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WO2010021126A1 - 糖タンパク質の製造方法及びスクリーニング方法 - Google Patents

糖タンパク質の製造方法及びスクリーニング方法 Download PDF

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Publication number
WO2010021126A1
WO2010021126A1 PCT/JP2009/003932 JP2009003932W WO2010021126A1 WO 2010021126 A1 WO2010021126 A1 WO 2010021126A1 JP 2009003932 W JP2009003932 W JP 2009003932W WO 2010021126 A1 WO2010021126 A1 WO 2010021126A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycoprotein
amino acid
sugar chain
fraction
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/003932
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
梶原康宏
深江一博
Original Assignee
大塚化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大塚化学株式会社 filed Critical 大塚化学株式会社
Priority to JP2010525594A priority Critical patent/JP5530358B2/ja
Priority to EP09808062.5A priority patent/EP2330114B1/en
Priority to DK09808062.5T priority patent/DK2330114T3/da
Priority to AU2009283678A priority patent/AU2009283678B2/en
Priority to RU2011110430/04A priority patent/RU2520240C2/ru
Priority to ES09808062.5T priority patent/ES2646119T3/es
Priority to CA2734124A priority patent/CA2734124C/en
Priority to CN2009801323996A priority patent/CN102124024A/zh
Priority to US13/059,649 priority patent/US20110262945A1/en
Priority to BRPI0917298A priority patent/BRPI0917298B8/pt
Publication of WO2010021126A1 publication Critical patent/WO2010021126A1/ja

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    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
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    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
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    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
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    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8135—Kazal type inhibitors, e.g. pancreatic secretory inhibitor, ovomucoid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a glycoprotein having a uniform amino acid sequence, sugar chain structure and higher order structure.
  • glycoproteins As various drugs has been underway.
  • the sugar chain part of glycoprotein has a function of delaying metabolism from the blood by adding resistance to protease, a function as a signal controlling transport to organelles in cells, and the like. Therefore, by adding an appropriate sugar chain, it is possible to control the blood half-life of the glycoprotein and the intracellular transport.
  • EPO erythropoietin
  • This glycoprotein is a blood cell differentiation hormone having a function of maintaining the number of erythrocytes in peripheral blood by acting on erythroid progenitor cells and promoting their proliferation and differentiation.
  • glycoproteins may be recognized by macrophages in the blood and excreted from the blood even when the sugar chains are incomplete or when different sugar chains are bound.
  • glycoproteins are used as pharmaceuticals, it is desirable that sugar chains with a uniform structure be added to the same positions of each protein.
  • the present inventors have so far developed a method capable of producing a relatively large amount of a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and a sugar chain, using an amino acid whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group and a sugar chain asparagine as materials.
  • a method capable of producing a relatively large amount of a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and a sugar chain using an amino acid whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group and a sugar chain asparagine as materials.
  • Patent Document 1 an aminated complex-type sugar chain derivative and a glycoprotein that can maintain a sufficient blood concentration were developed (see Patent Document 2). Any glycoprotein is expected to be useful as a pharmaceutical product.
  • glycoprotein functions include not only amino acid sequences and sugar chain structures, but also higher order of protein parts.
  • the structure is also considered to be closely related.
  • Protein conformations are stabilized by hydrogen bonds between amino acid residues, ionic bonds, hydrophobic interactions, SS bonds between cysteine residues, and many proteins have their own conformation. Have. However, bonds other than the SS bond are relatively weak bonds, and the higher-order structure is broken by relatively mild heating or pressurization, and its physiological activity is reduced or lost. This is called protein denaturation. In particular, when the amino acid chain is long, a plurality of structures giving a minimum energy point are generated, so that an abnormal higher-order structure (misfolding) may occur. Also in this case, it is reported that the activity of the protein is changed or lost.
  • the present inventors synthesized glycoprotein fragments by the method according to Patent Document 1, and ligated with other peptide fragments by a natural chemical ligation method (Native Chemical Ligation, NCL method), thereby monocyte chemotaxis.
  • Protein-3 was synthesized. After folding the synthesized monocyte chemotactic protein-3, the position of the disulfide bond was confirmed by chymotrypsin treatment. As a result, about 90% of the glycoproteins had the disulfide bond formed at the correct position. % Was found to have a disulfide bond formed at a different position (Non-patent Document 1).
  • ovomucoid protein a kind of protein contained in egg white, is a glycoprotein whose function and structure have been studied relatively well.
  • Ovomucoid is a protein having a molecular weight of about 28,000, has three domains in the molecule, and each domain has inhibitory activity against different proteases.
  • the third domain has been studied in detail because it exhibits inhibitory activity even alone. So far, the structure of the third domain derived from 100 or more birds has been reported, and the three-dimensional structure has been clarified by X-ray crystallography.
  • the present invention produces glycoproteins having uniform physiological activity in addition to functions based on sugar chains such as blood half-life, that is, glycoproteins having uniform amino acid sequence, sugar chain structure, and higher order structure. It aims to provide a way to do.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for selecting a glycoprotein having a predetermined activity from a plurality of types of glycoproteins having different physiological activities, and to provide a mixture of glycoproteins having a desired activity.
  • the inventors of the present invention have found that when a third domain of an ovomucoid protein having a uniform amino acid sequence and sugar chain structure is synthesized and folded, a mixture containing a plurality of types of higher-order structures at a certain ratio can be obtained with good reproducibility. I found it. Then, when these were separated and measured for physiological activity, unlike the conventional understanding, there were multiple types of higher-order structures having the same type of physiological activity at a level recognized as relatively high activity; relatively high activity However, it was confirmed that there is a difference in activity depending on the higher-order structure; glycoproteins having different higher-order structures can be separated and purified by column chromatography.
  • a non-glycoprotein having a predetermined activity is unfolded and then folded again, it can be converted into a higher-order structure obtained at the above-mentioned fixed ratio, and therefore the unfolding / refolding process is repeated.
  • a glycoprotein having a higher order structure having a predetermined activity can be recovered to the maximum extent.
  • the present invention A method for producing a glycoprotein having a uniform amino acid sequence, sugar chain structure, and higher order structure, comprising the following steps (a) to (c): (A) folding a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain; (B) providing a method comprising fractionating the folded glycoprotein by column chromatography; and (c) collecting a fraction having a predetermined activity.
  • step (d) (D) a step of unfolding the glycoprotein contained in the fraction not collected in the step (c); (E) refolding the unfolded glycoprotein; (F) fractionating the refolded glycoprotein by column chromatography and collecting the fraction having the predetermined activity; and (g) repeating steps (d) to (f) as necessary. It is preferable that it is further included.
  • the present invention also provides A method for screening a glycoprotein having a predetermined physiological activity, comprising the following steps (i) to (iii): (I) folding a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain; (Ii) providing a method comprising fractionating the folded glycoprotein by column chromatography; and (iii) measuring the activity of each fraction and determining whether it has a predetermined activity.
  • the present invention also provides A method for obtaining a glycoprotein mixture having a desired physiological activity, comprising the following steps (A) to (D): (A) a step of folding a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain; (B) a step of fractionating the folded glycoprotein by column chromatography; (C) a step of measuring the activity of each fraction; and (D) obtaining a mixing ratio of each fraction for obtaining a desired activity and mixing each fraction according to the ratio.
  • At least a part of the glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain includes the following steps (1) to (6): (1) Hydroxyl group of a resin (resin) having a hydroxyl group and a carboxyl group of an amino acid whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group, or a carboxyl group of an amino acid with an amino group protected with a lipophilic protecting group And esterification reaction; (2) removing the fat-soluble protecting group to form a free amino group; (3) An amidation reaction between the free amino group and a carboxyl group of an amino acid whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group, or a carboxyl group of an amino acid with a sugar chain added whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group The step of causing; (4) After the step (3), removing the lipophilic protecting group to form
  • the glycoprotein further comprises the following step (7): (7) It is preferable to include a step of linking a part of the glycoprotein obtained in the step (6) with another peptide or glycopeptide by a ligation method.
  • a glycoprotein having a uniform higher order structure can be obtained, so that there is no variation in blood half-life and intracellular transport.
  • a glycoprotein having a predetermined physiological activity can be produced.
  • the glycoprotein screening method of the present invention it is possible to select a glycoprotein having a predetermined physiological activity uniformly from a group of glycoproteins in which the physiological activity varies due to different higher-order structures. it can. Since the glycoprotein has a uniform sugar chain structure, the functions based on sugar chains such as blood half-life and transport in cells are also uniform.
  • OMSVP3 ovomucoid third domain
  • the fragment 1 (thioester body) used for the chemical synthesis of OMSVP3 is shown.
  • Fragment 2 (thioester form) used for chemical synthesis of OMSVP3 having a sugar chain is shown.
  • Fragment 3 used for chemical synthesis of OMSVP3 is shown.
  • combination is shown.
  • combination is shown.
  • combination is shown.
  • level of the connection by the NCL method of the fragment 2 and the fragment 3 is shown.
  • level of the connection by the NCL method of the fragment 2 and 3 and the fragment 1 is shown.
  • a chromatogram at a wavelength of 220 nm when OMSVP3 having a sugar chain is folded and then separated by HPLC is shown.
  • the NMR spectrum of the fraction B of FIG. 10 is shown.
  • the CD spectrum of the fraction B of FIG. 10 is shown.
  • the measurement result of the inhibitory activity with respect to chymotrypsin of each fraction of FIG. 10 is shown.
  • the fragment 2 '(thioester form) used for the chemical synthesis of OMSVP3 having no sugar chain is shown.
  • combination is shown.
  • level of the connection by the NCL method of the fragment 2 'and the fragment 3 is shown.
  • level of the connection by the NCL method of the fragment 2 'and 3 and the fragment 1 is shown.
  • a chromatogram at a wavelength of 220 nm when OMSVP3 having no sugar chain is folded and then separated by HPLC is shown.
  • the NMR spectrum of the fraction F of FIG. 18 is shown.
  • FIG. 19 shows the CD spectrum of fraction F in FIG.
  • a calibration curve for fraction F is shown.
  • the inhibition rate of fraction AD against chymotrypsin is shown.
  • IC 50 values for fractions AD are shown.
  • the inhibition rate of fraction EH against chymotrypsin is shown.
  • IC 50 values for fractions EH are shown.
  • the CD spectrum by the temperature change of the fraction B is shown.
  • the CD spectrum by the temperature change of the fraction F is shown.
  • the chromatogram in wavelength 220nm in Thermolysin digestion with respect to the fraction B is shown.
  • the mass-spectrometry result of the peptide fragment after Thermolysin digestion with respect to the fraction B is shown.
  • the chromatogram in wavelength 220nm in Thermolysin digestion with respect to the fraction F is shown.
  • the mass-spectrometry result of the peptide fragment after Thermolysin digestion with respect to fraction F is shown.
  • the result of the position determination of the disulfide bond by Thermolysin digestion with respect to fraction B is shown.
  • the result of the position determination of the disulfide bond by Thermolysin digestion with respect to fraction F is shown.
  • a calibration curve of the substrate peptide is shown.
  • the substrate peptide Michaelis-Menten plot is shown.
  • the reaction rate per unit time of the substrate peptide is shown.
  • the “protein” is not particularly limited as long as a plurality of amino acids are bonded by an amide bond, and includes known proteins, novel proteins, and protein variants.
  • the protein portion of the glycoprotein obtained by the production method of the present invention has a plurality of amino acids linked by the same amide bond (peptide bond) as that of the natural type.
  • the protein in the present specification has a length capable of taking a predetermined higher order structure by folding.
  • a “protein variant” is a compound obtained by natural or artificial modification of a protein.
  • modification include alkylation, acylation of one or more amino acid residues of a protein. (Eg, acetylation), amidation (eg, C-terminal amidation of protein), carboxylation, ester formation, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, phosphorylation, hydroxylation, binding of label components, etc. It is done.
  • peptide is used in the same meaning as protein in principle, but may be used to indicate a part of the protein or a relatively short amino acid chain that does not have a higher-order structure.
  • amino acid is used in its broadest sense, and is a natural amino acid such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Ler), isoleucine (Ile), alanine.
  • Al tyrosine
  • Tyr glycine
  • Gly lysine
  • Lys lysine
  • Arg arginine
  • His histidine
  • aspartic acid Aspartic acid
  • Glu glutamic acid
  • Glu glutamine
  • Gln glutamine
  • Thr threonine
  • amino acids in the present specification, for example, L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, ⁇ -alanine, ornithine It will be understood that amino acids that are not constituents of proteins in vivo, such as chemically synthesized compounds having amino acid properties known to those skilled in the art, and the like.
  • unnatural amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo” amino acids), and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid) .
  • ⁇ -methyl amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • D-amino acids histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine, etc.
  • amino acids with extra methylene in the side chain (“homo” amino acids)
  • the protein portion of the glycoprotein obtained by the production method of the present invention consists entirely of amino acids that are present in the living body as protein or constituent amino acids of the glycoprotein.
  • glycoprotein is not particularly limited as long as it is a compound in which at least one sugar chain is added to the protein, and includes known glycoproteins and novel glycoproteins.
  • glycopeptide is used in the same meaning as a glycoprotein in principle, but may also refer to a part of a glycoprotein or a sugar chain bound to the above peptide.
  • the glycoprotein obtained by the production method of the present invention is a protein having an N-linked sugar chain or an O-linked sugar chain.
  • erythropoietin, interleukin, interferon- ⁇ , antibody, monocyte chemotaxis examples thereof include a part or all of peptides such as sex factor protein-3 (MCP-3) and ovomucoid protein.
  • the sugar chain and the amino acid residue in the protein may be bonded directly or via a linker.
  • the binding site between the sugar chain and the amino acid it is preferable that the amino acid is bound to the reducing end of the sugar chain.
  • the type of amino acid to which the sugar chain is bound is not particularly limited, and may be bound to either a natural amino acid or a non-natural amino acid.
  • the sugar chain is bound to Asn like the N-linked sugar chain, or the O-linked sugar chain Thus, it is preferable to bind to Ser or Thr.
  • the glycoprotein obtained by the production method of the present invention has a sugar chain bound to Asn, and an amino acid (X) other than proline is bound to an amide bond (peptide bond) on the C-terminal side of the Asn.
  • the amino acid to which the sugar chain is bonded is: two or more carboxyl groups in the molecule such as aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acids having two or more amino groups in the molecule such as lysine, arginine, histidine, tryptophan; amino acids having hydroxyl groups in the molecule such as serine, threonine, tyrosine; amino acids having a thiol group in the molecule such as cysteine Or an amino acid having an amide group in the molecule, such as asparagine and glutamine.
  • amino acids having two or more amino groups in the molecule such as lysine, arginine, histidine, tryptophan
  • amino acids having hydroxyl groups in the molecule such as serine, threonine, tyrosine
  • amino acids having a thiol group in the molecule such as cysteine
  • an amino acid having an amide group in the molecule such as asparagine and glutamine.
