WO2004027055A1

WO2004027055A1 - 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法

Info

Publication number: WO2004027055A1
Application number: PCT/JP2003/011957
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Kizaki; Tozo Nishiyama; Yoshihiko Yasohara
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2002-09-19
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2004-04-01
Also published as: JP4414337B2; EP1553170A4; US7220564B2; AU2003264502A1; EP1553170B1; US20060035357A1; JPWO2004027055A1; US7531329B2; EP1553170A1; US20070178565A1

Abstract

　本発明は、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを効率よく生成する新規ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチドおよびその利用方法を提供する。本発明は、以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチドである：（１）作用：ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用し、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する、（２）作用至適ｐＨ：５．５から６．０、（３）作用至適温度：５０℃から５５℃、（４）分子量：ゲル濾過分析において約５５０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約２８０００。　本発明は、また、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び、該ポリペプチドを高生産する形質転換体である。

Description

明細書

新規カルポニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法技術分野

本発明は、式（1 )

で表される N—ベンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（2 )

で表される（R) —N—ベンジル一 3 _ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およぴ該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。

本発明はまた、該形質転換体を用いた光学活性アルコール、とりわけ光学活性 N—べンジルー 3—ピロリジノール、光学活性 2—テトラ口ール誘導体、及び、光学活性 1一フエニルエタノール誘導体の製造法に関する。光学活性 N—べンジルー 3—ピロリジノール、光学活性 2—テトラロール誘導体、及び、光学活性 1 —フユニルエタノール誘導体は、医薬、農薬等の合成原料として有用な化合物である。背景技術

光学活性 N—ベンジル一 3—ピロリジノールの製造方法としては、 N—べンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元する活性を有する酵素の存在下、この N—ベンジル一 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して光学活性 N—べンジル一 3—ピロリジノールを製造する方法（特開平 6— 141 876号公報）、 N— ベンジルー 3—ピロリジノンにデポダスカス (De p o d a s c u s) 属等の微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて光学活性 N_ベンジル一 3 一ピロリジノールを製造する方法（特開平 10— 1 50997号公報）が知られている。

また、光学活性 2—テトラロール誘導体の製造方法としては、ベンゼン環上に置換基を有する 2—テトラロン誘導体にパン酵母を作用させて、対応する光学活性 2—テトラロール誘導体を製造する方法（T e t r a h e d r o n 51, 1 1 53 1， ( 1 995) ) が知られている。

また、光学活性 1—フエニルエタノール誘導体の製造方法としては、 2—ハロ一 1一（置換フエニル）エタノンに、ァシビア属ゃォガタエァ属等に属する微生物またはその処理物を作用させ、光学活性 2 _ハロー 1一（置換フエ-ル）エタノールを得る方法（特開平 4— 218384号公報、及び、特開平 1 1— 215 995号公報）、 1_ (置換フエュル）エタノンにゲォトリカム 'キャンディダム (G e o t r i c h um c a n d i d urn) の乾燥菌体を作用させ、光学活性 1— (置換フユニル）エタノールを得る方法（J. O r g. Ch em. 63， 8 957 (1 998) ) が知られている。

しかしながら、これらの方法はいずれも、その基質仕込み濃度および基質から生成物への転換率が実用上十分ではなく、より効率の良い方法が待ち望まれていた。発明の要約

本発明は、上記現状に鑑み、光学活性 N—べンジルー 3—ピロリジノール、光学活性 2—テトラロール誘導体、光学活性 1一フエニルエタノール誘導体を始めとする各種光学活性アルコールの製造に有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現べクタ一で形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。また、本発明は、該形質転換体を用いて、光学活性 N—ベンジル— 3—ピロリジノール、光学活性 2—テトラ口ール誘導体、及ぴ、光学活性 1一フエ-ルエタノール誘導体を始めとする各種光学活性アルコールを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、 N—べンジル一 3—ピロリジノンを立体選択的に還元し、（R ) 一 N—べンジルー 3—ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離した。そして、該ポリペプチドを利用することにより光学活性 N—べンジルー 3 _ピロリジノールのみならず、光学活性 2—テトラロール誘導体及び光学活性 1 _フエニルエタノール誘導体を始めとする、有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出した。また、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、更には、発現べクタ一並びに形質転換体を創製することにも成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、 N—ベンジル一 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して、 (R) —N—べンジルー 3—ピロリジノールを生成し得るポリペプチドである。また、本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターである。また、本発明は、上記ポリペプチドを高生産する形質転換体である。

更に、本明は、該形質転換体を用いた、光学活性 N—べンジル _ 3—ピロリジノール、光学活性 2—テトラロール誘導体、及び、光学活性 1一フエニルエタノール誘導体を始めとする、有用な光学活性アルコールの実用的な製造方法である。発明の詳細な開示

以下、詳細に本発明を説明する。本発明のポリペプチドとしては、以下の（1 ) から（4 ) の理化学的性質を有するポリペプチドが挙げられる。

( 1 ) N AD Hまたは N A D P Hを捕酵素として、下記式（1 )

で表される N—べンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して、下記式（ 2)

で表される（R) — N—ベンジル一 3—ピロリジノールを生成する活性を有し、 (2) 作用至適 pHが 5. 5から 6. 0、

( 3 ) 作用至適温度が 50でから 55 °C、

( 4 ) 分子量が、ゲル濾過分析において約 55000、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において約 28000。

また、本発明のポリペプチドとしては、例えば、（a) 配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（b) 配列表の配列番号 1 に示したァミノ酸配歹 1Jまたは配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、揷入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ N—べンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) -N 一べンジノレ一 3—ピロリジノールを生成する活性を有するポリぺプチドを挙げることができる。

配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (J o h n Wi l e y a n d S o n s, I n c. , 1 989) 等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、 N—ベンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) —N—べンジルー 3—ピロリジノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリペプチドに包含される。

このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離することができる。本発明のポリペプチドの起源として用いられる微生物は、特に限定されない力例えばデポシァ (D e V o s ί a) 属細菌が挙げられ、特に好ましいものとしてはデポシァ . リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I FO 1 3 584株を挙げることができる。本発明のポリべプチドを生産する微生物は、野生株または変異^ ¾のいずれであつてもよく、また、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物であってもよい。

遺伝子操作された、本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらのポリペプチドを単離および/または精製してそのアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工程、およびこのポリヌクレオチドを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程を包含する方法により得られ得る。本発明のポリぺプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、超音波破砕機などで破砕し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液から、例えば、塩析（硫酸アンモニゥム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、ィオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。

