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WO2006046433A1 - 遺伝子検査用マイクロリアクタ - Google Patents

遺伝子検査用マイクロリアクタ Download PDF

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Publication number
WO2006046433A1
WO2006046433A1 PCT/JP2005/019076 JP2005019076W WO2006046433A1 WO 2006046433 A1 WO2006046433 A1 WO 2006046433A1 JP 2005019076 W JP2005019076 W JP 2005019076W WO 2006046433 A1 WO2006046433 A1 WO 2006046433A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reagent
liquid
gene
amplification
unit
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/019076
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akihisa Nakajima
Eiichi Ueda
Yasuhiro Sando
Kusunoki Higashino
Nobuhisa Ishida
Original Assignee
Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. filed Critical Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
Priority to EP05795667A priority Critical patent/EP1806393A4/en
Priority to JP2006542984A priority patent/JPWO2006046433A1/ja
Publication of WO2006046433A1 publication Critical patent/WO2006046433A1/ja

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    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
    • G—PHYSICS
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    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1095—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices for supplying the samples to flow-through analysers

Definitions

  • the present invention performs a gene amplification reaction by feeding a sample injected from a sample storage unit or a pretreatment solution of the sample and a reagent stored in an amplification reagent storage unit to a reaction unit Subsequently, the present invention relates to a microreactor for genetic testing in which the operation of detecting the gene amplification reaction at a detection unit is performed in a chip in which each unit communicates via a fine flow path, and is particularly suitable for detecting bacterial power of specimen force. It relates to a microreactor.
  • the chip is intended for a large amount of clinical specimens, and it is necessary to overcome problems such as versatility and manufacturing cost.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-28589
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-322099
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-108285
  • Non-Patent Document 1 "DNA chip technology and its application”, “Protein Nucleic Acid Enzyme” 43 ⁇ , No. 13 (1998) Fumio Kimizuka, Yasunobu Kato, Kyoritsu Publishing Co., Ltd.
  • the present invention has been made in view of these circumstances, and an object thereof is to provide a microreactor for genetic testing suitable for detecting bacterial cells from a specimen by a gene amplification reaction.
  • the objective is to provide a microreactor for genetic testing for cell detection that enables highly accurate detection with a simple configuration.
  • the microreactor for gene testing of the present invention sends a sample injected from a sample storage unit or a pretreatment solution of the sample and a reagent stored in an amplification reagent storage unit to a reaction unit. After the gene amplification reaction is performed, the operation for detecting the gene amplification reaction at the detection unit is performed in a chip in which each unit communicates through a fine channel.
  • An extraction reagent containing portion containing a gene extraction reagent for extracting the bacterial cell gene adsorbed on the carrier is provided in the chip;
  • control means for switching the liquid feeding direction of the liquid containing the bacterial cell gene fed to the carrier filling part and repeatedly moving the liquid back and forth in the carrier filling part.
  • the bacterial cells in the specimen are lysed and washed with the gene adsorbed to a particulate carrier (beads, etc.), and then the adsorbed gene is extracted with an extraction reagent. Since the gene amplification reaction is carried out by feeding the reaction solution to the reaction section after elution, a pretreatment solution suitable for the amplification reaction can be obtained efficiently and rapidly.
  • FIG. 1 is a plan view showing a schematic configuration of a chip in an embodiment of a microreactor for gene testing of the present invention.
  • FIG. 2 (a) is a cross-sectional view showing an example of a piezo pump
  • FIG. 2 (b) is a top view thereof
  • FIG. 2 (c) is a cross-sectional view showing another example of the piezo pump.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration around the pump connection portion of the tip when the piezo pump is separated from the tip.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a configuration in which a bacterial cell gene produced by lysis of specimen strength is adsorbed to a carrier in a carrier filling portion.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining another configuration for adsorbing bacterial cell genes produced by lysis of specimen strength to the carrier in the carrier filling portion.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining a control system for repeatedly switching the liquid containing the bacterial cell gene in the carrier filling part in the front-rear direction.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a flow path configuration for mixing and reacting a sample processing solution and a reagent.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining a control system that repeatedly switches in the front-rear direction the feeding of the combined liquid of the sample processing liquid and the reagent introduced into the fine channel.
  • FIG. 9 is a diagram showing an example of the configuration of an amplification reagent storage unit and a reagent mixing unit.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view showing a state in which a Peltier element is provided on the lower surface of the chip in the amplification reagent storage unit and the reagent mixing unit.
  • FIG. 11 is a diagram showing a reaction section for detecting an amplification reaction by the ICAN method by the method described above and a flow path configuration around the detection section.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view showing an example of a check valve used in a microreactor flow path.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining a quantitative liquid feeding mechanism using a check valve.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating the structure of a hydrophobic valve.
  • the reaction unit is connected to a microchannel from a confluence portion where a processing solution in which the sample is pretreated and a reagent accommodated in the amplification reagent accommodating portion merge.
  • control means for switching the liquid feeding direction of the combined liquid of the liquids fed to the reaction section and repeatedly moving the combined liquid back and forth in the reaction section.
  • the amplification reaction is performed while the combined solution of the treatment liquid and the reagent pretreated in the carrier filling part is moved back and forth in the reaction part while switching the liquid feeding direction.
  • the probability that the child and the reagent meet is increased, and the reaction rate is improved.
  • the reaction part is a fine flow path, a flow velocity gradient occurs due to viscosity from the central part of the flow path to the inner wall of the flow path. Under this condition, the diffusion of the reagent by switching the liquid flow in the front-rear direction of the flow path is 2 Dimensional and fungus Probability that body genes and reagents meet.
  • a second flow path whose rate of change in flow path resistance with respect to a change in differential pressure is smaller than that of the first flow path, a pressurizing chamber connected to the first flow path and the second flow path,
  • micro pump provided with a drive device for driving the actuator.
  • the gene testing microreactor of the present invention sends a sample injected from a sample storage unit or a pretreatment solution of the sample and a reagent stored in an amplification reagent storage unit to a reaction unit.
  • An extraction reagent containing portion containing a gene extraction reagent for extracting the bacterial cell gene adsorbed on the carrier is provided in the chip;
  • a check valve is provided in at least one of the fine channels that communicate with each other.
  • the bacterial cells in the specimen are lysed and washed with the gene adsorbed on the particulate carrier. Since the gene amplification reaction is carried out by eluting the solution to the reaction section, a pretreatment solution suitable for the amplification reaction can be obtained efficiently and rapidly.
  • a check valve is provided as a position when a later-described mechanism for quantifying a reagent or a sample treatment solution is provided, or in the PCR method, due to cross contamination and the influence of contamination. Therefore, it is possible to list appropriate positions to prevent these contaminations and other positions near the downstream side of the connection between the micropump and the chip.
  • the microreactor for genetic testing of the present invention sends a sample injected from a sample storage unit or a treatment solution pretreated with the sample and a reagent stored in an amplification reagent storage unit to a reaction unit.
  • a gene testing microreactor in which the operation of detecting the gene amplification reaction at the detection unit after the gene amplification reaction is performed in a chip connected to each unit through a fine channel,
  • An extraction reagent containing portion containing a gene extraction reagent for extracting the bacterial cell gene adsorbed on the carrier is provided in the chip;
  • Cooling means for cooling the amplification reagent storage unit and a reagent mixing unit in which each reagent from Z or a plurality of amplification reagent storage units is mixed is provided.
  • a Peltier element is preferable.
  • the bacterial cells in the specimen are lysed and washed in a state where the gene is adsorbed to the particulate carrier. Since the gene amplification reaction is carried out by eluting the solution to the reaction section, a pretreatment solution suitable for the amplification reaction can be obtained efficiently and rapidly.
  • amplification reagent storage unit and the reagent mixing unit are cooled by a cooling means such as a Peltier element, it is possible to prevent deterioration of the reagent due to temperature.
  • PCR amplification requires temperature control that raises and lowers between three temperatures, and ICAN (Isothermal chim
  • the reaction section needs to be set to 50 to 65 ° C, so that the reagent is heated during the temperature rise process of the reaction section, reagent mixing, etc.
  • this can be prevented by providing Peltier elements on the upper and lower surfaces of the chip and the upper and lower surfaces of the amplification reagent storage unit and the reagent mixing unit and cooling them.
  • the genetic testing microreactor of the present invention sends a sample injected from a sample storage unit or a pretreatment solution of the sample and a reagent stored in an amplification reagent storage unit to a reaction unit.
  • a gene testing microreactor in which the operation of detecting the gene amplification reaction at the detection unit after the gene amplification reaction is performed in a chip connected to each unit through a fine channel,
  • An extraction reagent containing portion containing a gene extraction reagent for extracting the bacterial cell gene adsorbed on the carrier is provided in the chip;
  • the bacterial cell gene and the internal control are amplified simultaneously in the reaction part, and these are detected by separate detection parts, respectively.
  • the bacterial cells in the specimen are lysed and washed in a state where the gene is adsorbed to the particulate carrier! Since the gene amplification reaction is carried out by eluting the solution to the reaction section, a pretreatment solution suitable for the amplification reaction can be obtained efficiently and rapidly.
  • an internal control for discriminating false negatives of the gene amplification reaction due to an inhibitor or the like is amplified together with the sample pretreatment solution, and the solution after the reaction is appropriately treated as necessary. After that, it is divided and sent to a separate detection unit, and the detection of bacterial genes is detected by one detection unit and the internal control amplification is detected by the other detection unit. , Can perform quick and reliable inspection. [0027] According to the present invention, versatility and high sensitivity are ensured, low cost is achieved as a disposable type, high-precision detection is possible with a simple configuration, and efficient and quick. In addition, a microreactor for genetic testing, which is suitable for detecting bacteria or viruses, which can perform a pretreatment suitable for an amplification reaction on a specimen is provided.
  • gene refers to DNA or RNA carrying genetic information that expresses some function, but may also be referred to simply as DNA or RNA that is a chemical entity.
  • FIG. 1 is a plan view showing a schematic configuration of a chip in an embodiment of the microreactor for gene testing of the present invention.
  • the microreactor for genetic testing of this embodiment includes the chip 1 shown in the figure, a micropump for liquid feeding, a control system related to each control of the liquid feeding, temperature, and reaction, an optical detection system, and data collection and processing. And an apparatus main body provided with a processing system responsible for the system.
  • the components other than the chip 1 can be configured such that the chip 1 is attached to and detached from the apparatus main body as an apparatus main body in which these are integrated.
  • the micro pump may be installed in the chip 1, but it is incorporated in the main body of the device, and the chip 1 is attached to the main body of the device so that the pump connection part of the chip 1 is connected to the micro pump of the main body of the device. Is also possible.
