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WO2003020939A1 - Neue nukleinsäuresequenzen und deren verwendung in verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen - Google Patents

Neue nukleinsäuresequenzen und deren verwendung in verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen Download PDF

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Publication number
WO2003020939A1
WO2003020939A1 PCT/EP2002/009719 EP0209719W WO03020939A1 WO 2003020939 A1 WO2003020939 A1 WO 2003020939A1 EP 0209719 W EP0209719 W EP 0209719W WO 03020939 A1 WO03020939 A1 WO 03020939A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
racb
nucleic acid
acid sequence
expression
seq
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/009719
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karl-Heinz Kogel
Ralph Hückelhoven
Holger Schultheiss
Markus Frank
Original Assignee
Basf Plant Science Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2001142579 external-priority patent/DE10142579A1/de
Priority claimed from DE2002129729 external-priority patent/DE10229729A1/de
Priority to US10/488,222 priority Critical patent/US7456335B2/en
Application filed by Basf Plant Science Gmbh filed Critical Basf Plant Science Gmbh
Priority to CA2459251A priority patent/CA2459251C/en
Priority to HU0402030A priority patent/HU228701B1/hu
Priority to EP02767458A priority patent/EP1427833B1/de
Priority to AT02767458T priority patent/ATE447032T1/de
Priority to DE50213970T priority patent/DE50213970D1/de
Publication of WO2003020939A1 publication Critical patent/WO2003020939A1/de
Priority to US12/276,776 priority patent/US20090165173A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the invention relates to new RacB cDNA sequences from barley, as well as expression cassettes and vectors which comprise these sequences.
  • the invention further relates to transgenic plants transformed with these expression cassettes or vectors, cultures derived therefrom, parts or transgenic propagation material, and the use thereof for the production of foodstuffs, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • the invention further relates to methods for producing or increasing a pathogen resistance in plants by reducing the expression of a RacB protein or a functional equivalent thereof.
  • the aim of biotechnological work on plants is the production of plants with advantageous, new properties, for example to increase agricultural productivity, to increase the quality of food or to produce certain chemicals or pharmaceuticals (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487-96 ) -
  • the plant's natural defense mechanisms against pathogens are often inadequate. Fungal diseases alone result in crop losses of many billions of US dollars a year.
  • the introduction of foreign genes from plants, animals or microbial sources can strengthen the immune system. Examples are the protection against insect damage in tobacco by expression of Baclllus thuringiensis endotoxins under the control of the 35 S CaMV promoter (Vaeck et al.
  • SAR systemic acquired resistance
  • SA salicylic acid
  • the barley locus has long been described in barley as a negative regulator of pathogen defense.
  • the loss or loss of function of the Mio gene results in increased and, above all, race-unspecific resistance to, for example, numerous types of mildew (Büschges R et al.
  • the Mlo phenotype is recessively inherited, which also speaks for a function as a susceptibility gene. Mlo-deficient barley varieties obtained through classic breeding are already widely used in agriculture. Presumably due to the recessiveness, despite intensive cultivation, this resistance has proven to be extraordinarily permanent. No breakthroughs in resistance have occurred so far. Mio-like resistances in other plants, especially cereals are not described, although wheat, rye and other cereals are also affected by similar mildew pathogens. For example, the cause of wheat can be the presence of a hexaploid genome, which makes it extremely difficult to identify mutants in which each of the six gene copies has been inactivated.
  • the Mio gene was only recently cloned (Büschges R et al. (1997) Cell 88: 695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sei. 5: 343-348). As a result, different homologues isolated from other cereals. Various methods using these genes to achieve pathogen resistance have been described (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552).
  • Penetration resistance causes: Papilla formation ("cell wall apposition"; CWA) below the penetration site of the pathogen, the epidermal cell wall.
  • CWA cell wall apposition
  • the spread of the fungal pathogen remains almost exclusively restricted to this subcellular structure (Jorgensen JH and Mortensen K (1977) Phytopathology 67: 678-685; Freialdenhoven A et al. (1996) Plant Cell 8: 5-14).
  • This reaction is caused by the genes Rorl and Ror2 required for the Mio effect (Peterhaensel C et al. (1997) 9: 1397-1409).
  • a disadvantage of the pathogen resistance caused by Mio is that Mlo-deficient plants - even in the absence of a pathogen - initiate a defense mechanism that manifests itself, for example, in the spontaneous death of leaf cells (Wolter M et al. (1993) -Mol Gen Genet 239: 122-128).
  • Another disadvantage is that the Mlo-deficient genotypes show hypersusceptibility to hemibiotrophic pathogens such as Magnaporte grisea (M. gri $ ea) and Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 508- 514; Ku ar J et al.