該酵素活性は、 1 0 0 mMリン酸緩衝液（ p H 6 . 5 ) に、基質 N—べンジル一 3—ピロリジノン 5 mM、捕酵素 NAD H O . 2 5 mMおよび酵素を添加し、 3 0 °Cで波長 3 4 0 n mの吸光度の減少を測定することにより確認および計算することができる。

本発明のポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、（c ) 配列表の配列番号 2に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、（d ) 配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、前記式（1 ) で表される N _ベンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して、前記式（2 ) で表される（ R) 一 N—べンジルー 3—ピロリジノールを生成する活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。

配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌタレォチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー 'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイプリダイゼーション法、あるいはサザンハイプリダイゼーシヨン法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. OMのN a C 1存在下、 65 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜 2倍濃度の S SC溶液（1倍濃度の33〇溶液の組成は、 1 50mM塩化ナトリゥム、 1 5 mMクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65 °Cの条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーシヨンは、 Mo l e c u l a r C l o n i n g, A l a b o r a t o r y ma n u a l , s e c o n d e d i t i o n (C o l d Sp r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, 1 989) 等に記載されている方法に準じて行うことができる。

ハイプリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号 2に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が 60 %以上、好ましくは 80 %以上、より好ましくは 90 °/₀以上、さらに好ましくは 95 %以上、最も好ましくは 99 % 以上のポリヌクレオチドをあげることができ、コードされるポリべプチドが N— ベンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) —N—べンジルー 3 —ピロリジノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリヌクレオチドに包含される。

ここで、「配列の同一性（％) 」とは、対比される 2つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、 A、 T、 C、 G、 U、または I) が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に 100を乗じた数値で表される。

配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る： GCG Wi s c o n s i n P a c k a g e (P r o g r am Ma nu a l f o r t h e Wi s c o n s i n P a c k a g e、 Ve r s i o n 8、 1 99 4年 9月、 Ge n e t i c s Comp u t e r Gr o u _s 575 S c i e n c e D r i v e M a d i s o n、 W i s c o n s i n、 U S A 5371 l ; R i c e、 P. (1996) P r o g r am Ma nu a l f o r EG C G P a c k a g e、 P e t e r R i c e、 Th e S a n g e r C e n t r e_N H i n x t o n Ha l l、 C amb r i d g e、 CB 10 I RQ, En g l a n d) , および、 t h e E x P AS y Wo r l d Wi d e W e b分子生物学用サーノ一 (Ge n e v a Un i v e r s i t y Ho s p i t a 1 a n d Un i v e r s i t y o f Ge n e v a、 ge n e v a、 Sw i t z e r l a n d) 。

本発明のポリヌクレオチドは、 N—ベンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) — N—ベンジルー 3—ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばデポシァ (D e V o s i a ) 属細菌が挙げられ、特に好ましいものとしてはデポシァ ' リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I F O 1 3584株を挙げることができる。

以下に、 N—ベンジル _ 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) -N 一ベンジル— 3—ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より、本発明のポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。

まず、精製した前記ポリペプチド、およぴ該ポリペプチドを適当なエンドぺプチダーゼで消化することにより得られるぺプチド断片の部分ァミノ酸配列を、ェドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、本発明のポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常の DN A単離法、例えば、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (J o hn "W i l e y a n d .S o n s， I n c. ， 1989) 等に記載の方法により、該微生物の染色体 DN Aを調製する。

この染色体 DNAを铸型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いて PC R (p o l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) を行い、該ホリへプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの一部を増幅する。ここで増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデォキシ■シークェンス法、ジデォキシ ·チエイン ·ターミネイシヨン法などにより決定することができる。例えば、 AB I P R I SM Dy e T e rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c i n g R e a d y Re a c t i o n K i t (P e r k i n E lme r社製）および AB I 373 A DNA S e q e n c e r (P e r k i n E l me r 社製）を用いて行い得る。

該ポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、 i一 PCR法（Nu c l . Ac i d s Re s. 16, 8 186 (1988) ) によりその全体の塩基配列を決定することができる。また、染色体 DNA上の該ポリヌクレオチドがイントロンを含むものであった場合は、例えば、以下の方法によりイントロンを含まない成熟型ポリヌクレオチドの塩基配列を決定する事ができる。

即ち、まず、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えば、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u 1 a r B i o l o g y (J o hn Wi l e y a n d S o n s, I n c. , 1989) 等に記載の方法により、該微生物の inRNAを調製する。次に、この mRNAを铸型とし、先に判明している該ポリヌクレオチドの 5' 末端および 3 ，末端付近の配列を有するヌクレオチドプライマーを用いて RT— PCR法（P r o c. Na t i . Ac a d. S c i . USA 85, 8998 (1 988) ) により成熟型ポリヌクレオチドを増幅し、その塩基配列を先と同様に決定する。本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該ポリヌクレオチド中の遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター等から選ばれたものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。

このようなベクターは、通常、 1 a c UV 5プロモーター、 t r pプロモータ一、 t r cプロモーター、 t a cプロモーター、 l p pプロモーター、 t u f B プロモーター、 r e cAプロモーター、 p Lプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。

本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、ェンハンサー、 C C AA Tボックス、 T A T Aボッタス、 S P I部位など）を有する塩基配列をいう。

本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、該ポリヌクレオチド中の遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、ェンハンサ一等の種々の調節エレメントと宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。

本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入することができる。

本発明のポリぺプチドを用いて N—べンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) —N—べンジルー 3—ピロリジノールを生産する場合、 NAD H、 NAD P H等の補酵素が必要となる。捕酵素は通常、基質と等モルを要する 1 酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに反応系に添加することにより、つまり補酵素再生系を、本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。

補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース一 6 _リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。

上記の捕酵素再生能を有する酵素を、不斉還元反応系に別途添加することによつても当該反応が行われ得るが、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。

このような形質転換体は、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするポリヌクレォチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら 2種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる 2種のベクタ一にそれぞれ組み込み、それら 2種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによつても得られる。

なお、上述したように、本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものである。好ましくは、プラスミド: NTDRである発現ベクターが挙げられる。

