0001 mass% or more, 0.0005 mass% or more, 0.001. Mass% or more can be mentioned. Further, the content of EGT can be, for example, 99.999% by mass or less, 99.9% by mass or less, 99.5% by mass or less, 99% by mass or less, 98. Examples thereof include 5% by mass or less and 98% by mass or less.
  • the EGT content when prepared as a liquid formulation, can be, for example, 80% by weight or less, 70% by weight or less, 60% or less, based on the total amount of the composition, without limitation. Examples thereof include mass% or less, 50% by mass or less, 40% by mass or less, 30% by mass or less, 20% by mass or less, 10% by mass or less, 5% by mass or less, and 1% by mass or less.
  • EGT is known to have various physiological activities including antioxidant ability. Even in a composition containing EGT and DTH, by using the present invention, the stability of EGT can be enhanced and its decomposition can be suppressed, so that the composition can be exhibited without impairing the bioactivity inherent in EGT. It becomes.
  • the physiological activities inherent in EGT such as for antioxidant, for improving brain function, for anti-aging, for eye diseases, for whitening, and for absorbing ultraviolet rays, are used.
  • For suppressing melanin production for eliminating active oxygen species, for inhibiting elastase activity, for suppressing wrinkle formation, for suppressing skin sagging, for suppressing skin stain formation, for suppressing bears around the eyes, reducing skin damage caused by ultraviolet rays ( It can be suitably used for (suppression of photoaging), for dry skin, for sensitive skin, for improving hair, for promoting autophagy, and the like.
  • composition of the present invention can further appropriately contain active ingredients and additives that can be used in foods and drinks, foods with functional claims, foods for specified health use, quasi-drugs, pharmaceuticals, cosmetics, daily necessities, feeds and the like.
  • active ingredients and additives that can be used in foods and drinks, foods with functional claims, foods for specified health use, quasi-drugs, pharmaceuticals, cosmetics, daily necessities, feeds and the like.
  • it can be appropriately formulated by a known formulation method used for the product.
  • Cosmetics and daily necessities include, for example, lotion, milky lotion, gel, serum, cream, sunscreen cream, facial mask, mask, foundation, whitewash, bathing agent, body lotion, shampoo, conditioner, hair treatment, hair conditioner, hair styling product. , Hair tonic, toothpaste, mouthwash, etc. can be formulated.
  • compositions of the present invention are, for example, solid formulations such as tablets, capsules, granules and powders; or liquids, syrups, injections, creams, lotions, pastes, ointments and emulsions (oil-in-water emulsions, water in oil). It can also be administered orally or parenterally (including external use) as a liquid formulation such as type emulsion, multiple emulsion, microemulsion, PET-emulsion, pickering emulsion), gel (hydrogel, alcohol gel), suspension, etc. can.
  • Excipients lubricants, binders, disintegrants for solid formulations; solvents, solubilizers, emulsifiers, emulsion stabilizers, thickeners, moisturizers, suspending agents, isotonic for liquid formulations.
  • Agents, buffers, soothing agents and the like can be used. If necessary, additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, and flavors can also be used.
  • Excipients include, for example, sugar alcohols such as sorbitol, mannitol and xylitol, sugars such as glucose, sucrose, lactose and fructose, crystalline cellulose, sodium carmellose, sodium croscarmellose, calcium hydrogen phosphate, wheat starch and rice.
  • sugar alcohols such as sorbitol, mannitol and xylitol
  • sugars such as glucose, sucrose, lactose and fructose
  • crystalline cellulose sodium carmellose, sodium croscarmellose, calcium hydrogen phosphate
  • wheat starch and rice examples include starch, corn starch, potato starch, dextrin, ⁇ -cyclodextrin, light anhydrous silicic acid, titanium oxide, magnesium aluminometasilicate, talc, kaolin, olive oil and the like.
  • binder examples include cellulose derivatives such as methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and hydroxypropyl methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, acrylate-based polymers, gelatin, gum arabic, purulan, pregelatinized starch, canten, tragant, and the like.
  • cellulose derivatives such as methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and hydroxypropyl methyl cellulose
  • polyvinylpyrrolidone polyvinyl alcohol
  • acrylate-based polymers examples include sodium alginate and propylene glycol alginate.
  • disintegrant examples include starch, low-degree-of-substitution hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, hydroxypropyl starch, and partially pregelatinized starch.
  • solvent examples include water, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • lubricant examples include stearic acid, magnesium stearate, calcium stearate, polyoxyl stearate, cetanol, talc, hydrogenated oil, sucrose fatty acid ester, dimethylpolysiloxane, beeswax, and salashimitsuro.
  • solubilizing agent examples include polyethylene glycol, propylene glycol, mannitol, benzyl benzoate, ethanol, tris (hydroxymethyl) aminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • suspending agent / emulsifier examples include surfactants such as stearylamine, triethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glycerin monostearate; for example, polyvinyl alcohol.
  • surfactants such as stearylamine, triethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glycerin monostearate; for example, polyvinyl alcohol.
  • Polypolypyrrolidone sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and other hydrophilic polymers; for example, shelac wax, beeswax, carnauba wax, whale wax, lanolin, liquid lanolin, reduced lanolin, hard lanolin, cyclic lanolin. , Lanolin wax, candelilla wax, mokurou, montan wax, rice wax and other waxes.
  • tonicity agent examples include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • the buffer examples include a buffer solution such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidant examples include sulfites, ascorbic acid and the like.
  • a production method known in the art can be used. For example, a method of crushing and sizing an extruded granule that is molded by kneading a composition and passing it through a screen, adding kneading water to the composition, and stirring granulation that is molded by a vertical granulator. After that, there is a method of crushing and sieving using a combil. Further, a method in which the pharmaceutical composition is compressed with a roller compactor, then pulverized with a roll granulator and sieved is mentioned. Further, a method of drying the fluidized bed after stirring and granulating can be mentioned. Further, for example, in the case of producing by direct striking, the composition may be mixed and then directly put into a locking machine to lock.
  • the composition of the present invention can also be used as a food and drink composition, and can be provided by being contained in a food or a functional food.
  • Such foods or functional foods include rice; various noodles including buckwheat, udon, harusame, Chinese noodles, instant noodles, cup noodles; soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, lactic acid drinks, sports drinks.