  • the Mio gene thus appears to be a negative regulator of cell death.
  • the cause is probably also the induction of cell death in the absence of the Mio gene, which increases the susceptibility to these rather necrotrophic pathogens.
  • This ambivalent effect which limits the biotechnological application of Mio, is probably due to the fact that necrotrophic fungi can use the stronger HR of the Mlo-deficient host plant for their infection process. Resistance comparable to Mlo deficiency would be desirable, but lacks the characteristic of cell death induction.
  • Rho, Rac and Cdc42 are members of the family of small GTP (guanosine triphosphate) binding proteins and, as "molecular switches", regulate numerous intracellular processes, both in plant and in animal organisms. As building blocks of signal transduction, they play an important role in the implementation of extracellular stimuli. For example, they regulate the NADPH oxidase and thus the release of reactive oxygen molecules ("oxidative burst"). Animal or human racl is essential for the formation of the active NADPH oxidase complex, which in turn is important for the formation of superoxide and thus contributes to the defense against pathogens (Irani K and Goldschmidt-Clermont PJ (1998) Biochem Phar acol 55: 1339 -1346).
  • GTP-binding proteins have a function in the restructuring of the cytoskeleton and cell transformation (Symon M. (1996) TIBS 21: 178-181), as well as in the activation transcription (Hill et al. (1995) Cell 81: 1159-1170; Chandra et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 13393-13397).
  • Rhoo QJ et al. (1996) Plant J 10: 515-522; Hassanain HH et al. (2000) Biochem Biophys Res Com un 272 ( 3): 783-788; Ono E et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 759-764).
  • Rac modulates i.a.
  • Racl from rice is able to induce a hypersensitive response (HR) at the sites of an M. grisea infestation if the constitutively active form is overexpressed and thus causes pathogen resistance.
  • HR hypersensitive response
  • the expression of a dominant-negative form of racl causes increased susceptibility to M. grisea (Kawasaki T et al. (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96: 10922-10926; Ono E et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 759-764).
  • WO 00/15815 describes five rac genes from maize. Although here both methods for up and down regulation of Rac proteins are described and speculatively related to the achievement of pathogen resistance (p.55 / Z.25ff.), The only technical teaching that specifically describes this use is alone directed to overexpression of the claimed Rac genes to achieve pathogen resistance (pp. 60 / Z.21ff.). Quite clearly - and in accordance with the state of the art - the postulate here (p. 60 / Z. 31ff): "Accordingly, the invention is useful for protecting plants from pathogens.
  • the present invention has for its object to provide new methods for pathogen defense in plants, which efficiently protect a broad spectrum of pathogens in as many different plant types as possible, preferably the crop plants used in agriculture. This object is achieved by the method according to the invention.
  • a first object of the invention comprises a method for generating or increasing the resistance to at least one pathogen in plants, characterized in that the following steps are included
  • the rac homologue RacB from barley (Hordeum vulgare) (SEQ ID NO: 1) (as a result: hvRacB) - in spite of a high similarity to rice racl - in contrast to this a negative control function in the case of an attack by the barley mildew Blumeria (syn.Erysxphe) gramxnis f.sp.
  • hordei (Bgh): The reduction in hvRacB expression in the epidermal cell by means of a sequence-specific RNA interference approach using double-stranded vRacB-dsRNA ("gene silencing"), significantly prevented the formation of hormones as a result of a Bgh infection. Further experiments showed (cf. Example 7) that this phenotype cannot be observed in a ml o5-rorlutant genotype - the barley A89. This suggests that RacB is functionally related to Mio or Rorl, or both, so presumably act in a signal chain.
  • HvRacB Similar to Mio's loss of function, HvRacB's broad resistance to various isolates of Blumeria grainis f.sp. hordei. In transient "gene silencing" experiments, HvRacB reduces the penetration efficiency (house formation) of Bgh by 44% (see Example 7) - an effect that corresponds in strength to that achieved with Mlo-dsRNA (Swiss et al. (2000) Plant J 24: 895-903). In the wild-type barley variety Ingrid, approx. 60% of the fungal penetrations lead to the formation of histories, whereas the penetration rate in BCIngrid-mlo5 is almost 0%.
  • the barley variety A89 (mlo-rorl double mutant) shows a penetration efficiency of approx. 20 to 35%. In none of these variants was an altered RacB expression follow the Bgh inoculation (see Example 7; Fig. 3). The fact that only penetration of around 50% can be observed even in pathogen-sensitive wild-type varieties such as Pallas or Ingrid can be attributed to the always present basal resistance.
  • HvRacB from OsRacl, a rice homolog from Racl (Ono E et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 759-764).
  • HvRacB mainly acts as a negative regulator of papilla formation. This difference is of paramount importance for use in achieving pathogen resistance in plants.