  • the chip 1 is formed by forming a flow path or the like by fine processing technology using, for example, resin, glass, silicon, ceramics, and the like.
  • the vertical and horizontal dimensions are several tens mm and the height is about several mm.
  • Have a size of The fine channel formed in the chip 1 has a size of about 10 ⁇ m to several hundred ⁇ m in width and height, for example.
  • the liquid in each storage unit such as the lysing reagent storage unit 3, the washing liquid storage unit 5, the extraction reagent storage unit 6, the amplification reagent storage unit 7, the detection reagent storage unit 8 and the like is connected to each of these micro storage units.
  • the micropump 11 includes, for example, a chip-shaped pump unit in which one or a plurality of micropumps are formed by a photolithography technique, etc., and a chip in which pretreatment, reaction, and detection flow paths as illustrated are formed. Can be connected to each accommodating portion by overlapping the surfaces.
  • FIG. 2 (a) is a cross-sectional view showing an example of a piezo pump
  • FIG. 2 (b) is a top view thereof.
  • the micropump includes a substrate 42 on which a first liquid chamber 48, a first flow path 46, a pressurization chamber 45, a second flow path 47, and a second liquid chamber 49 are formed, and is laminated on the substrate 42.
  • a photosensitive glass substrate having a thickness of 500 ⁇ m is used as the substrate 42, and etching is performed until the depth reaches 100 ⁇ m, whereby the first liquid chamber 48, the first flow path 46, A pressurizing chamber 45, a second flow path 47, and a second liquid chamber 49 are formed.
  • the first channel 46 has a width of 25 / ⁇ ⁇ and a length of 20 m.
  • the second channel 47 has a width of 25 m and a length of 150 m.
  • the upper substrate 41 which is a glass substrate
  • the upper surfaces of the first liquid chamber 48, the first flow path 46, the second liquid chamber 49, and the second flow path 47 are formed.
  • the portion of the upper substrate 41 that corresponds to the upper surface of the pressurizing chamber 45 is processed by etching or the like and penetrates.
  • a vibration plate 43 having a thickness of 50 ⁇ m and having a thin glass force is laminated, and further, for example, a force such as lead zirconate titanate (PZT) ceramics having a thickness of 50 m is also provided.
  • the piezoelectric element 44 is laminated.
  • the piezoelectric element 44 and the vibration plate 43 attached to the piezoelectric element 44 vibrate due to the driving voltage of the driving unit force, whereby the volume of the pressurizing chamber 45 increases or decreases.
  • the first flow path 46 and the second flow path 47 have the same width and depth, and the length of the second flow path is longer than that of the first flow path.
  • turbulent flow is generated so as to whirl in the flow path, and the flow path resistance increases.
  • the second channel 47 since the channel width is long, the rate of change in the channel resistance with respect to the change in the differential pressure is smaller than that in the first channel, which tends to become a laminar flow even if the differential pressure increases.
  • the diaphragm 43 is quickly displaced inward of the pressurizing chamber 45 by the driving voltage for the piezoelectric element 44 to reduce the volume of the pressurizing chamber 45 while applying a large and differential pressure.
  • the volume of the pressurizing chamber 45 is increased while slowly displacing the diaphragm 43 from the pressure chamber 45 to give a small differential pressure, the liquid is fed in the direction B in FIG.
  • the volume of the pressurizing chamber 45 is increased while the diaphragm 43 is quickly displaced outwardly from the pressurizing chamber 45 to give a large differential pressure.
  • the volume of the pressurizing chamber 45 is decreased while the diaphragm 43 is slowly displaced inward from the pressurizing chamber 45 to give a small differential pressure, the liquid is fed in the A direction of FIG.
  • the difference in flow rate resistance change ratio with respect to the change in differential pressure between the first flow channel and the second flow channel is not necessarily required due to the difference in flow channel length. It may be based.
  • the liquid feeding direction and the liquid feeding speed can be controlled by changing the driving voltage and frequency of the pump.
  • Figure 2 (c) shows another example of this pump.
  • the pump is composed of a silicon substrate 71, a piezoelectric element 44, and a flexible wiring force (not shown).
  • the silicon substrate 71 is a silicon wafer that is formed into a predetermined shape by photolithography, and is subjected to etching to pressurization chamber 45, diaphragm 43, first flow path 46, first liquid chamber 48, second flow.
  • a passage 47 and a second liquid chamber 49 are formed.
  • the first liquid chamber 48 is provided with a port 72
  • the second liquid chamber 49 is provided with a port 73.
  • this piezo pump when this piezo pump is separated from the chip 1 in FIG. It communicates with the pump connection of chip 1 via ports 72 and 73.
  • the pump can be connected to the chip 1 by superimposing the substrate 74 having the holes 72 and 73 perforated and the vicinity of the pump connection portion of the microreactor on each other.
  • FIG. 3 shows the configuration around the pump connection portion of chip 1 when the piezo pump is separated from chip 1 of Fig. 1.
  • FIG. 4A shows the configuration of the pump unit that sends the driving liquid
  • FIG. 4B shows the configuration of the pump unit that sends the amplification reagent.
  • 24 is a drive fluid container, and the drive fluid may be either an oil system such as mineral oil or an aqueous system.
  • Reference numeral 25 denotes a sealing liquid container for sealing the amplification reagent stored in advance. This sealing liquid is intended to prevent the reagent from reacting due to leakage into the fine flow path, etc., and is solidified or stored under refrigerated conditions where the microreactor (TAS) chip is stored before use.
  • TAS microreactor
  • sealing liquid and amplification Although air may intervene between the reagent and the reagent, it is desirable that the amount of air intervening is sufficiently small (relative to the reagent amount) from the viewpoint of quantitative liquid feeding. Further, the sealing liquid may be filled in a fine flow path, or may be filled in a reservoir provided for the sealing liquid.
  • a flow path 26 for venting air is provided in the flow path between the pump connection section 12 and the amplification reagent storage section 7, a flow path 26 for venting air is provided.
  • the air vent flow path 26 also branches off the flow path between the pump connection section 12 and the amplification reagent storage section 7, and its end is open. From the air vent flow channel 26, for example, bubbles present in the flow channel are removed when the pump is connected.
  • This air vent channel 26 has a channel diameter of 10 m or less and a contact angle with water on the inner surface of the channel of 30 ° from the point of preventing leakage of an aqueous liquid such as water. The above is preferable.
  • [0044] 13 is a hydrophobic valve having the structure shown in FIG. 14. This hydrophobic valve 13 blocks the passage of the liquid until the liquid feeding pressure in the forward direction reaches a predetermined pressure, and exceeds the predetermined pressure. Allow the liquid to pass through by adjusting the liquid supply pressure.
  • the hydrophobic valve 13 is composed of a portion with a narrowed flow path diameter, whereby the liquid 27 in FIG. 14 (b) whose one-end-side force reaches the throttle flow passage 51 also passes to the other end side. It regulates that.
  • the throttle channel 51 is formed so that the vertical and horizontal dimensions are about 200 m x 30 m with respect to the vertical and horizontal channels 200 / zm X 200 / zm connected in series on both sides. .
  • the inner surface of the throttle channel 51 may be provided with a water-repellent coating, for example, a fluorine-based coating.
  • Samples such as whole blood, serum, buffy coat, urine, feces, saliva, sputum and other body fluids are injected from the sample storage unit 2.
  • Detectable bacteria and viruses contained in or possibly in these specimens are not particularly limited. If the bacterial and viral genes, and preferably the unique DNA sequence, are known, PCR primers for that are known in the art. Therefore, since it can produce, all are detectable. Specific examples include Mycobacterium tuberculosis, MRSA, influenza virus, and new infectious pathogens.
  • the amount of specimen required is, for example, 0.001 to 100 ng as DNA.
  • the specimen injected into the specimen container 2 is fed by a piezo pump 11 connected to the lysis reagent container 3, for example, as an aqueous solution containing lysozyme.
  • the microbial cells in the specimen are lysed by mixing with a simple lysis reagent. Any known lysis reagent can be used.
  • the bacterial cell gene that has been lysed and moved out of the bacterial cell is adsorbed to the fine carrier 55 filled in the fine flow path 4a of the carrier filling section 4.
  • the carrier 55 for example, beads, powder, or the like made of glass, silica gel, hydroxyapatite, celite, or the like can be used.
  • glass beads having a particle diameter of 0.05 to 1000 / ⁇ ⁇ are filled in the micro flow path 4a at a density of 0.05 gZml to l.3 gZml.
  • the liquid containing the bacterial cell gene sent to the carrier filling unit 4 is switched in the forward and backward directions as indicated by the arrows in FIG.
  • the micropump 11 is driven so as to repeatedly move back and forth in the flow path direction.
  • the probability that the bacterial cell gene 56 and the fine particle carrier 55 meet each other is increased, and the efficiency of adsorbing many of the bacterial cell genes 56 to the fine particle carrier 55 in a short time can be increased.
  • the reciprocation may be performed with an amplitude of 5 mm and a period of about 5 seconds.
  • FIG. 6 is a diagram showing a control system of the liquid-feeding micro pump 11 that moves the liquid containing the bacterial cell gene in the carrier filling unit 4 back and forth.
  • the liquid-feeding micropump 11 is connected to a microcomputer 34 via an amplifier 32 and a DZA converter 33.
  • the microcomputer 34 is equipped with a timer 35 and controls the liquid feeding of the liquid feeding micropump 11 at a preprogrammed timing.
  • the 32 to 35 systems that control the micropump 11 may be in the chip. However, by installing the chip 1 in the main body of the microreactor unit, the pump connection part of the chip 1 can be connected. It is possible to control the operation by connecting to the microphone pump of the main body.
  • FIG. 5 is a diagram showing another example of the liquid feeding system in the specimen storage unit, the lysing reagent storage unit, and the carrier filling unit.
  • the micropump 11 is also connected to the sample container 2, and the sample feeding from the sample container 2 and the lysing reagent feeding from the lysis reagent container 3 are controlled separately. It is good.
  • a valve 57 such as a check valve is provided in the fine flow path on the specimen container 2 side, and when the liquid containing the bacterial cell gene introduced into the carrier filler 4 is moved back and forth, the valve 57 is The solution is switched by the micropump 11 that is closed and connected to the lysis reagent container 3.
  • a washing solution such as a Tris-EDTA-NaClZ ethanol mixed solution is fed from the washing solution storage unit 5 of Fig. 1 to fill the carrier. Pass through part 4 and clean thoroughly.
  • a valve such as an active valve (not shown) provided in the vicinity of the branch part 31 is switched, and an extraction reagent such as a Tris-EDTA buffer is supplied from the extraction reagent storage part 6 to the carrier filling part 4.
  • the bacterial cell adsorbed on the fine particulate carrier is eluted and fed to the reaction section 9 as a pretreatment liquid.