  • Beverages such as: Curry roux, stew, various soups; Cold confectionery such as ice cream, ice sherbet, shaved ice; Candy, cookies, candy, gum, chocolate, tablet confectionery, snack confectionery, biscuits, jelly, jam, cream, and other baked confectionery Confectionery such as; marine and livestock processed foods such as kamaboko, hampen, ham, sausage; dairy products such as processed milk and fermented milk; Processed foods; seasonings such as sauces, dressings, miso, soy sauce, sauces; soups, stews, salads, prepared foods, sprinkles, pickles; other various forms of health / nutritional supplements / functional foods / foods for specified health use, etc. Is illustrated.
  • supplements powder, granule, soft capsule, hard capsule, tablet, chewable tablet, quick-disintegrating tablet, syrup, liquid preparation, etc.
  • composition of the present invention may be prepared.
  • composition of the present invention can be contained in food for animals such as pets.
  • Additives are added to food and drink as needed.
  • Such additives include, for example, glucose, fructose, sucrose, maltose, sorbitol, trehalose, stebioside, rubusoside, corn syrup, lactose, mannitol, dextrin, citric acid, sodium citrate, tartrate, malic acid, succinic acid, etc.
  • the composition of the present invention can be used for foods and drinks for which labeling such as improvement / prevention / improvement of various symptoms and conditions is permitted.
  • the foods and drinks for which labeling of improvement, prevention, improvement, etc. of symptoms and conditions is permitted are foods and drinks having the effects permitted and designated by the national government and public organizations, for example.
  • the blending amount of the composition of the present invention is not particularly limited, and the purpose of application (target disease, type of symptom, etc.), target site, gender and age of the applicator, foods and drinks, foods with functional claims, etc. , Foods for specified health use, quasi-drugs, pharmaceuticals, cosmetics, daily necessities, feeds, etc., and their administration or ingestion methods, frequency, preferences, etc. are appropriately set.
  • the effective amount capable of exerting the physiological activity originally possessed by EGT can be set as the daily intake (applied amount).
  • the daily intake (applied amount) of EGT is, for example, 0.005 to 4,000 mg, preferably 0.1 to 3,000 mg, and more preferably 0. It can be used in an amount of 5. to 2,000 mg, more preferably 1 to 1,000 mg, particularly preferably 2 to 500 mg, and most preferably 3 to 300 mg.
  • composition of the present invention when used as a food or drink, it is not limited, but from the viewpoint of being able to display the physiological activity inherent in EGT, it is preferable to use a functional food, and among the functional foods, the functional food is labeled.
  • the functional food is labeled.
  • Foods, nutritionally functional foods, nutritional supplements, and foods for specified health use can be mentioned, but functionally labeled foods are preferable because their uses can be clearly labeled.
  • composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an age group that requires the physiological activity inherent in EGT, but is around 30 years old or older, which is an age group that is susceptible to stress from the living environment such as work. It may be a middle-aged person (around 45 years old or older and less than 55 years old) who is likely to feel a physical change due to a change in hormone balance or a change in living environment, or an elderly person (55 years old). Above).
  • the pH of the composition of the present invention is appropriately set according to the type and content of other compounding ingredients, the form of the preparation, the method of use, etc., and is not limited as long as it is within a pharmaceutically or physiologically acceptable range, but for example,
  • the pH can be 2 to 10.
  • the pH of the composition of the present invention is, for example, pH 2 to 10, pH 2 to 9, pH 2 to 8, pH 2 to 7, pH 3 to 10, pH 3 to 9, pH 3 to. 8, pH 3-7, pH 4-10, pH 4-9, pH 4-8, pH 4-7, pH 5-10, pH 5-9, pH 5-8, pH 5-7, pH 6-10, pH 6-9, pH 6-8,
  • the pH can be 6 to 7 or the like.
  • the method for producing a composition containing EGT and DTH and suppressing coloring includes a step of reducing the content of DTH.
  • the step of reducing the DTH content can be used by any known means as long as the DTH content is reduced.
  • a step of reducing the content ratio of DTH to EGT can be adopted.
  • the mode in which DTH coexists in the composition containing EGT is not particularly limited. It may be an aspect that exists as.
  • EGT electrospray
  • a method for producing EGT by a fermentation method a method using Escherichia coli or the like is known according to International Publication No. 2019/1673767 and the like.
  • the DTH is reduced in the contaminants in the EGT fermentation method, for example, the methods described in Examples described later can be mentioned.
  • DTH in the culture solution is reduced and EGT is reduced by adopting a step of deleting the metJ gene of a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae having EGT-producing ability. It is possible to produce efficiently.
  • a known method can be used, and examples thereof include a method of knocking out or knocking down the metJ gene by homologous recombination, mutation treatment, genome editing, or the like.
  • Bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae capable of producing EGT include bacteria of the genus Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, and Salmonella. However, it is not limited to these.
  • Particularly preferable intestinal bacteria include intestinal bacteria such as Escherichia coli and the like, and Pantoea such as Pantoea ananatis.
  • Bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae can be cultivated by a usual method. Specifically, LB medium, 2 ⁇ YT medium, NZY medium, M9 medium, SOC medium, YPD medium and the like can be used. EGT and DTH can be produced using the above-mentioned medium, but the medium used is not limited thereto. In addition, the produced EGT and DTH may be accumulated inside the cells, or may be secreted and accumulated outside the cells (in the culture medium).
  • EGT and DTH released from the cells or from the cells can be performed by a known method.
  • the culture can be subjected to solid-liquid separation such as centrifugation or filtration, and EGT and DTH extracts can be obtained from the cells by solvent extraction, hot water extraction, crushing treatment, or the like.
  • EGT can be obtained by subjecting it to known coutomography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • the preferable content ratio of EGT and DTH is the same as above.
  • the above manufacturing method can further include a step of adjusting the pH.
  • the optimum pH value range is the same as above.
  • composition containing EGT and DTH [Method for imparting a color-suppressing effect to a composition containing EGT and DTH]
  • the composition containing EGT and DTH It is also possible to provide a method for imparting a coloring suppressing effect to the composition by setting the content of the DTH to 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the EGT.
  • the preferable content ratios of EGT and DTH are as described above.