  • Powdery mildew is also due to increased papilla formation, but is more expensive with a higher susceptibility to necrotrophic fungi (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 508-514; Ku ar J et al. (2001 ) Phytopathology
  • RhB is to be understood as a key element for the successful penetration of a pathogen such as Bgh into the plant cell.
  • the method according to the invention accordingly offers all the advantages of Mlo deficiency without at the same time having its greatest disadvantage - the increased spontaneous cell death.
  • the method is superior to all methods in which a pathogen-resistant phenotype is realized by overexpression of a resistance-mediating protein.
  • a gene can be switched off without expression of a (foreign) protein. Ideally, only that
  • RhB protein amount activity or function, which, for example when using pathogen-inducible promoters, enables expression only when necessary (i.e. pathogen infestation).
  • HvRacB-cDNA A partial sequence of the barley RacB cDNA (HvRacB-cDNA) is described 5 (GenBank Acc.-No .: AJ290240), which is highly conserved with the Reis-RacB (GenBank Acc.-No .: AF250327) and Maize RacB (GenBank Acc .-No .: AF126053) and is very similar to rice racl. Maize RacB is also one of the five Rac genes in the above application WO 00/15815 (Sequence No. 3). The complete coding sequence of the HvRacB protein has not yet been described (see Example 1).
  • Barley RacB has a homology of 95% identity to rice RacB and maize RacB and is more than 55% identical to the human RACl or RAC2 (Hassanain et al. 2000, Fig. 1).
  • HvRacB is constitutively expressed in the primary leaves of the barley (epidermis-specific) and is not significantly affected in its level of expression by a Bg infection. In this respect, expression takes place in the tissue that interacts directly with the Bgh pathogen.
  • the method according to the invention can in principle be applied to all types of plants. Preferred for those in which a RacB protein or a functional equivalent thereof is naturally expressed. Since the function of RacB is closely linked to the Mio gene and this has been identified in numerous plants - including in dicotyledons (Devoto A et al. (1999) J Biol Chem 274 (49): 34993-5004) a similarly broad distribution can also be assumed for RacB and its homologues.
  • the sequences from other plants e.g. Arabidopsis thaliana
  • homologous to the RacB sequences disclosed in the context of this invention can e.g. by database search or screening of gene banks - using the RacB sequences as a search sequence vzw. Probe - easily found.
  • Plant in the context of the invention means all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Included under the term are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts derived therefrom, propagation material, plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell cultures, and all other types of groupings of plant cells into functional or structural units. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant includes all annual and perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants and includes, by way of example but not by way of limitation, those of the genera Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinu, Hesisocallis Pelargoniu, panieu, pennisetuia, ranunculus, senecio, salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum,
  • plant preferably includes monocot crops, such as cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, corn, rice, sorghum or oats and sugar cane.
  • monocot crops such as cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, corn, rice, sorghum or oats and sugar cane.
  • the term also includes dicot crops, such as
  • - Brassicacae such as rapeseed, canola, cress, arabidopsis, cabbage or canola, leguminosae such as soy, alfalfa, pea, bean-grown or peanut
  • Solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula
  • Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini
  • Tree species preferably include plum, cherry, peach, nectarine, apricot, banana, papaya, mango, apple, pear, quince.
  • ornamental plants useful or ornamental trees, flowers, cut flowers, shrubs or lawns
  • Rosaceae such as rose, Ericaceae such as rhododendrons and azaleas, Euphorbiaceae such as Christmas stars and croton
  • Caryophyllaceae such as carnations
  • Petunienaceae Gesneriaceae such as African violet
  • Balsaminaeea such as balsam
  • Orchidaceae such as orchids
  • Iridaceae such as gladiolus, iris, freesia and crocus
  • Compositae such as marigold, Geraniaceae such as geraniums
  • Liliaceae such as the dragon tree, Moraceae and other like Ficusendaceae
  • Rosaceae such as rose
  • Ericaceae such as rhododendrons and azaleas
  • Euphorbiaceae such as Christmas stars and croton
  • Phathogen resistance means reducing or alleviating the symptoms of a plant's disease as a result of an infestation by a pathogen.
  • the symptoms can be of various types, but preferably include those that directly or indirectly impair the quality of the plant, the quantity of the yield, the suitability for use as feed or food, or also make it difficult to sow, cultivate, harvest or process the crop ,
  • “Lending”, "existing”, “producing” or “increasing” pathogen resistance means that the defense mechanisms of a particular plant species or cultivar by using the method according to the invention compared to the wild type of the plant ("parent plant") to which the method according to the invention was not used, under otherwise identical conditions (such as, for example, climatic or cultivation conditions, type of pathogen, etc.) has increased resistance to one or more pathogens.
