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WO2012053862A2 - 홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2012053862A2
WO2012053862A2 PCT/KR2011/007898 KR2011007898W WO2012053862A2 WO 2012053862 A2 WO2012053862 A2 WO 2012053862A2 KR 2011007898 W KR2011007898 W KR 2011007898W WO 2012053862 A2 WO2012053862 A2 WO 2012053862A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
respiratory
composition
red garlic
extract
garlic extract
Prior art date
Application number
PCT/KR2011/007898
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English (en)
French (fr)
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WO2012053862A3 (ko
Inventor
강다원
성낙주
신정혜
한재희
Original Assignee
경상대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교 산학협력단 filed Critical 경상대학교 산학협력단
Publication of WO2012053862A2 publication Critical patent/WO2012053862A2/ko
Publication of WO2012053862A3 publication Critical patent/WO2012053862A3/ko

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/896—Liliaceae (Lily family), e.g. daylily, plantain lily, Hyacinth or narcissus
    • A61K36/8962—Allium, e.g. garden onion, leek, garlic or chives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases induced by respiratory cell death, including red garlic extract as an active ingredient, a food composition for preventing or ameliorating the diseases, a method for preventing or treating the diseases, and a respiratory cell It relates to a composition which inhibits the decrease in the concentration of glutathione.
  • Tobacco smoke is one of the most complex mixtures of structures in the world. When a cigarette is lit, it produces more than 4,000 substances, depending on the amount and temperature of oxygen in the air. When a person inhales such tobacco smoke, about 50cc of tobacco smoke enters the lungs through the esophagus and bronchus, including the total amount of carbon monoxide (CO), 90% of nicotine, and 70% of tar. Is absorbed into the body. In addition, tobacco smoke contains acetone for removing paint, formaldehyde for tear gas, naphtyramine for preservatives, methanol for rocket fuels, dimethylnitrosamine for carcinogens, and mothballs.
  • CO carbon monoxide
  • Naphtharin cadmium used in automobile batteries, carbon monoside, a toxic gas in automobile exhaust gases, benzopyrene, a carcinogen, vinyl chloride, a raw material of PVC, cyanide, ammonia, urethane, arsenic, butane, used in industrial solvents, It contains about 4,000 chemicals such as polonium and DDT, which is a pesticide, and about 40 of them are carcinogens that cause cancer. It is known to.
  • cigarette smoke contains various kinds of substances including carcinogens, and thus adversely affects not only smokers but also indirect smokers who inhale cigarette smoke around smokers.
  • Representative diseases caused by inhalation of tobacco smoke are respiratory diseases such as emphysema, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer.
  • garlic (Allium sativum L.) is a perennial herb that is cultivated all over the country and widely used as a medicinal herb or food ingredient, and its components include calcium, vitamin B1, vitamin B2, and vitamin C.
  • Anticancer action, antifungal action, antiprotozoal action has been reported.
  • the garlic is most preferably ingested raw in terms of nutrition and effect, but it is very difficult to eat raw garlic due to the smell and spicy taste of garlic.
  • black garlic, red garlic, etc. which have been aged for a certain time under certain conditions, have been manufactured.
  • Red garlic is a garlic processed product prepared by aging raw garlic for a specific time at a specific temperature, and was prepared by the present inventors. Compared to raw garlic, red garlic is easier to consume because it has improved taste and aroma, and the production time is shorter than that of black garlic, which is a processed raw garlic product, and thus, the possibility of generation of harmful substances that may occur during a long ripening period is reduced.
  • raw garlic or processed garlic has a therapeutic effect of respiratory diseases induced by respiratory cell death due to inhalation of tobacco smoke. There is no bar.
  • the present inventors confirmed that the red garlic extract has an effect of preventing the death of human bronchial smooth muscle cells by tobacco smoke, and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases induced by respiratory cell death, including red garlic extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a disease induced by respiratory cell death, comprising administering the composition to an individual.
  • Still another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving a disease induced by respiratory cell death, including the red garlic extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a composition for inhibiting the concentration of glutathione in respiratory cells containing red garlic extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the red garlic extract for the prevention or treatment of diseases induced by respiratory cell death.
  • the present invention exhibits the effect of inhibiting the concentration of glutathione in respiratory cells, and can be usefully used for the prevention and treatment of diseases induced by respiratory cell death.
  • 1A is a diagram showing the effect of tobacco smoke extract (CSE) of various concentrations on the survival of human bronchial smooth muscle cells.
  • CSE tobacco smoke extract
  • FIG. 1B is a photograph showing cells in which apoptosis occurred when 10% tobacco smoke extract was treated to human bronchial smooth muscle cells.
  • FIG. 1C shows cells treated with human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extracts of green garlic (FRG), black garlic (ABG) or red garlic (ARG) at 0.01%, 0.1% and 1% concentrations, respectively.
  • FSG green garlic
  • ABS black garlic
  • ARG red garlic
  • FIG. 1D is a diagram showing a change in cell viability when various concentrations of red garlic were treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • E and F of Figure 1 shows a change in cell viability when treated with human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract of the red garlic extract dialysis solution (IM solution) and dialysis solution (OM solution) of various concentrations Drawing.
  • IM solution red garlic extract dialysis solution
  • OM solution dialysis solution
  • Figure 2 A is a diagram showing the change in the concentration of intracellular GSH when treated with red garlic extract, L-BSO, GSH to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • FIG. 2B is a photograph showing ROS generation when the red garlic extract was treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • FIG. 2C is a diagram showing a change in the expression level of HO-1 when the red garlic extract or NAC was treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • 2D is a diagram showing a change in cell viability when treated with red garlic extract, L-BSO, GSH to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases induced by respiratory cell death comprising red garlic extract as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of red garlic extract for the prevention or treatment of diseases induced by respiratory cell death.
  • the red garlic is prepared by the following method as a reddish brown medium ripening garlic that improves the smell and spicy taste of fresh garlic by aging existing raw garlic for a specific condition and for a specific time, but is not limited thereto.
  • each piece of raw garlic is processed for 5 minutes in a microwave oven of 400W-600W and then fixed using a stainless steel pan so that the height of garlic is less than 4 cm from below.
  • the pan is then placed in an incubator and aged for 24 hours at a temperature of 90 ° C. and a humidity of 60%. After 24 hours, the temperature and humidity are reduced to 50 ° C. and 50%, respectively, and the garlic pieces are further aged for 30 hours. Then, further aged at a temperature of 50 °C for 12 hours, 5 °C for 30 hours, 70 °C for 36 hours. After aging, the temperature is lowered to 40 ° C. in 30 minutes, and then aged for 30 hours to prepare red garlic.