  • EGT manufactured by Tetraedron
  • DTH manufactured by Tetraedron
  • pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 so that the final concentrations of EGT and DTH and pH are as shown in Table 1. It was dissolved in Britton-Robinson Buffer (final concentration 30 mM), and 3.0 ml of a mixed solution of DTH and EGT having different pH and concentration was prepared.
  • the Britton-Robinson Buffer which is a wide-area buffer used for adjusting the pH, was prepared as follows. Take 20 ml of a mixed solution of boric acid + phosphoric acid + acetic acid (final concentration 200 mM each), adjust the pH to 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 with 1N NaOH, and then use water. By messing up to 40 ml, a 300 mM (100 mM each) Britton-Robinson Buffer with a pH of 3 to 10 was obtained.
  • EGT and DTH mixed solutions shown in Table 1 were prepared by dissolving EGT and DTH using 300 mM Britton-Robinson buffer and water at each pH so that the final concentration of Britton-Robinson Buffer was 30 mM.
  • the EGT and DTH mixed solutions shown in Table 1 were transferred to two tubes of 1.0 ml each for each sample number, and allowed to stand at 30 ° C. or 70 ° C. for 21 days, respectively. Immediately after the start (day 0), on the 8th, 14th, and 21st days, the color change of the solution was recorded by taking pictures of the tube, and 100 ⁇ l of each sample was further sampled, as shown in Table 2. Under the conditions, it was subjected to the quantification of EGT and DTH using high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). FIG. 1 is a photograph of the solution taken on day 14.
  • Test Example 2 Evaluation of Color Suppression in Composition Containing EGT and DTH 1
  • a new problem was found that the mixed solution of EGT and DTH was colored. Therefore, the degree of this discoloration was quantified by absorbance measurement, and at the same time, the concentrations of EGT and DTH were examined in various ways. , I searched for a method of suppressing coloring.
  • FIG. 2 shows the results of the color suppression evaluation test using the samples in Table 3.
  • the absorbance (A400 value) at 400 nm which indicates the degree of coloring, increased with the passage of time in all pH groups, and the EGT and DTH mixture confirmed in Example 1 was observed.
  • the coloration of the solution could also be confirmed from the absorbance.
  • the A400 value was decreased by decreasing the DTH concentration in all pH groups.
  • coloring over time is remarkably suppressed by setting the content ratio of DTH to 20 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of EGT. From the quantitative results of EGT of each sample, it was also shown that the decomposition of EGT can be suppressed by lowering the DTH concentration as well as coloring.
  • the Escherichia coli ⁇ metJ strain can also be prepared according to the following method, for example. It was constructed by a conventionally known method of deleting each gene region of Escherichia coli BW25113 strain by a homologous recombination method using a counterselection vector (including sacB gene and drug resistance gene) containing the upstream and downstream sequences of the metJ gene.
  • the above-mentioned disruption stock construction is carried out by M. S. Donnenberg and J. S. Kaper, Infect. Immun., 1991, 4310-4317, H. Mizoguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71 (12) ), 2905-2911, etc. can be referred to.
  • pACG-EGT (Prior Art: International Publication No. 2019/1633767) was used. Using the BW25113 strain and the ⁇ metJ strain, transformation was performed using pACG-EGT to obtain EGT-producing strains (BW25113 / pACG-EGT, ⁇ metJ / pACG-EGT).
  • a fermentation production test of EGT was carried out using the EGT production strain ⁇ metJ / pACG-EGT constructed above.
  • BW25113 / pACG-EGT obtained by introducing pACG-EGT into the BW25113 strain was used as a control strain.
  • BW25113 / pACG-EGT, ⁇ metJ / pACG-EGT, each glycerol stock is added to a test tube containing tetracycline (final concentration 10 ⁇ g / mL) in 3 mL of LB medium (polypeptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g / medium 1 L). Then, the cells were shake-cultured at 30 ° C.
  • a preculture solution 5 mL of 2 ⁇ YT medium (polypeptone 16 g, yeast extract 10 g, NaCl 5 g, Glucose 5%, L-Histidine 5 mM, L-Cysteine 2.5 mM, L-Methionine 5 mM, tetra, ⁇ 24 mm test tube).
  • EGT and DTH were quantified as follows. During the main culture, 1 mL of the culture solution was collected 24, 48, 72, and 96 hours after the start of the culture, and the culture sample was evaluated. After measuring the cell turbidity (OD600) of the collected culture solution, the cells were centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes to separate into an extracellular culture solution and a precipitate (bacteria). The EGT content in the separated extracellular culture solution (extracellular sample) was measured by HPLC. The HPLC measurement conditions are as shown in Table 5 below, and quantification was performed based on the peak of EGT occurring near the retention time of 10 minutes and the peak of DTH occurring around the retention time of 8 minutes.