  • a linker widely used in the art can be used as the linker, for example: —NH— (CO) — (CH 2 ) a —CH 2 — (Wherein, a is an integer and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably represents an integer of 0 to 4); C 1-10 polymethylene; —CH 2 —R 3 — Wherein R 3 is alkyl, substituted alkyl, alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, aryl, substituted aryl, carbocyclic group, substituted carbocyclic group, heterocyclic group And a group formed by elimination of one hydrogen atom from a group selected from the group consisting of substituted heterocyclic groups); Etc.
  • sugar chain refers to a compound in which two or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof) are connected, and one unit sugar (monosaccharide and / or derivatives thereof).
  • sugar chains include monosaccharides and polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and complexes thereof contained in the living body.
  • Derivatives and a wide variety of sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, and the like, but are not limited thereto.
  • each unit sugar is bound by dehydration condensation by a glycosidic bond.
  • the sugar chain may be linear or branched.
  • sugar chain also includes sugar chain derivatives.
  • sugar chain derivatives include sugars having a carboxyl group (for example, C-1 Oxidized aldonic acid converted to carboxylic acid (for example, D-gluconic acid oxidized D-glucose), uronic acid whose terminal C atom became carboxylic acid (D-glucose oxidized D-glucose) Glucuronic acid)), sugars having amino groups or amino group derivatives (eg acetylated amino groups) (eg N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine etc.), amino groups and carboxyls Sugars having both groups (eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.), deoxygenated sugars (eg, 2-deoxy-D-ribo Scan), sulfated sugar including a sulfuric acid group, including but sugar chains
  • the sugar chain of the present invention is preferably a sugar chain that exists as a complex carbohydrate (glycoprotein (or glycopeptide), proteoglycan, glycolipid, etc.) in vivo, and preferably glycoprotein (or sugar in vivo).
  • Peptide is an N-linked sugar chain, an O-linked sugar chain, or the like that is a sugar chain bound to a protein (or peptide).
  • N-acetylgalactosamine (GalNAc), N-acetylglucosamine (GlcNAc), xylose, fucose and the like are bound to the Ser or Thr of the peptide by an O-glycoside bond.
  • a sugar chain is added to this.
  • Examples of the N-linked sugar chain include a high mannose (high mannose) type, a complex (complex) type, and a hybrid (hybrid) type, and a complex type is preferable.
  • a preferable sugar chain is, for example, a sugar chain represented by the following formula (4).
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or a group represented by formulas (5) to (8). ]
  • preferred sugar chains include, for example, in the human body.
  • Sugar chains existing as glycoproteins linked to proteins for example, sugar chains described in FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975
  • sugar chains having the same structure types of constituent sugars and those Sugar chains having the same binding mode
  • sugar chains that have lost one or more sugars from the non-reducing end thereof for example, sugar chains described in FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975
  • the number of added sugar chains in the glycoprotein is not particularly limited as long as it is 1 chain or more. However, from the viewpoint of providing a glycoprotein having a structure similar to that of a glycoprotein present in the living body, the glycoprotein present in the body. It would be more preferable if the number of additions is about the same.
  • a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain is used.
  • the structure of a sugar chain in a glycoprotein is uniform when compared between glycoproteins, the glycosylation site in the peptide, the type of each sugar constituting the sugar chain, the binding order, and the sugar It means that the binding mode between them is the same in at least 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 99% or more of sugar chains.
  • the amino acid sequence in the glycoprotein is uniform means that the types of amino acids in the protein, the binding order, and the binding mode between the amino acids are the same when compared between glycoproteins. .
  • the glycoprotein may be the same in at least 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 99% or more.
  • Glycoproteins with uniform amino acid sequences and sugar chains used in the present invention are peptide production methods known to those skilled in the art, such as solid phase synthesis, liquid phase synthesis, cell synthesis, and methods for separating and extracting naturally occurring ones. It can be produced by incorporating a sugar chain addition step.
  • a sugar chain addition step for example, International Publication Nos. WO03 / 008431, WO2004 / 058884, WO2004 / 008431, WO2004 / 058824, WO2004 / 070046, WO2007 / 011055 and the like can be referred to.
  • At least a part of a glycoprotein having a uniform amino acid and sugar chain is produced by the following method.
  • WO2004 / 005330 pamphlet can also be referred to.
  • Carboxyl group is esterified.
  • the amino group of the amino acid is protected with a fat-soluble protecting group, self-condensation between amino acids is prevented, and an esterification reaction occurs between the hydroxyl group of the resin and the carboxyl group of the amino acid.
  • step (1) (2) the lipophilic protecting group of the ester obtained in step (1) is eliminated to form a free amino group, (3) Amidation reaction of the above free amino group with the carboxyl group of an amino acid whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group, or the carboxyl group of an amino acid with a sugar chain added whose amino group is protected with a fat-soluble protecting group Let (4) After step (3), the lipophilic protecting group is removed to form a free amino group. (5) Steps (3) and (4) are repeated as necessary to obtain the desired number of steps. A glycoprotein in which amino acids are linked and one or more sugar chains are added at a desired position can be obtained.
  • Examples of the amino acid added with a sugar chain include a sugar chain asparagine in which the sugar chain is N-glycoside bonded to the nitrogen of the amide group of the asparagine side chain, a sugar in which the sugar chain is O-glycoside bonded to the hydroxyl group of the serine or threonine side chain.
  • Examples include chain serine or sugar chain threonine.
  • the glycoprotein obtained in step (5) has one end bonded to the resin and the other end having a free amino group. Therefore, (6) the desired glycoprotein can be produced by cleaving the ester bond formed in step (1) with an acid.
  • the solid phase resin (resin) is usually a resin (resin) used in solid phase synthesis.
  • a resin (resin) used in solid phase synthesis.
  • Amino-PEGA resin (Merck), Wang resin (Merck), HMPA-PEGA resin (Merck), Trt Chloride resin (Merck), etc. can be used.
  • a linker may be present between the amino-PEGA resin (resin) and the amino acid.
  • examples of such a linker include 4-hydroxymethylphenoxyacetic acid (HMPA), 4- (4-hydroxymethyl-3 -Methoxyphenoxy) -butylacetic acid (HMPB) and the like.
  • the fat-soluble protecting group examples include carbonyl-containing groups such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, allyloxycarbonyl (Alloc) group, acetyl (Ac) group, etc.
  • Protecting groups such as an acyl group, an allyl group, and a benzyl group are not particularly limited thereto.
  • the fat-soluble protecting group for example, when introducing the Fmoc group, 9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate and sodium hydrogen carbonate can be added and reacted.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 1 to 5 hours.
  • amino acid protected with a fat-soluble protecting group those obtained by protecting the above-mentioned amino acids by the above method can be used.
  • Commercially available products can also be used.
  • Fmoc-Glu Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, and Fmoc-Pro.
  • a known dehydration condensing agent such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1,3-diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) is used.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI 1,3-diisopropylcarbodiimide
  • the use ratio of the amino acid and the dehydration condensing agent is usually 1 to 10 parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight, with respect to 1 part by weight of the former.
  • the esterification reaction is preferably performed, for example, by placing a resin in a solid phase column, washing the resin with a solvent, and then adding an amino acid solution.
  • the cleaning solvent include dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride and the like.
  • the solvent that dissolves amino acids include dimethyl sulfoxide (DMSO), DMF, and methylene chloride.
  • the esterification reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out, for example, by treatment with a base.
  • a base include piperidine and morpholine.
  • a solvent examples include DMSO, DMF, methanol and the like.
  • amidation reaction between the free amino group and the carboxyl group of any amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is preferably performed in the presence of an activator and a solvent.
  • activator examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC / HCl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), carbonyldiimidazole (CDI).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC / HCl 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • CDI carbonyldiimidazole
  • the activator is used in an amount of 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents with respect to any amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group. Is preferred.
  • the reaction proceeds even with the above activator alone, but it is preferable to use an amine as an auxiliary agent.
  • an amine for example, diisopropylethylamine (DIPEA), N-ethylmorpholine (NEM), N-methylmorpholine (NMM), N-methylimidazole (NMI) and the like can be used.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • NEM N-ethylmorpholine
  • NMM N-methylmorpholine
  • NMI N-methylimidazole
  • the amount of the adjuvant used is 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents with respect to any amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group. Is preferred.
  • the solvent examples include DMSO, DMF, methylene chloride and the like.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours. Also at this time, it is preferable to acetylate and cap the unreacted amino group on the solid phase using acetic anhydride or the like.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out in the same manner as described above.
  • the acid include trifluoroacetic acid (TFA) and hydrogen fluoride (HF).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • HF hydrogen fluoride
  • a highly reactive cationic species may be generated from the lipophilic protecting group used for amino acids and the linker on the resin (resin), so a nucleophilic reagent is added to capture this. It is preferable.
  • the nucleophilic reagent include triisopropylsilane (TIS), phenol, thioanisole, ethanedithiol (EDT) and the like.
  • a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain can also be produced by dividing it into several peptide blocks or glycopeptide blocks, which are synthesized by steps (1) to (6) and then linked by the ligation method. .
  • the “ligation method” refers to a peptide containing a non-natural amino acid or an amino acid derivative, including the natural chemical ligation method (Native Chemical Ligation, NCL method) described in WO 96/34878. This includes the case where natural chemical ligation is applied. According to the ligation method, a protein having a natural amide bond (peptide bond) at the linking site can be produced.
  • Ligation can be performed at any of peptide-peptide, peptide-glycopeptide, and glycopeptide-glycopeptide, but one of the two peptides or glycopeptide to be linked is cysteine at the N-terminus. It is necessary to have a residue and the other has an ⁇ -carboxythioester moiety at the C-terminus.
  • each peptide or glycopeptide block have a cysteine residue at the N-terminus, for example, when designing each peptide or glycopeptide block, a cysteine residue contained in a glycoprotein that is finally produced. What is necessary is just to divide
  • a peptide or glycopeptide block having an ⁇ -carboxythioester moiety at the C-terminus can be produced using techniques known to those skilled in the art, such as the method described in International Publication No. WO96 / 34878.
  • a protected peptide (or glycopeptide) in which the amino acid side chain and the N-terminal amino group are protected is obtained by solid phase synthesis, and the carboxyl group on the C-terminal side is changed.
  • PyBOP Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium phosphate
  • DIPEA Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium phosphate
  • DIPEA DIPEA
  • a peptide (or glycopeptide) having an ⁇ -carboxythioester moiety at the C-terminus can be obtained.
  • the ligation method can be carried out using a technique known to those skilled in the art as described in Patent Document 1 and with reference to the description of Examples described later.
  • a first peptide having an ⁇ -carboxythioester moiety represented by —C ( ⁇ O) —SR at the C-terminus and a second peptide having an amino acid residue having an —SH group at the N-terminus are prepared with reference to the above description.
  • R is not particularly limited as long as R does not inhibit the thiol exchange reaction and becomes a leaving group in the nucleophilic substitution reaction to the carbonyl carbon, but preferably a benzyl type such as benzyl mercaptan, It can be selected from aryl types such as thiophenol and 4- (carboxymethyl) -thiophenol, alkyl types such as 2-mercaptoethanesulfonic acid salt and 3-mercaptopropionic acid amide.
  • the —SH group at the N-terminus of the second peptide may optionally be protected by a protecting group, but this protecting group is deprotected at a desired point until the following ligation reaction, and the — A second peptide having an SH group reacts with the first peptide.
  • the protecting group is naturally deprotected under conditions where ligation occurs, such as a disulfide group
  • the second peptide protected by the protecting group can be used in the following ligation reaction as it is.
  • a solution such as a 100 mM phosphate buffer solution in the presence of a catalytic thiol such as 4-mercaptophenylacetic acid, benzyl mercaptan, and thiophenol as necessary.
  • a catalytic thiol such as 4-mercaptophenylacetic acid, benzyl mercaptan, and thiophenol as necessary.
  • the reaction is performed at a ratio of about 0.5 to 2 equivalents of the second peptide and about 5 equivalents of catalytic thiol to 1 equivalent of the first peptide.
  • the reaction is desirably carried out for about 1 to 30 hours under conditions of pH 6.5 to 7.5 and 20 to 40 ° C.
  • the progress of the reaction can be confirmed using a known method combining HPLC, MS and the like.
  • a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or tris 2-carboxyethylphosphine hydrochloride (TCEP) is added to suppress side reactions, and if desired, purification is performed, whereby the first peptide and the second peptide are purified.
  • DTT dithiothreitol
  • TCEP tris 2-carboxyethylphosphine hydrochloride
  • a peptide having a carboxythioester moiety (—C ⁇ O—SR) at the C-terminus
  • the order of the ligation reaction can be manipulated (Protein Science ( 2007), 16: 2056-2064, etc.), this can be taken into account when performing multiple ligations. For example, when an aryl group, a benzyl group and an alkyl group are present as R, the ligation reaction generally proceeds in this order.
  • “higher order structure” of protein means secondary structure such as ⁇ helix or ⁇ sheet structure, structure such as random coil, etc., secondary structure is hydrogen bond, disulfide bond, ionic bond, hydrophobicity It refers to a three-dimensional structure of a protein including a tertiary structure that is spatially folded by interaction or the like to form a stable conformation, and a quaternary structure formed by a plurality of polypeptide chains assembled as subunits.
  • the higher order structure of the protein is preferably a structure necessary for the protein to exhibit its function in vivo.
  • the higher order structure of the protein can be analyzed by X-ray crystal structure analysis, NMR, or the like.
  • the higher order structure of the glycoprotein is uniform means that the higher order structure of the protein portion of the glycoprotein is substantially the same when compared between glycoproteins.
  • the fact that the higher order structures are substantially the same means that the structures of at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more are uniform.
  • a glycoprotein having a uniform higher order structure has a constant quality, and is particularly preferable in fields such as pharmaceutical production and assay. Whether or not the higher-order structure of the glycoprotein contained in a certain fraction is uniform can be confirmed by, for example, NMR analysis, CD measurement, disulfide mapping and the like.
  • folding means that the protein portion of a glycoprotein is folded into a specific higher order structure.
  • a person skilled in the art can appropriately perform glycoprotein folding according to a known method or a method in accordance with the known method, and examples thereof include a dialysis method, a dilution method, and an inactivation method.
  • the dialysis method is a method in which a peptide denaturing agent (unfolding agent) is added in advance, and this is gradually diluted by dialysis and replaced with a buffer or the like to fold the peptide into a predetermined higher order structure.
  • the unfolding agent include guanidine hydrochloride and urea.
  • the dilution method is a method in which a peptide is folded into a higher-order structure by adding a protein denaturant and then diluting stepwise or at a time with a buffer solution or the like.
  • the deactivation method is a method in which a peptide is folded into a higher-order structure by adding a protein denaturant and then adding a second agent that deactivates the denaturant stepwise or at a time.
  • the “predetermined physiological activity” can be selected from the physiological activities of glycoproteins having a higher-order structure that are obtained at a certain ratio with good reproducibility when folded.