  • the increased resistance manifests itself preferably in a reduced expression of the disease symptoms, whereby disease symptoms - in addition to the above-mentioned impairments - also include, for example, the penetration efficiency of a pathogen in the plant or plant cells or the proliferation efficiency in or on the same.
  • the disease symptoms are preferably reduced by at least 10% or at least 20%, particularly preferably by at least 40% or 60%, very particularly preferably by at least 70% or 80%, most preferably by at least 90% or 95%.
  • Selection means, in relation to plants in which - in contrast to or compared to the starting plant - the resistance to at least one pathogen exists or is increased, all the methods which are suitable for the detection of an existing or increased pathogen resistance.
  • These may be symptoms of the pathogen infection (e.g. housorium formation in the case of fungal infection) but also include the symptoms described above, which concern the quality of the plant, the quantity of the yield, the suitability for use as feed or food, etc.
  • pathogen means, for example, non-restrictively viruses or viroids, bacteria, fungi, animal pests, such as insects or nematodes. Fungi such as powdery mildew are particularly preferred.
  • pathogen means, for example, non-restrictively viruses or viroids, bacteria, fungi, animal pests, such as insects or nematodes. Fungi such as powdery mildew are particularly preferred.
  • Fungal pathogens or fungus-like pathogens preferably come from the group comprising Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Zygo yceten, Basidiomycota and Deuteromycetes (fungi imperfecti).
  • the pathogens mentioned in Tables 1 and 2 and the diseases associated with them should be mentioned as examples, but not by way of limitation.
  • Leaf spots, minor Altemaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae Hel inthosporium victoriae
  • Penicillium ear red Penicillium spp. P. chrysogenum, (blue eye, blue old) P. expansu, P. oxalicum
  • Phaeocytostroma stalk Phaeocytostroma ambiguum, Phaeocyto-rot and root rot sporella zeae
  • Phaeosphaeria leaf spot Phaeosphaeria maydis Sphaerulina maydis
  • Botryosphaeria festucae Physalospora (Botryosphaeria ear rot) zeicola (anamorphic: Diplodia frumenti)
  • Red kernel disease ear Epicoccum nigrum mold, leaf and seed rot
  • Rhizoctonia ear red Rhizoctonia zeae (teleomorphic: Waitea (sclerotial red) circinata)
  • Plasmodiophoromycota such as Piasmodiophora brassicae (Kohl's hernia, clubroot of crucifers), Spongospora subterranea (powdery scab of potato tubers), Polymyxa graminis (root disease of cereals and grasses),
  • As ⁇ omycota such as Microdochium nivale (snow mold on rye and wheat), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (ear rot especially on wheat), Fusarium oxysporum (Fusarium wilt on tomato), Blumeria graminis (powdery mildew on barley and f.sp. horde) (f.sp.
  • Basidi ⁇ myceten such as Typhula incarnata (Typhula rot on barley, rye, wheat), Ustilago maydis (bump fire on
  • fungi imperfecti such as Septoria nodorum (tan) on wheat (Septoria tritici), Pseudocerco-sporella herpotrichoides (stalk-breaking disease on wheat, barley, rye), Rynchosporium secalis (leaf blotch disease on rye and barley), Alternaria solani (Alternaria solani) (Alternaria solani) Tomato), Phoma betae (root fire on beta beet), Cercospora beticola (Cercospora leaf spot disease on beta beet), (Alternaria brassicae (black rapeseed on rapeseed, cabbage and cruciferous vegetables, among others), Verticillium dahliae (rapeseed wilt and stalk rot), Collet Focal spot disease on beans), Phoma Hungary - diarrhea (black-legged on cabbage; root neck or stem rot on rapeseed),
  • Botrytis cinerea (gray mold on grapevines, strawberries, tomatoes, hops, etc.)
  • Phytophthora infestans (late blight with blight, brown rot in tomatoes etc.), Microdochium nivale (formerly Fusarium nivale; snow mold on rye and wheat), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (ear rot on wheat), Fusarium oxysporum (fusarium wilt on tomato), Blumeria graminis (powdery mildew on barley (f. Sp. Hordei) and wheat (f. Sp. Tritici)), Magnaporthe.