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Abstract

Ｌ－エルゴチオネイン（ＥＧＴ）とＮ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（ＤＴＨ）とが共存する組成物において、該組成物の着色を抑制することが可能となる。　ＥＧＴ、及び、ＤＴＨを含有する組成物であって、該ＤＴＨの含有量が、低減されてなる組成物を調製する。

Description

Ｌ－エルゴチオネイン含有組成物
　本発明は、Ｌ－エルゴチオネイン（ＥＧＴ）を含有する組成物に関する。より詳細には、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（ＤＴＨ）の存在下において、Ｌ－エルゴチオネイン（ＥＧＴ）の安定性を高めた組成物、及び、その製造方法に関する。
　Ｌ－エルゴチオネイン（本明細書では「ＥＧＴ」と表記する場合がある）は含硫アミノ酸の一種であり、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。
　例えば非特許文献１では、ＥＧＴが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とアジュバントとからなるガンワクチンによる免疫治療の効果を向上させる作用を有することが記載されている。特許文献１では、ＥＧＴが細菌による感染症を治療する作用を有することが記載されている。特許文献１の実験１では、５ｍＭ及び５０ｍＭのＥＧＴが大腸菌の増殖を抑制することが確認されていることから、特許文献１に記載の細菌の感染症抑制は、ＥＧＴが細菌の増殖を直接に抑制することによるものだと理解できる。
　非特許文献２では、トールライク受容体リガンドによる刺激条件下でのマウス骨髄由来マクロファージによるサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０）の生産が、１０ｍＭのＥＧＴにより促進され、１ｍＭのＥＧＴでは促進されないこと、及び、Ｆ４／８０マクロファージとＯＴ－ＩＩ　ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養において、ＯＴ－ＩＩ　ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７極性化が３０ｍＭのＥＧＴにより促進されることが記載されている。このように非特許文献２では、１０ｍＭ以上の高濃度のＥＧＴがマクロファージを活性化させることが記載されている。
　非特許文献３は、ＥＧＴの生理活性についての総説である。非特許文献３ではＥＧＴは動物及び植物の体内に吸収・蓄積されることが記載されている。
ＷＯ２０１９／０８９８７８
Ｓ．　Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｒｏｎｔ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１０：６７１（２０１９） ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　１２（１）：ｅ０１６９３６０ 玉川大学農学部研究教育紀要第１号：１７－４１（２０１６）
　しかしながら、ＥＧＴを含有する組成物における製剤安定性については、未だに十分に検討されていない状況である。特に、ＥＧＴを含有する組成物における、共存する他の成分による影響については、詳細な報告がなされていない。
　前記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、ＥＧＴを含有する組成物において、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（ＤＴＨ）が共存する場合に、ＥＧＴが不安定化し、それに伴い、ＥＧＴを含有する組成物の着色が生じるという、これまでに報告の無い新規な課題が見出された。
　この新規な課題に対して、ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物において、ＤＴＨの含有量を低減させることにより、ＥＧＴの安定性を高め、組成物の着色を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、下記に掲げる組成物を提供する。
　［１］
　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有する組成物であって、
　該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、低減されてなる、組成物。
　［２］
　前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が低減されることにより、前記組成物の着色が抑制されてなる、［１］に記載の組成物。
　［３］
　前記Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、５０質量部以下である、［１］又は［２］に記載の組成物。
　［４］
　前記Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、０．０００１質量部以上である、［１］～［３］のいずれか１に記載の組成物。
　［５］
　前記Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、０．０５質量部以上である、［１］～［４］のいずれか１に記載の組成物。
　［６］
　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有する組成物であって、
　該Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、５０質量部以下である、
　前記組成物の着色を抑制するための組成物。
　また、本発明は、下記に掲げる製造方法に関する。
　［７］
　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有し、着色が抑制された組成物の製造方法であって、
　該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量を低減させる工程を含む方法。
　また、本発明は、下記に掲げる方法に関する。
　［８］
　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有する組成物であって、
　該Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、５０質量部以下とすることによる、
　前記組成物に対して着色抑制効果を付与する方法。
　ＥＧＴの安定性に影響を与える成分として、ＤＴＨが見出されたことにより、ＥＧＴとＤＴＨとが共存する組成物において、ＤＴＨの含有量を低減することにより、製剤安定性を高め、組成物の着色を抑制することが可能となる。
図１は、試験例１における、ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物の安定性評価結果を示すグラフである。 図２は、試験例２における、ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物の着色抑制試験の結果を示すグラフである。 図３は、試験例２における、ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物の着色抑制試験の結果を示すグラフである。 図４は、試験例３における、ＥＧＴ発酵法におけるＤＴＨの低減試験を行った結果を示すグラフである。 図５は、試験例３における、ＥＧＴ発酵法におけるＤＴＨの低減試験を行った結果を示すグラフである。
　本発明の組成物は、Ｌ－エルゴチオネイン（ＥＧＴ）、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（ＤＴＨ）を含有するものであって、ＤＴＨの含有量が低減されてなる。
　［Ｌ－エルゴチオネイン（ＥＧＴ）］
　ＥＧＴは、ヒスチジン誘導体（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン）であり、その構造は次式（１）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ＥＧＴは、合成法、抽出法、発酵法等の公知の方法により得ることも可能であり、市販品を入手して用いることも可能である。
　ＥＧＴの市販品としては、Ｌ－エルゴチオネイン（テトラエドロン社製）等が挙げられる。
　［Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（ＤＴＨ）］