  • Such physiological activity is obtained by folding the target glycoprotein in advance by the same method as in steps (a) and (b) described later, fractionating by column chromatography, and collecting the effluent corresponding to the main peak. And it can obtain
  • the main peak means a peak obtained with good reproducibility when the step (a) and the step (b) are repeated.
  • the measurement of physiological activity can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the glycoprotein of interest.
  • step (a) the glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain is folded.
  • the solution containing the glycoprotein after folding includes a mixture of glycoproteins having different high-order structures, and those having a predetermined activity and those having no predetermined activity.
  • the folded glycoprotein is fractionated by column chromatography.
  • the column chromatography is not particularly limited as long as it can separate glycoproteins having different high-order structures.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • Conditions such as the stationary phase of the column chromatography, the type of mobile phase, and the outflow rate can be appropriately selected by those skilled in the art according to the glycoprotein to be separated.
  • ODS type reverse phase chromatography normal phase A system column, an affinity column, a gel filtration column, an ion exchange column, or the like can be used.
  • step (c) the activity of the glycoprotein contained in each fraction of the eluate of column chromatography is measured, and the fraction having a predetermined activity is collected, whereby the amino acid sequence, sugar chain structure, and higher order are recovered.
  • a glycoprotein having a uniform structure can be obtained.
  • the glycoprotein contained in the fraction not collected in the step (c) is unfolded, (E) refolding the unfolded glycoprotein, (F) fractionating the refolded glycoprotein by column chromatography and collecting the fraction having the desired activity; (G) It is also preferable to repeat (d) to (f) as necessary.
  • the fraction containing the glycoprotein that is unfolded in step (d) includes higher-order structures that do not have a predetermined activity.
  • a fraction in which two or more glycoproteins having a predetermined activity are mixed does not show a predetermined activity value, and thus is included in the unfolded fraction.
  • Glycoprotein unfolding can be performed using methods known to those skilled in the art. For example, a method of adding an unfolding agent (protein denaturant) such as guanidine hydrochloride or urea, or in addition to these, dithio A method of adding a reducing agent such as threitol (DTT) or mercaptoethanol is also included.
  • an unfolding agent protein denaturant
  • dithio A method of adding a reducing agent such as threitol (DTT) or mercaptoethanol is also included.
  • Process (e) and process (f) can be performed by the method similar to the said process (a) thru
  • the glycoprotein contained in the fraction not having the predetermined activity is once rewound and refolded so that the predetermined activity is obtained at a certain ratio. Can be converted to a higher-order structure having Thus, a glycoprotein having a higher order structure having a predetermined activity can be recovered to the maximum extent.
  • the “glycoprotein screening method” comprises (i) folding a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain, (Ii) fractionating the folded glycoprotein by column chromatography; (Iii) The activity of each fraction is measured to determine whether it has a predetermined activity.
  • Process (i) and process (ii) can be performed similarly to the said process (a) and process (b).
  • a glycoprotein solution after folding a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain contains a plurality of glycoproteins having a higher order structure. Therefore, after fractionation by column chromatography, the activity of each fraction is measured, and by determining whether or not it has a predetermined activity, only a glycoprotein having a uniform higher-order structure having a predetermined physiological activity is obtained. Can be selected and purified.
  • the present invention provides a method for obtaining a glycoprotein mixture having a desired physiological activity.
  • the method comprises (A) folding a glycoprotein having a uniform amino acid sequence and sugar chain, (B) fractionating the folded glycoprotein by column chromatography; (C) measuring the activity of each fraction, (D) Obtaining a mixing ratio of each fraction capable of obtaining a desired activity, and mixing each fraction according to the ratio.
  • Process (A) and process (B) can be performed similarly to the said process (a) and process (b).
  • steps (A) and (B) it is possible to obtain a glycoprotein having a predetermined activity and having a uniform amino acid sequence, sugar chain structure, and higher order structure. Therefore, it is possible to obtain a glycoprotein mixture having a desired physiological activity by mixing them at a predetermined ratio.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • VydacC-18 (5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm, 10 ⁇ 250 mm), VydacC-8 (5 ⁇ m, 10 ⁇ 250 mm), and VydacC-4 (5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm) were used.
  • the Fmoc group was then deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 mL) for 20 minutes. After washing with DMF, the reaction was confirmed by Kaiser Test, and the subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • Amino-protected amino acids include Fmoc-Pro, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Met, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Cys (Trt ), Fmoc-Ala, Fmoc-Pro, Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc -Asp (OtBu), Fmoc-Val, Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, and Boc-Leu-OH.H in which the last amino acid can be removed with an acid.
  • the obtained peptide (23-residue peptide having a protecting group described in SEQ ID NO: 1) 39 mg, 10 ⁇ mol
  • MS4A benzyl mercaptan
  • benzyl mercaptan 35.5 ⁇ L, 0.3 mmol
  • DMF solvent 1.35 mL
  • argon After stirring for 1 hour at ⁇ 20 ° C. under a stream of air, PyBOP (26 mg, 50 ⁇ mol) and DIPEA (8.5 ⁇ L, 50 ⁇ mol) were added and stirred for 2 hours. After stirring, an excess amount of diethyl ether was added to the reaction solution to precipitate the compound, followed by filtration. Thereafter, the precipitate was dissolved in DMF.
  • Fmoc-Phe (96.9 mg, 0.25 mmol), MSNT (74 mg, 0.25 mmol) and N-methylimidazole (14.9 ⁇ l, 0.188 mmol) were dissolved in DCM (1 mL) to obtain a solid phase synthesis column. And stirred at room temperature for 2 hours. After stirring, the resin was washed with DCM and DMF, and the Fmoc group was treated with a 20% piperidine / DMF solution (1 mL) for 20 minutes for deprotection. After washing with DMF, the reaction was confirmed by Kaiser Test, and subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • Amino group-protected amino acids include Fmoc-Asn, Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Thr (tBu), Fmoc -Lys (Boc), and on the solid phase resin, Fmoc-Lys (Boc) -Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Gly-Asn-Lys (Boc) -Cys (Trt) -Asn-Phe A 9-residue peptide (SEQ ID NO: 3) having a protecting group was obtained.
  • the obtained peptide (14-residue glycosylated peptide described in SEQ ID NO: 4 having a protecting group) (11.7 mg, 3 ⁇ mol), MS4A (10 mg) and benzyl mercaptan (10.6 ⁇ L, 0.09 mmol) were mixed in a DMF solvent.
  • the mixture was stirred for 1 hour at ⁇ 20 ° C. in an argon stream at 0.41 mL, PyBOP (7.8 mg, 15 ⁇ mol) and DIPEA (2.6 ⁇ L, 15 ⁇ mol) were added, and the mixture was stirred for 2 hours. After stirring, an excessive amount of diethyl ether was added to the reaction solution to precipitate the compound. After filtration, the precipitate was dissolved in DMF.
  • the Fmoc group was then deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 mL) for 20 minutes. After washing with DMF, the reaction was confirmed by Kaiser Test, and the subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • Amino-protected amino acids include Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Gly, Fmoc-Phe, Fmoc-His (Trt), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc -Leu, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Asn, Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Val, Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Asn, Using Cys (Trt), Cys (Trt) -Asn-Ala-Val-Val-Glu (OtBu) -Ser (tBu) -Asn-Gly-Thr (tBu) -Leu-Thr (tBu) ) -Leu-Ser (tBu) -His (
  • phosphate buffer solution pH 7.5, containing 6M guanidine hydrochloride
  • the 33-residue glycosylated peptide described in SEQ ID NO: 9 was also obtained under the following conditions. Fragment 3 (19-residue peptide described in SEQ ID NO: 7) 1.9 mg (1 ⁇ mol) and fragment 2 (14-residue glycosylated peptide having a protecting group whose C-terminus is benzylthioester described in SEQ ID NO: 5) 3.2 mg (1 ⁇ mol) of 2 types each was put into an Eppendorf tube, dissolved in 247.5 ⁇ L of 0.1% phosphate buffer solution (pH 7.5, containing 6M guanidine hydrochloride), and then put into one Eppendorf tube. Combined.
  • Fragment 3 (19-residue peptide described in SEQ ID NO: 7) 1.9 mg (1 ⁇ mol)
  • a 56-residue glycosylated peptide (SEQ ID NO: 10) could be obtained under the following conditions.
  • fragment 1 23-residue peptide whose C-terminus is benzylthioester described in SEQ ID NO: 2
  • Were placed in an Eppendorf tube dissolved in 247.5 ⁇ L of a 0.1% phosphate buffer solution (pH 7.5, containing 8M guanidine hydrochloride), and then combined into one Eppendorf tube.
  • the reaction time can be appropriately changed (for example, 24 hours) by tracking the reaction by HPLC and mass spectrometry and confirming that the molecular weight change and mass retention time of the peak have changed by HPLC.
  • NMR measurement of fraction B Fraction B after lyophilization was dissolved in 5% D 2 O / H 2 O (300 ⁇ l), and 2D TOCSY was measured at 25 ° C., 60 ms, 600 MHz.
  • the NMR spectrum is shown in FIG. CD measurement of fraction B: Fraction B after lyophilization was dissolved in distilled water and CD measurement was performed.
  • the apparatus used was JASCO J-820. The measurement region was in the range of 180 nm to 260 nm.
  • the CD spectrum is shown in FIG. From FIG. 11, it was confirmed that glycopeptides having the same higher order structure were highly purified only by separation by HPLC.
  • fragment 2 ′ the fragment corresponding to fragment 2 of the example (hereinafter referred to as “fragment 2 ′”) does not have a sugar chain as shown in FIG.
  • the Fmoc group was then deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 mL) for 20 minutes. After washing with DMF, the reaction was confirmed by Kaiser Test, and the subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • Amino group-protected amino acids include Fmoc-Asn, Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Thr (tBu), Fmoc -Lys (Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Gly, and the last amino acid is Boc-Cys (Thz) -OH whose protecting group can be removed with an acid (233.3 mg, 1 mmol) was used.
  • SEQ ID NO: 11 A 14-residue peptide (SEQ ID NO: 11) having a protecting group of -Cys (Trt) -Asn-Phe was obtained.
  • the 33-residue glycosylated peptide described in SEQ ID NO: 14 was also obtained under the following conditions. 1.6 mg (0.96 ⁇ mol) of the fragment 2 ′ (14-residue peptide having a protecting group whose C-terminus is a benzylthioester described in SEQ ID NO: 12) and 1.9 mg (0. 96 ⁇ mol) were put in Eppendorf tubes, dissolved in 247.5 ⁇ L of 0.1% phosphate buffer solution (pH 7.5, containing 6M guanidine hydrochloride), and then combined into one Eppendorf tube. 1% thiophenol (5 ⁇ L) was added, and the reaction was performed at room temperature.
  • 0.1% phosphate buffer solution pH 7.5, containing 6M guanidine hydrochloride
  • the 56-residue glycosylated peptide described in SEQ ID NO: 15 was also obtained under the following conditions. 0.6 mg (0.17 ⁇ mol) of the 33-residue peptide described in SEQ ID NO: 14 and 1.1 mg (0.41 ⁇ mol) of fragment 1 (23-residue peptide in which the C-terminus described in SEQ ID NO: 2 is a benzylthioester) Each of the two was placed in an Eppendorf tube, dissolved in 247.5 ⁇ L of a 0.1% phosphate buffer solution (pH 7.5, containing 8M guanidine hydrochloride), and then combined into one Eppendorf tube.
  • a 0.1% phosphate buffer solution pH 7.5, containing 8M guanidine hydrochloride
  • the reaction time can be appropriately changed (for example, 24 hours) by tracking the reaction by HPLC and mass spectrometry and confirming that the molecular weight change and mass retention time of the peak have changed by HPLC.
  • NMR measurement of fraction F Fraction F after freeze-drying was dissolved in 5% D 2 O / H 2 O (300 ⁇ l), and 2D TOCSY was measured at 25 ° C., 80 ms, 600 MHz.
  • the NMR spectrum is shown in FIG. CD measurement of fraction F: Fraction F after lyophilization was dissolved in distilled water and CD measurement was performed. The apparatus used was JASCO J-820. The measurement region was in the range of 180 nm to 260 nm.
  • the CD spectrum is shown in FIG. From FIG. 19, it was confirmed that glycopeptides having the same higher order structure were highly purified only by HPLC separation.
  • Example 2 Measurement of physiological activity [Measurement of physiological activity of glycosylated OMSVP3 (fractions A to D)]
  • the OD280 of each solution was measured, 20 ⁇ L of sample solution with a constant protein concentration contained in the solution was added, and the inhibitory activity was measured.
  • final reaction concentrations are a sample concentration of 2.5 ⁇ M, an enzyme concentration of 0.33 ⁇ g / mL, and a substrate concentration of 172 ⁇ M.
  • This reaction solution was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then 5 ⁇ L of 4N hydrochloric acid was added to stop the reaction. The same operation was repeated three times, and the average value and standard deviation of the decomposition rates were calculated. The results are shown in FIG.
  • the OD280 of each solution was measured, 20 ⁇ L of sample solution with a constant protein concentration contained in the solution was added, and the inhibitory activity was measured.
  • final reaction concentrations are a sample concentration of 2.5 ⁇ M, an enzyme concentration of 0.33 ⁇ g / mL, and a substrate concentration of 172 ⁇ M.
  • This reaction solution was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then 5 ⁇ L of 4N hydrochloric acid was added to stop the reaction. The same operation was repeated three times, and the average value and standard deviation of the decomposition rates were calculated. The results are shown in FIG.
  • Example 3 Measurement of physiological activity (derivation of IC 50 ) [Derivation of IC 50 of glycosylated OMSVP3 (fractions A to D)] A 14-residue peptide (SEQ ID NO: 16) (1.5 mg) having a protecting group synthesized in Reference Example 1 (described later) was added to 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0, containing 0.1 mg / mL BSA). 1 mM solution was prepared. It diluted to 0.34 mM using the absorptiometer (solution 1).
  • the decomposition rate per unit time was calculated from the peak area on the HPLC of the reaction product.
  • FIG. 23 shows a graph plotting the inhibition rate against each inhibitor concentration. Similarly, for the fractions A, C and D, the concentration of the inhibitor was plotted so as to sandwich the concentration at which the enzyme activity was inhibited by 50%. The graph of the result is shown (FIG. 23). IC 50 values of glycosylated OMSVP3 (fractions A to D) calculated based on this graph are shown in the graph (FIG. 24).
  • FIG. 25 shows a graph plotting the inhibition rate against each inhibitor concentration. Similarly, for the fractions E, G and H, the concentration of the inhibitor was plotted so as to sandwich the concentration at which the enzyme activity was inhibited by 50%. The graph of the result is shown (FIG. 25). IC 50 values of OMSVP3 (fractions E to F) having no sugar chain calculated based on this graph are shown in the graph (FIG. 26).