  • the present invention includes an extract extracted from red garlic as an active ingredient, there is no limitation in the extraction method for obtaining a red garlic extract.
  • the red garlic extract may be obtained by extracting the red garlic prepared from raw garlic through an inorganic solvent or an organic solvent.
  • the red garlic extract of the present invention may be preferably extracted by hot water extraction.
  • the heated mixture can be extracted by filtration. In this case, when heating at a temperature higher than 70 °C time is reduced but the active ingredient is destroyed and can be lost, when heating at a temperature lower than 60 °C may not be extracted completely the active ingredient.
  • any extracting organic solvent commonly used in the art may be used, preferably alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, butanol, acetone, hexane, chloroform, ethyl Acetate, butylene glycol or mixtures thereof can be used, most preferably with 1,3-butylene glycol, which can be extracted at room temperature or by heating.
  • alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, butanol, acetone, hexane, chloroform, ethyl Acetate, butylene glycol or mixtures thereof can be used, most preferably with 1,3-butylene glycol, which can be extracted at room temperature or by heating.
  • the final extract can be filtered using a filter such as nylon to remove suspended solid particles or by freeze filtration.
  • the extract of the present invention includes not only the extract by the above-mentioned extraction solvent, but also the extract that has undergone a conventional purification process. Fractions obtained through various additional purification methods, such as, for example, separation using ultrafiltration membranes having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity). It may also be included in the red garlic extract of the present invention.
  • red garlic extract of the present invention may be prepared in a powder state by an additional process such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
  • the respiratory cells are cells constituting organs such as the nose, mouth, bronchus, lungs, alveoli or diaphragm (diaphragm) responsible for respiration, and are preferably smooth muscle cells constituting the bronchi, lungs, alveoli, and more preferably. Bronchial smooth muscle cells.
  • the smooth muscle is rhythmic muscle cells with no rhabdomes and rhythmic contractile activity of the wall moving the contents from the internal organs to the involuntary muscles, and from the esophagus to the rectum, the trachea, bronchus, respiratory passages, tracheal wall, bladder wall, vasculature Most of the organs, eye muscles, and the sphincter of the pupil constitutes.
  • the smooth muscle is composed of smooth muscle cells.
  • the bronchial smooth muscle cells are constituents of the bronchial smooth muscle, and when the broncho smooth muscle cells die, airway remodeling is caused and various respiratory diseases develop. It causes a loss of function.
  • the death of respiratory cells means death of respiratory cells, and includes cell necrosis, apoptosis, necrosis, and the like.
  • respiratory cell death days such as apoptosis, cell necrosis, and necrosis of respiratory cells due to tobacco smoke inhalation. Can be.
  • Tobacco smoke is a gas containing more than 4,000 chemicals that are produced when a cigarette is lit and smokes. Tobacco smoke is mixed with various components according to the amount of oxygen and temperature in the air. Causes death of respiratory cells.
  • Diseases induced by respiratory cell death refer to respiratory diseases caused by severe dysfunction of the respiratory system as normal respiratory cells die, and include bronchial asthma, emphysema (pulmonary fibrosis), chronic obstructive emphysema, Centrilobular emphysema, panacinar pulmonary emphysema, acute bronchitis, chronic bronchitis, chronic obstructive bronchitis, acute respiratory distress syndrome, reactive respiratory tract disease, cystic fibrosis, bronchiectasis, Acquired bronchiectasis, Cartagener's syndrome, congenital armament, acute congenital armament, chronic congenital armament, pneumonia, essential thrombocytopenia, legionellosis, parrot disease, fibrous tissue Pneumoconiocis, pulmonary hypersensitivity, chronic obstructive pulmonary disease, and Idiopathic invasive lung disorders.
  • bronchial asthma emphy
  • the disease induced by respiratory cell death may preferably be emphysema, lobular-centered emphysema, radioactive emphysema, bronchitis, chronic bronchitis, chronic obstructive bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer, more preferably bronchitis, chronic Bronchitis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer.
  • the bronchitis, chronic bronchitis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer are known to be a direct cause of smoking. Therefore, the composition of the present invention can be usefully used for the prevention and treatment of respiratory diseases such as bronchitis, chronic bronchitis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer induced by respiratory cell death due to tobacco smoke inhalation.
  • respiratory diseases such as bronchitis, chronic bronchitis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer induced by respiratory cell death due to tobacco smoke inhalation.
  • a method for preventing or treating a disease induced by respiratory cell death comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a red garlic extract as an active ingredient.
  • a method for inhibiting the concentration of glutathione in the respiratory cell comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a red garlic extract as an active ingredient.
  • the red garlic extract increases the survival rate of human bronchial smooth muscle cells exposed to tobacco smoke, and ultimately induces the proliferation of cells (Experimental Example 1 and C to F of FIG. 1, FIG. 2). D), the effect of inhibiting the decrease in the concentration of intracellular glutathione by tobacco smoke (Experimental Example 3 and Figure 2A) was shown. Therefore, the red garlic extract may be usefully used for the prevention and treatment of diseases induced by respiratory cell death due to tobacco smoke inhalation.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of a disease induced by respiratory cell death by administration of the composition.
  • treatment means Means any action that improves or beneficially alters the symptoms caused by a disease induced by respiratory cell death.
  • the term "individual” means any animal, including humans, who may or may have developed a disease induced by respiratory cell death.
  • composition of the present invention can be prevented or treated by administering to an animal including a human suffering from a disease induced by respiratory cell death, or a disease induced by respiratory cell death.
  • the route of administration of the composition may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the composition of the present invention may be administered as desired, but is not limited to intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration.
  • the composition may also be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • the composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablet pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in one or more compounds. ) And gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solution solutions, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. It can have one formulation.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, drug Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, drug treatment and biological response modifiers for the prevention or treatment of diseases induced by respiratory cell death.
  • the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating a disease induced by respiratory cell death, including the red garlic extract as an active ingredient. That is, the red garlic extract of the present invention may be added to a food composition for the purpose of preventing or ameliorating diseases induced by respiratory cell death.
  • the food composition of the present invention corresponds to all forms of health functional foods, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafood, health food, nutraceutical, designer food, food additives and the like.
  • the red garlic extract of the present invention When used as a food additive, the extract may be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • Examples of the food to which the substance can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like and include all of the health foods in the conventional sense.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols. And carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the food composition of the present invention may contain a pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks, these components may be used independently or in combination.
  • the present invention provides a composition for inhibiting the concentration of glutathione in the respiratory cell containing red garlic extract as an active ingredient.