　ＤＴＨは、ＥＧＴの類縁体であり、その構造は次式（２）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ＤＴＨは、合成法、抽出法、発酵法等の公知の方法により得ることも可能であり、市販品を入手して用いることも可能である。
　ＤＴＨの市販品としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（テトラエドロン社製）等が挙げられる。
　ＥＧＴ及び／又はＤＴＨは、遊離体の形態であってもよく、塩の形態であってもよい。ＥＧＴ及び／又はＤＴＨの塩は、これらの構造におけるカルボキシル基で形成された塩であってもよいし、トリメチルアミノ基又はジメチルアミノ基で形成された塩であってもよい。また、Ｌ－エルゴチオネイン又はＬ－エルゴチオネイン類縁体は水和物等の溶媒和物であってもよい。
　ＥＧＴ及び／又はＤＴＨの塩としては、薬理学的に又は生理学的に許容される塩であれば、特に制限されないが、具体的には、有機酸塩、無機酸塩、有機塩基との塩、又は無機塩基との塩が挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酪酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩等のモノカルボン酸塩；フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩等の多価カルボン酸塩；乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等のオキシカルボン酸塩；メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩等の有機スルホン酸塩が例示される。無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩が例示される。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、ピペラジン、ピロリジン、エチレンジアミン等の有機アミンとの塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム又はカリウム等のアルカリ金属、カルシウム又はマグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム等の金属との塩等の各種の塩が挙げられる。これらのＥＧＴ及び／又はＤＴＨの塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。「薬学的に又は生理学的に許容される塩」には、塩の溶媒和物又は水和物を含んでいてもよい。
　下記の実施例において、本発明者らは、ＥＧＴを含有する組成物において、ＤＴＨが共存する場合に、ＥＧＴが不安定化し、それに伴い、ＥＧＴを含有する組成物の着色が生じるという、これまでに報告の無い新規な課題を見出している。さらに、本発明者らは、ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物において、ＤＴＨの含有量を低減させることにより、ＥＧＴの安定性を高め、組成物の着色を抑制できることを見出している。ＥＧＴを含有する組成物にＤＴＨが共存する態様は特に限定されず、例えば、ＥＧＴを含有する組成物に対してＤＴＨが添加されていてもよく、抽出法における夾雑物、合成法、発酵法等における副生成物等により内在的に含有していてもよい。
　本発明の組成物において、着色が抑制されているとは、ＥＧＴ及びＤＴＨを等量で含有する組成物に対して、同じｐＨ条件で、ＤＴＨの含有量を低減させることにより、４００ｎｍの吸光度が低減することを言う。４００ｎｍの吸光度の低減は、公知の分光光度計を用いて求めることが可能である。４００ｎｍの吸光度の低減は、例えば、ＥＧＴ及びＤＴＨを等量で含有する組成物に対して、少なくとも５％の低減率であることが好ましく、少なくとも１０％の低減率であることがより好ましい。
　本発明の組成物において、ＥＧＴ及びＤＴＨの含有比率は、組成物の着色抑制の観点、及び、ＥＧＴの安定性の観点から、ＥＧＴ１００質量部に対して、ＤＴＨの含有量が、５０質量部以下であることが好ましく、４０質量部以下であることがより好ましく、３０質量部以下であることが更に好ましく、２０質量部以下であることが特に好ましく、１０質量部以下であることが最も好ましい。
　また、本発明の組成物において、ＥＧＴ及びＤＴＨの含有比率は、組成物の生産効率等の観点から、ＥＧＴ１００質量部に対して、ＤＴＨの含有量が、０．０００１質量部以上であることが好ましく、０．００１質量部以上であることがより好ましく、０．００５質量部以上であることが更に好ましく、０．０１質量部以上であることが特に好ましく、０．０５質量部以上であることが最も好ましい。
　また、本発明の組成物において、ＥＧＴ及びＤＴＨの含有比率は、組成物の着色抑制の観点、ＥＧＴの安定性の観点、及び、組成物の生産効率等の観点から、ＥＧＴ１００質量部に対して、ＤＴＨの含有量が、０．０００１～５０質量部であることが好ましく、０．００１～４０質量部であることがより好ましく、０．００５～３０質量部であることが更に好ましく、０．０１～２０質量部であることが特に好ましく、０．０５～１０質量部であることが最も好ましい。
　また、本発明の組成物において、ＥＧＴの含有量は、製剤の形態や、用途、他の成分の種類や含有量等により適宜調整され、限定はされないが、例えば、組成物全量に対して、０．０００００１質量％以上とすることができ、０．０００００５質量％以上、０．００００１質量％以上、０．００００５質量％以上、０．０００１質量％以上、０．０００５質量％以上、０．００１質量％以上等が挙げられる。また、ＥＧＴの含有量は、例えば、組成物全量に対して、９９．９９９質量％以下とすることができ、９９．９質量％以下、９９．５質量％以下、９９質量％以下、９８．５質量％以下、９８質量％以下等が挙げられる。別の実施態様において、液状製剤として調製される場合、限定はされないが、ＥＧＴの含有量は、例えば、組成物全量に対して、８０質量％以下とすることができ、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、４０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等が挙げられる。
　［用途］
　ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物において、ＤＴＨの含有量を低減させることにより、ＥＧＴの安定性を高めることができるため、本発明は、上記組成物の着色を抑制するために用いることが可能である。
　また、上記の通り、ＥＧＴは、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物においても、本発明を用いることにより、ＥＧＴの安定性を高め、その分解を抑制することができるため、ＥＧＴが本来有する生理活性を損なうことなく発揮することが可能となる。
　ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物においても、本発明を用いることにより、ＥＧＴが本来有する生理活性である、抗酸化用、脳機能改善用、抗老化用、眼疾患用、美白用、紫外線吸収用、メラニン産生抑制用、活性酸素種の消去用、エラスターゼ活性阻害用、シワ形成抑制用、肌のたるみ抑制用、肌のシミの形成抑制用、眼周囲のクマ抑制用、紫外線による肌ダメージ軽減（光老化の抑制）用、乾燥肌用、敏感肌用、毛髪改善用、オートファジー促進用等に好適に用いることが可能となる。
　本発明の組成物は、更に飲食品、機能性表示食品、特定保健用食品、医薬部外品、医薬品、化粧品、日用品、飼料等に使用可能な有効成分や添加剤を適宜配合することができ、また、当該品目で使用される公知の製剤化方法により、適宜製剤化することができる。
　化粧品や日用品としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、ヘアコンディショナー、整髪料、ヘアトニック、歯磨き粉、マウスウォッシュ等に製剤化することが可能である。
　［製剤］
　本発明の組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤；または液剤、シロップ剤、注射剤、クリーム、ローション、ペースト、軟膏、エマルジョン（水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、多重エマルジョン、ミクロエマルジョン、ＰＥＴ－エマルジョン、ピッカリング・エマルジョン）、ゲル（ヒドロゲル、アルコールゲル）、懸濁液などの液状製剤として経口または非経口的（外用を含む）に投与することもできる。固形製剤には、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤には、溶剤、溶解補助剤、乳化剤、乳化安定剤、増粘剤、保湿剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを用いることができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、香料などの添加物を用いることもできる。