  • Example 4 Measurement of thermal stability A cell for CD measurement was filled with distilled water and measured at room temperature. With this measurement value as a blank, all subsequent measurement values were calculated by subtracting the blank value.
  • Thermal stability of glycosylated OMSVP3 (fraction B) Fraction B was dissolved in 300 ⁇ L of distilled water and measured at room temperature. After the measurement was completed, the sample was immersed in a thermostatic chamber with the cell filled in the cell, and a temperature variable experiment was performed. First, a cell immersed in a thermostat at 50 ° C. for 10 minutes was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and measurement was performed. Thereafter, the same operation was performed up to 90 ° C., and the CD spectrum was measured. The results are shown in FIG.
  • Fraction F was dissolved in 300 ⁇ l of distilled water and measured at room temperature. After the measurement was completed, the sample was immersed in a thermostatic chamber with the cell filled in the cell, and a temperature variable experiment was performed. First, a cell immersed in a thermostat at 50 ° C. for 10 minutes was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and measurement was performed. Thereafter, the same operation was performed up to 90 ° C., and the CD spectrum was measured. The results are shown in FIG.
  • Example 5 Disulfide mapping of ovomucoid third domain
  • the synthesized OMSVP3 has three disulfide bonds. Disulfide bonds are formed during protein folding, and the formation process is an equilibrium reaction. Therefore, it is considered that disulfide bond formation occurs at a position different from that of the natural protein.
  • OMSVP3 (Fraction B) synthesized this time was a single compound from the results of NMR and inhibitory activity evaluation, and was expected to form a disulfide bond at the same position as the native protein. Therefore, in order to confirm that fraction B surely forms a disulfide bond at the same position as natural, the following examination was conducted.
  • Fraction F (0.4 mg) obtained in Example 1 was reacted with cyanogen bromide (1 mg / mL) in 40% acetonitrile, 2% TFA aqueous solution at 37 ° C. under light-shielding conditions overnight. .
  • the ovomucoid third domain having glycoprotein was folded and fractionated by HPLC (FIG. 10), and the third domain having no sugar chain was folded and fractionated by HPLC ( FIG. 18) was relatively similar with four peaks.
  • the intensity of activity was fraction A> fraction B> fraction D> fraction C, fraction F> fraction E> fraction H> fraction G (FIGS. 13 and FIG. 21)
  • Example 3 it is similar to fraction A> fraction B> fraction C> fraction D, fraction E> fraction F> fraction G> fraction H (FIGS. 23 to 26). From this, it was seen that those having the same higher order structure were eluted in the same order.
  • glycoproteins as pharmaceuticals
  • pharmaceuticals that have a constant physiological activity and a half-life in blood by purifying and separating only those with a constant higher-order structure in a state where a sugar chain is added to the protein.
  • the method of the present invention makes this possible.
  • the Fmoc group was then deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 mL) for 20 minutes. After washing with DMF, the reaction was confirmed by Kaiser Test, and the subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • Amino group-protected amino acids include Fmoc-Asn, Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Thr (tBu), Fmoc -Lys (Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Gly, the last amino acid being Boc-Cys (Thz) -OH (233.3 mg, 1 mmol) Was used.
  • SEQ ID NO: 11 A 14-residue peptide (SEQ ID NO: 11) having a protecting group of -Cys (Trt) -Asn-Phe was obtained.
  • 95% TFA, 2.5% TIPS, 2.5% H 2 O solution (3 mL) was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the resin was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • reaction rate per unit time was calculated from the peak area on the HPLC of the reaction product (FIG. 37). Table 4 shows the reciprocal of the reaction rate with respect to the reciprocal of each substrate concentration.
  • the production method of the present invention makes it possible to obtain a glycoprotein having a uniform higher-order structure in addition to the amino acid sequence and sugar chain structure. Since the glycoprotein obtained by the production method of the present invention has a uniform higher order structure, it not only has no variation in blood half-life and intracellular transport, but also has a predetermined physiological activity. Moreover, according to the present invention, it is possible to control the mixture of glycoproteins to have a desired activity. Therefore, the production method of the present invention can be used particularly for the development of pharmaceuticals using glycoproteins.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence having a protecting group of fragment 1.
  • SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence of fragment 1 having a benzylthioester group.
  • SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence having a protecting group of fragment 2.
  • SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence having a protecting group, to which a sugar chain is added, of fragment 2.
  • SEQ ID NO: 5 is an amino acid sequence having a benzylthioester group and a protecting group, to which a sugar chain is added, of fragment 2.
  • SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence having a protecting group of fragment 3.
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of fragment 3.
  • SEQ ID NO: 8 is an amino acid sequence having a protecting group to which a sugar chain is added.
  • SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence to which a sugar chain has been added.
  • SEQ ID NO: 10 is an amino acid sequence to which a sugar chain is added of sugar chain added OMSVP3.
  • SEQ ID NO: 11 is an amino acid sequence having a protecting group of fragment 2 '.
  • SEQ ID NO: 12 is an amino acid sequence having a benzylthioester group and a protecting group in fragment 2 '.
  • SEQ ID NO: 13 is an amino acid sequence having a protecting group.
  • SEQ ID NO: 14 is an amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence of OMSVP3 with no sugar chain added.
  • SEQ ID NO: 16 is an amino acid sequence having a protecting group, which is a substrate for chymotrypsin.

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Abstract

　本発明は、血中半減期等の糖鎖に基づく機能に加えて、生理活性も均一である糖タンパク質、即ち、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。 　本発明は、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：（ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；（ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって、分画する工程；及び（ｃ）所定の活性を有する画分を回収する工程、を含む方法を提供する。

Description

糖タンパク質の製造方法及びスクリーニング方法
　本発明は、アミノ酸配列、糖鎖構造及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法等に関する。
　近年、糖タンパク質を様々な医薬として用いる研究が進められている。糖タンパク質の糖鎖部分は、プロテアーゼへの耐性を付加して血中からの代謝を遅延させる機能や、細胞内での小器官への輸送をつかさどるシグナルとしての機能等を有する。従って、適切な糖鎖を付加することによって、糖タンパク質の血中半減期や細胞内での輸送を制御することが可能である。
　糖鎖が糖タンパク質の生理活性に影響する代表的な例として、エリスロポエチン（ＥＰＯ）が挙げられる。この糖タンパク質は、赤血球系前駆細胞に作用し、その増殖・分化を促進することにより、末梢血中の赤血球数を維持する機能を持った血球分化ホルモンである。ＥＰＯの糖鎖構造と生理活性の相関について研究された結果、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは糖鎖が結合していなくても生理活性を有するが、ｉｎ　ｖｉｖｏでは糖鎖がないとすぐに腎臓から排出されてしまい、十分な生理活性が得られないことが判明した。
　また、糖タンパク質は糖鎖が不完全な場合や、異なる糖鎖が結合している場合も、血液中のマクロファージ等に認識され、血中から排出されることがある。
　従って、糖タンパク質を医薬品として用いる場合には、各タンパク質の同じ位置に均一な構造の糖鎖が付加されていることが望ましい。
　従来、糖タンパク質の製造方法としては、タンパク質に糖を酵素付加する方法が広く用いられているが、この方法では、均一な糖鎖を付加することができず、また、糖鎖を付加した後に修飾やトリミングを均一に施すことも困難である。
　また、一般に、タンパク質製剤は力価で評価されるが、同一の力価を有する製剤でも、糖鎖構造にばらつきがあるものが含まれる場合があり、血中半減期にばらつきが生じたり、品質管理の点で問題となりうる。
　本発明者らは、これまでに、脂溶性保護基でアミノ基を保護したアミノ酸と糖鎖アスパラギンを材料とし、均一なアミノ酸配列と糖鎖を有する糖タンパク質を比較的大量に製造できる方法を開発した（例えば特許文献１参照）。さらに、十分な血中濃度を維持できるアミノ化複合型糖鎖誘導体および糖タンパク質を開発した（特許文献２参照）。いずれの糖タンパク質も、医薬品としての有用性が期待される。
　ところで、医薬品として使用するためには、生理活性にばらつきのない糖タンパク質を製造することが必要であるが、糖タンパク質の機能には、アミノ酸配列と糖鎖構造のみでなく、タンパク質部分の高次構造も密接に関連すると考えられる。
　タンパク質の高次構造は、アミノ酸残基間の水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、システイン残基間のＳ－Ｓ結合などによって安定化され、多くのタンパク質は、それぞれ固有の高次構造を有する。しかしながら、Ｓ－Ｓ結合以外の結合は、比較的弱い結合であり、比較的温和な加熱や加圧等によって高次構造が壊れ、その生理活性が低下・消失する。これをタンパク質の変性と呼ぶ。また、特にアミノ酸鎖が長い場合、エネルギーの極小点を与える構造が複数生じるため、異常な高次構造（ミスフォールディング）を生じることがある。この場合も、タンパク質の活性が変化または消失することが報告されている。
　これらの事実から、一般に、タンパク質が機能を発揮するためには正しい高次構造が必須であり、タンパク質をフォールディングさせると、生理活性を有する正しいフォールディングと、生理活性を有しないミスフォールディングに分かれると考えられている。
　タンパク質の高次構造と生理活性の関係については種々の研究がなされているが、人工的に合成した糖タンパク質において、糖鎖がフォールディングや生理活性にどのような影響を与え得るかについては、これまでに報告がない。
　本発明者らは、特許文献１に係る方法で糖タンパク質断片を合成し、天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法）で他のペプチド断片と連結することによって、単球走化性タンパク質－３を合成した。合成された単球走化性タンパク質－３をフォールディングさせた後、キモトリプシン処理でジスルフィド結合の位置を確認したところ、約９０％の糖タンパク質はジスルフィド結合が正しい位置に形成されているが、約１０％は通常と異なる位置にジスルフィド結合が形成されていることが判明した（非特許文献１）。
　しかしながら、同文献では、異なる２種類以上の糖タンパク質をフォールディングした状態では分離していない。キモトリプシン処理時に、ジスルフィド結合が再形成される可能性があることも考慮すると、２種類以上のフォールディングが生じていたのではなく、キモトリプシン処理の結果が２種類以上に分かれただけである可能性も否定できない。従って、当然のことながら、ジスルフィド結合が正しい位置に形成された糖タンパク質と、通常と異なる位置に形成された糖タンパク質との生理活性の違いについても検討されていない。
　また、比較的よく機能や構造が研究されている糖タンパク質に、卵白に含まれるタンパク質の一種であるオボムコイドタンパク質がある。オボムコイドは分子量約２８，０００のタンパク質であり、分子内に３つのドメインを有し、各ドメインがそれぞれ異なったプロテアーゼに対して阻害活性を有する。特に第３ドメインは、単独でも阻害活性を示すことから詳細に研究されている。これまでに、１００種以上の鳥由来の第３ドメインについて構造が報告され、Ｘ線結晶解析によっても立体構造が明らかにされている。
　化学的に合成されたオボムコイド第３ドメインの立体構造については、例えば、ＮＣＬ法によって、ペプチド骨格を改変したオボムコイド第３ドメインを合成し、Ｘ線結晶解析を行ったことが報告されている（非特許文献２を参照）。
　また、オボムコイド第３ドメインを逐次伸長（ｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法とＮＣＬ法によって合成し、フォールディングさせたところ、熱安定性の解析により、正しく折りたたまれたことが強く示唆される結果が得られたとの報告もある（非特許文献３を参照）。
国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット 国際公開第２００４／０１１０３６号パンフレット
Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００８，１３０，５０１－５１０ Ｂａｔｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）３０５，８３９－８４９ Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９６，１１８，８５１８－８５２３
　しかしながら、上述の先行技術では、合成されたタンパク質に糖鎖が付加されておらず、糖タンパク質において、糖鎖がフォールディングや生理活性にどのように影響するかについては不明であった。
　そこで、本発明は、血中半減期等の糖鎖に基づく機能に加えて、生理活性も均一である糖タンパク質、即ち、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
　また、本発明は、生理活性の強さが異なる複数種類の糖タンパク質から所定の活性を有する糖タンパク質を選択するスクリーニング方法を提供すること、所望の活性を有する糖タンパク質混合物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、アミノ酸配列と糖鎖構造が均一なオボムコイドタンパク質の第３ドメインを合成してフォールディングさせると、複数種類の高次構造を一定の比率で含む混合物が再現性よく得られることを見出した。そしてこれらを分離して生理活性を測定したところ、従来の理解とは異なり、同一種類の生理活性を比較的高活性と認められるレベルで有する高次構造が複数種類存在すること；比較的高活性であるとはいえ高次構造によって活性に差があること；高次構造の異なる糖タンパク質は、カラムクロマトグラフィーによってそれぞれ分離・精製できること、を確認した。
　また、所定の活性を有する糖タンパク質以外のものは、アンフォールディングさせた後、再度フォールディングさせると、上記一定の比率で得られる高次構造に変換できること、従って、アンフォールディング／リフォールディング工程を繰り返すことにより、所定の活性を持つ高次構造を有する糖タンパク質を最大限に回収できることを見出した。
　即ち、本発明は、
　アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
　（ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって、分画する工程；及び
　（ｃ）所定の活性を有する画分を回収する工程
を含む、方法を提供する。
　上記方法においては、
　前記工程（ｃ）の後に、
　（ｄ）前記工程（ｃ）で回収されなかった画分に含まれる糖タンパク質をアンフォールディングさせる工程；
　（ｅ）前記アンフォールディングさせた糖タンパク質を再度フォールディングさせる工程；
　（ｆ）前記再度フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、前記所定の活性を有する画分を回収する工程；及び
　（ｇ）必要に応じて（ｄ）から（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含むことが好ましい。
　本発明はまた、
　所定の生理活性を有する糖タンパク質をスクリーニングする方法であって、以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）：
　（ｉ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
　（ｉｉ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する工程；及び
　（ｉｉｉ）各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定する工程
を含む方法を提供する。
　本発明はまた、
　所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法であって、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）：
　（Ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
　（Ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する工程；
　（Ｃ）各画分の活性を測定する工程；及び
　（Ｄ）所望の活性を得るための各画分の混合比率を求め、当該比率に従って各画分を混合する工程
を含む方法を提供する。
　本発明に係る糖タンパク質の製造方法、糖タンパク質のスクリーニング方法、または所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法においては、
　アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が以下の工程（１）～（６）：