  • the bacterial cell gene is RNA
  • it is converted to cDNA using an appropriate reverse transcriptase and subjected to a force gene amplification reaction.
  • the sample treatment solution obtained by pretreating the sample and the amplification reagent from the amplification reagent storage unit 7 are sent to the reaction unit 9 to perform a gene amplification reaction.
  • the reaction unit 9 may have a wide liquid reservoir shape or a fine flow path depending on the case.
  • a plurality of amplification reagent storage units 7 are provided corresponding to a plurality of reagents, and the mixing of the reagent and the reagent and the mixing of the sample treatment liquid and the reagent are performed at a desired ratio in a single mixing unit. It is also possible to mix at one or both, or to divide one or both of them to provide a plurality of merging sections and finally mix them to achieve the desired mixing ratio.
  • FIG. 10 An example of the configuration of the amplification reagent storage unit and the reagent mixing unit is shown in FIG.
  • the micropump (piezopump in this example) 11 is connected to each of the amplification reagent storage portions 7a, 7b, and 7c, and the reagent mixing portion 14 is connected to the end where the flow paths having the capacity of each storage portion are joined. Is provided.
  • These parts are cooled by Peltier elements. That is, Peltier element 59 is provided on the lower surface of the chip as shown in FIG. 10 (a) in area A1 where amplification reagent storage parts 7a, 7b, and 7c are provided in FIG. 9, and reagent mixing part 14 in FIG. As shown in FIG. 10 (b), a Peltier element 59 is also provided on the lower surface of the chip in the area A2 in which is provided.
  • the Peltier element 59 may be provided on the upper surface of the chip of each of these parts or on both upper and lower surfaces. Yes. In this way, by cooling the amplification reagent storage unit 7 and the reagent mixing unit 14, it is possible to prevent the deterioration of the reagent due to heating. In particular, PCR amplification requires temperature control that raises and lowers between three temperatures. Even when the ICAN (Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification) method is applied for gene amplification, the amplification reaction section needs to be set to 50 to 65 ° C. Although the reagent is easily heated and deteriorated at times, this can be prevented by providing a Peltier element and cooling as shown in FIG. Usually, if the amplification reagent storage unit 7 and the reagent mixing unit 14 are kept at about 4 ° C or less, the sample can be sufficiently prevented from being altered.
  • a reagent is stored in advance in the amplification reagent storage unit 7 so that a test can be performed quickly regardless of location or time.
  • Reagents built in the chip are sealed with a sealing material (sealing liquid) to prevent evaporation, leakage, air bubbles, contamination, denaturation, etc.
  • a sealing material contained in the sealing liquid container 25 in Fig. 3 are solid or gelled under refrigerated conditions where the microreactor TAS) chip is stored before use. When it reaches room temperature, it melts and becomes fluid.
  • a sealing material a water-insoluble plastic substance can be used.
  • the water solubility is 1% or less and the melting point is 8 ° C to room temperature (25 ° C).
  • an aqueous solution of gelatin is an aqueous solution of gelatin.
  • the gelatin temperature can be adjusted by changing the gelatin concentration. For example, in order to gel before and after 10 ° C, it should be about 1% aqueous solution! /.
  • the amplification method is not limited.
  • a DNA amplification technique a PCR amplification method that is widely used in various fields can be used.
  • Various conditions for implementing the amplification technique have been examined in detail and are described in various documents including various modifications and improvements.
  • PCR amplification force that requires temperature control to be raised and lowered between three temperatures
  • Channel device force that enables temperature control suitable for microchips has already been proposed by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-2006). 108285).
  • This device system may be applied to the amplification channel of the chip of the present invention. This makes the thermal cycle Since the microchannel is a micro reaction cell with a small heat capacity that can be switched at high speed, DNA amplification can be performed in a much shorter time than the conventional method that is performed manually in microtubes or microvials.
  • the recently developed ICAN (Isother malchimera primer initiated nucleic acid amplification) method is an arbitrary constant temperature from 50 to 100 ° C. It has the feature that DNA amplification can be carried out in a short time (Patent No. 3343392). Therefore, the ICAN method is a suitable amplification technique for the microreactor of the present invention because simple temperature control is sufficient. In a manual operation, the method, which takes 1 hour, ends in 10-20 minutes, preferably 15 minutes, in the bioreactor of the present invention.
  • the DNA amplification reaction may be another PCR modification method.
  • the microreactor of the present invention is flexible enough to cope with any change in the design of the flow path.
  • the technical details are disclosed and can be easily derived by those skilled in the art.
  • PCR primers are two oligonucleotides that are complementary to both ends of the amplified DNA strand at a specific site.
  • the design has already been developed for dedicated applications, and can be easily made by those skilled in the art using DNA synthesizers, chemical synthesis, and the like.
  • the primer for the ICAN method is a chimeric primer of DNA and RNA, but the preparation method of this primer has already been technically established (Japanese Patent No. 3433929). It is important to use the most appropriate primer design and selection to determine the success and efficiency of the amplification reaction.
  • the DNA of the amplification product can be immobilized on the substrate through binding to streptavidin on the chip substrate, and can be used for quantification of the amplification product.
  • primer labeling substances include digoxigenin and various fluorescent dyes.
  • Reagents such as enzymes used for amplification reactions are both for PCR and ICAN. It is easily available.
  • Reagents in the PCR method include at least 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate, Taq DNA polymerase, Vent DNA polymerase, or Pfo DNA polymerase.
  • the reagents in the ICAN method are at least 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate, a detected chimeric primer that can specifically hybridize to a gene, and DNA having strand displacement activity. Contains RNase of polymerase and endonuclease.
  • Internal control is used for target nucleic acid (DNA, RNA) as an internal standard for monitoring amplification or quantification.
  • the internal control sequence can be amplified in the same manner as the sample because it has a sequence that can hybridize the same primer as the sample primer on both sides of the sequence different from the sample.
  • the sequence of the positive control is a specific sequence for detecting the sample, and the portion where the primer hybridizes and the sequence between them are the same as those of the sample.
  • Nucleic acids (DNA, RNA) used for control may be those described in known technical literature.
  • the negative control contains all reagents other than nucleic acids (DNA, RNA), and is used for checking for contamination and for correcting the ground.
  • RNA samples there are reverse transcriptase and reverse transcription primer for synthesizing cDNA from RNA, and these are also commercially available.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a flow path configuration for mixing and reacting the sample processing solution and the reagent.
  • the sample treatment liquid sent from the sample treatment liquid side flow path 54 by the micropump (not shown) and the reagent sent from the reagent storage unit 7 by the micropump 11 are the Y-shaped flow path. Are merged at the merging section 58 and fed to the succeeding fine channel 9a.
  • the fine channel 9a has, for example, a width of 0.2 mm and a depth of 0.2 mm, and an ICAN reaction is performed in the fine channel 9a.
  • the micropump 11 for feeding the reagent is driven so as to repeatedly switch the liquid feeding direction, and the combined liquid in the microchannel 9a is driven.
  • a valve 57 such as a check valve or an active valve is provided in the flow path 54 on the specimen processing liquid side, and the fine flow path 9a is closed by the micropump 11 that closes the mixing process and feeds the reagent.
  • a separate micro pump for mixing in the flow path As the micropump 11, a piezo pump as shown in FIG. 2 is suitable.
  • the micropump on the sample processing liquid side and the micropump 11 on the reagent storage unit 7 side are driven without providing the force valve 57 that reciprocates the combined liquid with only one micropump 11. By doing so, the combined liquid in the fine flow path 9a can be reciprocated.
  • FIG. 8 is a diagram showing a control system for the micropump 11 for feeding liquid and the valve 57. As shown in the figure, the liquid-feeding micropump 11 is connected to a microcomputer 34 via an amplifier 32 and a DZA converter 33.
  • an air cylinder 36 for opening and closing the valve 57 is connected to the microphone computer 34 via the DZA modification 33!
  • the microcomputer 34 is equipped with a timer 35, and controls the liquid feeding of the liquid feeding micropump 11 and the opening / closing of the valve 57 at a preprogrammed timing. These control units may also be incorporated in the microreactor apparatus body as described above, and may be operated and controlled when the pump connection part of the chip 1 is connected to the micropump of the apparatus body.
  • the detection unit 10 After performing the gene amplification reaction in the reaction unit 9, the detection unit 10 detects the amplification reaction.
  • the detection unit 10 may also serve as the reaction unit 9 in some cases, but in the detection using a colloidal gold described later, detection is performed by a separate detection unit to which streptavidin is adsorbed.
  • the amplification reaction solution is divided, and amplification detection of the bacterial gene and amplification detection of the internal control are performed by a separate detection unit. It is preferable to do so.
  • the detection reagent for example, colloidal gold solution, luminescent reagent, etc.
  • the detection reagent storage unit 8 is sent to the detection unit 10 or the flow path between the reaction unit 9 and the detection unit 10, and the reaction amplification solution or its treatment is performed. Mix or contact with objects.
  • the method for detecting the amplified DNA of the target gene is not particularly limited, and a suitable method is used as necessary.
  • detection methods such as visible spectrophotometry, fluorescence measurement, and luminescence luminescence are the mainstream.
  • methods such as electrochemical methods, surface plasmon resonance, and quartz crystal microbalance are also included.
  • electrochemical methods, surface plasmon resonance, and quartz crystal microbalance are also included.
  • a method that can be measured with high sensitivity by visible light is preferable. Compared with fluorescence photometry, the instrument is more versatile, has fewer interfering factors, can be measured easily, and data processing is easy.
  • Suitable reactions and detection methods applied to the present invention include:
  • a colloidal gold solution whose surface is modified with an anti-FITC antibody that specifically binds to FITC is allowed to flow into the microchannel, and this makes the FITC-modified probe probed and immobilized on the immobilized gene. Adsorbing the colloidal gold,
  • a step of feeding a cleaning liquid into the flow path where streptavidin is adsorbed as necessary is included.
  • a washing solution for example, various buffer solutions, salt aqueous solutions, organic solvents and the like are suitable.
  • the denaturing solution is a reagent for making the gene DNA into a single strand, and examples thereof include sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • examples of the probe include an oligonucleotide.
  • fluorescent substances such as RITC (rhodamine isothiocyanate) can be mentioned.
  • the preprocessing, amplification, and detection described above include software having the conditions set in advance with respect to the liquid feeding sequence, volume, timing, etc. as the contents of the program along with control of the micropump and temperature, the micropump, and detection.
  • the process starts with the chip mounted on the main body of the device and the temperature controller. After the sample is injected, the analysis is started, and the sample and reagent delivery, pretreatment, mixing-based gene amplification reaction, gene detection reaction, and optical measurement are automatically performed as a series of continuous steps. Measurement data is stored in a file together with necessary conditions and recorded items.