  • grisea rice blast disease
  • Sclerotinia sclerotium white stalk, rape cancer
  • Septoria nodorum and Septoria tritici tac brown on wheat
  • Alternaria brassicae black rapeseed on rapeseed, cabbage and cruciferous vegetables, among others
  • Phoma lingam denying sickness, black legs or cabbage; root throat
  • the following pathogenic bacteria are very particularly preferred: Corynebacterium sepedonicum (ring rot on potatoes), Erwinia carotovora (black legs on potatoes), Erwinia amylovora (fire blight on pear, apple, quince), Streptomyces scabies (potato scab), Pseudomonas syringae pv. tabaci (wildfire on tobacco), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (fat blotch on bush bean), Pseudomonas syringae pv. tomato ("bacterial speck” on tomato), Xanthomonas campestris pv. malvacearum (leaf blotch on cotton) and Xanthomonas campestris pv. oryzae (bacterial rot on rice and others
  • “Viral pathogens” includes all plant viruses such as tobacco or or cucumber mosaic virus, ring spot virus, necrosis virus, maize dwarf mosaic virus etc.
  • Table 4 named pathogens and the diseases associated with them.
  • Insects such as beetles, caterpillars, lice or mites may be mentioned as examples, but not by way of limitation. Insects of the genera Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera are preferred. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc.
  • Coleoptera and Lepidoptera insects such as the European corn borer (European Corn Borer (ECB)), Diabrotica barberi (“northern corn rootworm”), Diabrotica undecim-punctata (“ southern corn rootworm “), Diabrotica virgifera (“ Western corn “rootworm”), Agrotis " ipsilon (“ black cutworm “), Crymodes devastator (“ glassy cutworm “), Feltia prisens (“ dingy cutworm “), Agrotis gladiaria (“ claybacked cutworm “), Melanotus spp., Aeolus mellillus (“ wireworm “), Aeolus mancus (“ wheat wireworm “), Horistonotus uhlerii (“ sand wireworm “), Sphenophorus maidis (“ maize billbug “), Sphenophorus zeae (“ timothy billbug “), Sphenophorus parvulus (“ bluegrass billbug “), Sphenophorus callosus (“ southern corn bill
  • EBC
  • aphids such as oat aphid Rhopalosiphum padi, large cereal aphid Sitobion avenae.
  • Globodera rostochiensis and G. pallida (cysts on potatoes, tomatoes and nightshade plants), Heterodera schachtii (beet cysts on sugar and fodder beet, oilseed rape, cabbage, etc.), Heterodera avenae (oat cysts on oats and other cereals), dityi gel (densei gel) or cane, beet's head on rye, oats, maize, clover, tobacco, beet), Anguina tritici (wheat beet, radiosis on wheat (spelled, rye), Meloidogyne hapla (beetroot on carrot, cucumber, lettuce,. tomato, potato, sugar beet, Alfalfa).
  • fungi or virus pathogens preferred for the individual varieties are:
  • Fungal, bacterial and viral pathogens Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem rust), blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. hordei (Barley Powdery Mildew), barley yellow dwarf virus (BYDV), Pathogenic insects / nematodes: Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm), - Schizaphis graminum (greenbug); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Acrosternum hilare (green stink bug); Euschistus servus (brown stink bug); Deliaplatura (seedcorn maggot); Mayetiola destructor (Hessian fly); Petrobia latens (brown wheat ite).
  • Fungal, bacterial or viral pathogens Phytophthora megas- per a fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var.
  • phaseoli Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, soybean mosaic virus, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus, Tobacco Streak virus, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphaniderm tum, Pythium ultimum, Pythium debaryotteda soltum, Tomato hematocytosis, Tomato hematocytosis.
  • Pseudoplusia includens (soybean looper); Anticarsia gemmatalis (Velvet Bean Caterpillar); Plathypena scabra (green cloverworm); Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Spodoptera exigua (beet armyworm); Heliothis virescens (cotton budworm), - Helicoverpa zea (cotton bollworm); Epilachna varivis (Mexican bean beetle); Myzus persicae (green peach aphid); Empoasca fabae (potato leaf hopper); Acrosternum hilare (green stink bug), - Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differential (differential grass-hopper); Hylemya platura (seedcorn maggot); Sericothrips varabilia
  • Fungi, bacterial or viral pathogens Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola,
  • Fungus, bacterial or viral pathogens Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregular, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma edicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p .v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.
  • Pathogenic insects / nematodes Pseudaletia unipunctata (army worm); Spodoptera, frugiperda (fall armyworm); Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer); Agrotis orthogonia (western cutworm); Elasmopalpus Zignosellus (lesser cornstalk borer); Oule a melanopus (cereal leaf beetle); Hypera punctata (clover leaf weevil); Diabrotica undecimpunctata howardi (southern corn rootworm), - Russian wheat aphid; Schizaphis graminum (greenbug); Macrosiphum avenae (English grain aphid); Melanoplus femurrübrum (redlegged grasshopper), - Melanoplus differentialis (differential grasshopper); melanogaster plus sanguinipes (migratory grasshopper); Mayetiola destructor (Hessian fly); Sitodiplosis
  • Fungi, bacterial or viral pathogens Plasmophora halste- dii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zi niae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macropho- minaeusyhephephephephepheyphephephephephephephephepheum, cochlear spine , Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum pv Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.