　（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる工程；
　（２）前記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；
　（３）前記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させる工程；
　（４）前記工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；及び
　（５）前記工程（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返す工程；および
　（６）前記工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断する工程
を含む方法によって製造されることが好ましい。
　また、上記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質の製造方法においては、
　前記工程（１）～（６）によって前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質の一部が製造される場合であって、当該糖タンパク質が、さらに、以下の工程（７）：
　（７）前記工程（６）で得られた糖タンパク質の一部と、他のペプチド又は糖ペプチドとを、ライゲーション法によって連結する工程
を含むことが好ましい。
　本発明に係る糖タンパク質の製造方法によれば、アミノ酸配列、糖鎖構造に加えて、高次構造も均一な糖タンパク質を得られるので、血中半減期や細胞内での輸送にばらつきがないだけでなく、所定の生理活性を均一に有する糖タンパク質を製造することができる。
　また、本発明に係る糖タンパク質のスクリーニング方法によれば、高次構造が異なるために生理活性にばらつきが生じている糖タンパク質群から、所定の生理活性を均一に有する糖タンパク質を選択することができる。当該糖タンパク質は、糖鎖構造が均一であることから、血中半減期や、細胞内での輸送といった糖鎖に基づく機能も均一である。
　また、本発明によれば、糖タンパク質の混合物が所望の活性を有するように制御することが可能となる。
　本発明によるこれらの効果は、特に糖タンパク質を医薬品として用いる場合に有利である。
ｓｉｌｖｅｒ　ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメイン（ＯＭＳＶＰ３）と、その化学合成に用いるフラグメント１～３のアミノ酸配列を示す。 ＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント１（チオエステル体）を示す。 糖鎖を有するＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント２（チオエステル体）を示す。 ＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント３を示す。 フラグメント１合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 フラグメント２合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 フラグメント３合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 フラグメント２及びフラグメント３のＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 フラグメント２及び３と、フラグメント１とのＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 糖鎖を有するＯＭＳＶＰ３をフォールディングさせた後、ＨＰＬＣで分離したときの波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 図１０の画分ＢのＮＭＲスペクトルを示す。 図１０の画分ＢのＣＤスペクトルを示す。 図１０の各画分のキモトリプシンに対する阻害活性の測定結果を示す。 糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３の化学合成に用いるフラグメント２’（チオエステル体）を示す。 フラグメント２’合成時の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 フラグメント２’及びフラグメント３のＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 フラグメント２’及び３と、フラグメント１とのＮＣＬ法による連結の各段階における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３をフォールディングさせた後、ＨＰＬＣで分離したときの波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 図１８の画分ＦのＮＭＲスペクトルを示す。 図１８の画分ＦのＣＤスペクトルを示す。 図１８の各画分のキモトリプシンに対する阻害活性の測定結果を示す。 画分Ｆの検量線を示す。 画分Ａ－Ｄのキモトリプシンに対する阻害率を示す。 画分Ａ－ＤのＩＣ５０値を示す。 画分Ｅ－Ｈのキモトリプシンに対する阻害率を示す。 画分Ｅ－ＨのＩＣ５０値を示す。 画分Ｂの温度変化によるＣＤスペクトルを示す。 画分Ｆの温度変化によるＣＤスペクトルを示す。 画分Ｂに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 画分Ｂに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化後のペプチド断片の質量分析結果を示す。 画分Ｆに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化における波長２２０ｎｍにおけるクロマトグラムを示す。 画分Ｆに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化後のペプチド断片の質量分析結果を示す。 画分Ｂに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化によるジスルフィド結合の位置決定の結果を示す。 画分Ｆに対するＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化によるジスルフィド結合の位置決定の結果を示す。 基質ペプチドの検量線を示す。 基質ペプチドのＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ　ｐｌｏｔを示す。 基質ペプチドの単位時間当たりの反応速度を示す。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
　本明細書において、「タンパク質」とは、複数のアミノ酸がアミド結合により結合しているものであれば特に限定されず、公知タンパク質及び新規タンパク質並びにタンパク質改変体を含む。好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖タンパク質におけるタンパク質部分は、天然型と同じアミド結合（ペプチド結合）で複数のアミノ酸が結合している。本明細書におけるタンパク質は、フォールディングさせることによって所定の高次構造を取り得る長さを有するものである。
　本明細書において、「タンパク質改変体」とは、タンパク質を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、タンパク質の１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化（例えば、タンパク質のＣ末端のアミド化）、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
　なお、本明細書において、用語「ペプチド」は、原則としてタンパク質と同義で用いられるが、タンパク質の一部や、高次構造をとらない比較的短いアミノ酸鎖を指すために用いられる場合もある。
　本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン及びα－メチル－ヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）があげられる。
　好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖タンパク質のタンパク質部分は、全て生体内にタンパク質又は糖タンパク質の構成アミノ酸として存在するアミノ酸からなる。
　本明細書において、「糖タンパク質」とは、前記のタンパク質に少なくとも１つの糖鎖が付加された化合物であれば特に限定されず、公知の糖タンパク質及び新規の糖タンパク質を含む。なお、本明細書において、用語「糖ペプチド」は、原則として糖タンパク質と同義で用いられるが、糖タンパク質の一部や、上記ペプチドに糖鎖が結合したものを指す場合もある。
　好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖タンパク質は、Ｎ結合型糖鎖又はＯ結合型糖鎖を有するタンパク質であり、例えば、エリスロポエチン、インターロイキン、インターフェロン－β、抗体、単球走化性因子タンパク質－３（ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－３、ＭＣＰ－３）、オボムコイドタンパク質等のペプチドの一部分又は全部が挙げられる。
　糖タンパク質において、糖鎖とタンパク質中のアミノ酸残基とは、直接結合していても、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
　糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されず、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれに結合していてもよい。糖タンパク質が生体内に存在する糖タンパク質と同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖は、Ｎ結合型糖鎖のようにＡｓｎに結合していること、又はＯ結合型糖鎖のようにＳｅｒ若しくはＴｈｒに結合していることが好ましい。特に、Ｎ結合型糖鎖の場合、本発明の製造方法により得られる糖タンパク質は、Ａｓｎに糖鎖が結合し、該ＡｓｎのＣ末端側にプロリン以外のアミノ酸（Ｘ）がアミド結合（ペプチド結合）し、さらに該ＸのＣ末端側にＴｈｒ又はＳｅｒがアミド結合（ペプチド結合）した構造（－糖Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ－）を有する糖タンパク質であることが好ましい。　糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖が結合するアミノ酸は：アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２以上のカルボキシル基を持つアミノ酸；リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸；セリン、トレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸；システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸；又はアスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン又はグルタミンが好ましい。
　糖タンパク質において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば：
－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－ＣＨ２－
（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）；
Ｃ１－１０ポリメチレン；
－ＣＨ２－Ｒ３－
（ここで、Ｒ３は、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）；
等を挙げることができる。
　本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が２つ以上連なってできた化合物の他、１つの単位糖（単糖及び／又はその誘導体）からなる化合物をも含む。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
　また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ－１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ－アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の糖鎖は、好ましくは、生体内で複合糖質（糖タンパク質（又は糖ペプチド）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖タンパク質（又は糖ペプチド）としてタンパク質（又はペプチド）に結合している糖鎖であるＮ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖等である。Ｏ－結合型糖鎖が結合している糖タンパク質においては、ペプチドのＳｅｒ又はＴｈｒにＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、キシロース、フコース等がＯ－グリコシド結合で結合し、これにさらに糖鎖が付加する。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、複合型が好ましい。
　本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、下記式（４）で表される糖鎖である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素原子、又は、式（５）～（８）で示される基である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明の糖タンパク質の製造方法を、医薬品等の製造の分野に適用することを考慮した場合に抗原性等の問題を回避し得るという観点からは、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳ　Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖を挙げることができる。
　糖タンパク質における、糖鎖の付加数は、１鎖以上であれば特に限定されないが、生体内に存在する糖タンパク質と類似した構造の糖タンパク質を提供するという観点からは、体内に存在する糖タンパク質と同程度の付加数であれば、より好ましいであろう。
　本発明に係る糖タンパク質の製造方法では、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質が用いられる。本発明において、糖タンパク質における糖鎖の構造が均一であるとは、糖タンパク質間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖において同一であることをいう。
　また、本発明において、糖タンパク質におけるアミノ酸配列が均一であるとは、糖タンパク質間で比較した場合に、タンパク質中のアミノ酸の種類、結合順序、及びアミノ酸間の結合様式が同一であることをいう。ただし、糖タンパク質をフォールディングさせたときに所定の活性を有する限り、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖タンパク質において同一であればよい。
　本発明に用いられる、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、固相合成、液相合成、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等、当業者に公知のペプチド製造方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加工程で用いる糖鎖の製造方法に関しては、例えば、国際公開番号ＷＯ０３／００８４３１、ＷＯ２００４／０５８９８４、ＷＯ２００４／００８４３１、ＷＯ２００４／０５８８２４、ＷＯ２００４／０７００４６、ＷＯ２００７／０１１０５５等を参照することができる。
　本発明の好ましい態様においては、アミノ酸及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が、以下に示す方法によって製造される。以下に示す方法においては、ＷＯ２００４／００５３３０パンフレットも参照することができる。
　まず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基との間でエステル化反応が起こる。
　次に、（２）工程（１）で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
　（３）上記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させ、
　（４）工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ
　（５）工程（３）及び（４）の工程を必要に応じて繰り返すことにより、所望の数のアミノ酸が連結し、所望の位置に１つ以上の糖鎖が付加した糖タンパク質を得ることができる。なお、糖鎖付加したアミノ酸としては、例えば、アスパラギン側鎖のアミド基の窒素に糖鎖がＮ－グリコシド結合した糖鎖アスパラギン、セリン又はトレオニン側鎖の水酸基に糖鎖がＯ－グリコシド結合した糖鎖セリン又は糖鎖トレオニンが挙げられる。
　工程（５）で得られる糖タンパク質は、一端がレジンに結合し、もう一端に遊離アミノ基を有する。そこで、（６）工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断することにより、所望の糖タンパク質を製造することができる。
　固相樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｔｒｔ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅレジン（メルク社製）等を用いることができる。
　また、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジン（樹脂）とアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４－ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４－（４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ）－ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。
　脂溶性保護基としては、例えば、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等のカルボニル含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
　脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９－フルオレニルメチル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１～５時間程度行うのが良い。
　脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、既出のアミノ酸を上記の方法で保護したものを用いることができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏを挙げることができる。
　エステル化触媒として、例えば１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，３－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１～１０重量部、好ましくは２～５重量部である。
　エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。
　この時固相上の未反応の官能基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
　脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
　遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
　活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、１，３－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、３－ジエトキシホスホリルオキシ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－５－アザベンゾ－１，２，３－トリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ－ＯＨ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）等を挙げることができる。
　活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とするのが好ましい。
　上記活性化剤のみでも反応は進行するが、補助剤としてアミンを併用することが好ましい。アミンとしては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ－エチルモルホリン（ＮＥＭ）、Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）、Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）等を用いることができる。補助剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とするのが好ましい。
　溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。この際にも固相上の未反応のアミノ基を無水酢酸等を用いてアセチル化しキャッピングするのが好ましい。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
　レジン（樹脂）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。その際、アミノ酸に使用していた脂溶性保護基およびレジン（樹脂）上のリンカーから、反応性の高いカチオン種が生成する場合があるため、このものを捕獲するため求核性試薬を添加することが好ましい。求核性試薬としてはトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、フェノール、チオアニソール、エタンジチオール（ＥＤＴ）等を挙げることができる。
　アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、いくつかのペプチドブロック又は糖ペプチドブロックに分け、それぞれを工程（１）～（６）によって合成した後、ライゲーション法によって連結して製造することもできる。
　本明細書において「ライゲーション法」とは、国際公開第９６／３４８７８号パンフレットに記載された天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法）をはじめとし、非天然アミノ酸やアミノ酸誘導体を含むペプチドについて、天然型化学的ライゲーション法を応用する場合も含む。ライゲーション法によれば、連結部位に天然アミド結合（ペプチド結合）を有するタンパク質を製造することができる。
　ライゲーションを用いた連結は、ペプチド－ペプチド間、ペプチド－糖ペプチド間、糖ペプチド－糖ペプチド間のいずれにおいても行うことができるが、連結される２つのペプチド又は糖ペプチドの一方がＮ末端にシステイン残基を有し、他方がＣ末端にαカルボキシチオエステル部分を有していることが必要である。
　各ペプチド又は糖ペプチドブロックが、Ｎ末端にシステイン残基を有するようにするためには、例えば、各ペプチド又は糖ペプチドブロックを設計する際に、最終的に製造する糖タンパク質に含まれるシステイン残基のＮ末端側で分割すればよい。
　Ｃ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド又は糖ペプチドブロックは、国際公開番号ＷＯ９６／３４８７８の記載された方法等、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。
　例えば、後述の実施例に記載のように、固相合成法によって、アミノ酸側鎖とＮ末端のアミノ基が保護された保護ペプチド（又は糖ペプチド）を得て、このＣ末端側のカルボキシル基を、液相中において縮合剤にＰｙＢＯＰ（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ－１－ｙｌ－ｏｘｙ－ｔｒｉｓ－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／ＤＩＰＥＡを用いてベンジルメルカプタンと縮合させ、その後、９５％ＴＦＡ溶液を用いて脱保護することで、Ｃ末端にα－カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド（又は糖ペプチド）を得ることができる。