本発明の発現ベクターとしては、グルコース脱水素酵素活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むものも挙げられる。上記ダルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、バシラス 'メガテリゥム (B a c i 1 1 u s me g a t e r i urn) 由来のグルコース脱水素酵素であることが好ましい。より好ましくは、プラスミド: NTDRG 1である発現ベクターが挙げられる。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られたものである。上記宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。

また、本発明の形質転換体として、

E. c o l i HB 101 (pNTDR) は、 FERM BP— 08457の受託番号で、平成 1 5年 8月 25日付で、

E. c o l i HB l O l (pNTDRG l) は、 FERM BP— 08458 の受託番号で、平成 1 5年 8月 25日付で、

それぞれ、 B本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブタぺスト条約に基づいて国際寄託されている。形質転換体中の補酵素再生能を有する酵素の活性は常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素活性の測定は、 1 Mトリス塩酸緩衝液（ p H 8 . 0 ) に、基質グルコース 0 . 1 M、補酵素 NAD P 2 mMおよび酵素を添加し、 2 5 °Cで波長 3 4 0 n mの吸光度の増加を測定することにより行い得る。本発明の形質転換体を用いた光学活性 N—べンジルー 3—ピロリジノール、光学活性 2—テトラロール誘導体、及ぴ、光学活性 1ーフヱニルェタノール誘導体等の光学活性アルコールの生産は以下のように実施され得る。つまり、形質転換体の培養物またはその処理物を、力ルポ-ル基を有する化合物と反応させることにより、光学活性アルコールを製造する。

まず、適当な溶媒中に基質となるカルボ二ル基を有する化合物、 NAD H等の補酵素、および該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、 p H調整下、攪拌して反応させる。

形質転換体の培養は、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて行い得る。また、培養温度は、好ましくは 4〜5 0 °Cである。

ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨碎物等を意味する。さらにそれらは、ポリべプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。

また、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有する酵素（例えば、グルコース脱水素酵素）の両者を生産するものを用いる場合、反応系に補酵素再生のための基質（例えば、グルコース）を添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。

基質となるカルボ二ル基を有する化合物としては、例えば、式（1 )

で表される N—べンジルー 3—ピロリジノン、一般式 ( 3 ) (3)

(CH₂)_n

(式中、 R R²は水素原子、水酸基又はアルコキシ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、 nは 1又は 2を示す。）で表される 2—テトラロン誘導体、及び、一般式（5)

(式中、 R³、 R ⁴は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又は-トロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、 R ⁵は水素原子、ハロゲン原子、水酸基又は置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される 1一フエニルエタノン誘導体を挙げることができる。式（3) 、 (5) で表される化合物としてより詳しくは、例えば、 7—メトキシー 2—テトラロン、 3ーメトキシ一 6, 7, 8, 9—テトラヒドロー 5 H—べンゾシクロヘプテン一 6—オン、 2—クロロー 1— (4，一フレオ口フエ-ノレ）エタノン、及び 2—クロ口一 1一（3，一クロ口フエュル）エタノンを挙げることができる。

また、上記方法により得られる光学活性アルコールとしては、例えば式（2)

で表される（R) —N—べンジルー 3—ピロリジノール、一般式（4) (4)

(CH₂)_n

(式中、 R R²及び nは前記と同じ）で表される 2—テトラロール誘導体、又は、一般式（6)

(式中、 R³、 R⁴、及び、 R⁵は前記と同じ）で表される 1—フエ二.

ル誘導体を挙げることができる。式（4) 、 (6) で表される化合物としてより詳しくは、例えば、 7—メトキシー 2—テトラロール、 3—メトキシー6， 7， 8， 9ーテトラヒドロ一 5 H—ベンゾシク口ヘプテン一 6—ォーノレ、 2—クロ口 - 1 - (4，ーフノレオ口フエ-ノレ）エタノーノレ、又は、 2—クロロー 1— (3，一クロ口フエニル）エタノールを挙げることができる。

R R²、 R³、 R ⁴におけるアルコキシ基としては、炭素数 1〜3のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。好ましくはメトキシ基である。

R³、 R\ R⁵におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。

R ⁵における置換基を有してもよいアルキル基のアルキル基としては、炭素数 1〜8のアルキル基であり、例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、へキシル基、ォクチル基等が挙げられる。好ましくは炭素数 1〜2のアルキル基である。 R ⁵における置換基を有してもよいアルキル基の置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。

反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系溶媒と有機系溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、へキサン、ジイソプロピルェ一テル、酢酸 n—ブチル、酢酸ェチル等が挙げられる。

反応温度は、 10 °C〜 70 °C、好ましくは 20〜 40 °Cであり、反応時間は、

1- 100時間、好ましくは 10〜 50時間である。また、反応中、反応液の p Hは、例えば塩酸、水酸化ナトリゥム水溶液、炭酸ナトリゥム水溶液等を用いて、 4〜10、好ましくは 5~8に維持する。

反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。パッチ方式の場合、反応基質は 0. 1%から 70°/₀ (w/v) の仕込み濃度で添加される。 ·

反応で生じた光学活性アルコールは常法により精製し得る。例えば、反応で生じた光学活性アルコールが N—ベンジル一 3—ピロリジノール、 7—メトキシ一

2—テトラロール、 3—メトキシ一 6， 7, 8, 9—テトラヒドロ一 5 H—ベンゾシクロヘプテン一 6—ォーノレ、 2—クロ口一 1— (4，ーフノレオロフェェノレ）エタノーノレ、又は、 2—クロロ一 1— (3，一クロ口フエェノレ）エタノーノレである場合、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して反応物から菌体等の懸濁物を除去した後、水酸化ナトリゥム水溶液、炭酸ナトリゥム水溶液、塩酸等で抽出に適した pH (3〜1 1) に調整し、酢酸ェチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに、蒸留、晶析またはクロマトグラフィ一等の処理を行うことにより、精製され得る。

N—ベンジル一 3—ピロリジノン、及び、 N—ベンジル一 3—ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム： Un i p o r t B 10% PEG - 2 OM (I D 3. OmmX 1. Om、ジーエルサイエンス社製）、カラム温度： 200°C、キヤリァガス：窒素、検出： F I D) で行い得る。

また、 N—ベンジルー 3—ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム： Ch i r a l c e l OB ( I D 4. 6mmX 25 Omm, ダイセル化学工業株式会社製) 、溶離液： n—へキサン/イソプロパノール /ジェチルァミン = 99/1Z0. 1、流速 : 1m l /m i n、検出： 254 nm、カラム温度：室温）で行い得る。