  • Pathogenic insects / nematodes Suleima helianthana (sunflowers bud moth); Homoeosoma electellum (sunflower moth); zygo-gramma exclamationis (sunflower beetle); Bothyrus gibbosus (carrot beetle); Neolasioptera murtfeldtiana (sunflower seed midge);
  • Fungal, bacterial or viral pathogens Fusarium moniliforme var. Subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium onili- forme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregul re, Pythium debarya- numol, Pythium graminensum, Pythium gr , Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium aphictadis, Phyticdisum Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis,
  • Pathogenic insects / nematodes Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Helicoverpa zea (corn earworm); Spodoptera frugiperda. (fall armyworm); Dia- traea grandiosella (southwestern corn borer); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer); Diatraea saccharalis (surgarcane borer); Diabrotica virgifera (western corn rootworm); Diabrotica longicornis barberi (northern com rootworm); Diabrotica undecimpunctata howardi (southern co rootworm); Melanotus spp.
  • Ostrinia nubilalis European corn borer
  • Agrotis ipsilon black cutworm
  • Helicoverpa zea corn earworm
  • Spodoptera frugiperda. fall armyworm
  • Dia- traea grandiosella
  • Fungi, bacterial or viral pathogens Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae pv syringae, Xanthomonas campestris Pv holomonolumropina, Macon, pom holomolomropina, and Perconia circinata, Fusarium onilifonne, alternate Alternaria, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans) Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporis
  • Pathogenic insects / nematodes Chilo partellus (Sorghum borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (com ear-worm); Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer); Feltia subterranea (granulate cutworm); Phllophaga crinita (white grub); Eleodes, Conoderus and Aeolus spp.
  • Pathogenic insects / nematodes Heliothis virescens (cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollwor); Spodoptera ex-igua (beet armyworm); Pectinophora gossypiella (pink bollworm); ⁇ nthonomus grandis grandis (boll weevil); Aphis gossypii (cotton aphid); Pseudatomoscelis seriatus ( ⁇ otton flea-hopper); Trialeurodes abutilonea (bandedwinged whitefly); Lygus lineolaris (tarnished plant bug); Melanoplus fe ur-rubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differential (differential grasshopper); Thrips tabaci (onion thrips); Franklinkiella fusca (tobacco thrips); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite); Tetranychus
  • Pathogenic insects / nematodes Diatraea saccharalis (sugar-cane borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (corn earworm); Colaspis brunnea (grape colaspis); Lissorhoptrus oryzophilus (rice water weevil); Sitophilus oryzae (rice weevil); Nephotettix nigropictus (rice leafhopper); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug), - Acroster num hilare (green stink bug);
  • Pathogenic insects / nematodes Brevicoryne brassicae (cabbage aphid); Phyilotreta crucif erae (Flea beetle); Mamestra conjgurata (Bertha armyworm); Plutella xylostella (Diamondback moth); Delia ssp. (Root maggots).
  • RhB protein means the RacB protein from barley according to SEQ ID NO: 2, and its homologues from rice (Oryza sative) according to SEQ ID NO: 4 and maize (Zea mays) according to SEQ ID NO: 6 as well as functional equivalents of the aforementioned.
  • Amount of protein means the amount of a RacB polypeptide in an organism, a tissue, a cell or a cell compartment. "Decreasing" the amount of protein means reducing the amount of a RacB protein in an organism, a tissue, a cell or a cell compartment
  • the reduction is at least 10%, preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably by at least 40% or 60%, very particularly preferably by at least 70% or 80%, most preferably by at least 90% or 95%.
  • Activity preferably means the GTPase activity of a RacB polypeptide in an organism, a tissue, a cell or a cell compartment.”
  • Reduction “of the activity means the reduction in the total activity of a RacB protein in an organism, a tissue , a cell or a cell compartment
  • the reduction is at least 10%, preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably by at least 40% or 60%, very particularly preferably by at least 70% or 80%, most preferably by at least 90% or 95%.
  • “Function” preferably means the substrate binding capacity of a RacB polypeptide in an organism, a tissue, a cell or a cell compartment. Low-molecular compounds such as GTP but also the protein interaction partners of a RacB protein can be considered as substrates.
  • Reduction of the function means, for example, the quantitative reduction in the binding capacity or binding strength of a RacB protein to at least one substrate in an organism, a tissue, a cell or a cell compartment - for example by one of those described below Method - compared to the wild type of the same genus and species to which this method was not applied, under otherwise the same general conditions (such as culture conditions, age of the plants, etc.) Reduction is also to be understood as the change in the substrate specificity, as can be expressed, for example, by the kcat / km value.