　ライゲーション法は、特許文献１に記載のような当業者に公知の手法を用いて、また、後述の実施例の記載を参照して実施することができる。例えば、Ｃ末端に－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＲにより表されるα－カルボキシチオエステル部分を有するようにした第１のペプチドと、Ｎ末端に－ＳＨ基を有するアミノ酸残基を有する第２のペプチドとを上述の記載を参照して用意する。なお、第１のペプチドにおいて、Ｒはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、４－（カルボキシメチル）－チオフェノール等のアリール型、２－メルカプトエタンスルホン酸塩、３－メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。また、第２のペプチドのＮ末端の－ＳＨ基は、所望により保護基により保護されていてもよいが、この保護基は以下のライゲーション反応までの所望の時点で脱保護し、Ｎ末端に－ＳＨ基を有する第２のペプチドが、第１のペプチドと反応する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、保護基により保護した第２のペプチドをそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。
　これらの２つのペプチドを、必要に応じ、４－メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、１００ｍＭリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第１のペプチド１当量に対し第２のペプチドを０．５～２当量及び触媒チオールを５当量程度の割合で反応を行う。反応はｐＨ６．５～７．５程度、２０～４０℃程度の条件下、約１～３０時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、ＨＰＬＣ、ＭＳ等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。
　これに、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス２－カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第１のペプチドと第２のペプチドとを連結することができる。
　なお、Ｃ末端にカルボキシチオエステル部分（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）を有するようにしたペプチドにおいて、Ｒ基の異なるペプチドが存在する場合、ライゲーション反応の順序を操作することが可能であり（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７），１６：２０５６－２０６４等参照）、複数回のライゲーションを行う場合にはこれを考慮することができる。例えば、Ｒとしてアリール基、ベンジル基及びアルキル基が存在する場合には、一般に、この順に、連結反応が進行する。
　本明細書において、タンパク質の「高次構造」とは、αへリックスやβシート構造などの２次構造、またはランダムコイル等の構造、２次構造が水素結合、ジスルフィド結合、イオン結合、疎水性相互作用などにより空間的に折りたたまれて、安定なコンフォメーションを形成した３次構造、複数のポリペプチド鎖がサブユニットとして集合して形成される４次構造を含む、タンパク質の立体構造をいう。タンパク質の高次構造は、タンパク質が生体内で機能を発揮するために必要な構造であることが好ましい。タンパク質の高次構造は、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ等により解析することができる。
　本明細書において、糖タンパク質の高次構造が均一とは、糖タンパク質のタンパク質部分の高次構造を、糖タンパク質間で比較した場合に、実質的に同一であることをいう。高次構造が実質的に同一であるとは、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の構造が均一であることを言う。高次構造が均一の糖タンパク質は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。ある画分に含まれる糖タンパク質の高次構造が均一であるか否かは、例えば、ＮＭＲ解析、ＣＤ測定、ジスルフィドマッピング等によって確認することができる。
　本明細書において「フォールディング」とは、糖タンパク質のタンパク質部分が特定の高次構造に折りたたまれることをいう。糖タンパク質のフォールディングは、公知の方法またはそれに順ずる方法に従って当業者は適宜行うことができるが、例えば、透析法と希釈法、失活法等が挙げられる。透析法は、予めタンパク質変性剤（アンフォールディング剤）を加えておき、これを透析によって徐々に希釈して緩衝液等に置き換えることにより、ペプチドを所定の高次構造にフォールディングさせる方法である。アンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素等が挙げられる。また、希釈法は、タンパク質変性剤を加えた後、緩衝液などで段階的あるいは一度に希釈することでペプチドを高次構造にフォールディングさせる方法である。失活法とは、タンパク質変性剤を加えた後、段階的あるいは一度にこの変性剤を失活させる第２の剤を加えることでペプチドを高次構造にフォールディングさせる方法である。
　本発明において「所定の生理活性」とは、フォールディングさせたときに、一定の比率で再現性よく得られる高次構造を有する糖タンパク質の生理活性の中から選択することができる。かかる生理活性は、予め対象とする糖タンパク質を、後述する工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様の方法でフォールディングさせ、カラムクロマトグラフィーによって分画し、主なピークに対応する流出液を回収し、その画分に含まれる糖タンパク質の生理活性を測定することによって求めることができる。ここで、主なピークとは、工程（ａ）及び工程（ｂ）を繰り返し行った場合に、再現性よく得られるピークを意味する。生理活性の測定は、対象となる糖タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で行うことができる。
　本発明に係る「アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質の製造方法」では、まず工程（ａ）において、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる。フォールディング後の糖タンパク質を含む溶液には、高次構造の異なる糖タンパク質が混在し、所定の活性を有するものと有しないものが含まれる。
　次に、工程（ｂ）において、フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する。カラムクロマトグラフィーは、高次構造の異なる糖タンパク質を分離できるものである限り特に限定されないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。カラムクロマトグラフィーの固定相、移動相の種類、流出速度等の条件は、分離する糖タンパク質に応じて、当業者が適宜選択することができるが、例えば、ＯＤＳタイプの逆相クロマトグラフィー、順相系カラム、アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換カラム等を用いることができる。
　工程（ｃ）において、カラムクロマトグラフィーの溶出液の各画分に含まれる糖タンパク質の活性を測定し、所定の活性を有する画分を回収することによって、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を得ることができる。
　本発明に係る糖タンパク質製造方法では、工程（ｃ）の後、（ｄ）前記工程（ｃ）で回収されなかった画分に含まれる糖タンパク質をアンフォールディングさせ、
　（ｅ）前記アンフォールディングさせた糖タンパク質を再度フォールディングさせ、
　（ｆ）前記再度フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、前記所望の活性を有する画分を回収し、
　（ｇ）必要に応じて（ｄ）から（ｆ）を繰り返すことも好ましい。
　工程（ｄ）でアンフォールディングされる糖タンパク質が含まれる画分には、所定の活性を有しない高次構造も含まれる。また、所定の活性を有する糖タンパク質が２以上混在している画分も、所定の活性値を示さないため、アンフォールディングされる画分に含まれる。
　糖タンパク質のアンフォールディングは、当業者に公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、塩酸グアニジン、尿素等のアンフォールディング剤（タンパク質変性剤）を添加する方法、また、これらに加えてジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール等の還元剤を添加する手法も挙げられる。
　工程（ｅ）及び工程（ｆ）は、上記工程（ａ）乃至工程（ｃ）と同様の方法で行うことができる。
　このように工程（ｄ）から工程（ｆ）を行うことによって、所定の活性を有しない画分に含まれる糖タンパク質が、いったん巻き戻され、再度折りたたまれることによって、一定の比率で所定の活性を有する高次構造に変換されうる。こうして、所定の活性を有する高次構造をとる糖タンパク質を、最大限回収することができる。
　本発明に係る「糖タンパク質のスクリーニング方法」は、（ｉ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせ、
　（ｉｉ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、
　（ｉｉｉ）各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定する。
　工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）は、上記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様に行うことができる。上述のとおり、アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングした後の糖タンパク質溶液には、複数の高次構造をとる糖タンパク質が混在している。従って、カラムクロマトグラフィーによって分画した後、各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定することによって、所定の生理活性を有する均一な高次構造を有する糖タンパク質のみを選択し精製することができる。
　さらに、本発明は、所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法を提供する。同方法は、（Ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせ、
　（Ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、
　（Ｃ）各画分の活性を測定し、
　（Ｄ）所望の活性を得られる各画分の混合比率を求め、当該比率に従って各画分を混合することを含む。
　工程（Ａ）及び工程（Ｂ）は、上記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様に行うことができる。工程（Ａ）及び工程（Ｂ）によって、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一で、所定の活性を有する糖タンパク質を得ることができる。従って、これらを所定の比率で混合することによって、所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得ることが可能である。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、　例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
<実施例１>　ｓｉｌｖｅｒ　ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメイン（以下、「ＯＭＳＶＰ３」と記載することもある。）の化学合成
１．アミノ酸配列及び糖鎖が均一なｓｉｌｖｅｒ　ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインの化学合成
　図１に示される３つのフラグメントをそれぞれ合成した後、ＮＣＬ法によってライゲーションを行って、アミノ酸配列及び糖鎖が均一なｓｉｌｖｅｒ　ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインを合成した。フラグメント１～３を図２～４に示す。
［使用した装置］
　１Ｈ－ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ　６００（６００ＭＨｚと表記）で測定した。ＥＳＩマススペクトル測定には、Ｂｒｕｃｋｅｒ　ＤａｌｔｏｎｉｃｓのＥｓｑｕｉｒｅ３０００ｐｌｕｓ．を用いた。
　ＣＤスペクトル測定には、ＪＡＳＣＯのＪ－８２０、Ｊ－８０５を用いた。
　ＲＰ－ＨＰＬＣ分析装置はＷａｔｅｒｓ社製のものを、ＵＶ検出器はＷａｔｅｒｓ製のＷａｔｅｒｓ４８６とｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ　２９９６）とＷａｔｅｒｓ２４８７を、カラムはＣａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｉｍｔａｋｔ　Ｃｏｒｐ．，３μｍ，４．６×７５ｍｍ）とＶｙｄａｃＣ－１８（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ，１０×２５０ｍｍ），ＶｙｄａｃＣ－８（５μｍ，１０×２５０ｍｍ），ＶｙｄａｃＣ－４（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を使用した。
［フラグメント１の合成］
　固相合成用カラムに２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ（１４３ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ（２１２．１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、を用い、最後のアミノ酸は保護基が酸で除去できるＢｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ（２４９．３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を用いた。固相樹脂上に、Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｐｒｏ－Ｌｅｕの保護基を有する２３残基ペプチド（配列番号１）を得た。このものに、ＡｃＯＨ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：４：１を（２ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をろ過して除き、さらにＭｅＯＨにて樹脂の洗浄を行った。ろ液を別途用意したヘキサン中に加え、晶析を行った。ろ過後の結晶を過剰量のベンゼンで３回共沸した後、凍結乾燥を行った（図５上段。ただし脱保護して測定した。）。
　得られたペプチド（保護基を有する配列番号１に記載の２３残基ペプチド）（３９ｍｇ、１０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ、ベンジルメルカプタン（３５．５μＬ、０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１．３５ｍＬ）、アルゴン気流下－２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ、５０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（８．５μＬ、５０μｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。攪拌後、反応溶液に過剰量のジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させ、ろ過した。その後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。溶液を減圧下に濃縮した後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（１ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した（図５中段）。反応溶液を減圧濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）　１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－ＳＢｎのＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基のペプチド（配列番号２）を得た（図５下段）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１１８Ｈ１８１Ｎ２７Ｏ３４Ｓ４：［Ｍ＋２Ｈ］２＋１３２６．０，Ｆｏｕｎｄ．１３２５．８
［フラグメント２の合成］
　次いで、別の固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１ｇ、５０μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．１２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．１２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．１２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で２時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔで反応を確認した。Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔ陰性（－）であることを確認し、樹脂をＤＣＭで１時間膨潤させた。ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、これを固相合成用の固相担体として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ（９６．９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（７４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（１４．９μｌ、０．１８８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（３３．８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３８．５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、を用い、固相樹脂上に、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ－Ｐｈｅの保護基を有する９残基ペプチド（配列番号３）を得た。この固相樹脂上の９残基ペプチド３μｍｏｌ相当を別の固相合成用カラムにとりＦｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦにて十分洗浄を行った後、樹脂をエッペンチューブに移した。次いで、下記式（１）で表される糖鎖アスパラギン（１２ｍｇ、６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（３ｍｇ、１０μｍｏｌ）をＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１、０．２０ｍＬに溶解させ、エッペンチューブに入れ、ＤＩＰＥＡ（１．０２μＬ、６μｍｏｌ）を加えて室温で２０時間攪拌した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　攪拌後、樹脂を固相合成用カラムに移し、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（２．３μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３７５ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）を用い、固相樹脂上にＢｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）―Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ－Ｐｈｅの保護基を有する１４残基糖鎖付加ペプチド（配列番号４）を得た。このものに、酢酸：トリフルオロエタノール（＝１：１）１ｍＬを加え、室温で２０時間撹拌を行った。樹脂をろ過して除き、さらにＭｅＯＨで洗浄した後、ろ液を減圧下に濃縮後、ベンゼンを用いて共沸を３回行った。この残渣を溶解後、凍結乾燥を行った（図６上段。ただし脱保護して測定した。）。
　得られたペプチド（保護基を有する配列番号４に記載の１４残基糖鎖付加ペプチド）（１１．７ｍｇ、３μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（１０．６μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（０．４１ｍＬ）、アルゴン気流下－２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（７．８ｍｇ、１５μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２．６μＬ、１５μｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。攪拌後、反応溶液に過剰量のジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させ、ろ過後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。溶液を減圧下に濃縮した後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（１ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した（図６中段）。反応溶液を減圧下に濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、　７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－ＳＢｎのＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基糖鎖付加ペプチド（配列番号５）を得た（図６下段）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１３３Ｈ２０３Ｎ２３Ｏ６７Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋１６４７．１，Ｆｏｕｎｄ．１６４６．６
［フラグメント３の合成］
　次いで、固相合成用カラムに２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ（２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（３５１．４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上に、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の保護基を有する１９残基ペプチド（配列番号６）を得た。このものに９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（３ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した後、樹脂をろ過して除き、ろ液を減圧下に濃縮した（図７上段）。これをＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの１９残基ペプチド（配列番号７）を得た（図７下段）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ８３Ｈ１３４Ｎ２４Ｏ２８Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋９９１．１，Ｆｏｕｎｄ．９９１．０
［フラグメント２とフラグメント３のＮＣＬ法によるライゲーション］
　フラグメント３（配列番号７に記載の１９残基ペプチド）１．９ｍｇ（１μｍｏｌ）とフラグメント２（配列番号５に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基の糖鎖付加ペプチド）３．２ｍｇ（１μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）４８５μＬに溶解させた後、２５℃にてチオフェノール（１５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図８の０ｈ）。２４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図８の２４ｈ）、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）　１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図８の精製後）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの保護基を有する３３残基糖鎖付加ペプチド（配列番号８）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２０９Ｈ３２９Ｎ４７Ｏ９５Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２８７．２８，Ｆｏｕｎｄ．１２８７．６
　得られたペプチド（配列番号８に記載の保護基を有する３３残基糖鎖付加ペプチド）を、０．２Ｍメトキシアミン水溶液（ｐＨ＝４．０）に溶解させた。４時間後、反応の終了をＨＰＬＣにて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図８のチアゾリン脱保護）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの３３残基糖鎖付加ペプチド（配列番号９）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２０８Ｈ３２９Ｎ４７Ｏ９５Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２８４．２８，Ｆｏｕｎｄ．１２８４．５