　賦形剤としては、例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖アルコール、ブドウ糖、白糖、乳糖、果糖などの糖類、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、β－シクロデキストリン、軽質無水ケイ酸、酸化チタン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、タルク、カオリン、オリーブ油などが挙げられる。
　結合剤としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アクリル酸系高分子、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、アルファー化デンプン、カンテン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、部分アルファー化デンプンなどが挙げられる。
　溶剤としては、例えば、水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
　滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ポリオキシル、セタノール、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ジメチルポリシロキサン、ミツロウ、サラシミツロウなどが挙げられる。
　溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　懸濁化剤・乳化剤としては、例えば、ステアリルアミン、トリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；例えばシェラックロウ、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、環状ラノリン、ラノリンワックス、キャンデリラロウ、モクロウ、モンタンロウ、ライスワックスなどワックス類などが挙げられる。
　等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトールなどが挙げられる。
　緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
　防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
　抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
　本発明の組成物を固形製剤とする場合、当該分野で公知の製造方法を用いることができる。例えば、組成物を練合し、スクリーンを通過させることで成型する押出造粒物を、粉砕し、整粒する方法、前記組成物に練合水を加え、バーチカルグラニュレーターによって成型する攪拌造粒の後に、コーミルを用いて粉砕・篩過する方法が挙げられる。また、前記製剤組成物をローラーコンパクターで圧縮した後、ロールグラニュレーターで粉砕し篩過する方法が挙げられる。また、撹拌造粒の後に、流動層乾燥する方法が挙げられる。また、例えば、直打により製造する場合には、組成物を混合した後、直接、打錠機に投入して打錠すればよい。
　［飲食品］
　本発明の組成物は、飲食品組成物としても使用することができ、食品または機能性食品に含有させて提供され得る。このような食品または機能性食品としては、米飯；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺を含む各種の麺類；清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等の飲料；カレールー、シチュー、各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品・機能性表示食品・特定保健用食品などが例示される。
　また、本発明の組成物を含有するサプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）を調製してもよい。
　また、ペットなどの動物用の餌に対して本発明の組成物を含有させることもできる。
　飲食品には、必要に応じて、添加物が加えられる。このような添加物としては、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、トレハロース、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、マンニトール、デキストリン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ－アスコルビン酸、トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
　本発明の組成物は、各種症状や状態の改善・予防・向上等の表示が許可されている飲食品ために用いることができる。ここで、本発明において、症状や状態の改善・予防・向上等の表示が許可されている飲食品とは、国や公共団体が許可・指定している効能を有する飲食品であり、例えば、機能性表示食品、特定保健用食品等の保健機能食品、特別用途食品等である。なお、状況や時代、各国の制度により名称や規程が変化するが、本質的に同じであるものは本発明に含まれる。
　本発明において、本発明の組成物の配合量は、特に制限されず、適用の目的（対象疾患や症状の種類等）、適用対象部位、適用者の性別や年齢、飲食品、機能性表示食品、特定保健用食品、医薬部外品、医薬品、化粧品、日用品又は飼料等の製品形態、これらの投与又は摂取方法や回数、嗜好等に応じて適宜設定される。
　本発明の組成物を使用する場合には、ＥＧＴが本来有する生理活性を発揮できる有効量を１日当たりの摂取量（適用量）とすることが可能である。例えば、健常の成人が摂取（適用）する場合、ＥＧＴの１日当たりの摂取量（適用量）は、例えば、０．００５～４，０００ｍｇ、好ましくは０．１～３，０００ｍｇ、より好ましくは０．５～２，０００ｍｇ、更に好ましくは１～１，０００ｍｇ、特に好ましくは２～５００ｍｇ、最も好ましくは３～３００ｍｇで使用することができる。
　また本発明の組成物を飲食品として用いる場合は、限定はされないが、ＥＧＴが本来有する生理活性を表示できる観点からは、機能性食品とすることが好ましく、機能性食品のなかでも機能性表示食品、栄養機能食品、栄養補助食品、特定保健用食品が挙げられるが、用途を明確に表示できる点で機能性表示食品が好ましい。
　［適用対象者］
　本発明の組成物が適用される対象者は、ＥＧＴが本来有する生理活性を必要とする年代であれば、特に制限されないが、仕事等の生活環境からストレスを受けやすい年代である３０歳頃以上であってもよく、ホルモンバランスの変化や生活環境の変化等により身体の変化を感じやすい年代である中年齢者（４５歳頃以上５５歳未満）であってもよく、高年齢者（５５歳以上）であってもよい。
　［ｐＨ］
　本発明の組成物のｐＨは、他の配合成分の種類及び含有量、製剤形態、使用方法等に応じて適宜設定され、薬学的又は生理学的に許容できる範囲であれば制限されないが、例えば、ｐＨ２～１０とすることができる。本発明の効果を安定的に発揮する観点から、本発明の組成物のｐＨは、例えば、ｐＨ２～１０、ｐＨ２～９、ｐＨ２～８、ｐＨ２～７、ｐＨ３～１０、ｐＨ３～９、ｐＨ３～８、ｐＨ３～７、ｐＨ４～１０、ｐＨ４～９、ｐＨ４～８、ｐＨ４～７、ｐＨ５～１０、ｐＨ５～９、ｐＨ５～８、ｐＨ５～７、ｐＨ６～１０、ｐＨ６～９、ｐＨ６～８、ｐＨ６～７等とすることが可能である。
　［ＥＧＴ及びＤＴＨを含有し、着色が抑制された組成物の製造方法］
　本発明において、ＥＧＴ及びＤＴＨを含有し、着色が抑制された組成物の製造方法は、ＤＴＨの含有量を低減させる工程を含む。
　ＤＴＨの含有量を低減させる工程は、ＤＴＨ含有量が低減される限り、公知のどのような手段であっても利用することができる。例えば、ＥＧＴとＤＴＨとを混合し、組成物を調製する場合は、ＥＧＴに対するＤＴＨの含有比率を低減させる工程を採用することができる。また、上述の通り、ＥＧＴを含有する組成物にＤＴＨが共存する態様は特に限定されず、例えば、ＥＧＴの抽出法における夾雑物においてＤＴＨが存在する態様、合成法又は発酵法等における副生成物として存在する態様であってもよい。