7—メトキシー 2—テトラロン、 3—メトキシ一 6, 7, 8， 9—テトラヒド口一 5 H—ベンゾシクロヘプテン _ 6—オン、 7—メトキシー 2—テトラローノレ、及び、 3—メトキシー6， 7, 8， 9ーテトラヒドロ _ 5 H—ベンゾシクロヘプテン一 6—オールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製 CO SMO S I L 5 C 8 -MS ( I D4. 6mmX 25 0 mm) 、溶離液：水ノァセトニトリル = 1 Z 1、流速： 1 m 1 /m i n、検出： 2 10 nm、カラム温度：室温）で行い得る。

また、 7—メトキシー 2—テトラロール、及び、 3—メトキシ一 6, 7, 8, 9ーテトラヒドロー 5 H—ベンゾシクロヘプテン一 6—オールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製 Ch i r a l c e l O J ( I D 4. 6 mm X 250 mm) 、溶離液： n一へキサン/ィソプロパノール = 9 1、流速 : 1m l /m i n、検出： 254 nm、カラム温度：室温）で行い得る。

2—クロ口一 1— (4' —フノレオロフエニスレ）エタノン、 2—クロ口一 1— ( 3，一クロ口フエ-ノレ）エタノン、 2—クロロー 1一（4，一フノレオロフェニノレ ) エタノーノレ、及び、 2—クロ口一 1— (3，一クロ口フエ二ノレ）エタノー/レの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：株式会社ヮイエムシィ製 YMC— P a c k ODS A- 303 ( I D 4. 6mmX 25 Omm) 、溶離液：水 Zァセトニトリル= 1ノ 1、流速： 1ml /m i n、検出： 210 n m、カラム温度：室温）で行い得る。

また、 2—クロ口一 1— (4，一フルオロフェニノレ）エタノール、及ぴ、 2 - クロ口 _ 1一（3，一クロ口フエュル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体力ラムクロマトグラフィー (カラム：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a l c e l O J ( I D 4. 6 mmX 250 mm) 、溶離液： n—へキサン/イソプロパノール =39/1, 流速： 1 m 1 /m i n、検出： 254 nm、カラム温度：室温）で行い得る。

以上のように、本宪明に従えば、本発明のポリぺフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、種々の有用な光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。図面の簡単な説明図 1は、本発明のポリヌクレオチド配列及び推定ァミノ酸配列を示す図である。図 2は、組換えプラスミド pNTDRG 1の作製方法及び構造を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換え DN A技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。

Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d E d i t i o n (C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, 1989) 、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (Gr e e n e P u b l i s h i n g As s o c i a t e s a n d W i 1 e y— I n t e r s c i e n c e ) 。実施例 1 酵素の精製

以下の方法に従って、デポシァ ' リボフラビナ (D e ν,ο s i a r i b o f 1 a v i n a ) I FO 1 3584株より N—べンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) — N—ベンジル一 3—ピロリジノールを生成する活性を有する酵素を単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は 4°Cで行った。

(デポシァ■ リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I FO 1 3584株の培養）

2 L容坂ロフラスコ 72本に下記の組成からなる液体培地 400m lを分注し、 1 20°Cで 20分間蒸気殺菌を行った。

培地組成（。/。は（wZv) で表示）：

ポリぺプトン 0%

ィーストエキス 0 3%

肉エキス 0 3%

モノレトエキス 0%

N a C 1 0 3%

アデ力ノール LG— 109 (日本油脂社製） 0. 003% 水道水

p H 7. 0

この培地に、予め同培地にて前培養しておいたデボシァ · リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I F O 13584株の培養液を 5 m 1ずつ接種し、 30°Cで、 48時間振とう培養した。

(無細胞抽出液の調整）

上記の培養液 28000m l力ら遠心分離により菌体を集めた後、生理食塩水で菌体を洗浄し、該菌株の湿菌体 363 gを得た。この湿菌体を 500 m 1の 1 O OmMリン酸緩衝液 (p H 7. 0) に懸濁し、 S O N I F I E R 250型超音波破砕機（BRAN SON社製）を用いて破碎した。破碎物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液 840m lを得た。

(無細胞抽出液の熱処理おょぴ酸処理）

上記の無細胞抽出液を入れたビーカーを 60°Cの恒温水槽に浸け、 25分間攪拌した後、氷浴中で 4°Cまで冷却した。生じた沈殿物を遠心分離にて除いた後、この遠心上清の； pHをリン酸を用いて 5. 0に調整し、氷浴中で 3時間攪拌した。生じた沈殿物を再度遠心分離にて除き、粗酵素液 83 Om lを得た。

(硫酸アンモニゥム分画）

上記で得た粗酵素液の p Hをアンモユア水を用いて 7. 0に調整した後、 35 %飽和となるように硫酸ァンモユウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除いた（この際粗酵素液の pHをアンモニア水で pH 7. 0に維持しながら行った）。先と同様 pH7. 0を維持しながら、この遠心上清に 55%飽和となるようさらに硫酸アンモニゥムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を 50 m 1の 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 0 ) に溶解した後、同一緩衝液で 1夜透析し、粗酵素液 83m lを得た。

(DEAE— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）

上記硫酸ァンモユウム分画で得られた粗酵素液の pHをアンモニア水を用いて 8. 0に調整した。これを、 10mMリン酸緩衝液 (pH8. 0) で予め平衡化した DEAE— TOYOPEARL 650M (東ソ一株式会社製）カラム（2 5 Om l) に供し、同一緩衝液で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、リン酸を添加して pH 7. 0に調製した。

(P h e n y l— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）

上記DEAE— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィ一で得られた粗酵素液に終濃度 1Mとなるよう硫酸アンモニゥムを溶解し（この際、粗酵素液にァンモニァ水を添カ卩して: H 7. 0に維持しながら行った）、 1Mの硫酸アンモェゥムを含む 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 0 ) で予め平衡化した P h e n y 1 -TOYOPEARL 65 OM (東ソ一株式会社製）カラム（100m l ) に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニゥムのリニアグラジェント（11\1から01^まで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、 1 OmMリン酸緩衝液（pH7. 0) にて 1夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。以後、この酵素を RDRと呼ぶことにする。実施例 2 酵素の性質の測定

実施例 1で得られた RDRの酵素学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、 100mMリン酸緩衝液（pH6. 5) に、基質 Ν—べンジル — 3—ピロリジノン 5mM、補酵素 NADH0. 25 mMおよび酵素を添加し、 30°Cで 1分間反応させ、波長 340 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。