　なお、以下の条件でも同様に配列番号９に記載の３３残基糖鎖付加ペプチドが得られた。
　フラグメント３（配列番号７に記載の１９残基ペプチド）１．９ｍｇ（１μｍｏｌ）とフラグメント２（配列番号５に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基の糖鎖付加ペプチド）３．２ｍｇ（１μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。２５℃にて１％チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、７時間後にＨＰＬＣでフラグメント３の消失を確認した。その後０．２Ｍのメトキシアミン水溶液を系中がｐＨ４付近になるまで加えてＮ末端のＣｙｓを脱保護した。６時間後反応の終了を質量分析で確認し、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）　１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。その後凍結乾燥を行い、配列番号９の３３残基糖鎖付加ペプチドを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２０８Ｈ３２９Ｎ４７Ｏ９５Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２８４．２８，Ｆｏｕｎｄ．１２８４．５
［フラグメント１と、フラグメント２及び３とのＮＣＬ法によるライゲーション］
　フラグメント２とフラグメント３をライゲーションすることによって調製した３３残基糖鎖付加ペプチド（配列番号９）１．３ｍｇ（０．２５μｍｏｌ）とフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．３ｍｇ（０．５０μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）４８５μＬに溶解させた後、２５℃にてチオフェノール（１５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図９の０ｈ）。５４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図９の５４ｈ）。反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図９下段）。その後凍結乾燥を行い、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３１９Ｈ５０２Ｎ７４Ｏ１２９Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１５３２．４６，Ｆｏｕｎｄ．１５３２．７
　なお、以下の条件でも同様に、５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）を得ることができた。
　配列番号９に記載の３３残基糖鎖付加ペプチド１．３ｍｇ（０．２５μｍｏｌ）とフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．３ｍｇ（０．５０μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブに入れ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、３０時間後に、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。
［糖タンパク質のフォールディング］
　このようにして調製した５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）０．５ｍｇ（６５．２ｎｍｏｌ）をエッペンチューブに取り、０．６Ｍトリス緩衝液（ｐＨ＝８．７、０．６Ｍグアニジン塩酸塩、６ｍＭ　ＥＤＴＡ含有）１００μＬに溶解した。蒸留水５００μＬを加え希釈して、糖鎖を有するオボムコイド第３ドメインをフォールディングさせた。
［ＨＰＬＣによる分画］
　３６時間後、反応の進行をＨＰＬＣと質量分析にて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。高次構造を有したＬｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの５６残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１０）が含まれる４つの画分Ａ～Ｄを得た（図１０）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３１９Ｈ５０２Ｎ７４Ｏ１２９Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１５３２．２，［Ｍ＋４Ｈ］４＋１９１５．０，［Ｍ＋３Ｈ］３＋２５５３．０，
Ａ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．５，１９１５．２，２５５３．２
Ｂ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．５，１９１５．２，２５５３．２
Ｃ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．６，１９１５．３，２５５３．２
Ｄ；Ｆｏｕｎｄ．１５３２．７，１９１５．４，２５５３．３
　図９下段から図１０へのピークの変化、および、質量の減少は、上述のフォールディング工程により、ジスルフィド結合が形成されたことを示す。
　なお、反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、質量分析で分子量変化とＨＰＬＣでピークのリテンションタイムが変化したことを確認することにより、反応時間を適宜変更（例えば、２４時間）することができる。
　画分ＢのＮＭＲ測定：凍結乾燥後の画分Ｂを５％Ｄ２Ｏ／Ｈ２Ｏ（３００μｌ）に溶かし２５℃、６０ｍｓ、６００ＭＨｚで２Ｄ　ＴＯＣＳＹを測定した。ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。
　画分ＢのＣＤ測定：凍結乾燥後の画分Ｂを蒸留水に溶かしＣＤ測定を行った。装置はＪＡＳＣＯのＪ－８２０を用いた。測定領域は１８０ｎｍ～２６０ｎｍの範囲で行った。ＣＤスペクトルを図１２に示す。
　図１１より、ＨＰＬＣによる分離のみで、同一の高次構造を有する糖ペプチドが高度に精製されることが確認された。
２．糖鎖を有しないｓｉｌｖｅｒ　ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインの化学合成
　実施例と同様に、３つのフラグメントをそれぞれ合成した後、ＮＣＬ法によるライゲーションを行って、糖鎖を有しないｓｉｌｖｅｒ　ｐｈｅａｓａｎｔのオボムコイド第３ドメインを合成した。フラグメント１及びフラグメント３は、実施例と同様に合成した。比較例で、実施例のフラグメント２に対応するフラグメント（以下「フラグメント２’」という。）は、図１４に示すとおり糖鎖を有しない。
［フラグメント２’の合成］
　固相合成用カラムに２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ（１４３ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ（２３２．４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、を用い、最後のアミノ酸は保護基が酸で除去できるＢｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－ＯＨ（２３３．３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を用いた。固相樹脂上に、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ－Ｐｈｅの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１１）を得た。このものに、ＡｃＯＨ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：４：１を（２ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をろ過して除き、さらにＭｅＯＨにて樹脂の洗浄を行った。ろ液を減圧下に濃縮し、過剰量のベンゼンで３回共沸して凍結乾燥を行った（図１５上段。ただし脱保護して測定した。）。
　得られたペプチド（配列番号１１に記載の保護基を有する１４残基ペプチド）１１０ｍｇ（５０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（１７７．４μＬ、１．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（６．８ｍＬ）、アルゴン気流下－２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（１３０ｍｇ、２５０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（４２．５μＬ、２５０μｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。攪拌後、反応溶液に過剰量のジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させ、ろ過後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。溶液を減圧下に濃縮した後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（５ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した（図１５中段）。反応溶液を減圧下に濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、　７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：９％→２７％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－ＳＢｎのＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１２）を２６９．６ｍｇ得た（図１５下段）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ７１Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ２２Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋８３４．８，　Ｆｏｕｎｄ．８３４．７
［フラグメント２’とフラグメント３のＮＣＬ法によるライゲーション］
　このようにして調製したフラグメント２’（配列番号１２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基ペプチド）１．６ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）と、実施例にて合成したフラグメント３　１．９ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）４９５μＬに溶解させた後、チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図１６の０ｈ）。１８時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図１６の１８ｈ）、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、　７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図１６の精製後）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの保護基を有する３３残基ペプチド（配列番号１３）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４７Ｈ２２７Ｎ４３Ｏ５０Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋１１７５．９，Ｆｏｕｎｄ．１１７５．４
　得られた保護基を有する３３残基ペプチド（配列番号１３）を、０．２Ｍメトキシアミン水溶液（ｐＨ＝４．０）に溶解させた。４時間後、反応の終了をＨＰＬＣにて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した（図１６のチアゾリン脱保護）。その後凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの３３残基ペプチド（配列番号１４）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４６Ｈ２２７Ｎ４３Ｏ５０Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３
＋１１７１．９、Ｆｏｕｎｄ．１１７１．５
　なお、以下の条件でも同様に配列番号１４に記載の３３残基糖鎖付加ペプチドが得られた。
　フラグメント２’（配列番号１２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである保護基を有する１４残基ペプチド）１．６ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）と、実施例にて合成したフラグメント３　１．９ｍｇ（０．９６μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。１％チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、６時間後にＨＰＬＣでフラグメント３の消失を確認した。その後０．２Ｍのメトキシアミン水溶液を系中がｐＨ４付近になるまで加えてＮ末端のＣｙｓを脱保護した。６時間後反応の終了を質量分析で確認し、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４６Ｈ２２７Ｎ４３Ｏ５０Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋１１７１．９、Ｆｏｕｎｄ．１１７１．５
［フラグメント１と、フラグメント２’及び３とのＮＣＬ法によるライゲーション］
　このようにして調製した３３残基ペプチド（配列番号１４）０．６ｍｇ（０．１７μｍｏｌ）と実施例で合成したフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．１ｍｇ（０．４１μｍｏｌ）との二種類を同じエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）４８５μＬに溶解させた後、チオフェノール（１５μＬ）を加え、室温で反応を行った（図１７の０ｈ）。４５時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後（図１７の４５ｈ）、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、　７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。その後凍結乾燥を行い、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの５６残基ペプチド（配列番号１５）を得た（図１７下段）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５７Ｈ４００Ｎ７０Ｏ８４Ｓ７：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１５１０．７，Ｆｏｕｎｄ．１５１０．６
　なお、以下の条件でも同様に配列番号１５に記載の５６残基糖鎖付加ペプチドが得られた。
　配列番号１４に記載の３３残基ペプチド０．６ｍｇ（０．１７μｍｏｌ）とフラグメント１（配列番号２に記載のＣ末端がベンジルチオエステルである２３残基ペプチド）１．１ｍｇ（０．４１μｍｏｌ）との二種類をそれぞれエッペンチューブにいれ、０．１％りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、８Ｍ　グアニジン塩酸塩含有）２４７．５μＬに溶解させた後、ひとつのエッペンチューブに合わせた。１％チオフェノール（５μＬ）を加え、室温で反応を行った。反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、３０時間後に、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製した。その後凍結乾燥を行い、配列番号１５に記載の５６残基糖鎖付加ペプチドを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５７Ｈ４００Ｎ７０Ｏ８４Ｓ７：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１５１０．７，Ｆｏｕｎｄ．１５１０．６
［タンパク質のフォールディング］
　このようにして調製した５６残基ペプチド（配列番号１５）０．４ｍｇ（６６．２ｎｍｏｌ）をエッペンチューブに取り、０．６Ｍトリス緩衝液（ｐＨ＝８．７、０．６Ｍグアニジン塩酸塩、６ｍＭ　ＥＤＴＡ含有）１００μＬに溶解した。蒸留水５００μＬを加え希釈し、糖鎖のないオボムコイド第３ドメインをフォールディングさせた。
［ＨＰＬＣによる分画］
　３６時間後、反応の進行をＨＰＬＣと質量分析にて確認した後、ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＤ１８（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３ｍｍ、７５ｘ４．６ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）１５分　流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、高次構造を有したＬｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓの５６残基ペプチド（配列番号１５）が含まれる４つの画分Ｅ～Ｈを得た（図１８）。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５７Ｈ３９４Ｎ７０Ｏ８４Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１２０７．５，［Ｍ＋４Ｈ］４＋１５０９．１，［Ｍ＋３Ｈ］３＋２０１１．９，
Ｅ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．７、１５０９．３、２０１２．０
Ｆ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．６、１５０９．３、２０１２．０
Ｇ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．７、１５０９．３、２０１２．０
Ｈ；Ｆｏｕｎｄ．１２０７．８、１５０９．３、２０１２．０
　図１７下段から図１８へのピークの変化、および、質量の減少は、上述のフォールディング工程により、ジスルフィド結合が形成されたことを示す。
　なお、反応をＨＰＬＣと質量分析で追跡し、質量分析で分子量変化とＨＰＬＣでピークのリテンションタイムが変化したことを確認することにより、反応時間を適宜変更（例えば、２４時間）することができる。
　画分ＦのＮＭＲ測定：凍結乾燥後の画分Ｆを５％Ｄ２Ｏ／Ｈ２Ｏ（３００μｌ）に溶かし２５℃、８０ｍｓ、６００ＭＨｚで２Ｄ　ＴＯＣＳＹを測定した。ＮＭＲスペクトルを図１９に示す。
　画分ＦのＣＤ測定：凍結乾燥後の画分Ｆを蒸留水に溶かしＣＤ測定を行った。装置はＪＡＳＣＯのＪ－８２０を使用した。測定領域は１８０ｎｍ～２６０ｎｍの範囲で行った。ＣＤスペクトルを図２０に示す。
　図１９より、ＨＰＬＣによる分離のみで、同一の高次構造を有する糖ペプチドが高度に精製されることが確認された。
［画分Ｆの検量線の作成］
　画分Ｆ（１ｍｇ）をＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸バッファー（１ｍｌ）に溶かし、この溶液を希釈して１６５μＭ、８２．５μＭ、４１．３μＭ、２０．６μＭの濃度の画分Ｆを調製した。各濃度の溶液のＯＤ２８０をそれぞれ３回ずつ測定し、平均値化したものを表１および図２２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
<実施例２>生理活性の測定
［糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ａ～Ｄ）の生理活性の測定］
　０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％α－キモトリプシン、０．０１％牛血清アルブミン含有）の酵素溶液、及び、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、５１７μＭの参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）、０．０１％牛血清アルブミン含有）の基質溶液を調製し、各々２０μＬをエッペンチューブに加えた。この溶液に、実施例１で得られた画分Ａ～Ｄそれぞれを凍結乾燥した後、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％牛血清アルブミン含有）に溶解させ、各溶液のＯＤ２８０を測定し、溶液中に含まれるタンパク質濃度を一定としたサンプル液２０μＬを加え、阻害活性を測定した。この際の、最終的な反応濃度は、サンプル濃度２．５μＭ、酵素濃度０．３３μｇ／ｍＬ、基質濃度１７２μＭである。この反応液を、３７℃で１０分間インキュベートした後、４Ｎ塩酸を５μＬ加え反応を停止した。同様の操作を３回繰り返し、それぞれ分解率の平均値及び標準偏差を算出した。結果を図１３に示す。
［糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｅ～Ｈ）の生理活性の測定］
　０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％α－キモトリプシン、０．０１％牛血清アルブミン含有）の酵素溶液、及び、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、５１７μＭの参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）、０．０１％牛血清アルブミン含有）の基質溶液を調製し、各々２０μＬをエッペンチューブに加えた。この溶液に、実施例１で得られた画分Ｅ～Ｈそれぞれを凍結乾燥した後、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．０１％牛血清アルブミン含有）に溶解させ、各溶液のＯＤ２８０を測定し、溶液中に含まれるタンパク質濃度を一定としたサンプル液２０μＬを加え、阻害活性を測定した。この際の、最終的な反応濃度は、サンプル濃度２．５μＭ、酵素濃度０．３３μｇ／ｍＬ、基質濃度１７２μＭである。この反応液を、３７℃で１０分間インキュベートした後、４Ｎ塩酸を５μＬ加え反応を停止した。同様の操作を３回繰り返し、それぞれ分解率の平均値及び標準偏差を算出した。結果を図２１に示す。
<実施例３>生理活性の測定（ＩＣ５０の導出）
［糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ａ～Ｄ）のＩＣ５０の導出］
　参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）（１．５ｍｇ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、１ｍＭの溶液を調製した。吸光度計を用いて０．３４ｍＭになるように希釈した（溶液１）。キモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．２μｇ／ｍＬになるよう調製した（溶液２）。画分Ｂを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ含有）１００μＬに溶解させ、吸光度計を用いて６５ｎＭになるように希釈した。これを希釈して５８．５ｎＭ，５２ｎＭ，４５．５ｎＭ，３９ｎＭ，３２．５ｎＭ，２６ｎＭ，１９．５ｎＭ，１３ｎＭ，６．５ｎＭの溶液を作った（溶液３）。氷上で十分に冷やした溶液１を８０μＬ、溶液２，３を４０μｌずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、１Ｎの塩酸を１６μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、バッファー８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した。図２３は各阻害剤濃度に対する阻害率をプロットしたグラフを示す。同様に画分Ａ，ＣおよびＤに対しても阻害剤の濃度が酵素の活性を５０％阻害する濃度を挟むようにプロットした。その結果のグラフを示す（図２３）。このグラフを元に算出した糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ａ～Ｄ）のＩＣ５０値をグラフに示す（図２４）。
［糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｅ～Ｈ）のＩＣ５０の導出］