  • the glutathione is a tripeptide consisting of three amino acids such as glutamate, cysteine, and glycine (glycine), and is present at a concentration of 0.1 to 10 mM in cells of animals, plants, and microorganisms. It is a substance. In vivo, glutathione is conjugated with toxic substances, such as xenobiotics, which are harmful to the body by acting as an important antiviral agent and acting as a substrate for glutathione S-transferase (GST) by causing increased immune activity through leukocyte production. It is known to play an important role in detoxification.
  • toxic substances such as xenobiotics
  • the killing of human bronchial smooth muscle cells by tobacco smoke is accompanied by the activity of caspase (Experimental Example 2 and FIG. 1B), and it can be seen that the concentration of intracellular glutathione is reduced ( Experimental Example 3 and A) of FIG. 2, it is known that the activity of caspase-3 is related to the depletion of glutathione.
  • the concentration of glutathione in the respiratory cell decreases, respiratory cell death occurs, causing respiratory diseases such as bronchitis, alveolitis, and emphysema.
  • composition of the present invention which inhibits the decrease in the concentration of glutathione in the respiratory cell can be usefully used for the prevention and treatment of the above diseases associated with the reduction in the respiratory intracellular concentration of glutathione.
  • Human bronchial smooth muscle cells (PromoCell GmbH, Germany) were prepared according to PromoCell's instructions for 0.5 ng / ml epidermal growth factor and 2 ng / ml basic fibroblast growth factor. 5% CO 2 in smooth muscle cell basal medium with 5 ⁇ g / ml insulin, 5% fetal calf serum, 50 ⁇ g / ml amphotericin B, and 50 ng / ml gentamycin Cultured in a humidified air at 37 °C containing. The culture medium was changed every two days.
  • Tobacco smoke extract was prepared according to the method of Nana-Sinkam (Nana-Sinkam SP, et al., 2007. Prostacyclin prevents pulmonary endothelial cell apoptosis induced by cigarette smoke.Am J Respir Crit Care Med 175 (7): 676-685) .
  • one filterless Camel cigarette R.J. Reynolds, USA
  • PBS phosphate-buffered saline
  • This 100% tobacco smoke extract was brought to pH 7.4 and filtered through a 0.2 ⁇ m pore filter (Minisart, Germany) to remove bacteria and impurities.
  • the extracted tobacco smoke extract was diluted to an appropriate concentration and added to human bronchial smooth muscle cells within 10 minutes after the tobacco smoke extract was prepared.
  • Raw garlic was harvested from the South Sea.
  • Raw garlic and black garlic were supplied from a garlic processing plant operated in the Southwest Sea Agricultural Cooperatives and aged in a chamber that can control the temperature and time to change the inside of the garlic into reddish brown.
  • each piece of raw garlic was processed in a microwave oven (400W-600W) for 5 minutes, and then fixed using a stainless steel pan so that the height of the garlic pieces is less than 4 cm. Thereafter, the pan was placed in an incubator and aged at a temperature of 90 ° C. and a humidity of 60% for 24 hours. After 24 hours, the fresh garlic pieces were further aged for 30 hours after decreasing the temperature and humidity to 50 ° C. and 50%, respectively.
  • the residue was reextracted three times under the same conditions.
  • the hot water garlic extract was filtered through Whatman filter paper (Grade No. 2; Whatman International Ltd, UK), lyophilized to a powder form, and stored at -40 ° C until analysis.
  • the concentration was adjusted by dissolving the dried garlic powder in the DW solution.
  • the red garlic extract dissolved in the DW solution was dialyzed at 4 ° C. for 5 hours using a molecular weight cut-off of 2500.
  • the red garlic extract was dialyzed five times and divided into dialysis inner solution (IM solution) and dialysis outer solution (OM solution). Each solution was lyophilized to prepare a powder in powder form, and then stored at -20 ° C.
  • an MTT assay was performed as follows. Exponentially growing cells were dispensed at 4 ⁇ 10 4 cells / ml in 24 well plates. After 24 hours, cells of each well were treated with tobacco smoke extract at a concentration of 0.1 to 10%, and 20 ⁇ l of 5 mg / ml MTT solution (Duchefa, Netherlands) was added to each well (0.1 mg / ml) and incubated for 4 hours. .
  • the cell viability of each well was treated with 10% tobacco smoke extract, various concentrations of garlic, black garlic, red garlic extract, and dialysis inner solution or dialysis external liquid of red garlic extract, respectively.
  • Figure 1 A shows the effect of tobacco smoke extract of various concentrations on the survival of human bronchial smooth muscle cells.
  • 1A the survival rate of cells exposed to 1%, 3%, 5% and 10% tobacco smoke extracts for 24 hours decreased to 13%, 18%, 18% and 30%, respectively, compared to the control group. It was. Tobacco smoke extract at a concentration of 0.1% to 0.5% had some effect on apoptosis.
  • FIG. 1C shows cells treated with human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extracts of green garlic (FRG), black garlic (ABG) or red garlic (ARG) at 0.01%, 0.1% and 1% concentrations, respectively.
  • the change in survival rate is compared with the control group.
  • the cell survival rate of the human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract did not increase compared to the control group, but the cell survival rate of the red garlic extract of 1% did not increase. Significant increase compared to this control.
  • FIG. 1D is a diagram showing a change in cell viability when various concentrations of red garlic were treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • the first bar on the left of D of FIG. 1 represents the survival rate (100%) of human bronchial smooth muscle cells not exposed to tobacco smoke, and the second bar on the left shows the survival of human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract. (54.2 ⁇ 4.8%).
  • the cell survival rate was 79.0 ⁇ 10.9%.
  • E and F of Figure 1 is a diagram showing a change in cell viability when treated with human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract dialysis solution and dialysis solution of red garlic extract of various concentrations.
  • 0.3% and 1% red garlic extract dialysis solution was found to have an effect of preventing cell death by tobacco smoke.
  • the red garlic extract dialysis external fluid prevents cell death by tobacco smoke at 0.1%, 0.3% and 1% concentration.
  • the dialysis external liquid contains high molecular weight browning substance
  • the dialysis inner liquid contains high molecular weight browning substance, so that the active substance plays a pivotal role in preventing the cell death from low molecular weight browning substance in red garlic extract. Implies that it is included.
  • FLICA a fluorochrome inhibitor of caspase
  • FAM-VAD-FMK valylalanylaspartic acid fluoromethyl ketone
  • the experiment was performed as follows. First, human bronchial smooth muscle cells were treated with 10% tobacco smoke extract at 37 ° C. for 12 hours and then cultured together. Samples of 300 ⁇ L were collected from each sample of cells growing at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and then diluted FAM-VAD-FMK (1:30, 10 ⁇ L) was added. Cells were labeled with FAM-VAD-FMK at 37 ° C. for 60 minutes. The cells were then washed three times using 1 ⁇ wash buffer. After washing, caspase activity was measured using a band pass filter of 488 nm (excitation wavelength) and 518 nm (emission wavelength).