　ＥＧＴのキノコや植物等からの抽出法における夾雑物においてＤＴＨを低減させる場合は、例えば、溶媒抽出、溶解度差による分離、シリカゲル、アルミナなど吸着剤を用いたクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過、チオプロピル－セファロース6B、逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、結晶化、活性炭処理、膜処理などの方法、およびこれらを組み合わせた方法が挙げられる。
　ＥＧＴを発酵法により生産する方法は、国際公開第２０１９／１６３７６７号等により大腸菌等を用いた方法が公知である。ＥＧＴの発酵法における夾雑物においてＤＴＨを低減させる場合は、例えば、後述の実施例にて記載された方法等が挙げられる。具体的には、ＥＧＴの発酵法において、ＥＧＴ生産能を有する腸内細菌科に属する細菌のｍｅｔＪ遺伝子を欠失させる工程を採用することにより、培養液中のＤＴＨを低減させ、且つ、ＥＧＴを効率的に生産させることが可能となる。
　ｍｅｔＪ遺伝子を欠失させる工程は、公知の方法を用いることができ、例えば、相同組換え、変異処理、ゲノム編集などによりｍｅｔＪ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする方法等が挙げられる。
　EGT生産能を有する腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、及びサルモネラ（Salmonella）属の細菌が例示されるが、これらに限定されない。特に好ましい腸内細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等のパントエア属などの腸内細菌が挙げられる。
　腸内細菌科に属する細菌の培養は、通常の方法にて行うことができる。具体的には、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、またはＹＰＤ培地などを用いることができる。上記の培地を用いて、ＥＧＴ及びＤＴＨを生産させることができるが、用いる培地はこれらに限定されない。また、生産させたＥＧＴ及びＤＴＨは菌体内に蓄積してもよいし、菌体外（培養液中）に分泌・蓄積してもよい。
　菌体内、または菌体から遊離されたＥＧＴ及びＤＴＨの回収は公知の方法によって行うことができる。例えば、培養物を遠心分離あるいは濾過等の固液分離に供して、菌体内からは溶媒抽出、熱水抽出、破砕処理等によりＥＧＴ及びＤＴＨの抽出液を取得できる。ＥＧＴ及びＤＴＨの抽出液、または培養上清からは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知のクトマトグラフィーに供してＥＧＴを得ることができる。
　各種のＤＴＨの含有量を低減させる手段において、ＥＧＴ及びＤＴＨの好ましい含有比率については、上記に準じる。
　上記製造方法は、更に、ｐＨを調整する工程を含むことが可能である。至適なｐＨの数値範囲については、上記に準じる。
　［ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物に対して着色抑制効果を付与する方法］
　本発明において、ＥＧＴ、及び、ＤＴＨを含有する組成物であって、
　該ＥＧＴ１００質量部に対して、該ＤＴＨの含有量が、５０質量部以下とすることによる、前記組成物に対して着色抑制効果を付与する方法を提供することも可能である。ＥＧＴ及びＤＴＨの好ましい含有比率については、上記に準じる。
　次に、実施例や試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例や試験例に限定されるものではない。なお、特に説明がない場合には、分子生物学、応用微生物学に関する標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾、改変した方法を用いて実験を実施した。また、％は、特に明記しない限りｗ／ｖ％を表す。
　（試験例１．ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物における安定性評価１）
　Ｌ－エルゴチオネイン（ＥＧＴ）及びＮ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジン（ＤＴＨ）を含む組成物について、種々のｐＨ条件下における保存安定性を下記の通り調べた。
　ＥＧＴ、ＤＴＨの終濃度、及びｐＨが表１の通りになるよう、ＥＧＴ（テトラエドロン社製）及びＤＴＨ（テトラエドロン社製）をｐＨ３、４、５、６、７、８、９、又は、１０のＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（終濃度３０ｍＭ）に溶解し、ｐＨ及び濃度の異なるＤＴＨとＥＧＴの混合溶液を３．０ｍｌ調製した。
　ｐＨの調整に用いた広域緩衝液であるＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒは、次の要領で調製した。ホウ酸＋リン酸＋酢酸混合溶液（終濃度各２００ｍＭ）を２０ｍｌ分取し、１Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ３、４、５、６、７、８、９、又は、１０にそれぞれ調整後、水を用いて４０ｍｌにメスアップすることで、ｐＨ３～１０の３００ｍＭ（各１００ｍＭ）Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒとした。さらに、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒの終濃度が３０ｍＭとなるように、各ｐＨの３００ｍＭ　Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｂｕｆｆｅｒと水を用いてＥＧＴとＤＴＨを溶解させることで、表１のＥＧＴ及びＤＴＨ混合溶液を調製した。
　表１記載のＥＧＴ及びＤＴＨ混合溶液をサンプル番号一つにつき、１．０ｍｌずつ２本のチューブに移し、それぞれ３０℃、または７０℃で２１日間静置した。開始直後（０日目）、８日目、１４日目、及び、２１日目にチューブの写真を撮影することで溶液の色の変化を記録し、さらに１００μｌずつサンプリングを行い、表２記載の条件で高速液体クロマトグラフィー（島津製作所社製）を用いたＥＧＴとＤＴＨの定量に供した。図１は、１４日目に撮影した溶液の写真である。
　図１に示される通り、７０℃で１４日間保存したサンプルのうち、ＥＧＴ１００ｍｇ／Ｌ＋ＤＴＨ２０ｍｇ／Ｌ、ＥＧＴ１００ｍｇ／Ｌ＋ＤＴＨ５０ｍｇ／Ｌ、ＥＧＴ１００ｍｇ／Ｌ＋ＤＴＨ１００ｍｇ／Ｌの試験区のサンプルにおいて、無色透明から茶褐色への溶液の着色が確認された。また、ＤＴＨ濃度の増加に伴い着色の度合いは強くなった。また、ＤＴＨ保存期間の増加に伴い着色の度合いは強くなった。以上より、本試験例により、ＥＧＴ及びＤＴＨの混合溶液が着色するという課題が初めて確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（試験例２．ＥＧＴ及びＤＴＨを含有する組成物における着色抑制評価１）
　試験例１の結果、ＥＧＴ及びＤＴＨの混合溶液が着色するという新規な課題が見出されたため、この変色の程度を吸光度測定により数値化すると同時に、ＥＧＴとＤＴＨの濃度を様々に検討することで、着色の抑制方法を探索した。
　試験例１と同様に、ＥＧＴ（テトラエドロン社製）及びＤＴＨ（テトラエドロン社製）の終濃度が表３及び表４に示す濃度かつｐＨになるようにＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（終濃度３０ｍＭ）に溶解し、２．０ｍｌのＥＧＴ及びＤＴＨ混合溶液を調製した。
　表３及び表４に記載のＥＧＴ及びＤＴＨ混合溶液各１．５ｍｌを２．０ｍｌチューブに移し、溶液の蒸散防止としてミネラルオイルを２００μｌずつ液面に重層した。調製したサンプルを７０℃で２８日間静置し、開始直後（０日目）、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目に２００μｌずつ９６ｗｅｌｌマイクロプレートに採取し、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ　ＧＯ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて２５０～８００ｎｍの吸光度測定を行った。図２は、表３のサンプルを対象とした吸光度測定により得られたデータのうち、４００ｎｍの吸光度データを用いて作成した。さらに、吸光度測定後のサンプル１００μｌを使用して、表２記載の条件で高速液体クロマトグラフィー（島津製作所社製）を用いたＥＧＴとＤＴＨの定量も行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３のサンプルを用いた着色抑制評価試験の結果が図２である。図２に示される通り、ＥＧＴ１００ｍｇ／Ｌ＋ＤＴＨ５０ｍｇ／Ｌのサンプルでは全てのｐＨ区で、時間経過とともに着色度合いを示す４００ｎｍの吸光度（Ａ４００値）が増加し、実施例１で確認されたＥＧＴ及びＤＴＨ混合溶液の着色を吸光度からも確認できた。さらに、様々なＤＴＨ濃度を検討した結果、全てのｐＨ区でＤＴＨ濃度を低下させることでＡ４００値が低下することが確認できた。限定はされないが、特に、ＥＧＴ１００質量部に対しＤＴＨを２０質量部以下の含有比率にすることで経時的な着色が顕著に抑制されることを見出した。各サンプルのＥＧＴの定量結果から、着色と同様に、ＤＴＨ濃度を低下させることでＥＧＴの分解を抑制できることも示された。