　参考例１（後述）で合成した保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）（１．５ｍｇ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、１ｍＭの溶液を調製した。吸光度計を用いて０．３４ｍＭになるように希釈した（溶液１）。キモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ含有）１ｍＬに溶解させ、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．２μｇ／ｍＬになるよう調製した（溶液２）。画分Ｆを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ含有）１００μＬに溶解させ、吸光度計を用いて６５ｎＭになるように希釈した。これを希釈して５８．５ｎＭ，５２ｎＭ，４５．５ｎＭ，３９ｎＭ，３２．５ｎＭ，２６ｎＭ，１９．５ｎＭ，１３ｎＭ，６．５ｎＭの溶液を作った（溶液３）。氷上で十分に冷やした溶液１を８０μＬ、溶液２，３を４０μＬずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、１Ｎの塩酸を１６μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、バッファー８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した。図２５は各阻害剤濃度に対する阻害率をプロットしたグラフを示す。同様に画分Ｅ，ＧおよびＨに対しても阻害剤の濃度が酵素の活性を５０％阻害する濃度を挟むようにプロットした。その結果のグラフを示す（図２５）。このグラフを元に算出した糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｅ～Ｆ）のＩＣ５０値をグラフに示す（図２６）。
<実施例４>熱安定性の測定
　ＣＤ測定用のセルを蒸留水で満たし、室温のまま測定した。この測定値をブランクとして以降の測定値は全てこのブランクの数値を差し引いて計算した。
［糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）の熱安定性］
　画分Ｂを蒸留水３００μＬに溶解し室温で測定した。測定終了後、試料をセルに満たしたままセルごと恒温槽に浸し温度可変実験を行った。はじめに５０℃の恒温槽に１０分間浸しておいたセルを１０分間室温に静置し測定を行った。以降９０℃まで同様の操作をしてＣＤスペクトルを測定した。結果を図２７に示す。
［糖鎖のないＯＭＳＶＰ３（画分Ｆ）の熱安定性］
　画分Ｆを蒸留水３００μｌに溶解し室温で測定した。測定終了後、試料をセルに満たしたままセルごと恒温槽に浸し温度可変実験を行った。はじめに５０℃の恒温槽に１０分間浸しておいたセルを１０分間室温に静置し測定を行った。以降９０℃まで同様の操作をしてＣＤスペクトルを測定した。結果を図２８に示す。
<実施例５>オボムコイド第３ドメインのジスルフィドマッピング
　合成したＯＭＳＶＰ３は３本のジスルフィド結合を有している。ジスルフィド結合はタンパク質のフォールディングの際に形成され、その形成過程は平衡反応である。そのため天然型タンパク質とは異なる位置でのジスルフィド結合形成も生じると考えられる。
　今回合成したＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）はＮＭＲおよび阻害活性評価の結果から単一化合物であり、天然型タンパク質と同じ位置でジスルフィド結合を形成していると予想された。そこで画分Ｂが確かに天然と同じ位置でジスルフィド結合を形成しているか確認するために以下の検討を行った。
［アミノ酸配列及び糖鎖が均一なＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）のジスルフィドマッピング］
　実施例１で得られた画分Ｂ（０．４ｍｇ）に対して臭化シアン（１ｍｇ／ｍＬ）を、４０％アセトニトリル、２％ＴＦＡ水溶液中、３７℃、遮光条件化で一晩反応させた。これを凍結乾燥させＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）３０分　流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分Ｉを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３１８Ｈ４９４Ｎ７４Ｏ１３０Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１９０７．５，Ｆｏｕｎｄ．１９０７．４
　次に、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を溶解させた５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２含有）に、画分Ｉ（０．１ｍｇ）を溶解させ、３７℃でインキュベートした。３時間後にＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ　展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（アセトニトリル　グラジエント：４．５％→４５％）１５分　流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分ＩＩからＶＩを得た（図２９、３０）。
ＥＳＩ－ＭＳ：
画分ＩＩ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３５Ｈ５４Ｎ１０Ｏ１３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，４４４．８，Ｆｏｕｎｄ　４４４．７
画分ＩＩＩ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５Ｈ３７Ｎ７Ｏ８：［Ｍ＋Ｈ］＋，５６４．４，Ｆｏｕｎｄ　５６４．４
画分ＩＶ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１１４Ｈ１８７Ｎ１９Ｏ６４Ｓ２：［Ｍ＋３Ｈ］３＋，９７１．６，Ｆｏｕｎｄ　９７１．５
画分Ｖ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１２３Ｈ１９６Ｎ２０Ｏ６６Ｓ２：［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１０２６．０，Ｆｏｕｎｄ　１０２５．９
画分ＶＩ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ６４Ｈ９３Ｎ１５Ｏ２２Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７４４．８，Ｆｏｕｎｄ　７４５．０
［糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３（画分Ｆ）のジスルフィドマッピング］
　実施例１で得られた画分Ｆ（０．４ｍｇ）に対して臭化シアン（１ｍｇ／ｍＬ）を、４０％アセトニトリル、２％ＴＦＡ水溶液中、３７℃、遮光条件化で一晩反応させた。これを凍結乾燥させＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ　展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０（アセトニトリルのグラジエント：１８％→５４％）３０分　流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分ＶＩＩを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５６Ｈ３９２Ｎ７０Ｏ８５Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１５０１．６，Ｆｏｕｎｄ．１５０１．５
　次に、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を溶解させた５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２含有）に、画分ＶＩＩ（０．１ｍｇ）を溶解させ、３７℃でインキュベートした。４時間後にＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ　展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（アセトニトリル　グラジエント：４．５％→４５％）　１５分　流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して画分ＶＩＩＩからＸＩを得た（図３１、３２）。
ＥＳＩ－ＭＳ：
画分ＶＩＩＩ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３５Ｈ５４Ｎ１０Ｏ１３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，４４４．８，Ｆｏｕｎｄ　４４４．７
画分ＩＸ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５Ｈ３７Ｎ７Ｏ８：［Ｍ＋Ｈ］＋，５６４．４，Ｆｏｕｎｄ　５６４．４
画分Ｘ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５２Ｈ８５Ｎ１５Ｏ１９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，６４４．８，Ｆｏｕｎｄ　６４４．９
画分ＸＩＩ；Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ６４Ｈ９３Ｎ１５Ｏ２２Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７４４．８，Ｆｏｕｎｄ　７４４．９
　ＣＮＢｒ処理を用いて糖鎖を有するＯＭＳＶＰ３（画分Ｂ）配列中のメチオニン部位で特異的にペプチド鎖を切断し（画分Ｉ）、続いてＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ消化を行った結果、ジスルフィド結合でつながったペプチド断片が得られた（図２９）。それぞれのペプチドフラグメントを精製後、ＥＳＩ－ｍａｓｓによりその質量を測定した。そして、得られた質量が、ＯＭＳＶＰ３のどのフラグメントに相当するかを解析した。その結果得られた推定構造を図３３の下図に示した。同様の方法を用いて糖鎖を有しないＯＭＳＶＰ３（画分Ｆ）についても、同様の方法を用いて解析し（図３１、３４参照）、その結果得られた推定構造を図３４の下図に示した。天然のＯＭＳＶＰ３と同じ位置でジスルフィド結合が形成していることを確認した（図３１、３４）。これらのジスルフィドマッピングから推定された画分Ｂおよび画分Ｆにおけるジスルフィド結合位置は、すでに解析されている天然のＯＭＳＶＰ３のジスルフィド結合位置と一致するものであった。
　これらのことから、本発明のフォールディング工程、分画工程、及び、回収工程によって、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び、高次構造が均一な糖タンパク質を製造することができることが示された。また、ＯＭＳＶＰ３の場合において、本発明の分画工程において最大ピークとして得られた画分は、天然と同じジスルフィド結合を有し、かつ、高活性の画分であり、所望の構造及び所望の活性を有する糖タンパク質を効率よく製造することができた。なお、このことは、他の糖タンパク質を製造する場合において、最大ピークの画分が所望の活性ないし所望の構造でないものであったとしても、所望の活性を有するその他の画分を適宜回収することにより、やはり、所定の活性を有する、アミノ酸配列、糖鎖構造、及び、高次構造が均一な糖タンパク質を製造することができるものであり、本発明が実施可能であることをなんら妨げるものではない。
　本発明の実施例において、糖タンパク質を有するオボムコイド第３ドメインをフォールディングさせ、ＨＰＬＣで分画したパターン（図１０）と、糖鎖を有しない第３ドメインをフォールディングさせ、ＨＰＬＣで分画したパターン（図１８）は、４つのピークを有する比較的類似したものであった。また、活性の強さもそれぞれ、実施例２においては、画分Ａ>画分Ｂ>画分Ｄ>画分Ｃ、画分Ｆ>画分Ｅ>画分Ｈ>画分Ｇ（図１３と図２１）、実施例３においては、画分Ａ>画分Ｂ>画分Ｃ>画分Ｄ、画分Ｅ>画分Ｆ>画分Ｇ>画分Ｈ（図２３～２６）と類似していたことから、同一の高次構造を有するものが、同じ順序で溶出したように見えた。中でも最大ピークとして得られる、高活性を有する画分Ｂと画分Ｆについて、ジスルフィド結合位置が同一であったことも、これと整合する結果であった。
　しかしながら、画分Ｂと画分ＦのＣＤスペクトルは一致せず、両者の高次構造が異なることが示された（図１２と図２０）。このことは、糖鎖付加が、糖鎖を有しないタンパク質のフォールディングに対して歪みを与えることなどによって、タンパク質の高次構造に変化をもたらしうることを示す。
　タンパク質のこのような高次構造の変化は、基質との結合のしやすさ等にも影響する点で、生理活性に影響を与えうることが予想され、また、糸球ろ過体の通過しやすさ等にも影響する点で、血中半減期にも影響を与えうることが予想される。このことから、糖タンパク質を医薬品として用いる際には、タンパク質に糖鎖を付加した状態で高次構造が一定のもののみを精製分離することにより、生理活性及び血中半減期を一定とする医薬を製造することが重要であるところ、本発明の方法はこれを可能にするものである。
<参考例１　阻害活性試験用基質の合成>
［基質ペプチドの合成］
　固相合成用カラムに２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ（１４３ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、で十分に洗浄した。別途、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ（２３２．４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２７２．１μＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶解させたものを、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｋａｉｓｅｒ　Ｔｅｓｔにより反応を確認し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１３５．１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１５３．９μＬ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れ、室温で１時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、を用い、最後のアミノ酸はＢｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－ＯＨ　（２３３．３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を用いた。固相樹脂上に、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ－Ｐｈｅの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１１）を得た。このものに９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ溶液（３ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した後、樹脂をろ過して除き、ろ液を減圧下に濃縮した。これをＨＰＬＣ（ＶｙＤＡＣ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｃ４（Ｉｍｔａｋｔ　Ｉｎｃ．）、３μｍ、４．５×２５０ｍｍ　展開溶媒Ａ：０．０９％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（アセトニトリル　グラジエント：４．５％→４５％）１５分　流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製した後、凍結乾燥を行い、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ６４Ｈ９５Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７８２．３４，Ｆｏｕｎｄ．７８２．２
［基質ペプチドの検量線の作成］
　合成した１４残基ペプチド（配列番号１６）１．５ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、この溶液を希釈して０．６ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭの基質濃度の溶液を調製した。各濃度の溶液のＯＤ２８０をそれぞれ３回ずつ測定し、平均値化したものを表２および図３５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［基質ペプチドのＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ　ｐｌｏｔの導出］
　合成した１４残基ペプチド（配列番号１６）３．１ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、２ｍＭの溶液を調製した。これを希釈して１．６ｍＭ、１．２ｍＭ、０．８ｍＭ、０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭの濃度の基質溶液を調製した。またキモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．１μｇ／ｍＬになるよう調製した。氷上で十分に冷やした各濃度の基質溶液を５０μＬ、酵素溶液を５０μＬずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で３０分インキュベートした。３０分後、１Ｎの塩酸を１０μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、緩衝液８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した（図３６）。表３に各基質濃度に対する反応速度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［基質ペプチドのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔの導出］
　合成した１４残基ペプチド（配列番号１６）１．５ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、１ｍＭの溶液を調製した。これを希釈して１ｍＭ、５００μＭ、３３３μＭ、２５０μＭ、２００μＭの濃度の基質溶液を調製した。またキモトリプシン（１ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）含有）１ｍＬに溶解し、この溶液を１０倍希釈し、さらにその溶液を１０倍希釈することを繰り返して０．１μｇ／ｍＬになるよう調製した。氷上で十分に冷やした各濃度の基質溶液を５０μＬ、酵素溶液を５０μｌずつ同じエッペンチューブに移し、３７℃で３０分インキュベートした。３０分後、１Ｎの塩酸を１０μＬ加えることで反応を停止させた。反応液２０μＬを、バッファー８０μＬと混合させ計１００μＬとし、ＨＰＬＣによる測定に用いた。反応生成物のＨＰＬＣ上のピーク面積から単位時間当たりの分解率（単位時間当たりの反応速度）を計算した（図３７）。表４に各基質濃度の逆数に対する反応速度の逆数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の製造方法によって、アミノ酸配列、糖鎖構造に加えて、高次構造も均一な糖タンパク質を得ることが可能となった。本発明の製造方法により得られる糖タンパク質は、高次構造が均一であることから、血中半減期や細胞内での輸送にばらつきがないだけでなく、所定の生理活性を均一に有する。また、本発明によれば、糖タンパク質の混合物が所望の活性を有するように制御することが可能となる。したがって、本発明の製造方法は、特に糖タンパク質を利用した医薬品の開発に利用可能である。
　配列番号１は、フラグメント１の、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号２は、フラグメント１の、ベンジルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号３は、フラグメント２の、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号４は、フラグメント２の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号５は、フラグメント２の、糖鎖が付加された、ベンジルチオエステル基及び保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号６は、フラグメント３の、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号７は、フラグメント３のアミノ酸配列である。
　配列番号８は、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号９は、糖鎖が付加された、アミノ酸配列である。
　配列番号１０は、糖鎖付加ＯＭＳＶＰ３の、糖鎖が付加された、アミノ酸配列である。
　配列番号１１は、フラグメント２’の、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号１２は、フラグメント２’の、ベンジルチオエステル基及び保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号１３は、保護基を有するアミノ酸配列である。
　配列番号１４は、アミノ酸配列である。
　配列番号１５は、糖鎖付加されていないＯＭＳＶＰ３の、アミノ酸配列である。
　配列番号１６は、キモトリプシンの基質である、保護基を有するアミノ酸配列である。

Claims (6)

  1. 　アミノ酸配列、糖鎖構造、及び高次構造が均一な糖タンパク質を製造する方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
    　（ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって、分画する工程；及び
    　（ｃ）所定の活性を有する画分を回収する工程
    を含む、方法。
  2. 　前記工程（ｃ）の後に、
    　（ｄ）前記工程（ｃ）で回収されなかった画分に含まれる糖タンパク質をアンフォールディングさせる工程；
    　（ｅ）前記アンフォールディングさせた糖タンパク質を再度フォールディングさせる工程；
    　（ｆ）前記再度フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画し、前記所定の活性を有する画分を回収する工程；及び
    　（ｇ）必要に応じて（ｄ）から（ｆ）を繰り返す工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　所定の生理活性を有する糖タンパク質をスクリーニングする方法であって、以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）：
    　（ｉ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
    　（ｉｉ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する工程；及び
    　（ｉｉｉ）各画分の活性を測定し、所定の活性を有するか否か判定する工程
    を含む方法。
  4. 　所望の生理活性を有する糖タンパク質混合物を得る方法であって、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）：
    　（Ａ）アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質をフォールディングさせる工程；
    　（Ｂ）前記フォールディングさせた糖タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって分画する工程；
    　（Ｃ）各画分の活性を測定する工程；及び
    　（Ｄ）所望の活性を得るための各画分の混合比率を求め、当該比率に従って各画分を混合する工程
    を含む方法。
  5. 　前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質は、少なくともその一部が以下の工程（１）～（６）：
    　（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをエステル化反応させる工程；
    　（２）前記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；
    　（３）前記遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基、又は脂溶性保護基でアミノ基が保護された糖鎖付加したアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させる工程；
    　（４）前記工程（３）の後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程；及び
    　（５）前記工程（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返す工程；および
    　（６）前記工程（１）で形成されたエステル結合を酸で切断する工程
    を含む方法によって製造される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記工程（１）～（６）によって前記アミノ酸配列及び糖鎖が均一な糖タンパク質の一部が製造される場合であって、当該糖タンパク質が、さらに、以下の工程（７）：
    　（７）前記工程（６）で得られた糖タンパク質の一部と、他のペプチド又は糖ペプチドとを、ライゲーション法によって連結する工程
    を含む方法によって製造される、請求項５に記載の方法。
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