  • FIG. 1B is a diagram showing cells in which apoptosis occurs when 10% tobacco smoke extract is treated to human bronchial smooth muscle cells.
  • the cells stained by FLICA in FIG. 1B represent cells in which apoptosis occurred, and human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract showed more apoptosis than the control group.
  • GSH content of human bronchial smooth muscle cells was measured by a total GSH detection kit (Assay Designs, Ann Arbor, USA) using a dithionitrobenzoic acid-glutathione disulfide (DTNB-GSSG) reductase recycling assay system.
  • DTNB-GSSG dithionitrobenzoic acid-glutathione disulfide
  • the suspension of homogenized cells was mixed in a GSH reducing agent and a micro plate. Absorbance was measured 10 times at 1 minute intervals at a wavelength of 405 nm using a plate reader (Infinite F200, Tecan, Switzerland).
  • the reduced GSH concentration was obtained by subtracting the oxidized GSH (GSSG) concentration measured from the sample treated with 4-vinylpyridine at the total GSH concentration.
  • the formula used is as follows.
  • FIG. 2A is a diagram showing changes in intracellular GSH concentrations when red garlic extract, L-BSO, and GSH were treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • the GSH concentration of the cells exposed to 10% tobacco smoke extract was significantly reduced compared to the control group.
  • the red garlic extract was treated, the decrease in GSH concentration was significantly inhibited.
  • L-BSO a GSH synthesis inhibitor, was treated with red garlic extract, it did not show an effect of inhibiting the decrease of GSH concentration caused by tobacco smoke, but when L-BSO was treated with GSH, It was confirmed that the GSH concentration inhibits the decrease.
  • 2D is a diagram showing the change in cell viability when treated with red garlic extract, L-BSO, GSH to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • red garlic extract when the red garlic extract was treated with human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract, cell survival was increased compared to the control group, but when the red garlic extract and L-BSO were treated together, tobacco It was confirmed that it did not prevent apoptosis by smoke.
  • the treatment of GSH was confirmed that cell proliferation was increased by increasing the cell survival rate compared to the case of no treatment to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke.
  • Human bronchial smooth muscle cells were cultured by exposing to 10% tobacco smoke extract without the red garlic extract. Human bronchial smooth muscle cells were treated with 5 ⁇ M dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA; Calbiochem, USA) for 30 minutes and incubated in a light-free environment. After incubation, the cells were washed three times with PBS and immediately measured fluorescence intensity using confocal laser scanning microscope (IX70 Fluoview; Olympus, Japan). 488 nm and 518 nm lasers were irradiated to cells to detect green fluorescence ((H2DCFDA). The fluorescence images were stored in TIFF format and analyzed using Fluoview software program (version 2.0, Olympus).
  • 2B is a photograph showing ROS generation when the red garlic extract was treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • NAC N-acetylcysteine
  • the cells were then incubated on ice for 30 minutes with intermittent vortexing. After incubation, the extract was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. using a centrifuge (16,609 ⁇ g; Micro 17TR, Hanil, Korea).
  • the supernatants were separated using 8% SDS-polyacrylamide gels and then transferred to PVDF membranes using semi-dry transfer (Bio-Rad, USA) for 15 minutes.
  • the membranes were blocked using 5% nonfat dry milk and then heme oxygenase-1 (HO-1, oxidant sensing protein) polyclonal antibody (1: 1000 dilution; Biovision, USA) and ⁇ -tubulin monoclonal antibody (1: 10,000 dilution).
  • the secondary peroxidase conjugated anti-rabbit or anti-mouse antibody was incubated together at a ratio of 1: 10,000. Immuno-positive bands were visualized by chemiluminescence (enhanced chemiluminescence, ECL Plus kit; ELPIS, Korea).
  • a luminescence image analyzer LAS-4000 (Fujifilm corp, Japan) was used to capture Western blot images.
  • SigmaGel image analysis software version 1.0; Jandel Scientific, USA
  • Quantity One software version 4.6.3; Bio-Rad, USA
  • FIG. 2C is a diagram showing a change in HO-1 expression level when red garlic extract or NAC was treated to human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke extract.
  • HO-1 expression level of human bronchial smooth muscle cells exposed to 10% tobacco smoke increased time dependently (a), but HO-1 expression level decreased by NAC (b).
  • the red garlic extract was also found to have an effect of attenuating HO-1 expression by tobacco smoke (b and c).

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Abstract

본 발명은 홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 홍마늘 추출물이 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제시키므로 상기 홍마늘 추출물을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법 및 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 조성물에 관한 것이다.
담배연기는 이 세상에서 존재하는 가장 복잡한 구조의 혼합물 가운데 하나로 담배에 불을 붙여 피우게 되면 약 4,000가지 이상의 물질이 생성되며 이것은 공기중 산소의 양과 기온에 따라 다양하게 나타난다. 이러한 담배연기를 사람이 한 번 들이 마실 때에 약 50cc 정도의 담배연기가 식도 및 기관지를 거쳐 폐속으로 들어가게 되는데 그 중 일산화탄소(CO) 전량과 니코틴(Nicotine)의 90％, 타르(Tar)의 70％가 몸속으로 흡수되며, 그 외에도 담배연기에는 페인트 제거에 사용되는 아세톤, 최루탄에 사용되는 포름알데히드, 방부제에 사용되는 나프티라민, 로켓연료에 사용되는 메타놀, 발암물질인 디메칠니트로사민, 좀약에 사용되는 나프 타린, 자동차의 배터리에 사용되는 카드늄, 자동차 배기가스 중 독성가스인 카본 모노사이드, 발암물질인 벤조피렌, PVC의 원료인 비닐크롤라이드, 청산가리, 암모니아, 산업용 용제에 사용되는 우레탄, 비소, 부탄, 폴로늄, 살충제인 DDT 등 약 4,000여 가지의 화학적 성분이 포함되어 있고, 이 중 40가지 정도는 암을 유발하는 발암물질로 알려져 있다.
이와 같이, 담배연기에는 발암물질을 비롯하여 다양한 종류의 물질을 포함하고 있어 흡연자 뿐만 아니라, 흡연자 주변에서 담배연기를 흡입하게 되는 간접 흡연자에게도 악영향을 미치게 된다. 담배연기를 흡입함으로써 발생하는 대표적인 질환은 폐기종, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐암 등의 호흡기 질환이다.