(1) 作用

NADHを補酵素として、 N—ベンジル一 3—ピロリジノンに作用し、光学純度 99. 9%e e以上の（R) —N—べンジルー 3—ピロリジノールを生成した。 NADPHを捕酵素として上記方法に準じて酵素活性を測定した場合、 NADH を補酵素とした場合の約 0. 6%の活性を示した。

(2) 作用至適 pH

緩衝液として 10 OmMリン酸緩衝液および 10 OmM酢酸緩衝液を用いて、 pHを 4. 0から 8. 0の範囲とした以外は、上記酵素活性の測定と同様にして酵素活性を測定した。その結果、 N—べンジルー 3—ピロリジノンに作用する至適 pHは 5. 5から 6. 0であった。 (3) 作用至適温度

温度を 20°Cから 60°Cとした以外は、上記酵素活性の測定と同様にして、酵素活性を測定した。その結果、 N—ベンジルー 3—ピロリジノンに作用する至適温度は 50 °Cから 5 5 °Cであった。

(4) 分子量

溶離液として 150 mMの塩化ナトリウムを含む 50 mMリン酸緩衝液 ( H 7. 0) を用い、 TSK— GEL G 3000 SWXLカラム（東ソ一株式会社製）による精製酵素 R D Rのゲル濾過クロマトグラフィー分析を行つた結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約 55000であった。また、酵素のサブユニットの分子量は SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出した。本酵素のサブュニットの分子量は約 28000であった。実施例 3 RDR遺伝子のクローニング

(P CRプライマーの作成）

実施例 1で得られた精製 RDRを 8 M尿素存在下で変性した後、ァク口モバクター由来のリシルエンドぺプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を AB I 492型プロテインシーケンサー（パーキンエルマ一社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、 DNAプライマー 2種（プライマー 1 ：配列番号 3、プライマー 2 ：配列番号 4) を常法に従って合成した。

(P CRによる RDR遺伝子の増幅）

デボシァ，リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I FO 13584株の培養菌体から Mu r r a y等の方法（Nu c 1. , Ac i d s R e s. 8 : 4321-4325 (1 980) ) に従って染色体 DNAを抽出した。次に、上記で調製した DNAプライマーを用い、得られた染色体 DNAを铸型として PC Rを行ったところ、 RDR遺伝子の一部と考えられる約 700 b p の DNA断片が增幅された（PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKa Ra Ex T a q (宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。この DNA断片を、プラスミド pT 7B 1 u e T— Ve c t o r (No v a g e n社製）にクローユングし、 AB I P R I SM Dy e T e rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c i n g Re a d y R e a c t i o n K i t (P e r k i n E l me r社製）および AB I 37 3 A DNA S e q u e n c e r (P e r k i n E 1 m e r社製）を用いてその塩基配列を確認した。

( i— PCR法による RDR遺伝子の全長配列の決定）

デポシァ■ リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I FO 1 3584株の染色体 DNAを制限酵素 E c o R Iで完全消化し、得られた DN A断片の混合物を T 4リガーゼにより分子內環化させた。これを錡型として用い、前項で判明した R D R遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、 i一 P C R法（N u c 1. Ac i d s R e s. 16， 8186 (1 988) ) により、染色体 D N A上の RDR遺伝子の全塩基配列を決定した（PCRは、 DN Aポリメラーゼとして T aKa R a Ex T a q (宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、塩基配列の決定は先と同様に行った）。その塩基配列を図 1に示した。また、塩基配列がコードするアミノ酸配列を塩基配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製 RDRのリシルエンドべプチダーゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製 RDRの部分アミノ酸配列は全て、このアミノ酸配列中に存在した。図 1中のアミノ酸配列において、精製 RDRの部分アミノ酸配列と一致した部分には下線を付した。なお、図 1の塩基配列及ぴァミノ酸配列は、配列表の配列番号 2のものと同一である。実施例 4 RDR遺伝子を含む組換えプラスミドの作製

実施例 3で決定された塩基配列を基に、 RDR遺伝子の開始コドン部分に Nd e I部位を付加した N末端 DNAプライマー（プライマー 3 ：配列番号 5 ) 、おょぴ同遺伝子の 3 ' 末端の直後に E c o R I部位を付加した C末端 DN Aプライマー（プライマー 4 ：配列番号 6) を合成した。次に、この 2種の DNAをプライマ一として用い、実施例 3で調製したデポシァ■ リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I F O 1 3584株の染色体 DNAを錡型として PCRを行い、開始コドン部分に Nd e I部位を付加し、 3' 末端の直後に Ec oR I切断点を付加した、 RDR遺伝子を增幅した（PCRは、 DNAポリメラーゼとして T aKa R a Ex T a q (宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。これを、 Nd e Iおよび E c' oR I で消化し、プラスミド p UCNT (WO 94/0361 3) の l a cプロモータ一の下流の Nd e I -E c o R I部位に揷入することにより、組換えプラスミド p NTDRを得た。実施例 5 RD R遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を含む組換えプラスミドの作製

ノンラス .メガテリゥム (B a c i 1 1 u s me g a t e r i um) I AM 1030株由来のグルコース脱水素酵素（以後、 GDHと称する）の遺伝子の塩基配列情報（Eu r. J. B i o c h em. 186, 389 (1989) ) を基に、 GDHの構造遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌の S h a i n e - D a 1 g a r n o配列（9塩基）を、さらにその直前に E c o R I切断点を付加した N末端 DNAプライマー（プライマー 5 ：配列番号 7) と、 GDHの構造遺伝子の終始コドンの直後に S a 1 I部位を付加した C末端 DNAプライマー（プライマー 6 :配列番号 8) を常法に従って合成した。これら 2つの DNAプライマーを用い、プラスミド pGDKl (Eu r. J. B i o c h em. 186, 3 89 (1989) ) を鍀型として P C Rにより二本鎖 DNAを合成した。この D NA断片を E c o R Iおよび S a 1 Iで消化し、プラスミド pUCNT (WO 9 4/0361 3) の l a cプロモーターの下流の E c o R I— S a 1 I部位に揷入することにより、組換えプラスミド！) NTG 1を得た。次に、実施例 4で調製した pNTDRを Nd e Iおよび E c o R Iで消化して得られる RD R遺伝子を、この p NT G 1上の GDH遺伝子の上流に存在する Nd e I— E c oR I部位に揷入し、プラスミド p NTDRG 1を得た。 pNTDRG 1の作製法および構造を図 2に示す。実施例 6 組換_ 大腸菌の作製実施例 4および 5で得た組換えプラスミド pNTDR又は pNTDRG 1を用いて大腸菌 HB 101 (宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌 HB 1 01 (p NTDR) および HB 10 1 (pNTDRG 1) を得た。