  • the reduction is at least 10%, preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably by at least 40% or 60%, very particularly preferably by at least 70% or 80%, most preferably by at least 90% or 95%.
  • Binding partners for RacB can be identified, for example, by the yeast-2 hybrid system in the manner familiar to the person skilled in the art.
  • “Functional equivalents" of a RacB protein preferably means those sequences which are derived from a RacB protein described by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 or are homologous to it and have essentially the same properties.
  • Essentially the same properties of a functional equivalent means above all the conferment of a pathogen-resistant phenotype or the conferral or increase of the pathogen resistance to at least one pathogen when the amount of protein, activity or function of the functional RacB equivalent in a plant or in one is reduced Tissue, part or cells of the same. Furthermore, the absence of spontaneously-induced cell death with said reduction in the amount of protein, activity or function of the functional equivalent is to be understood as an essential property.
  • the efficiency of the pathogen resistance can vary both downwards and upwards compared to a value obtained when one of the RacB proteins according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 is reduced.
  • Preferred functional equivalents are those in which the efficiency of the pathogen resistance - measured, for example, based on the penetration efficiency of a pathogen (formation of housorium) - is not more than 50%, preferably 25%, particularly preferably 10%, of a comparative value obtained with the reduction of a RacB protein according to NO: 2, 4 or 6.
  • Those sequences are particularly preferred which, when reduced, reduce the efficiency of the pathogen resistance quantitatively. tatively by more than 50%, preferably 100%, particularly preferably 500%, very particularly preferably 1000%, a comparison value is obtained when one of the RacB proteins according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 is reduced.
  • Analog conditions means that all framework conditions such as, for example, culture or breeding conditions, assay conditions (such as buffer, temperature, substrates, pathogen concentration etc.) are kept identical between the experiments to be compared and the approaches are determined solely by the sequence of those to be compared Differentiate RacB polypeptides, their organism of origin and, where appropriate, the pathogen. When choosing the pathogen, the pathogen that comes closest to the other - taking into account the species specificity - must be selected for the comparison.
  • “Functional equivalents” means in particular natural or artificial mutations of the RacB polypeptides according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 and homologous polypeptides from other plants which still have essentially the same properties. Homologous polypeptides from preferred plants described above are preferred.
  • the sequences from other plants (for example Arabidopsis thaliana) which are homologous to the RacB sequences disclosed in the context of this invention can e.g. by database search or screening of gene banks - using the RacB sequences as a search sequence vzw. Probe - easy to find.
  • Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions, or insertions of one or more amino acid residues.
  • the present invention also includes those polypeptides which are obtained by modifying a polypeptide according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • Homology between two nucleic acid sequences is understood to mean the identity of the nucleic acid sequence over the entire entire length of the sequence, which can be determined by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff) using the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • a sequence which has a homology of at least 80% on a nucleic acid basis with the sequence SEQ ID NO: 1 is understood to mean a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 1 according to the above program algorithm with the above parameter set Has at least 80% homology.
  • GAP WorldNetwork Protocol
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • a sequence which has a homology of at least 80% on a protein basis with the sequence SEQ ID NO: 2 is understood to mean a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above parameter set, has a homology of has at least 80%.
  • Functional equivalents derived from one of the polypeptides according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 by substitution, insertion or deletion, have a homology of at least 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, very particularly preferably at least 98% of one of the polypeptides according to the invention according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 and are distinguished by essentially the same properties as the polypeptide according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • Functional equivalents derived from the nucleic acid sequence according to the invention according to SEQ ID NO: 1, 3 or 5 by substitution, insertion or deletion, have a homology of at least 60%, preferably 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, very particularly preferably at least 98% of one of the polypeptides according to the invention according to SEQ ID NO: 1, 3 or 5 and code for polypeptides with essentially the same properties as the polypeptide according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • the racB proteins included as functional equivalents preferably have at least one of the following sequence motifs: a) A Gl element GXXXXGKS / T preferably in the N-terminal region.
  • An element with the sequence GDGAVGKT is very particularly preferred, most preferably an element with the sequence KCVTVGDGAVGKTC.
  • TKXD particularly preferably TKLD, very particularly preferably LVGTKLDLRDDKQ
  • CXXX A C-terminal isoprenylation motif (CXXX, Hassanain HH et al. (2000) Biochem Biophys Res Com un. 272 (3): 783-8.), particularly preferably CSIL.
  • motifs (a to f) occur in a functionally equivalent RacB protein, very particularly preferably at least 4 or 5, most preferably all motifs a to f.
  • the person skilled in the art can easily derive further RacB-typical sequence motifs, in particular also motifs for differentiation from Racl proteins, from the sequence comparison of the known RacB (or Ra ⁇ 1) proteins, as shown in FIG. 1.