한편, 마늘(Allium sativum L.)은 전국에서 재배되는 다년생 초본으로서 그 인경을 약재 또는 식품 재료로 널리 사용하며, 그 구성 성분으로는 칼슘, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 C 등의 성분이 알려져 있으며, 항암작용, 항진균 작용, 항원충작용 등이 보고된 바가 있다. 이러한 마늘은 생으로 섭취하는 것이 영양 및 그 효과면에서 가장 바람직하나, 마늘 특유의 냄새와 매운맛으로 인해 생으로 섭취하기가 상당히 곤란하였다. 최근에는 이러한 생마늘의 냄새와 맛을 개선하기 위하여 생마늘을 특정 조건에서 특정시간 동안 숙성시킨 흑마늘, 홍마늘 등이 제조되고 있다.
홍마늘은 특정온도에서 특정시간 동안 생마늘을 숙성함으로써 제조된 마늘가공품으로서, 본 발명자에 의해 제조되었다. 홍마늘은 생마늘에 비하여 맛과 향이 개선되어 섭취가 용이하고, 기존의 생마늘 가공품인 흑마늘보다 제조시간이 단축되어 오랜 숙성기간 동안 발생할 수 있는 유해물질의 발생 가능성이 감소된다.
이와 같이, 생마늘 또는 가공된 마늘에 대한 다양한 약리활성이 보고되어 있으나, 생마늘 또는 가공된 마늘이 담배연기의 흡입으로 인한 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 호흡기 질환의 치료효과를 가지고 있음은 아직까지 보고된 바 없다.
이러한 배경하에서, 본 발명자는 홍마늘 추출물이 담배연기에 의한 인간 기관지 평활근 세포의 사멸을 방지하는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 홍마늘 추출물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 효과를 나타내므로, 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 A는 다양한 농도의 담배연기 추출물(CSE)이 인간 기관지 평활근 세포의 생존에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 1의 B는 인간 기관지 평활근 세포에 10%의 담배연기 추출물을 처리한 경우 아포토시스가 일어난 세포를 보인 사진이다.
도 1의 C는 0.01%, 0.1% 및 1% 농도의 생마늘(FRG), 흑마늘(ABG) 또는 홍마늘(ARG)을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 각각 처리한 경우, 세포 생존율의 변화를 대조군과 비교한 도면이다.
도 1의 D는 다양한 농도의 홍마늘을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우, 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다.
도 1의 E 및 F는 다양한 농도의 홍마늘 추출물 투석 내액(IM solution) 및 투석 외액(OM solution)을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우, 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다.
도 2의 A는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우, 세포내 GSH의 농도 변화를 보인 도면이다.
도 2의 B는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물을 처리한 경우, ROS 생성을 보인 사진이다.
도 2의 C는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물 또는 NAC를 처리한 경우, HO-1의 발현 수준의 변화를 보인 도면이다.
도 2의 D는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우, 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 홍마늘 추출물의 용도를 제공한다.
상기 홍마늘은 기존의 생마늘을 특정조건 및 특정시간 동안 숙성시킴으로써 생마늘 특유의 냄새 및 매운 맛을 개선시킨 적갈색을 띄는 중간숙성 마늘로서 하기의 방법으로 제조되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
먼저, 각각의 생마늘 조각들을 400W-600W의 전자레인지에서 5분간 가공한 후 스테인레스 스틸 팬을 사용하여 마늘이 위치하는 높이가 아래로부터 4cm 미만이 되도록 고정한다. 그 후, 팬을 인큐베이터에 넣은 후 90℃의 온도, 60%의 습도에서 24시간 동안 숙성한다. 24시간 후, 온도와 습도를 각각 50℃, 50%로 감소시킨 후 마늘 조각들을 30시간 동안 더 숙성한다. 이후, 12시간 동안 50℃, 30시간 동안 5℃, 36시간 동안 70℃의 온도에서 더 숙성한다다. 숙성한 후, 30분내 온도를 40℃로 낮추고난 후 다시 30시간 동안 숙성과정을 진행하여 홍마늘을 제조할 수 있다.
본 발명은 홍마늘로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 홍마늘 추출물을 얻기 위한 추출방법에는 제한이 없다.
구체적으로, 생마늘로부터 제조된 홍마늘을 무기용매 또는 유기용매 추출을 통해 홍마늘 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명의 홍마늘 추출물은 바람직하게는 열수 추출법에 의해 추출할 수 있다.
무기용매 추출하는 경우, 제조된 홍마늘의 껍질을 벗기고 으깬 후, 10배 부피의 증류수와 혼합하고, 60℃ 이상, 바람직하게는 70℃ 이상의 온도에서 7시간 이상, 바람직하게는 8시간 이상 가열하고, 가열된 혼합물을 여과하여 추출할 수 있다. 이때, 70℃보다 높은 온도에서 가열하는 경우 시간은 줄어들지만 유효성분이 파괴되어 손실될 수 있고, 60℃ 보다 낮은 온도에서 가열하게 되면 혼합물의 유효성분이 완전 추출되지 않을 수 있다.
또한, 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출 유기용매도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올, 아세톤, 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 1,3-부틸렌글리콜을 이용하여 실온에서 또는 가온하여 추출할 수 있다.
최종 추출물은 부유하는 고체입자를 제거하기 위하여 나일론 등의 필터를 이용하거나 냉동여과법에 의해 여과시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 홍마늘 추출물에 포함될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 홍마늘 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
상기 호흡기 세포는 호흡을 담당하는 코, 입, 기관지, 폐, 폐포 또는 가로막(횡경막) 등의 기관을 구성하는 세포로서, 바람직하게는 기관지, 폐, 폐포를 구성하는 평활근 세포이며, 보다 바람직하게는 기관지 평활근 세포이다.
상기 평활근은 장방추형의 근세포로 횡문이 없고 불수의근으로 내장기관에서 내용물을 이동하는 벽의 율동적 수축 활동을 하며, 식도에서 직장까지의 관벽, 기관지, 호흡기의 통로, 기관벽, 방광벽, 맥관벽, 생식기관의 대부분, 안구의 모양근, 동공 괄약근 등을 구성한다.
평활근은 평활근 세포로 구성되어 있는데, 상기 기관지 평활근 세포는 기관지 평활근을 구성하는 세포로서 기관지 평활근 세포가 사멸하게 되면 기도변형(airway remodeling) 등이 야기되어 여러 가지 호흡기 질환이 발병하게 되는 등 호흡기에 심각한 기능손실을 초래하게 된다.
상기 호흡기 세포의 사멸은 호흡기 세포의 죽음을 의미하며, 세포괴사, 아포토시스, 네크로시스 등을 포함하며, 바람직하게는 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포의 아포토시스, 세포괴사, 네크로시스 등의 호흡기 세포 사멸일 수 있다.