こうして得られた形質転換体 E. c o l i HB 101 (pNTDR) および E. c o 1 i HB 101 ( p N T D R G 1 ) は、それぞれ、受託番号 F E RM B P— 08457および FERM BP— 08458として、平成 1 5年 8月 25日付で、日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている。実施例 7 組換え大腸菌における RDRの生産

実施例 6で得た組換え大腸菌 HB 101 (pNTDR) を 120/i g/m lのアンピシリンを含む 2 XYT培地で培養し、遠心分離により集菌後、 l O OmM リン酸緩衝液 (pH6. 5) に懸濁し、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー (S MT社製）を用いて破砕し、無細胞抽出液を得た。

この無細胞抽出液の RDR活性を以下のように測定した。 RDR活性の測定は、 100 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 5 ) に、基質 N—べンジルー 3—ピロリジノン 5mM、捕酵素 NADH0. 25 mMおよび酵素を添カ卩し、 30°Cで波長 34

0 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、 1 分間に 1 μηιο 1の NAD Hを NADに酸化する酵素活性を 1 u n i tと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中の RDR活性を比活性として表し、ベクタ一プラスミドを保持する形質転換体と比較した。また、実施例 1と同様の方法で調製したデボシァ■ リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a)

1 FO 13584株の無細胞抽出液中の RDR活性についても同様に比較した。それらの結果を表 1に示す。

大腸菌 HB 101 (pNTDR) では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌 HB 101 (pUCNT) と比較して明らかな RDR活性の増加が見られ、デポシァ . リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I FO 1 3584株と比較して、比活性は約 1 7倍に達した。菌株名 RDR比活性（U/mg)

£ coli HB101 (pUCNT) <0.01

£ coli HB101 (pNTDR) 0.67

Devosia riboflavina IF013584 0.04

実施例 8 組換え大腸菌における R D Rおよび G D Hの同時生産

実施例 6で得た組換え大腸菌 H B 101 (pNTDRG 1) を、実施例 7と同様に処理して得られる無細胞抽出液の GDH活性を、以下のように測定した。 G DH活性の測定は 1Mトリス塩酸緩衝液（pH8. 0) に、基質グルコース 0. 1M、補酵素 NAD P 2 mM及び酵素を添加し、 25 °Cで波長 340 n mの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、 1分間に Ι μπι ο 1の NADPを NADPHに還元する酵素活性を 1 u n i tと定義した。また、 RDR活性についても実施例 7と同様に測定した。

このように測定した無細胞抽出液中の RDRおよび GDH活性を比活性として表し、大腸菌 HB 101 (pNTDR) およびベクターのみの形質転換体 H B 1 01 (pUCNT) と比較した結果を表 2に示す。大腸菌 HB 101 (p NTD RG 1) では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌 HB 101 ( pUCNT) と比較して、明らかな RDRおよび GDH活性の増加が見られた。表 2

実施例 9 R D Rおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた N—ベンジル一 3—ピロリジノンからの（R) — N—ベンジル一 3—ピロ

V -ルの合成

実施例 8で得られた組換え大腸菌 H B 101 (pNTDRG 1) の培養液を、 SON I F I RE 250 (BRAN SON社製）を用いて超音波破碎した。この菌体破砕液 2 Om 1にグルコース 2 g、 NAD 1 m g _N N—ベンジルー 3—ピロリジノン l gを添加した。この反応液を、 5 Mの塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより PH6. 5に調整しつつ、窒素雰囲気下、 30でで1 8時間攪拌した。反応終了後、 5 Mの水酸化ナトリウム水溶液 2 m 1を添カ卩し、反応液をトルエンで抽出した。抽出液をエバポレーターで脱溶剤した後、抽出物の分析を行ったところ、収率 96%で N—べンジルー 3—ピロリジノールが得られた。この際、生成した N—べンジルー 3—ピロリジノールは光学純度 99. 9 % e eの R体であった。

N—べンジルー 3—ピロリジノン、及ぴ、 N—べンジルー 3—ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム： Un i p o r t B 10% PEG - 2 OM (I D 3. OmmX l. 0m、ジーエルサイエンス社製）、カラム温度： 200°C、キヤリァガス：窒素、検出： F I D) で行った。

また、 N—ベンジルー 3 -ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体力ラムクロマトグラフィー（カラム： Ch i r a l c e l OB ( I D 4. 6mmX 25 Omm ダイセル化学工業社製）、溶離液： n—へキサン _/ /イソプロパノールノジェチルアミン= 99/1/0. 1、流速 : 1m l / i n、検出 : 254 n m、カラム温度：室温）で行つた。実施例 10 RDRおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた 7—メトキシ _ 2—テトラロンからの (R) —7—メトキシー 2—テトラローノレの合成

実施例 8で得られた組換え大腸菌 HB 101 (pNTDRG 1) の培養液 20 m lにグノレコース 3 g、 NAD2mg、 7—メトキシー 2—テトラロン 2 gを添力 tlし、 5 Mの水酸化ナトリウム水溶液の滴下により pH6. 5に調整しつつ、窒素雰囲気下、 30°Cで 1 5時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、 7—メトキシ一 2—テトラロール 1. 7 gを得た。光学純度を測定した結果、生成した 7—メトキシー 2—テトラロールは光学純度 99. 9 % e eの R体であった。 ^-NMR (CD C 1 ₃) δ p pm 1. 62 (s， 1 H) ， 1. 73〜： L. 87 (m, 1 H) , 1. 98〜2. 08 (m, 1 H) ， 2. 70— 2. 81 (m, 2H) ， 2. 88 (a p p d t, 1H) ， 3. 05 (d d, 1 H) , 3. 76 (s, 3 H) ， 4. 09〜4. 19 (m， 1 H) ， 6. 6 1 (d, 1 H) ， 6. 6 9 (d d, 1H) , 7. 00 (d, 1H)