  • FIG. 11 is a diagram showing a reaction unit for detecting an amplification reaction by the ICAN method by the above-described method and a flow channel configuration around the detection unit.
  • Reagents such as a chitin primer modified with piotin that specifically hybridizes to the gene to be detected, a DNA polymerase having strand displacement activity, and an endonuclease are accommodated in the amplification reagent accommodating portions 7a, 7b, and 7c in FIG. Then, the reagent is sent from the reagent storage unit to the downstream flow path 14 and mixed by the piezo pump 11 on the upstream side of each reagent storage unit.
  • Each of the reagent containers 7a, 7b, and 7c contains, for example, a total of more than 7.5 ⁇ 1 of reagents, and the reagent mixture liquid of a total of 7.5 1 with the leading edge discarded is 2.5.
  • the liquid is fed into a flow path that branches into three.
  • One of the channels is connected to the position of ⁇ in Fig. 11, and is connected to the system for reaction with the sample processing solution and its detection.
  • the other channel is connected to the system for reaction with positive control and its detection, and the other channel is connected to the system for reaction with negative control and its detection. ing.
  • the mixed reagent sent from the position force B in Fig. 11 is filled in the reservoir 17a.
  • the sample processing liquid is also fed with the positional force of A in FIG. 11, filled in the reservoir 17b in a fixed amount (2.5 1), and is sent to the subsequent flow path quantitatively.
  • the sample processing solution and the reagent mixture filled in the reservoirs 17a and 17b are sent to the channel 15a (volume 51) via the Y-shaped channel, and mixed and ICAN— PCR reaction is performed.
  • This treatment solution is sent to the streptavidin adsorption part 1 Oa, 10b having streptavidin adsorbed in the flow path to fix the amplified gene in the flow path, and then the washing liquid storage part 21d Then wash with the washing solution flowing to the streptavidin adsorption part 10a, 10b.
  • the hybridization buffer accommodated in the hybridization buffer accommodating portion 21c is accommodated in the streptavidin adsorption portions 10a and 10b.
  • the probe DNA solution, washing solution, and FITC contained in the receiving portions 21f, 21d, 21e, and 21d, and labeled with FITC at the ends are received by the single pump 11.
  • the colloidal gold solution labeled with the antibody is fed in the order shown in the figure.
  • the flow path is configured so that the probe DNA is noblyzed to the single-stranded amplified gene before the single-stranded amplified gene is immobilized on the streptavidin adsorbing portions 10a and 10b. A little.
  • the colloidal gold is bound to the immobilized amplified gene via FITC and immobilized.
  • the presence or absence of amplification or amplification efficiency is measured by optically detecting the immobilized gold colloid.
  • the internal control is subjected to an amplification reaction together with the sample pretreatment solution, and then amplified. Divide the reaction solution and send it to different detection units 10a and 10b.
  • One detection unit 10a detects bacterial gene amplification
  • the other detection unit 10b detects internal control amplification. Therefore, a highly reliable inspection can be performed quickly with a simple configuration.
  • a check valve 16 is provided at an appropriate position in the flow path between the reagent storage unit, the reaction unit, and the detection unit.
  • a check valve may be provided at an appropriate position for preventing cross contamination as described above (for example, a position near the downstream side of the pump connection portion 12 in FIG. 11). preferable.
  • FIGS. 12A and 12B are cross-sectional views showing an example of a check valve used in the flow channel of the microreactor of the present embodiment.
  • the microsphere 67 is used as a valve body, and the opening 68 formed in the substrate 62 is opened and closed by the movement of the microsphere 67, thereby permitting and blocking the passage of liquid. That is, when the liquid is fed from the direction A, the microspheres 67 are separated from the substrate 62 by the liquid pressure and the opening 68 is opened, so that the passage of the liquid is allowed. On the other hand, when the liquid flows backward from the B direction, the microsphere 67 is seated on the substrate 62 and the opening 68 is closed, so that the liquid is blocked from passing.
  • the flexible substrate 69 which is laminated on the substrate 62 and whose end extends to the upper side of the opening 68, moves up and down above the opening 68 by hydraulic pressure.
  • the opening 68 is opened and closed. That is, when the liquid is fed from the A direction, the end of the flexible substrate 69 is separated from the substrate 62 by the hydraulic pressure, and the opening 68 is opened, so that the passage of the liquid is allowed.
  • the flexible substrate 69 comes into close contact with the substrate 62 and the opening 68 is closed, so that the passage of the liquid is blocked.
  • FIG. 2 The quantitative liquid feeding mechanism shown in Fig. 2 can be mentioned.
  • a predetermined amount of reagent is filled in the flow path (reagent filling flow path 15A) between the check valve 16 and the hydrophobic valve 13a.
  • a branch channel 15B is provided that branches from the reagent-filled channel 15A and communicates with the micropump 11 that feeds the driving liquid.
  • the driving liquid 70 is fed by the micro pump 11 and this air, sealing liquid, etc. is supplied to the reagent filling flow path. Reagents can be pushed out by feeding into 15A. It should be noted that by providing a large volume reservoir 17a in the reagent filling channel 15A, the variation in the quantity is reduced.
  • This quantitative liquid feeding mechanism is used for the quantification of the reagent mixed solution in FIG. 11 (position X2 in the figure) and the quantification of the sample treatment liquid (position XI in the figure).

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Abstract

　汎用性および高感度が確保され、ディスポーサブルタイプとする低コスト性を実現し、シンプルな構成で精度の高い検出が可能であると共に、効率良く且つ迅速に、検体に対して増幅反応に適した前処理を行うことができる菌体検出のための遺伝子検査用マイクロリアクタを提供する。 　溶菌試薬収容部３に収容された溶菌試薬により検体中の菌体を溶菌し、菌体遺伝子を担体充填部４内に充填された担体に吸着させた後、洗浄および菌体遺伝子の抽出を行う前処理を行う。さらに、担体充填部４に送液された菌体遺伝子を含む液体の送液方向を切り替えて繰り返し前後動させる制御手段、逆止弁、増幅試薬収容部７および試薬混合部を冷却するペルチェ素子等の冷却手段を設けた。

Description

明 細 書
遺伝子検査用マイクロリアクタ
技術分野