　また、表４に示すＥＧＴ及びＤＴＨ混合溶液を用いた着色抑制評価試験においても、表３のサンプルと同傾向の結果が得られた。結果を図３に示す。具体的には、全てのｐＨ区でＤＴＨ濃度を低下させることでＡ４００値が低下することが確認でき、特に、ＥＧＴ１００質量部に対しＤＴＨを２０質量部以下の含有比率にすることで経時的な着色が顕著に抑制できることが確認された。
　（試験例３．ＥＧＴ発酵法におけるＤＴＨの低減試験）
　ＥＧＴ合成遺伝子を発現させた大腸菌を用いた、ＥＧＴの微生物生産を試みた（先行技術：国際公開第２０１９／１６３７６７号）。鋭意検討を進めた結果、偶然にもｍｅｔＪ遺伝子を破壊した株を用いることで培養液中のＤＴＨ含量が有意に低下することを見出した。下記に、その実施例を記載する。
　奈良先端科学技術大学院大学より、Mol. Syst. Biol., 2006; 2: 2006.0008（ Baba, T.ら、Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection）記載の方法に準じて大腸菌ＢＷ２５１１３（ＮＢＲＣ１０３４０４）株から調製された、ｍｅｔＪをコードする遺伝子の欠損した大腸菌ΔｍｅｔＪ株を入手した。
　なお、大腸菌ΔｍｅｔＪ株は例えば以下の方法に準じて調製することもできる。ｍｅｔＪ遺伝子の上流配列と下流配列を含むカウンターセレクションベクター（ｓａｃＢ遺伝子、薬剤耐性遺伝子を含む）を用いた相同組み換え法により、大腸菌ＢＷ２５１１３株の各遺伝子領域を欠失させる従来公知の方法で構築した。上記の破壊株構築は、M. S. Donnenberg and J. S. Kaper, Infect. Immun., 1991, 4310-4317や、H. Mizoguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71 (12), 2905-2911などを参照できる。
　ＥＧＴ生産ベクターはｐＡＣＧ－ＥＧＴ（先行技術：国際公開第２０１９／１６３７６７号）を使用した。ＢＷ２５１１３株及びΔｍｅｔＪ株を使用し、ｐＡＣＧ－ＥＧＴを用いて形質転換を行い、ＥＧＴ生産株（ＢＷ２５１１３／ｐＡＣＧ－ＥＧＴ、ΔｍｅｔＪ／ｐＡＣＧ－ＥＧＴ）を得た。
　上記で構築したＥＧＴ生産株ΔｍｅｔＪ／ｐＡＣＧ－ＥＧＴを用いて、ＥＧＴの発酵生産試験を行った。ＢＷ２５１１３株にｐＡＣＧ－ＥＧＴを導入したＢＷ２５１１３／ｐＡＣＧ－ＥＧＴをコントロール株とした。ＢＷ２５１１３／ｐＡＣＧ－ＥＧＴ、ΔｍｅｔＪ／ｐＡＣＧ－ＥＧＴ、それぞれのグリセロールストックを３ｍＬのＬＢ培地（ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ　１０ｇ、ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ、ＮａＣｌ　１０ｇ／培地１Ｌ）にテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を含む試験管に添加し、３０℃、２００ｒｐｍで１５－１８時間、定常期に達するまで振盪培養し前培養液を得た。さらに、Φ２４ｍｍ試験管中の５ｍＬの２×ＹＴ培地（ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ　１６ｇ、ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１０ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ　５％、Ｌ－Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　５ｍＭ、Ｌ－Ｃｙｓｔｉｎｅ　２．５ｍＭ、Ｌ－Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　５ｍＭ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　１０μｇ／ｍＬ／培地１Ｌ）に、ＯＤ＝０．５となるよう前培養液を添加し、３０℃３００ｒｐｍで９６時間振盪することで本培養を行った。
　ＥＧＴ及びＤＴＨの定量は下記の通り行った。本培養の間、培養開始後２４、４８、７２、９６時間に培養液１ｍＬを採取し培養サンプルを評価した。採取した培養液の菌体濁度（ＯＤ６００）を測定後、１４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。分離した菌体外培養液（菌体外サンプル）中のＥＧＴ含量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表５の通りで、保持時間１０分付近に生じるＥＧＴのピーク、保持時間８分付近に生じるＤＴＨのピークをもとに、定量を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＷＴ／ｐＡＣＧ－ＥＧＴ、ΔｍｅｔＪ／ｐＡＣＧ－ＥＧＴを培養しＥＧＴ、ＤＴＨの生産量を調べた結果、図４、図５に示す通り、９６時間目の培養液中のＤＴＨ量がΔｍｅｔＪ株を用いた場合、ＷＴと比較して、約１／７と顕著に低下することを見出した。

Claims (8)

  1. 　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有する組成物であって、
    　該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、低減されてなる、組成物。
  2. 　前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が低減されることにより、前記組成物の着色が抑制されてなる、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、５０質量部以下である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　前記Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、０．０００１質量部以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 　前記Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、前記Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、０．０５質量部以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有する組成物であって、
    　該Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、５０質量部以下である、
    　前記組成物の着色を抑制するための組成物。
  7. 　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有し、着色が抑制された組成物の製造方法であって、
    　該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量を低減させる工程を含む方法。
  8. 　Ｌ－エルゴチオネイン、及び、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンを含有する組成物であって、
    　該Ｌ－エルゴチオネイン１００質量部に対して、該Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－２－チオヒスチジンの含有量が、５０質量部以下である、
    　前記組成物に対して着色抑制効果を付与する方法。
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