7—メトキシ一 2—テトラロン、及び、 7—メトキシー 2—テトラロールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（'カラム：ナカライテスタ株式会社製 COSMOS I L 5 C 8 -MS ( I D 4. 6 mm X 250 mm) 、溶離液：水 /ァセトニトリゾレ =： 1/1、流速 : 1m l /m i n、検出： 210 n m、カラム温度：室温）で行った。

また、 7—メトキシー 2—テトラロールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー (カラム：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 c e 1 O J ( I D4. 6mmX 250mm) 、溶離液： n—へキサン Zイソプロパノ一ル= 9 / 1、流速： 1m l /m i n、検出： 254 n m、力ラム温度：室温）で行った。実施例 1 1 RDRおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた 3—メトキシー 6, 7, 8, 9ーテトラヒドロー 5 H—べンゾシクロへプテン一 6—オンからの（R) — 3—メトキシ一 6, 7, 8, 9ーテトラヒドロ - 5 H—ベンゾシク口ヘプテン一 6—ォーノレの合成

実施例 8で得られた組換え大腸菌 H B 101 (pNTDRG 1) の培養液 20 m lにグノレコース 3 g、 NAD 2mg、 50% (w/w) の 3—メトキシー 6， 7， 8， 9—テトラヒドロー 5 H—ベンゾシク口ヘプテン一 6—オンのトノレエン溶液 4 gを添加し、 5 Mの水酸化ナトリウム水溶液の滴下により p H 6. 5に調整しつつ、窒素雰囲気下、 30°Cで 18時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、 3—メトキシ一6, 7, 8, 9—テトラヒドロ一 5 H—ベンゾシクロヘプテン一 6—オール 1. 6 gを得た。光学純度を測定した結果、生成した 3—メトキシ一 6， 7, 8， 9ーテトラヒドロ一 5 H—ベンゾシクロヘプテン一6—オールは光学純度 99. 9% 6 6の1 体でぁった。

'H-NMR (CDC 1₃) δ p p m 1. 40〜： L. 65 (m, 2 H) ， 1.

70〜： L. 95 (m， 2 H) , 1. 95〜 2. 20 (m, 1 H) , 2. 65〜 2.

75 (m, 2H) ， 2. 90〜3. 10 (m, 2 H) , 3. 78 (s, 3 H) ， 3. 65〜 3. 90 (m, 1H) , 6. 66 (d d, 1H) , 6, 73 (d， 1

H) , 6. 98 (d， 1 H)

3—メトキシー 6, 7， 8, 9—テトラヒドロ一 5 H—べンゾシクロヘプテン

—6—オン、及び、 3—メトキシー 6， 7, 8， 9ーテトラヒドロ一 5 H—ベンゾシクロヘプテン一 6—オールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製 CO SMO S I L 5 C 8 -MS ( I D 4.

6mmX 250 mm) 、溶離液：水/ァセトニトリノレ = 1 Z 1、流速： lm 1 Z m i n、検出： 210 nm、カラム温度：室温）で行った。

また、 3—メトキシー 6， 7 , 8, 9—テトラヒドロー 5 H—べンゾシクロへプテン一 6—オールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製 Ch i r a 1 c e 1 O J ( I D4. 6m mX 250 mm) 、溶離液： n—へキサン/イソプロパノール = 9 / 1、流速： lm 1 /m i n、検出： 254 nm、カラム温度：室温）で行った。実施例 1 2 RDRおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた 2—クロ口一 1一（4，ーフノレオロフェニノレ）エタノンからの (S) — 2—クロロー 1一（4， —フ /レオ口フエ二ノレ) エタノーノレの合成

実施例 8で得られた組換え大腸菌 H B 101 (pNTDRG 1) の培養液 50 m 1にグノレコース 10 g、 NAD 5 ra g、及ぴ、 50 % (w/w) の 2—クロ口 —1— (4，一フルオロフェニル）エタノンのトルエン溶液 10 gを添加し、 5 Mの水酸化ナトリゥム水溶液の滴下により p H 6. &に調整しつつ、 30でで 2 2時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、蒸留（1 10 °C, 0. 8mmH g) し、無色オイル状の 2—クロロー 1— (4，一フルオロフェエル）エタノール 4. l gを得た。光学純度を測定した結果、生成した 2—クロロ一 1一（4，一フルオロフェニル）エタノールは光学純度 99. 9%e eの S体であった。

^XH-NMR (CD C 1 ₃) δ p pm 3. 1 0 ( s , 1 H) ， 3. 6 1 (d d , 1 H) ， 3. 7 0 (d d, 1 H) ， 4. 8 8 (d d, 1 H) , 7. 0 6 (m, 2 H) ， 7. 3 5 (m， 2 H)

2—クロロー 1一（4，一フノレオ口フエ-ノレ）エタノン、及び、 2—クロ口一 1— (4，一フルオロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：株式会社ヮイエムシィ製 YMC— P a c k OD S A— 3 0 3 ( I D 4. 6 mm X 2 5 0 mm) 、溶離液：水/ァセトニトリノレ = 1 Z 1、流速： l m 1 /m i n、検出： 2 1 0 nm、カラム温度：室温）で行った。また、 2—クロロー 1一（4，一フルオロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a l c e l O J ( I D 4. 6 mmX 2 5 0 mm) 、溶離液： n—へキサン/ィソプロパノーノレニ 3 9/ 1、流速 : 1 m l /m i n、検出 : 2 5 4 η m、カラム温度：室温）で行った。実施例 1 3 RDRおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた 2—クロロー 1一（3，一クロ口フエニル）エタノンからの（S) - 2 —クロ口一 1— (3，一クロ口フエ二ノレ）エタノーノレの合成

実施例 8で得られた組換え大腸菌 HB 1 0 1 (p NTDRG 1) の培養液 5 0 m lにグルコース 1 0 g、 NAD 5mg_N 及び、 5 0% (w/w) の 2—クロ口一 1一（3，一クロ口フエ-ル）エタノンのトルエン溶液 1 0 gを添加し、 5M の水酸化ナトリウム水溶液の滴下により r> H 6. 5に調整しつつ、 30でで 22 時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物の分析を行った。その結果、収率 9 7%で 2—クロ口一 1一（3，一クロ口フエニル）ェタノールが得られた。この際、生成した 2—クロ口一 1— (3，一クロ口フエ二ル）ェタノールは光学純度 9 9. 9 % e eの S体であった。