[0001] 本発明は、検体収容部から注入された検体もしくは該検体を前処理した処理液と、 増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に送液して遺伝子増幅反応を行った 後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操作を、前記各部が微細流路を介して 連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用マイクロリアクタに関し、特に、検体 力 の菌体検出に好適なマイクロリアクタに関する。
背景技術
[0002] 近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試 料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段 (例えばポンプ、バルブ、 流路、センサーなど)を微細化して 1チップ上に集積ィ匕したシステムが開発されている (特許文献 1)。これは、 μ -TAS (Micro total Analysis System)、バイオリアクタ、ラ ブ'オン 'チップ (Lab-on-chips)、バイオチップとも呼ばれ、医療検査 '診断分野、環 境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見 られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、 自動化、高速ィ匕および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所 要時間のみならず、時間および場所を選ばな 、分析を可能とすることによる恩恵は 多大と言える。
[0003] 例えばヒト、家畜に見られる新型感染症の突発的流行にあっては、原因となるウイ ルス、細菌の特定が、一刻を争う予防対策における最初の障壁となる。菌の培養が 律速となりがちな従来の検出法に対し、場所を選ばず迅速に結果を出す遺伝子検 查技術は、こうした急務の要請に応えるものである。さらには遺伝子による病気の診 断、生活習慣病などの発症リスク予測、遺伝子医療においてもニーズが高い。
[0004] 臨床検査ではこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性 などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システム を確立することが課題である。精度が高ぐ信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が 求められて!/ヽる。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案し て 、る（特許文献 2および 3)。
[0005] また、大量の臨床検体を対象とするチップに対しては、デイスポーサブルであること が望まれ、さらに多用途対応性、製造コストなどの問題点を克服する必要がある。
[0006] 多数の DNA断片を高密度で固定ィ匕した DNAチップでは、搭載する情報の内容、 力さむ作製コスト、さらに検出精度、再現性などが未だ充分でないといった問題点が 存在する。し力しながら、遺伝子検査の目的と種類によっては、チップ基板上に多数 の DNAプローブを網羅的に配置する方式よりも、適宜変更できるプライマーを使用 して DNA増幅反応の効率をリアルタイムで追跡する方力 簡便かつ迅速な検査法を 提供する可能性もある。
特許文献 1：特開 2004-28589号公報
特許文献 2：特開 2001-322099号公報
特許文献 3：特開 2004-108285号公報
非特許文献 1 :「DNAチップ技術とその応用」、「蛋白質 核酸 酵素」 43卷、 13号（19 98年)君塚房夫、加藤郁之進、共立出版 (株)発行
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明はこれらの実状に鑑みてなされたものであり、遺伝子増幅反応による検体か らの菌体検出に好適な遺伝子検査用マイクロリアクタを提供することを目的とする。
[0008] 即ち、汎用性および高感度が確保され、用いるプライマー、バイオプローブを適宜 変更する方式の DNA増幅を行うことができ、デイスポーサブルタイプとする低コスト性 を実現し、し力も検出に際してはシンプルな構成で精度の高い検出を可能とする菌 体検出のための遺伝子検査用マイクロリアクタの提供を行うことを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしく は該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に 送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操 作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用 マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、 前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路 内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が 収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽 出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記担体充填部に送液された前記菌体遺伝子を含む液体の送液方向を切り替え て、前記液体を前記担体充填部で繰り返し前後動させる制御手段が設けられて 、る ことを特徴とする。
発明の効果
[0010] 上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微 粒状担体 (ビーズ等）に吸着させた状態で洗浄を行い、次いで抽出試薬で吸着遺伝 子を溶離した後に反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにして ヽるので、効 率良く且つ迅速に増幅反応に適した前処理液を得ることができる。
[0011] 特に、溶菌された菌体遺伝子を含む液体の送液方向を流路前後方向に切り替える ようにしたので、菌体遺伝子と微粒状担体とが出会う確率が高められ、効率よく多くの 菌体遺伝子を微粒状担体に吸着させることができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]図 1は、本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタの実施形態におけるチップの概 略構成を示した平面図である。
[図 2]図 2 (a)は、ピエゾポンプの一例を示した断面図、図 2 (b)は、その上面図である 。図 2 (c)は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図である。
[図 3]図 3は、ピエゾポンプをチップとは別体とした場合におけるチップのポンプ接続 部周辺の構成を示した図である。
[図 4]図 4は、担体充填部の担体へ検体力 の溶菌で出た菌体遺伝子を吸着させる 構成を説明する図である。 [図 5]図 5は、担体充填部の担体へ検体力 の溶菌で出た菌体遺伝子を吸着させる 他の構成を説明する図である。
[図 6]図 6は、担体充填部内の菌体遺伝子を含む液体の送液を前後方向に繰り返し 切り替える制御系統を説明する図である。
[図 7]図 7は、検体処理液と試薬との混合および反応を行う流路構成の一例を示した 図である。
[図 8]図 8は、微細流路内に導入された検体処理液と試薬との合流液の送液を前後 方向に繰り返し切り替える制御系統を説明する図である。
[図 9]図 9は、増幅試薬収容部および試薬混合部の構成の一例を示した図である。
[図 10]図 10は、増幅試薬収容部および試薬混合部におけるチップ下面にペルチェ 素子を設けた状態を示した断面図である。
[図 11]図 11は、 ICAN法による増幅反応を上述した方法で検出する反応部および検 出部周辺の流路構成を示した図である。
[図 12]図 12は、マイクロリアクタの流路に使用される逆止弁の一例を示した断面図で ある。
[図 13]図 13は、逆止弁を利用した定量送液機構を説明する図である。
[図 14]図 14は、疎水性バルブの構造を説明する図である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、前記反応部が、前記検体を前処理した 処理液と、前記増幅試薬収容部に収容された試薬とが合流する合流部から先の微 細流路からなり、
前記反応部に送液された前記各液の合流液の送液方向を切り替えて、前記合流 液を前記反応部で繰り返し前後動させる制御手段を備えることを特徴とする。
[0014] 上記の発明では、担体充填部で前処理した処理液と試薬との合流液を、反応部内 で送液方向を切り替えて前後動させながら増幅反応を行うようにしたので、菌体遺伝 子と試薬とが出会う確率が高められ、反応速度が向上する。特に、反応部を微細流 路とすると、流路中央部から流路内壁側へ粘性により流速勾配が生じるので、この条 件下では、流路前後方向への切り替え送液による試薬の拡散は 2次元的になり、菌 体遺伝子と試薬とが出会う確率が高くなる。
[0015] なお、担体充填部もしくは反応部における送液方向の切り替えは、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第 1流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第 1流路よりも小さい第 2流路と、 第 1流路および第 2流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるァクチユエータと、
該ァクチユエータを駆動する駆動装置とを備えるマイクロポンプを用いて行うことが 好ましい。
[0016] 本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしく は該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に 送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操 作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用 マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、 前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路 内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が 収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽 出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記各部を連通する微細流路のうち少なくとも一つの微細流路に逆止弁が設けら れていることを特徴とする。
[0017] 上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微 粒状担体に吸着させた状態で洗浄を行!ヽ、次!ヽで抽出液で吸着遺伝子を溶離して 反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に 増幅反応に適した前処理液を得ることができる。
[0018] さらに、前記各収容部および担体充填部の間の流路における適宜の位置に、逆止 弁を設けて 、るので、当該位置における液体の逆流を防止して正確に所定の送液を 行うことができる。
[0019] 逆止弁を設ける好ま 、位置としては、試薬もしくは検体の処理液を定量する後述 の機構を設けた場合には当該位置、また、 PCR法ではクロスコンタミネーシヨンといつ た汚染による影響が著しぐ深刻となるため、これらの汚染を防止するための適切な部 位、その他、マイクロポンプとチップとの接続部に対する下流側の近傍位置を挙げる ことができる。
[0020] 本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしく は該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に 送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操 作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用 マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、 前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路 内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が 収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽 出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記増幅試薬収容部、および Zまたは複数の前記増幅試薬収容部からの各試薬 が混合される試薬混合部を冷却する冷却手段が設けられていることを特徴とする。
[0021] 前記冷却手段としては、ペルチェ素子が好ましい。
[0022] 上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微 粒状担体に吸着させた状態で洗浄を行!ヽ、次!ヽで抽出液で吸着遺伝子を溶離して 反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に 増幅反応に適した前処理液を得ることができる。
[0023] さらに、増幅試薬収容部と試薬混合部をペルチヱ素子などの冷却手段により冷却 するようにしたので、温度による試薬の変質を防止できる。特に、 PCR増幅では 3つ の温度間で昇降させる温度管理が必要になり、遺伝子増幅に ICAN (Isothermal chim era primer initiated nucleic acid amplification )法を適用する構成とした場合でも、反 応部を 50〜65°Cとする必要があるため、反応部の昇温過程、試薬混合時等に試薬 が加温されて変質し易くなるが、増幅試薬収容部と試薬混合部のチップ上面もしくは 下面、あるいは上下両面にペルチヱ素子等を設けて冷却することによりこれを防止す ることがでさる。