담배연기는 담배에 불을 붙여 피우게 되면 발생하는 약 4,000가지 이상의 화학물질을 포함하는 기체로서 공기 중 산소의 양과 기온에 따라 다양한 성분이 혼합된 담배연기가 발생하며, 코와 입을 통하여 호흡기로 흡입되어 호흡기 세포의 사멸을 초래한다.
담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포의 사멸은 담배연기가 코와 입을 통하여 호흡기에 도달하게 되면 담배연기에 포함된 유해한 화학성분에 의해 호흡기 세포의 사멸이 일어난다. 본 발명의 실험예 1을 보면 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 생존율이 급격하게 감소함을 알 수 있다(도 1의 A).
호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환은 정상적인 기능을 하고 있는 호흡기 세포가 사멸함에 따라 호흡기에 심각한 기능손실이 발생하여 발병하는 호흡기 질환을 의미하며, 기관지 천식, 폐기종(폐섬유화증), 만성 폐쇄성 폐기종, 소엽중심성 폐기종(centrilobular emphysema), 방선방성 폐기종(panacinar pulmonary emphysema), 급성 기관지염, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome), 반응성 호흡관 질환, 낭포성 섬유증, 기관지확장증, 후천성 기관지확장증, 카르타게너 증후군(Kartagener's syndrome), 선천성무기폐(apneumatosis), 급성 선천성무기폐, 만성 선천성무기폐, 폐렴, 본태성 혈소판감소증, 레지오넬로시스병(legionellosis), 앵무새병 (parrot disease), 섬유조직형성 규소폐증(pneumoconiocis), 폐의 과민성, 만성 폐쇄성 폐질환 및 특발성 침습성 폐 장애 (idiopathic invasive lung disorder) 등을 포함한다.
상기 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환은, 바람직하게는 폐기종, 소엽중심성 폐기종, 방선방성 폐기종, 기관지염, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암일 수 있다.
상기 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 및 폐암은 흡연이 직접적인 원인으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 및 폐암 등의 호흡기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 홍마늘 추출물은 담배연기에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 생존율을 높이고, 궁극적으로 세포의 증식을 유도하며(실험예 1 및 도 1의 C 내지 F, 도 2의 D), 담배연기에 의한 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 효과(실험예 3 및 도 2의 A)를 보였다. 따라서, 홍마늘 추출물은 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "개체"란 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 조성물로 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환을 앓고 있는 인간을 비롯한 동물에게 투여함으로써 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물은 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명의 홍마늘 추출물을 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강 식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태에 해당한다.
본 발명의 홍마늘 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 조성물을 제공한다.
상기 글루타티온(Glutathione, GSH)은 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine)의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1~10 mM의 농도로 존재하는 생리활성 물질이다. 생체내에서 글루타티온은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할, GST(glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질과 콘쥬게이션되어 해독 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 실험예에 따르면, 담배연기에 의한 인간 기관지 평활근 세포의 사멸은 카스페이즈의 활성을 수반하고(실험예 2 및 도 1의 B), 세포내 글루타티온의 농도를 감소시킴을 알 수 있으며(실험예 3 및 도 2의 A), 카스페이즈-3의 활성은 글루타티온의 고갈과 관련되어 있음이 알려져 있다. 결국, 글루타티온의 호흡기 세포내 농도가 감소하면 호흡기 세포의 사멸이 일어나고, 기관지염, 폐포염, 폐기종 등의 호흡기 질환을 야기하게 된다.
따라서, 호흡기 세포내 글루타티온의 농도의 감소를 억제하는 본 발명의 조성물은 글루타티온의 호흡기 세포내 농도 감소와 관련되는 상기 질환들의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험재료의 준비
1-1. 세포배양
인간 기관지 평활근 세포(human bronchial smooth muscle cells; PromoCell GmbH, Germany)를 PromoCell사의 설명서에 따라 0.5 ng/ml 표피생장인자(epidermal growth factor), 2 ng/ml 염기성 섬유모세포 생장인자(basic fibroblast growth factor), 5 μg/ml 인슐린, 5% 소태아 혈청(fetal calf serum), 50 μg/ml 암포테리신 B(amphotericin B), 및 50 ng/ml 젠타마이신을 첨가한 평활근 세포 기저 배지에서 5% CO2를 포함하는 37℃의 가습공기에서 배양하였다. 배양배지는 2일마다 교체하였다.
1-2. 담배연기 추출물의 제조
담배연기 추출물 Nana-Sinkam의 방법에 따라 제조하였다(Nana-Sinkam SP, et al., 2007. Prostacyclin prevents pulmonary endothelial cell apoptosis induced by cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med 175(7):676-685). 먼저, 필터가 없는 카멜 담배(Camel cigarette, R.J. Reynolds, USA) 하나를 100%의 담배연기 추출물을 생산하는 진공펌프를 사용하여 포스페이트 버퍼 살린(phosphate-buffered saline, PBS) 10 ml에 통과시켰다. 이 100% 담배연기 추출물을 pH가 7.4가 되도록 하고, 박테리아 및 불순물을 제거하기 위하여 0.2 μm 공극필터(Minisart, Germany)를 통과시켜 여과시켰다.
추출된 담배연기 추출물을 적절한 농도로 희석하였고, 담배연기 추출물이 제조된지 10분 안에 인간 기관지 평활근 세포에 첨가하였다.
1-3. 홍마늘의 제조를 위한 숙성
생마늘은 남해에서 수확한 것을 사용하였다. 생마늘 및 흑마늘은 서남해 농협에서 운영하는 마늘 가공공장으로부터 공급받아 생마늘 내부를 적갈색으로 변화시키는 온도와 시간을 조절할 수 있는 챔버에서 숙성시켰다. 홍마늘의 숙성과정을 살펴보면, 먼저 각각의 생마늘 조각들을 전자레인지(400W-600W)에서 5분간 가공한 후, 스테인레스 스틸 팬을 사용하여 마늘 조각이 위치하는 높이가 4cm 미만이 되도록 고정하였다. 그 후, 팬을 인큐베이터에 넣은 후 90℃의 온도, 60%의 습도에서 24시간 동안 숙성하였다. 24시간 후, 온도와 습도를 각각 50℃, 50%로 감소시킨 후 생마늘 조각들을 30시간 동안 더 숙성하였다. 이후, 12시간 동안 50℃의 온도, 30시간 동안 5℃의 온도, 36시간 동안 70℃의 온도에서 더 숙성하였다. 숙성 후, 30분안에 온도를 40℃로 낮추고 다시 30시간 동안 숙성과정을 진행하여 홍마늘을 제조하였다.