2—クロ口一 1一（3，一クロ口フエェノレ）エタノン、及び、 2—クロロー 1 ― (3，一クロ口フエ二ノレ）エタノールの定量は、 2—クロロー 1— (4，ーフノレオロフェニノレ）エタノン、及び、 2—クロロー 1一 (4，一フルオロフェニノレ ) エタノールの場合と同様に行った。また、 2—クロロー 1— (3' —クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、 2—クロ口一 1一（4，一フルオロフェニル）エタノールの場合と同様に行った。実施例 14 RDRの基質特異性

0. 33% (v/v) のジメチルスルフォキシドを含む 10 OmMリン酸緩衝液（pH6. 5) に、基質となる表 3の各種カルボニル化合物を終濃度 lmM、補酵素 NADHを終濃度 0. 25 mMとなるようそれぞれ溶解した。これに RD Rを添加し、 30 °Cで波長 340n mの吸光度の減少を測定した。この反応条件において、 1分間に 1 /imo 1の NADHを NADに酸化する酵素活性を 1 u n i tと定義した。そして、各種カルボニル化合物に対する活性を、 N—ベンジノレ一 3 _ピロリジノンに対する活性を 100 %とした場合の相対値で表し、表 3に示した。 R D Rは非常に広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。

ln i¾mwt 3»i脚R Rs D 産業上の利用可能性

N—べンジル _ 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して（R) —N—ベンジルー 3 _ピロリジノールを生成する活性を有するポリべプチド遺伝子のクローニング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリぺプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になつた。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、種々のカルボニル化合物から光学活性アルコールを効率良く合成することが可能となった。

Claims

請求の範囲

L. 以下の（1) から（4) の理化学的性質を有するポリペプチド

(1) 作用： NADHまたは NAD PHを補酵素として、式（1)

で表される N—ベンジルー 3 _ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（2)

で表される (R) 一 N—ベンジル一 3—ピロリジノールを生成する、

(2) 作用至適 p H： 5. 5から 6. 0、

(3) 作用至適温度： 50でから 55で、

( 4 ) 分子量：ゲル濾過分析において約 55000、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 28000。

2. 以下の（a) 又は（b) のポリペプチド：

( a ) 配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列からなるポリぺプチド

( b ) 配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列または配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、揷入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、式（1)

で表される N—べンジルー 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（2)

で表される（R) — N—ベンジル一 3—ピロリジノールを生成する活性を有するポリぺプチド。

3. ポリペプチドがデポシァ (D e V o s i a) 属に属する微生物に由来する請求の範囲第 1または 2項に記載のポリぺプチド。

4. デボシァ属に属する微生物が、デボシァ · リボフラビナ (D e V o s i a r i b o f l a v i n a) I FO 13584株である請求の範囲第 3項記載のポリぺプチド。 5. 請求の範囲第 1から 4項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

6. 以下の（c) 又は（d) のポリヌクレオチド：

( c ) 配列表の配列番号 2に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド ( d ) 配列表の配列番号 2に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、式（1)

で表される N—べンジル _ 3—ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（2)

(2) で表される（R) — N—ベンジル一 3—ピロリジノールを生成する活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド。

7. 請求の範囲第 5または 6項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

8. プラスミド！ NTDRである請求の範囲第 7項記載の発現ベクター。

9. グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレォチドをさらに含む、請求の範囲第 7項に記載の発現べクタ一。

10. 前記ダルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス 'メガテ yゥム (B a c i l l u s me g a t e r i u m) 由来のグルコース脱水素酵素である、請求の範囲第 9項に記載の発現ベクター。 1 1. プラスミド pNTDRGlである請求の範囲第 10項に記載の発現べクター。

1 2. 請求の範囲第 7から 11項のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。

1 3 · 前記宿主細胞が大腸菌である請求の範囲第 1 2項に記載の形質転換体。

14. E. c o l i HB 101 (p NTDR) (FERM BP— 0845 7) である請求の範囲第 1 3項に記載の形質転換体。

1 5. E. c o l i HB 101 (pNTDRG 1) (FERM BP— 08 458) である請求の範囲第 1 3項に記載の形質転換体。

16. 請求の範囲第 1 2から 15項のいずれかに記載の形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボ二ル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。

1 7. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、式（1)

で表される N_ベンジルー 3—ピロリジノンであり、前記光学活性アルコールが、式（2)

で表される（R) —N—ベンジル一 3—ピロリジノールである、請求の範囲第 6項に記載の製造方法。

8. 前記カルボ二ル基を有する化合物が、一般式（3)

(式中、 R R²は水素原子、水酸基又はアルコキシ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、 nは 1又は 2を示す。）で表される 2—テトラロン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（4) (4)

(CH₂)_n

(式中、 R R ²及び nは前記と同じ）で表される 2—テトラロール誘導体である請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

1 9 . 前記 2—テトラロン誘導体が 7—メトキシ一 2—テトラロンであり、前記 2—テトラロール誘導体が（R) — 7—メトキシ一 2—テトラロールである請求の範囲第 1 8項に記載の製造方法。

2 0 . 前記 2—テトラロン誘導体が 3—メトキシ一 6 , 7， 8， 9—テトラヒドロー 5 H—ベンゾシクロヘプテン一 6—オンであり、前記 2—テトラ口ール誘導体が ( R ) 一 3—メトキシ一 6 , 7 , 8 , 9ーテトラヒドロー 5 H—べンゾシク口ヘプテン一 6—オールである請求の範囲第 1 8項に記載の製造方法。

2 前記カルボ二ル基を有する化合物が、一般式（5 )

(式中、 R ³、 R ⁴は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、 R ⁵は水素原子、ハロゲン原子、水酸基又は置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される 1一フエニルエタノン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（6 )

(式中、 R³、 R⁴、及び、 R ⁵は前記と同じ）で表される 1—フエニルエタノール誘導体である請求の範囲第 16項に記載の製造方法。

22. 前記 1一フエ-ルエタノン誘導体が 2—クロロー 1一（4，一フ^ /レオ口フエニル）エタノンであり、前記 1一フエエルエタノール誘導体が（S) — 2— クロロー 1— (4，一フルオロフェニル）エタノールである、請求の範囲第 21 項に記載の製造方法。

23. 前記 1一フエニルエタノン誘導体が 2—クロ口一 1一（3，ークロロフェニル) エタノンであり、前記 1 _フエ-ルエタノール誘導体が（S) — 2—クロロ _ 1一（3，一クロ口フエ-ル）エタノールである請求の範囲第 21項に記載の製造方法。