[0024] 本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしく は該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に 送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操 作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用 マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、 前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路 内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が 収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽 出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記菌体遺伝子とインターナルコントロールとを前記反応部で同時に増幅し、これ らを別途の検出部でそれぞれ検出するようにしたことを特徴とする。
[0025] 上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微 粒状担体に吸着させた状態で洗浄を行!ヽ、次!ヽで抽出液で吸着遺伝子を溶離して 反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に 増幅反応に適した前処理液を得ることができる。
[0026] さらに、阻害物質等による遺伝子増幅反応の偽陰性を判別するためのインターナ ルコントロールを検体の前処理液と共に増幅反応させ、反応後の溶液を、必要に応 じて適宜の処理を行った後に分割して別途の検出部に送液し、一方の検出部で菌 体遺伝子の増幅を検出し、他方の検出部でインターナルコントロールの増幅を検出 するようにしたので、簡易な構成で、迅速に信頼性の高い検査を行うことができる。 [0027] 本発明によれば、汎用性および高感度性が確保され、デイスポーサブルタイプとす る低コスト性を実現し、シンプルな構成で精度の高い検出が可能であると共に、効率 良く且つ迅速に、検体に対して増幅反応に適した前処理を行うことができる細菌また はウィルス検出に好適である遺伝子検査用マイクロリアクタが提供される。
[0028] 本明細書にぉ ヽて、「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担う DNA または RNAをいうが、単に化学的実体である DNA、 RNAと言及することもある。
[0029] 以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。図 1は、本発明 の遺伝子検査用マイクロリアクタの実施形態におけるチップの概略構成を示した平面 図である。本実施形態の遺伝子検査用マイクロリアクタは、図示したチップ 1と、送液 用のマイクロポンプと、その送液、温度、反応の各制御に関わる制御系と、光学検出 系と、データの収集および処理を受け持つ処理系とを備えている装置本体とから構 成されていてもよい。
[0030] チップ 1以外の構成要素は、これらを一体ィヒした装置本体としてチップ 1をこの装置 本体に着脱するように構成することができる。マイクロポンプは、チップ 1に設けてもよ いが、装置本体に組み込んで、チップ 1を装置本体に装着することによりチップ 1のポ ンプ接続部を装置本体のマイクロポンプに接続するようにすることも可能である。
[0031] チップ 1は、例えば榭脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどを材料として微細加工技 術により流路等を形成したものであり、例えば、その縦横が数十 mm、高さが数 mm 程度のサイズを有している。チップ 1に形成された微細流路は、例えば、その幅およ び高さが約 10 μ m〜数百 μ mのサイズを有している。
[0032] 溶菌試薬収容部 3、洗浄液収容部 5、抽出試薬収容部 6、増幅試薬収容部 7、検出 試薬収容部 8などの各収容部内の液体は、これらの各収容部に連通されたマイクロ ポンプ 11で送液される。マイクロポンプ 11は、例えば、単数もしくは複数のマイクロポ ンプがフォトリソグラフィー技術などにより形成されたチップ状のポンプユニットと、図 示したような前処理、反応および検出用の流路が形成されたチップとを面同士で重 ね合わせることにより各収容部に接続することができる。
[0033] マイクロポンプ 11としては、ァクチユエータを設けた弁室の流出入孔に逆止弁を設 けた逆止弁型のポンプなど各種のものが使用できる力 ピエゾポンプを用いることが 好適である。図 2 (a)は、ピエゾポンプの一例を示した断面図、図 2 (b)は、その上面 図である。このマイクロポンプには、第 1液室 48、第 1流路 46、加圧室 45、第 2流路 4 7、および第 2液室 49が形成された基板 42と、基板 42上に積層された上側基板 41と 、上側基板 41上に積層された振動板 43と、振動板 43の加圧室 45と対向する側に 積層された圧電素子 44と、圧電素子 44を駆動するための駆動部（図示せず)とが設 けられている。
[0034] この例では、基板 42として、厚さ 500 μ mの感光性ガラス基板を用い、深さ 100 μ mに達するまでエッチングを行なうことにより、第 1液室 48、第 1流路 46、加圧室 45、 第 2流路 47および第 2液室 49を形成している。第 1流路 46はその幅を 25 /ζ πι、長さ を 20 mとしている。また、第 2流路 47は、その幅を 25 mゝ長さを 150 mとしてい る。
[0035] ガラス基板である上側基板 41を、基板 42上に積層することにより、第 1液室 48、第 1流路 46、第 2液室 49および第 2流路 47の上面が形成される。上側基板 41の加圧 室 45の上面に当たる部分は、エッチングなどにより加工されて貫通している。
[0036] 上側基板 41の上面には、厚さ 50 μ mの薄板ガラス力もなる振動板 43が積層され、 その上に、例えば厚さ 50 mのチタン酸ジルコン酸鉛（PZT)セラミックスなど力もな る圧電素子 44が積層されて ヽる。
[0037] 駆動部力 の駆動電圧により、圧電素子 44とこれに貼付された振動板 43が振動し 、これにより加圧室 45の体積が増減する。第 1流路 46と第 2流路 47とは、幅および深 さが同じで、長さが第 1流路よりも第 2流路の方が長くなつており、第 1流路 46では、 差圧が大きくなると、流路内で渦を卷くように乱流が発生し、流路抵抗が増加する。 一方、第 2流路 47では、流路幅が長いので差圧が大きくなつても層流になり易ぐ第 1流路に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。
[0038] 例えば、圧電素子 44に対する駆動電圧により、加圧室 45の内方向へ素早く振動 板 43を変位させて大き 、差圧を与えながら加圧室 45の体積を減少させ、次 、でカロ 圧室 45から外方向へゆっくり振動板 43を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室 45の体積を増加させると、液体は同図の B方向へ送液される。逆に、加圧室 45の外 方向へ素早く振動板 43を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室 45の体積を増 加させ、次いで加圧室 45から内方向へゆっくり振動板 43を変位させて小さい差圧を 与えながら加圧室 45の体積を減少させると、液体は同図の A方向へ送液される。
[0039] なお、第 1流路と第 2流路における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の 相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなぐ他の形状的な相違に基づくも のであってもよい。
[0040] 上記のように構成されたピエゾポンプによれば、ポンプの駆動電圧および周波数を 変えることによって、液体の送液方向、送液速度を制御できるようになつている。図 2 ( c)に、このポンプの他の例を示した。この例では、ポンプをシリコン基板 71、圧電素 子 44、および図示しないフレキシブル配線力 構成している。シリコン基板 71は、シ リコンウェハをフォトリソグラフィー技術により所定の形状にカ卩ェしたものであり、エツ チングにより加圧室 45、ダイヤフラム 43、第 1流路 46、第 1液室 48、第 2流路 47、お よび第 2液室 49が形成されている。第 1液室 48にはポート 72が、第 2液室 49にはポ ート 73がそれぞれ設けられており、例えばこのピエゾポンプを図 1のチップ 1とは別体 とする場合には、このポート 72、 73を介してチップ 1のポンプ接続部と連通する。例 えば、ポート 72、 73が穿孔された基板 74と、マイクロリアクタのポンプ接続部近傍とを 上下に重ね合わせることによって、ポンプをチップ 1に接続することができる。また、前 述したように、 1枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場 合、チップ 1と接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンクが接続されている ことが望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに 接続されていてもよい。
[0041] ピエゾポンプを図 1のチップ 1とは別体とした場合におけるチップ 1のポンプ接続部 周辺の構成を図 3に示した。同図（a)は駆動液を送液するポンプ部の構成を示し、同 図（b)は増幅試薬を送液するポンプ部の構成を示している。ここで、 24は駆動液の 収容部であり、駆動液は鉱物油などのオイル系、あるいは水系のいずれであってもよ い。 25は、予め収容された増幅試薬を封止する封止液の収容部である。この封止液 は、微細流路への漏出により試薬が反応してしまうこと等を防止するためのものであり 、使用前に、マイクロリアクタ —TAS)チップが保管される冷蔵条件下では、固化 もしくはゲルイ匕しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となる。封止液と増幅 試薬との間には空気が介在しても差し支えないが、定量送液の観点から介在する空 気の量は (試薬量に対して）充分に少ないことが望ましい。また、封止液は、微細流 路中に充填してもよぐあるいは封止液用に設けられた貯留部に充填してもよい。
[0042] ポンプ接続部 12と、増幅試薬収容部 7との間の流路には、空気抜き用の流路 26が 設けられている。この空気抜き用の流路 26は、ポンプ接続部 12と増幅試薬収容部 7 との間の流路カも分岐し、その末端が開放されている。この空気抜き用の流路 26か ら、例えばポンプ接続時などに流路内に存在する気泡を除去するようにしている。
[0043] この空気抜き用の流路 26は、例えば水などの水性液体が漏出することを防止する 点から、流路径が 10 m以下であり、且つ流路内面の水との接触角が 30° 以上で あることが好ましい。
[0044] 13は、図 14に示した構造を有する疎水性バルブであり、この疎水性バルブ 13は、 正方向への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送 液圧力をカ卩えることにより液体の通過を許容する。図示したように、疎水性バルブ 13 は、流路径を絞った部分からなり、これにより、一端側力もこの絞り流路 51に達した図 14 (b)の液体 27が、他端側へ通過することを規制している。この絞り流路 51は、例え ば、両側に直列に連結された縦横が 200 /z m X 200 /z mの流路に対して、縦横が 2 00 m X 30 m程度となるように开成される。
[0045] 液体 27を、細径の絞り流路 51の端部力も太径の流路 50へ押し出すには、表面張 力のために所定の送液圧力を要する。したがって、マイクロポンプからのポンプ圧に より、液体の停止と通過を制御することができるので、例えば流路の所定箇所におい て液体の移動を一時止めておき、所望のタイミングでこの箇所力も先の流路へ送液 を再開することができる。
[0046] 必要に応じて、絞り流路 51の内面には、撥水性のコーティング、例えばフッ素系の コーティングを施してもよい。 <検体の前処理 >
検体収容部 2から、例えば全血、血清、バフィ一コート、尿、糞便、唾液、喀痰その 他の体液等の検体が注入される。これら検体に含まれる、またはその可能性がある検 出可能な細菌、ウィルスとしては特に限定されない。細菌、ウィルスの遺伝子、好まし くは固有の DNA配列が既知であれば、そのための PCRプライマーは、公知技術に よって作製できるため、いずれも検出可能である。具体例として、結核菌、 MRSA、ィ ンフルェンザウィルス、新型感染病原菌などを挙げることができる。必要とされる検体 量は、例えば、 DNAとして 0.001〜100ngである。
[0047] 図 4に示したように、検体収容部 2に注入された検体は、溶菌試薬収容部 3に接続 されたピエゾポンプ 11により送液される、例えばリゾチーム (lysozyme)を含む水溶液 のような溶菌試薬と混合され、検体中の菌体は溶菌される。溶菌試薬としては、任意 の公知のものを使用することができる。溶菌されて菌体外へ出た菌体遺伝子は、担 体充填部 4の微細流路 4a内に充填された微粒状の担体 55に吸着される。
[0048] 担体 55としては、例えばガラス、シリカゲル、ハイドロキシアパタイト、セライトなどか らなるビーズ、粉末等を使用できる。一例としては、粒子径 0. 05〜1000 /ζ πιのガラ スビーズが 0. 05gZml〜l. 3gZmlの密度で微細流路 4a内に充填される。
[0049] 好ましくは、担体充填部 4に送液された菌体遺伝子を含む液体は、同図の矢印で 示したようにその送液方向が前後に切り替えられ、液体が担体充填部 4内で流路方 向へ繰り返し前後動するようにマイクロポンプ 11を駆動する。これにより、菌体遺伝子 56と微粒状担体 55とが出会う確率が高められ、菌体遺伝子 56の多数を短時間で微 粒状担体 55に吸着させる効率を高めることができる。場合によるが、例えば、振幅 5 mm、周期 5秒程度の往復動をさせればよい。
[0050] 図 6は、担体充填部 4内の菌体遺伝子を含む液体を前後動させる送液用のマイクロ ポンプ 11の制御系統を示した図である。図示したように、送液用マイクロポンプ 11は 増幅器 32、 DZA変翻 33を介してマイクロコンピュータ 34に接続されている。マイ クロコンピュータ 34はタイマー 35を搭載しており、予めプログラムされたタイミングで 送液用マイクロポンプ 11の送液を制御する。なお、マイクロポンプ 11を制御する 32 〜35系統は、チップ内にあってもよいが、マイクロリアクタ装置本体に組み込んで、チ ップ 1を装置本体に装着することにより、チップ 1のポンプ接続部を装置本体のマイク 口ポンプに接続するようにして、作動制御させることも可能である。