1-4. 마늘 열수 추출물의 제조
모든 마늘조각의 껍질을 벗기고 으깨었다. 으깬 생마늘, 흑마늘, 홍마늘을 10배 부피의 DW 용액(100g/1000ml)과 혼합한 후 70℃의 물에서 8시간 동안 추출하였다.
잔류물을 같은 조건으로 세 번 재추출하였다. 열수 마늘 추출물을 Whatman 여과지(Grade No. 2; Whatman International Ltd, UK)를 통과시켜 여과한 후, 동결건조하여 파우더 형태의 분말로 만든 후 분석하기 전까지 영하 40℃의 온도에서 저장하였다. 건조된 마늘 분말을 DW 용액에 용해시킴으로써 농도를 조절하였다.
1-5. 수용성 갈변물질(water soluble browning reaction products)의 분리
DW 용액에 용해된 홍마늘 추출물을 투석용 백(molecular weight cut-off of 2,500)을 사용하여 4℃에서 5시간 동안 투석하였다. 홍마늘 추출물을 5번 투석하여 투석 내액(IM solution) 및 투석 외액(OM solution)으로 나누었다. 각 용액을 동결건조하여 파우더 형태의 분말로 제조한 후, 영하 20℃에서 저장하였다.
실험예 1. 세포 생존율 측정(MTT assey)
인간 기관지 평활근 세포에 대한 담배연기 추출물의 독성을 조사하기 위하여 하기와 같이 MTT 에세이를 수행하였다. 지수적으로 성장하는 세포들을 24 웰 플레이트에 4×104 cells/ml로 분주하였다. 각 웰의 세포에 0.1 내지 10% 농도의 담배연기 추출물을 처리하고 24시간 후에, 5 mg/ml MTT 용액(Duchefa, Netherlands) 20μl를 각 웰(0.1 mg/ml)에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 상청액을 빨아내고, 각 웰의 포르마잔 결정(formazan crystals)을 200 μl의 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 37℃에서 30분 동안 용해시킨 후, 24 웰 플레이트를 마리크로 리더(Bio-Rad, USA)로 측정하였다.
또한, 각 웰의 세포에 10% 담배연기 추출물과 다양한 농도의 마늘, 흑마늘, 홍마늘 추출물, 홍마늘 추출물의 투석 내액 또는 투석 외액을 각각 처리한 후 동일한 방법으로 세포 생존율을 측정하였다.
도 1의 A는 다양한 농도의 담배연기 추출물이 인간 기관지 평활근 세포의 생존에 미치는 영향을 나타낸다. 도 1의 A를 보면, 24시간 동안 1%, 3%, 5% 및 10% 농도의 담배연기 추출물에 노출시킨 세포의 생존율은 대조군에 비하여 각각 13%, 18%, 18% 및 30%로 감소하였다. 0.1% 내지 0.5% 농도의 담배연기 추출물은 세포사멸에 약간의 영향을 미쳤다.
도 1의 C는 0.01%, 0.1% 및 1% 농도의 생마늘(FRG), 흑마늘(ABG) 또는 홍마늘(ARG)을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 각각 처리한 경우, 세포 생존율의 변화를 대조군과 비교한 도면이다. 도 1의 C를 보면, 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 생마늘 및 흑마늘을 처리한 경우 세포 생존율이 대조군에 비해 증가하지 않았으나, 1%의 홍마늘 추출물을 처리한 경우에는 세포 생존율이 대조군에 비하여 상당히 증가하였다.
도 1의 D는 다양한 농도의 홍마늘을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다. 도 1의 D의 왼쪽에서 첫 번째 막대는 담배연기에 노출되지 않은 인간 기관지 평활근 세포의 생존율(100%)을 나타내며, 왼쪽에서 두 번째 막대는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 생존율(54.2±4.8%)을 나타낸다. 도 1의 D를 보면, 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 1%의 홍마늘 추출물을 처리한 경우 세포 생존율이 79.0±10.9%로 담배연기에 의한 세포사멸이 상당히 감소하였음을 알 수 있었다.
도 1의 E 및 F는 다양한 농도의 홍마늘 추출물 투석 내액 및 투석 외액을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우, 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다. 도 1의 E를 보면, 0.3% 및 1% 홍마늘 추출물 투석 내액이 담배연기에 의한 세포사멸을 방지하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 도 1의 F를 보면, 홍마늘 추출물 투석 외액이 0.1%, 0.3% 및 1% 농도에서 담배연기에 의한 세포사멸을 방지함을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 투석 외액은 저분자량의 갈변물질을 많이 함유하고, 투석 내액은 고분자량의 갈변물질을 많이 함유하므로 홍마늘 추출물에서 저분자량의 갈변물질에 세포 사멸을 방지하는데 중추적인 역할을 하는 활성물질이 포함되어 있는 것임을 시사한다.
실험예 2. 카스페이즈(Caspase)의 활성 측정
카스페이즈의 활성을 측정하기 위하여 FLICA(a fluorochrome inhibitor of caspase) apoptosis detection kit(Immunochemistry Technologies, USA)을 사용하였다. FAM-VAD-FMK(valylalanylaspartic acid fluoromethyl ketone)의 녹색형광으로 표지된 카복시플루오레신(carboxyfluorescein) 유도체는 카스페이스 활성의 강한 억제제이다.
실험은 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 인간 기관지 평활근 세포를 37℃에서 12시간 동안 10%의 담배연기 추출물을 처리한 후 함께 배양하였다. 1×106 cells/ml의 농도로 세포들이 성장하고 있는 각 시료에서 300 μL의 표본을 채취한 후, 희석된 FAM-VAD-FMK(1:30, 10 μL)를 첨가하였다. 세포들은 37℃에서 60분 동안 FAM-VAD-FMK로 표지시켰다. 그 후, 세포들을 1×세척 버퍼를 사용하여 세 번 세척하였다. 세척한 후, 488 nm(excitation wavelength)와 518 nm(emission wavelength)의 band pass filter를 사용하여 카스페이즈 활성을 측정하였다.
도 1의 B는 인간 기관지 평활근 세포에 10% 담배연기 추출물을 처리한 경우 아포토시스가 일어난 세포를 보인 도면이다. 도 1의 B에 FLICA에 의해 염색된 세포는 아포토시스가 일어난 세포를 나타내며, 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포는 대조군에 비하여 아포토시스가 많이 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 담배연기에 의해 호흡기 세포 사멸이 발생함을 나타낸다.