[0051] 図 5は、検体収容部、溶菌試薬収容部および担体充填部における送液系の他の例 を示した図である。図示したように、検体収容部 2にもマイクロポンプ 11を接続し、検 体収容部 2からの検体送液と、溶菌試薬収容部 3からの溶菌試薬の送液とを別制御 としてもよい。この場合、例えば検体収容部 2側の微細流路に逆止弁などの弁 57を 設け、担体充填部 4内に導入された菌体遺伝子を含む液体を前後動させる際には、 弁 57を閉止して溶菌試薬収容部 3に接続されたマイクロポンプ 11により送液の切り 替えを行う。
[0052] 担体充填部 4の微粒状担体に菌体遺伝子を吸着させた後、図 1の洗浄液収容部 5 から、例えば Tris-EDTA-NaClZエタノール混合液などの洗浄液を送液して担体充 填部 4を通過させ、充分に洗浄を行う。次いで、分岐部 31の近傍に設けられた能動 弁などの弁（図示せず)を切り替えて、抽出試薬収容部 6から、例えば Tris-EDTA緩 衝液などの抽出試薬を担体充填部 4へ送液し、微粒状担体に吸着された菌体遺伝 子を溶離して反応部 9へ前処理液として送液する。
[0053] なお、菌体遺伝子が RNAである場合には、適当な逆転写酵素を利用して cDNA に変換して力 遺伝子増幅反応を行う。 <遺伝子増幅反応および検出 > 検体を前処理した検体処理液と、増幅試薬収容部 7からの増幅試薬とを反応部 9 へ送液し、遺伝子増幅反応を行う。反応部 9は、場合に応じて広幅の液溜め状であ つてもよく、微細流路であってもよい。
[0054] 増幅試薬収容部 7は、複数の試薬に対応して複数設けられており、試薬と試薬との 混合、および検体処理液と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合して もよぐあるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望 の混合比率となるように混合してもよ 、。
[0055] 増幅試薬収容部および試薬混合部の構成の一例を図 9に示した。このように、各増 幅試薬収容部 7a、 7b、 7cにはマイクロポンプ（この例ではピエゾポンプ） 11が接続さ れ、これらの各収容部力もの流路が合流した先に試薬混合部 14が設けられている。 そして、これらの各部は、ペルチヱ素子によって冷却されるようになっている。即ち、 図 9において増幅試薬収容部 7a、 7b、 7cが設けられた領域 A1には、図 10 (a)に示 したようにチップ下面にペルチェ素子 59が設けられ、図 9において試薬混合部 14が 設けられた領域 A2にも、図 10 (b)に示したようにチップ下面にペルチェ素子 59が設 けられている。
[0056] ペルチェ素子 59は、これらの各部のチップ上面に、あるいは上下両面に設けてもよ い。このように、増幅試薬収容部 7と試薬混合部 14を冷却することにより、加温による 試薬の変質を防止できる。特に、 PCR増幅では 3つの温度間で昇降させる温度管理 が必要になる。また遺伝子増幅に ICAN (Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification )法を適用する構成とした場合でも、増幅反応部を 50〜65°Cとす る必要があるため、反応部の昇温過程、試薬混合時等に試薬が加温されて変質し易 くなるが、図 10のようにペルチェ素子を設けて冷却することによりこれを防止すること ができる。通常は、増幅試薬収容部 7と試薬混合部 14を 4°C以下程度に保てば試料 の変質を充分に防止できる。
[0057] 増幅試薬収容部 7には、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試 薬が収容されていることが望ましい。チップ内に内蔵される試薬類などは、蒸発、漏 失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その試薬部の表面が密封処理さ れ、封止材 (封止液）により封入されている。これらの封止材（図 3では封止液収容部 25に収容される）は、使用前、マイクロリアクタ —TAS)チップが保管される冷蔵 条件下では、固ィ匕もしくはゲルイ匕しており、使用時、室温にすると融解し流動状態と なるものである。このような封止材としては、水に対して難溶性の可塑性物質を使用 することができ、好ましくは、水に対する溶解度が 1%以下であり且つ融点が 8°C〜室 温（25°C)である油脂、およびゼラチンの水溶液が挙げられる。ゼラチンの水溶液は 、ゼラチンの濃度を変えることによりゲルィ匕温度を調整することができ、例えば 10°C前 後でゲルィ匕させるためには、約 1%の水溶液とするとよ!/、。
[0058] 以下、反応部 9で行われる遺伝子増幅反応について説明する。
，増幅法
本発明のマイクロリアクタでは、増幅方法を限定されない。例えば DNA増幅技術と して、多方面で盛んに利用されている PCR増幅法を使用することができる。その増幅 技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、各種の変法、改良点も含めて各 種文献などに記載されている。 PCR増幅においては、 3つの温度間で昇降させる温 度管理が必要になる力 マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイス 力 すでに本発明者らにより提案されている（特開 2004— 108285号)。このデバイスシ ステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが 高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、 DNA増幅は、手作業によりマイクロチューブ、マイクロバイアルなどで行なう従来の 方式よりはるかに短時間で行うことができる。
[0059] PCR反応のように複雑な温度管理を必要としな!/、、最近開発された ICAN (Isother mal chimera primer initiated nucleic acid amplification )法は、 50〜り ό°しにおける任 意の一定温度の下に DNA増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第 343392 9号)。したがって、 ICAN法は、本発明のマイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済 むために好適な増幅技術である。手作業では、 1時間かかる本法は、本発明のバイ ォリアクタにおいては、 10〜20分、好ましくは、 15分で解析まで終わる。
[0060] DNA増幅反応は、その他の PCR変法であってもよぐ本発明のマイクロリアクタは 、流路の設計変更などによりいずれにも対応できる柔軟性がある。いずれの DNA増 幅反応を使用する場合にも、その技術の詳細は開示されており、当業者は容易に導 人することができる。
'試薬類
(0 プライマー
PCRプライマーは、増幅した 、特定部位の DNA鎖の両端に相補的な 2種のオリゴ ヌクレオチドである。その設計は、すでに専用のアプリケーションが開発されており、 当業者であれば DNAシンセザィザ一、化学合成などにより容易に作成できる。 ICA N法用のプライマーは、 DNAおよび RNAのキメラプライマーであるが、このものの調 製法もすでに技術的に確立されている（特許第 3433929号)。プライマーの設計、選 択は、増幅反応の成否、効率を左右するため最も適切なものを使用することが重要 である。
[0061] また、 PCRプライマーにピオチンを結合させておくと、増幅産物の DNAを、チップ 基板上のストレプトアビジンとの結合を介して基板上に固定ィ匕でき、増幅産物の定量 に供し得る。その他のプライマー標識物質としてジゴキシゲニン、各種蛍光色素など が例示される。
GO 増幅反応用試薬類
増幅反応に使用する酵素をはじめとする試薬類は、 PCR用、 ICAN法のいずれも 容易に入手できる。
[0062] PCR法における試薬類として、少なくとも 2'—デォキシヌクレオシド 5'—三リン酸の ほ力、 Taq DNAポリメラーゼ、 Vent DNAポリメラーゼまたは Pfo DNAポリメラーゼが 含まれる。
[0063] ICAN法における試薬類は、少なくとも 2'—デォキシヌクレオシド 5'—三リン酸、検 出した 、遺伝子に特異的にハイブリダィゼーシヨンできるキメラプライマー、鎖置換活 性を有する DNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼの RNaseを含む。
(iii) コントロール
インターナルコントロールは、標的核酸（DNA, RNA)について、増幅のモニタリン グ、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの 配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブ リダィズできる配列を有するために検体と同様に増幅できるものである。
[0064] ポジティブコントロールの配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーが ハイブリダィズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用 する核酸 (DNA, RNA)は、公知技術文献に記載されているものを使用すればよい 。ネガティブコントロールは、核酸（DNA, RNA)以外の試薬などをすベて含み、コン タミネーシヨンの有無のチェック、ノ ックグラウンド補正用に用いる。
(iv) 逆転写用試薬
RNAの試料の場合、 RNAから cDNAを合成するための逆転写酵素、逆転写ブラ イマ一などであり、これらも市販され容易に入手できる。
[0065] 図 7は、検体処理液と試薬との混合および反応を行う流路構成の一例を示した図で ある。図示したように、検体処理液側流路 54からマイクロポンプ（図示せず）により送 液される検体処理液と、試薬収容部 7からマイクロポンプ 11により送液される試薬は 、 Y字流路の合流部 58で合流され、後続する微細流路 9aに送液される。
[0066] 微細流路 9aは、例えば、幅が 0. 2mm、深さが 0. 2mmとされ、この微細流路 9a内 で ICAN反応が行われる。
[0067] 検体処理液と試薬とを微細流路 9a内に充填した後、試薬を送液するマイクロボン プ 11を、送液方向を繰り返し切り替えるように駆動し、微細流路 9a内の合流液を微 細流路 9a内で前後動させ、 ICAN反応を行う。例えば微細流路 9aの幅が 0. 2mm, 深さが 0. 2mm,液量が 25 1である場合、振幅 25mm、周期 5秒程度の往復動をさ せればよい。
[0068] この前後動により、微細流路 9a内の試薬と検体とがアクティブに拡散混合されるとと もに、流路の中心部分と壁面近傍との液体の流速勾配によって、 DNAと試薬とが出 会う確率が高くなり、反応速度が向上する。
[0069] また、検体処理液側の流路 54に逆止弁、能動弁などの弁 57を設けて、混合時に はそれを閉止するとともに、試薬を送液するマイクロポンプ 11によって微細流路 9a内 の合流液を前後動させると、混合用の別途のマイクロポンプを流路に配置する必要 が無い。このマイクロポンプ 11には、図 2に示したようなピエゾポンプが好適である。
[0070] 図 7では一方のマイクロポンプ 11だけで合流液を往復動させている力 弁 57を設 けずに、検体処理液側のマイクロポンプと試薬収容部 7側のマイクロポンプ 11とを駆 動することにより微細流路 9a内の合流液を往復動させるようにしてもょ 、。
[0071] 図 8は、送液用のマイクロポンプ 11および弁 57の制御系統を示した図である。図示 したように、送液用マイクロポンプ 11は増幅器 32、 DZA変換器 33を介してマイクロ コンピュータ 34に接続されて 、る。
[0072] さらに、弁 57を開閉するためのエアシリンダ 36が、 DZA変 33を介してマイク 口コンピュータ 34に接続されて!、る。
[0073] マイクロコンピュータ 34はタイマー 35を搭載しており、予めプログラムされたタイミン グで送液用マイクロポンプ 11の送液および弁 57の開閉を制御する。これらの制御部 についても、上述のようにマイクロリアクタ装置本体に組み込んで、チップ 1のポンプ 接続部を装置本体のマイクロポンプに接続させた場合に作動制御させるようにしても よい。
[0074] 反応部 9で遺伝子増幅反応を行った後、検出部 10で増幅反応を検出する。この検 出部 10は、場合によっては反応部 9を兼ねてもよいが、後述する金コロイドによる検 出では、ストレプトアビジンを吸着させた別途の検出部で検出する。また、インターナ ルコントロールを菌体遺伝子と同時に増幅反応させた後、増幅反応液を分割して、 菌体遺伝子の増幅検出と、インターナルコントロールの増幅検出を別途の検出部で 行うようにすることが好ましい。検出部 10、もしくは反応部 9と検出部 10との間の流路 へ、検出試薬収容部 8からの検出試薬 (例えば金コロイド溶液、発光試薬など）が送 液され、反応増幅液もしくはその処理物と混合もしくは接触させる。
[0075] 本発明にお ヽて、増幅された目的遺伝子の DNAを検出する方法は特に限定され ず、必要に応じて好適な方法が使用される。そうした方法としては、可視分光測光法 、蛍光測定法、発光ルミネッセンス法といった検出方法が主流である。さらに、電気化 学的方法、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランスなどの手法も挙げられ る。増幅反応の検出は、最終的に可視光により、高感度で測定できる方式が好まし い。蛍光測光より、機器が汎用的であり、妨害因子が少なぐかつ簡便に測定できて データ処理も容易である。
[0076] 本発明に適用される好適な反応、検出方法としては、
(1)検体からの菌体遺伝子の DNAと、ピオチン修飾したプライマーとを、反応部 9で 反応させ、遺伝子を増幅する工程、
(2)増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を 一本鎖に変性処理する工程、
(3)増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ストレプトアビジンを吸着 させた微細流路内に送液し、前記の増幅された遺伝子を固定ィ匕する工程、
(4)増幅された遺伝子を固定化した微細流路内に、末端を FITC (fluorescein isothio cyanate)で蛍光標識したプローブ DNAを流し、これを固定ィ匕した遺伝子にハイブリ ダイズさせる工程、
(5)上記微細流路内に、好ましくは FITCに特異的に結合する抗 FITC抗体で表面 を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定ィ匕した遺伝子にノ、イブリダィズした FI TC修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる工程、
(6)上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する工程、とを含む方法が挙 げられる。
[0077] 上記方法において、ピオチン化 DNA、ピオチン ストレプトアビジン結合による固 定化、 FITC蛍光標識、 FITC抗体などは公知技術である。また、増幅遺伝子に FIT C標識プローブ DNAをノヽイブリダィズさせた後に、ストレプトアビジンを吸着させた微 細流路に固定化させる順序の方式も可能である。本発明では、上記（3)次いで (4) の順序の構成が好ましい。
[0078] 好ましくは、前記各工程の間に、必要に応じてストレプトアビジンを吸着させた前記 流路内に洗浄液を送液する工程を含む。そのような洗浄液としては、例えば各種の 緩衝液、塩類水溶液、有機溶媒などが好適である。
[0079] 上記工程にぉ 、て、変性液は、遺伝子 DNAを 1本鎖にするための試薬で、例えば 水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウムなどが挙げられる。プローブは、オリゴデォキシヌク レオチドなどが挙げられる。また FITCの他に、 RITC (ローダミンイソチオシァネート） などの蛍光物質が挙げられる。
[0080] 上記の前処理、増幅および検出は、予め送液順序、容量、タイミングなどに関して 設定された諸条件を、マイクロポンプおよび温度の制御とともにプログラムの内容とし て有するソフトウェア、前記マイクロポンプ、検出装置および温度制御装置とが一体 化された装置本体に、チップを装着した状態で開始される。試料を注入した後、分析 が開始され、試料および試薬類の送液、前処理、混合に基づく遺伝子増幅反応、遺 伝子検出反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、 測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。
[0081] 図 11は、 ICAN法による増幅反応を上述した方法で検出する反応部および検出部 周辺の流路構成を示した図である。検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダィ ズするピオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、 およびエンドヌクレアーゼなどの試薬は、図 9の増幅試薬収容部 7a、 7b、 7cに収容さ れ、各試薬収容部の上流側のピエゾポンプ 11により、各試薬収容部から下流側の流 路 14へ試薬が送液され混合される。
[0082] 各試薬収容部 7a、 7b、 7cには、例えば、合計で 7. 5 μ 1超の試薬が収容され、先 端を切り捨てた計 7. 5 1の試薬混合液が、 2. 5 1ずつ 3本に分岐した流路へ送液 される。そのうち一つの流路は、図 11の Βの位置に連通し、検体処理液との反応およ びその検出のための系統へ繋がっている。図示しないが、他の一つの流路はポジテ イブコントロールとの反応およびその検出のための系統へ連通し、残りの一つの流路 はネガティブコントロールとの反応およびその検出のための系統へ連通している。 [0083] 図 11の Bの位置力ゝら送液された混合試薬は、貯留部 17aに充填される。検体処理 液は、図 11の Aの位置力も送液され、貯留部 17bに定量に充填され（2. 5 1)、後 続する流路へ定量送液される。各貯留部 17a、 17bに充填された検体処理液と試薬 混合液は、 Y字流路を介して流路 15a (容積 5 1)に送液され、この流路 15a内で混 合および ICAN— PCR反応が行われる。
[0084] 増幅反応は、 5 μ 1の反応液と、停止液収容部 21aに収容された 1 μ 1の反応停止液 とを容積 6 1の流路 15bに送液してこれらを混合することにより停止される。次いで、 変性液収容部 21bに収容された変性液（1 μ 1)と、反応液と停止液との混合液 (0. 5 μ 1)とを、容積 1. 5 μ 1の流路 15cへ送液して混合し、増幅された遺伝子を 1本鎖に 変性する。
[0085] この処理液を、流路内にストレプトアビジンを吸着させたストレプトアビジン吸着部 1 Oa、 10bに送液して増幅遺伝子をこの流路内に固定ィ匕し、次に洗浄液収容部 21dか らストレプトアビジン吸着部 10a、 10bへ洗浄液を流して洗浄する。
[0086] 次に、ハイブリダィゼーシヨンバッファー収容部 21cに収容されたハイブリダィゼー シヨンバッファーを、ストレプトアビジン吸着部 10a、 10bに収容する。次に流路 10a内 へ、単一のポンプ 11により、各収容部 21f、 21d、 21e、 21dに収容された、末端を FI TCで蛍光標識した菌体遺伝子のプローブ DNA溶液、洗浄液および、 FITC抗体で 標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。同様に、増幅遺伝子が 固定化された流路 10b内へ、単一のポンプ 11により、各収容部 21g、 21d、 21e、 21 dに収容された、インターナルコントロール用プローブ DNA溶液、洗浄液および、 FI TC抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。
[0087] なお、 1本鎖の増幅遺伝子をストレプトアビジン吸着部 10a、 10bに固定ィ匕する前の 段階で 1本鎖の増幅遺伝子にプローブ DNAをノヽイブリダィズさせるように流路を構 成してちょい。
[0088] 金コロイド溶液を送液することにより、固定ィ匕された増幅遺伝子に FITCを介して金 コロイドが結合され、固定ィ匕される。この固定ィ匕された金コロイドを光学的に検出する ことにより、増幅の有無または増幅効率を測定する。
[0089] このように、インターナルコントロールを検体の前処理液と共に増幅反応させ、増幅 反応液を分割して別異の検出部 10a、 10bに送液し、一方の検出部 10aで菌体遺伝 子の増幅を検出し、他方の検出部 10bでインターナルコントロールの増幅を検出する ようにしたので、簡易な構成で、迅速に信頼性の高い検査を行うことができる。
[0090] 図 11に示したように、試薬収容部、反応部および検出部の間の流路における適宜 の位置には、逆止弁 16が設けられている。これ以外にも、上記のようにクロスコンタミ ネーシヨンと 、つた汚染を防止するための適切な位置（例えば、図 11におけるポンプ 接続部 12の下流側の近傍位置）にも逆止弁を設けることが好ましい。
[0091] 図 12 (a)、 (b)は、本実施形態のマイクロリアクタの流路に使用される逆止弁の一例 を示した断面図である。図 12 (a)の逆止弁では、微小球 67を弁体として、基板 62に 形成した開口 68をこの微小球 67の移動により開閉させることによって、液体の通過 を許容および遮断している。すなわち、 A方向から液体が送液される際には、液圧に よって微小球 67が基板 62から離反して開口 68が開放されるので、液体の通過が許 容される。一方、 B方向から液体が逆流した場合には、微小球 67が基板 62に着座し て開口 68が閉止されるので、液体の通過が遮断される。
[0092] 図 12 (b)の逆止弁では、基板 62上に積層され、その端部が開口 68の上側に延び 出した可撓性基板 69が、液圧により開口 68の上側を上下動することにより開口 68を 開閉している。すなわち、 A方向から液体が送液される際には、液圧によって可撓性 基板 69の端部が基板 62から離反して開口 68が開放されるので、液体の通過が許容 される。一方、 B方向から液体が逆流した場合には、可撓性基板 69が基板 62に密着 して開口 68が閉止されるので、液体の通過が遮断される。
[0093] このように、液体の逆流を防止して正確に所定の送液を行うために逆止弁を配設す ることが望ましいが、逆止弁を利用した好適な機構として、図 13に示した定量送液機 構を挙げることができる。この機構では、図示したように逆止弁 16と、疎水性バルブ 1 3aとの間の流路 (試薬充填流路 15A)には、所定量の試薬が充填される。また、この 試薬充填流路 15 Aから分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプ 11に連通する分岐 流路 15Bが設けられている。
[0094] 試薬の定量送液は、次のように行われる。最初に、逆止弁 16側から、疎水性バル ブ 13aから先へ試薬液 60が通過しない送液圧力で試薬充填流路 15Aに試薬液 60 を供給することにより試薬液 60を充填する。次いで、疎水性バルブ 13aから先へ試 薬液 60が通過することを許容する送液圧力で、マイクロポンプ 11により分岐流路 15 B力 試薬充填流路 15Aに向力う方向へ、疎水性バルブ 13bを介して駆動液 70を 送液することにより、試薬充填流路 15A内に充填された試薬液 60を送液制御部 15 Aから先へ押し出し、これにより試薬液 60を定量的に送液する。分岐流路 15Bには、 空気、封止液などが存在していることがある力 この場合でもマイクロポンプ 11で駆 動液 70を送液してこの空気、封止液などを試薬充填流路 15Aに送り込むことによつ て試薬を押し出すことができる。なお、試薬充填流路 15Aに、大容積の貯留部 17aを 設けることによって、定量のバラツキが小さくなる。
[0095] なお、この定量送液機構を、図 11における試薬混合液の定量（同図の X2の位置） 、および検体処理液の定量（同図の XIの位置）に使用している。
[0096] 以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定 されることはなく、その要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形、変更が可能で ある。

Claims

請求の範囲
[1] 検体または前記検体を前処理した処理液と溶菌試薬とが混合されて、前記溶菌試 薬により溶菌された菌体遺伝子を含む液体から、前記菌体遺伝子を吸着する微粒状 の担体が充填された担体充填部、
前記担体充填部の上流に連通し、双方向に液体の送液を行うマイクロポンプを接 続するマイクロポンプ接続部、および
前記担体充填部に送液された前記菌体遺伝子を含む液体の送液方向を切り替え て、前記液体を前記担体充填部で繰り返し前後動させるようにマイクロポンプを制御 する制御手段を備えたことを特徴とする遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[2] 増幅試薬を収容する増幅試薬収容部、
注入された検体または前記検体を前処理した処理液中の菌体を溶菌する溶菌試 薬を収容する溶菌試薬収容部、
前記担体充填部の上流に連通し、前記担体に吸着した前記遺伝子を抽出する遺 伝子抽出試薬が収容される抽出試薬収容部、
前記担体充填部の下流に連通し、遺伝子増幅を行う増幅試薬を収容する増幅試 薬収納部、
前記担体充填部の下流に設けられ、前記抽出試薬収容部から送液された前記遺 伝子抽出試薬により前記担体から抽出された遺伝子と、前記増幅試薬容部から送液 された前記増幅試薬とが混合された液体を反応させて遺伝子増幅を行う反応部、お よび
前記反応部の下流に設けられ、前記遺伝子増幅が行われた前記増幅試薬が送液 され遺伝子を検出が行われる第 1の検出部を有し、
前記担体充填部は、前記溶菌試薬収容部の下流に設けられ、前記注入された検 体または前記検体を前処理した処理液と、前記溶菌試薬収容部に収容された溶菌 試薬とが混合されて、前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を含む液体が送液 されることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[3] 前記反応部の上流に連通した双方向に送液を行うマイクロポンプを接続するマイク 口ポンプ接続部と、 前記反応部の上流に連通したマイクロポンプを制御し送液方向を切り替えて、前記 遺伝子と前記増幅試薬容部から送液された前記増幅試薬とが混合された液体を、前 記反応部で繰り返し前後動させる制御手段を備えたことを特徴とする請求の範囲第 2 項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[4] 前記マイクロポンプは、流路抵抗が差圧に応じて変化する第 1流路と、差圧の変化 に対する流路抵抗の変化割合が第 1流路よりも小さい第 2流路と、第 1流路および第
2流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるァクチユエータと、 該ァクチユエータを駆動する駆動装置とを備えていることを特徴とする請求の範囲 第 2項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[5] 前記マイクロポンプは、流路抵抗が差圧に応じて変化する第 1流路と、差圧の変化 に対する流路抵抗の変化割合が第 1流路よりも小さい第 2流路と、第 1流路および第
2流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるァクチユエータと、 該ァクチユエータを駆動する駆動装置とを備えていることを特徴とする請求の範囲 第 3項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[6] 前記増幅試薬収容部、溶菌試薬収容部、担体充填部、抽出試薬収容部、反応部
、第 1の検出部、およびマイクロポンプ接続部の間に少なくとも 1つの、液体の逆流を 阻止する逆止弁が設けられていることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の遺伝 子検査用マイクロリアクタ。
[7] 前記増幅試薬収容部が混合される試薬混合部を冷却する冷却手段が設けられて いることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[8] 前記冷却手段がペルチェ素子であることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載の 遺伝子検査用マイクロリアクタ。
[9] 液を 2つの流路に分割する送液分割手段および
遺伝子の検出が行われる第 2の検出部を有し、
前記 2つの流路のそれぞれの下流に前記第 1の検出部および第 2の検出部を設け 前記反応部で同時に増幅された前記菌体遺伝子とインターナルコントロールとを含 む増幅試薬を、前記送液分割手段で 2つに分割して第 1及び第 2の検出部に送液し 、それぞれ検出部において前記菌体遺伝子とインターナルコントロールを検出するこ とを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
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