실험예 3. 세포내 글루타티온(GSH)의 함량 측정
인간 기관지 평활근 세포의 GSH 함량은 dithionitrobenzoic acid-glutathione disulfide(DTNB-GSSG) reductase recycling assay 시스템을 사용하는 total GSH detection kit(Assay Designs, Ann Arbor, USA)로 측정하였다. 먼저, 균질화된 세포들의 현탁액을 GSH 환원제와 마이크로 플레이드에서 혼합하였다. 흡광도는 플레이트 리더(Infinite F200, Tecan, Switzerland)를 사용하여 405 nm의 파장에서 1분 간격으로 10번 측정하였다. 환원된 GSH 농도는 전체 GSH 농도에서 4-vinylpyridine을 처리한 시료로부터 측정된 산화된 GSH(GSSG) 농도를 공제하여 구하였다. 사용한 식은 다음과 같다.
환원된 GSH = 전체 GSH - GSSG
도 2의 A는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우, 세포내 GSH 농도 변화를 보인 도면이다. 도 2의 A와 같이, 10% 담배연기 추출물에 노출된 세포의 GSH 농도가 대조군에 비하여 상당히 감소하였으나, 홍마늘 추출물을 처리한 경우에는 담배연기에 의한 GSH 농도 감소가 상당히 억제되었다. 그러나, GSH 합성 억제제인 L-BSO를 홍마늘 추출물과 함께 처리한 경우에 담배연기에 의한 GSH 농도 감소를 억제하는 효과를 보이지 못했으나, L-BSO를 GSH와 함께 처리한 경우에는 담배연기에 의한 GSH 농도가 감소되는 것을 억제시킴을 확인하였다. 이러한 결과는 홍마늘 추출물이 인간 기관지 평활근 세포의 GSH 생산에 영향을 미치고 있음을 나타낸다.
도 2의 D는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다. 도 2의 D를 보면, 홍마늘 추출물을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 대조군에 비하여 세포 생존율이 증가하였으나, 홍마늘 추출물과 L-BSO를 함께 처리한 경우에는 담배연기에 의한 세포사멸을 방지하지 못하는 것으로 확인되었다. 또한, GSH를 처리한 경우에는 10% 담배연기에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 아무것도 처리하지 않은 경우에 비하여 세포 생존율이 증가하여 세포증식이 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 홍마늘 추출물에 GSH 생성을 야기하는 효과가 있음을 나타낸다.
실험예 4. ROS 생성 수준 측정
인간 기관지 평활근 세포를 홍마늘 추출물 없이 10%의 담배연기 추출물에 노출시켜 배양하였다. 인간 기관지 평활근 세포에 빛이 없는 환경에서 5 μM dichlorodihydrofluorescein(H2DCFDA; Calbiochem, USA)를 30분 동안 처리하고 배양하였다. 배양 후, 세포들을 PBS로 세 번 세척하고, 즉시 공초점 레이저 주사 현미경(IX70 Fluoview; Olympus, Japan)을 사용하여 형광강도를 측정하였다. 녹색 형광((H2DCFDA)을 검출하기 위하여 488 nm 및 518 nm 레이저를 세포에 조사시켰다. 형광 이미지는 TIFF 포맷으로 저장한 후, Fluoview 소프트웨어 프로그램(version 2.0, Olympus)을 사용하여 분석하였다.
도 2의 B는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물을 처리한 경우 ROS 생성을 보인 사진이다. 도 2의 B를 보면, 10% 담배연기 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 ROS가 2배 정도 더 생성되었고, 담배연기에 의한 ROS 생성은 ROS 스캐빈져(scavenger)인 NAC(N-acetylcysteine)을 전처리함으로써 감소하였다. 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물을 처리한 경우에도 NAC를 처리한 경우와 유사하게 ROS 생성이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 웨스턴 블랏
인간 기관지 평활근 세포를 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol(DTT), 0.5% nonyl phenoxylpolyethoxylethanol(NP-40), 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 1 μM leupeptin, 1 μM pepstatin A, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) 및 0.1 μM aprotinin을 포함하는 단백질 추출 용액(PRO-PREPTM; iNtRON Biotechnology Inc, Korea)에 혼합한 후 균질화 하였다. 이 후, 세포들을 간헐적인 볼텍싱을 하면서 30분 동안 얼음에서 배양하였다. 배양한 후, 추출물을 원심분리기(16,609×g; Micro 17TR, Hanil, Korea)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다.
상청액을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분리한 후, 15분 동안 semi-dry transfer(Bio-Rad, USA)를 사용하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 5% 무지방 분유를 사용하여 막은 후, heme oxygenase-1(HO-1, oxidant sensing protein) 폴리클로날 항체(1:1000 희석; Biovision, USA) 및 α-tubulin 모노클로날 항체(1:10,000 희석)와 함께 배양하였다. 1차 항체와 함께 배양한 후에 이차 퍼옥시다제 공액 항-레빗 또는 항-마우스 항체(secondary peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse antibody)를 1:10,000의 비율로 함께 배양하였다. 면역 양성 밴드(Immuno-positive bands)는 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL Plus kit; ELPIS, Korea)에 의해 시각화하였다.
웨스턴 블랏 이미지를 캡쳐하기 위하여 발광 이미지 분석기 LAS-4000 (Fujifilm corp, Japan)을 사용하였다. 밴드의 수치화를 위하여 SigmaGel 이미지 분석 소프트웨어(version 1.0; Jandel Scientific, USA) 및 Quantity One 소프트웨어(version 4.6.3; Bio-Rad, USA)를 사용하였다.
도 2의 C는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물 또는 NAC를 처리한 경우, HO-1 발현 수준의 변화 양상을 보인 도면이다. 도 2의 C를 보면, 10% 담배연기에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 HO-1 발현 수준이 시간 의존적으로 증가하였으나(a), NAC에 의해서는 HO-1 발현 수준이 감소하였다(b). 홍마늘 추출물 또한 담배연기에 의한 HO-1 발현 증가를 약화시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(b 및 c). 이러한 결과는 홍마늘 추출물이 HO-1의 기능을 대체함으로써 HO-1 없이도 담배연기에 의한 세포사멸을 방지할 수 있음을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 호흡기 세포의 사멸은 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포의 사멸인 것인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 홍마늘 추출물은 열수 추출된 것인 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 홍마늘 추출물은 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 것인 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환은 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암인 것인 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 호흡기 세포는 기관지 평활근 세포인 것인 조성물.
  7. 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소 억제용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소는 담배연기 흡입으로 인한 글루타티온의 농도 감소인 것인 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 호흡기 세포는 기관지 평활근 세포인 것인 조성물.
  11. 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환은 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암인 것인 방법.
  13. 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소는 담배연기 흡입으로 인한 글루타티온의 농도 감소인 것인 방법.
  15. 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 홍마늘 추출물의 용도.
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