  • Examples of the functional equivalents to the RacB proteins according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 to be reduced in the process according to the invention can be obtained, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, for example from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum , Solanum tuberosum, Helianthinum, by comparing homology from databases.
  • probes derived from the nucleic acid sequences according to SEQ ID NO: 1, 3 or 5 have a length of at least 20 bp, preferably at least 50 bp, particularly preferably at least 100 bp, very particularly preferably at least 200 bp, most preferably at least 400 bp.
  • a DNA strand complementary to the sequences described under SEQ ID NO: 1, 3 or 5 can also be used for screening the libraries.
  • Functional equivalents accordingly comprise DNA sequences which hybridize under standard conditions with the RacB nucleic acid sequence described by SEQ ID NO: 1, 3 or 5, the nucleic acid sequence complementary to it or parts thereof, and code as complete sequences for proteins which have the same properties as have the proteins described under SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • Standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, in Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. describe.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C. ) (20X SSC: 0.3M sodium citrate, 3M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can also be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Hybridization conditions can be selected from the following conditions, for example.
  • Ficoll 0.1% polyvinylpyrrolidone, 50 M sodium phosphate buffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM sodium current at 42 ° C, or
  • Washing steps can be selected, for example, from the following conditions:
  • Functional equivalents derived from a polypeptide according to SEQ ID NO: 2, 4 or 6 in particular also include the proteins with SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58 , 60, 62, 64, 66, 68 or 70.
  • functional equivalents mean proteins which are separated by a nucleic acid sequence with SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53 , 55, 57, 61, 63, 65, 67 or 69 can be encoded.
  • the reduction in the expression of a RacB protein, the RacB activity or the RacB function can be achieved in a variety of ways.
  • Reduction or “decrease” is to be interpreted broadly in connection with a RacB protein, a RacB activity or RacB function and comprises the partial or essentially complete blocking or blocking of the functionality of a RacB protein in a plant based on different cell biological mechanisms or a part, tissue, organ, cells or semen derived therefrom.
  • a reduction in the sense of the invention also includes a quantitative reduction of a RacB protein up to an essentially complete absence of the RacB protein (i.e. lack of detectability of RacB activity or RacB function or lack of immunological detectability of the RacB protein).
  • the expression of a specific RacB protein or the RacB activity or RacB function in a cell or an organism is preferably reduced by more than 50%, particularly preferably by more than 80%, very particularly preferably by more than 90%.
  • a reduction in the RacB activity or the RacB function is preferably achieved by a reduced expression of an endogenous RacB protein.
  • a reduction in the amount of Ra ⁇ B protein, RacB activity or RacB function can be achieved using the following methods:
  • RhB-dsRNA a double-stranded RacB RNA nucleic acid sequence
  • a RacB antisense nucleic acid sequence or an expression cassette ensuring its expression.
  • Such procedures are included in which the antisense nucleic acid sequence against a RacB gene (ie genomic DNA sequences) or a RacB gene transcript (ie RNA sequences) is directed.
  • ⁇ -Anomeric nucleic acid sequences are also included.
  • double-stranded RNA interference double-stranded RNA interference
  • dsRNAi double-stranded RNA interference
  • Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364.
  • the procedures and methods described in the quotations are expressly referred to.
  • Efficient gene suppression can also be shown in the case of transient expression or after transient transformation, for example as a result of a biolistic transformation * (Schweizer -P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903).
  • dsRNAi methods are based on the phenomenon that the simultaneous introduction of complementary strand and counter strand of a gene transcript causes a highly efficient suppression of the expression of the corresponding gene. The phenotype caused is very similar to that of a corresponding knock-out mutant (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95: 13959-64).
  • dsRNAi has proven to be particularly efficient and advantageous in reducing RacB expression. Like i.a. described in WO 99/32619, dsRNAi approaches are clearly superior to classic antisense approaches.
  • Another object of the invention therefore relates to double-stranded RNA molecules (dsRNA molecules) which, when introduced into a plant (or a cell, tissue, organ or seed derived therefrom), reduce RacB.
  • dsRNA molecules double-stranded RNA molecules
  • one of the two RNA strands is essentially identical to at least part of a RacB nucleic acid sequence
  • the other RNA strand is essentially identical to at least part of the complementary strand of a RacB nucleic acid sequence.
  • the double-stranded RNA molecule comprises for reducing the expression of a RacB protein
  • RNA strand comprising at least one ribonucleotide sequence which is essentially identical to at least part of the “sense” RNA transcript of a nucleic acid sequence coding for a RacB protein
  • RNA strand which is essentially — preferably completely — complementary to the RNA sense strand under a).
  • RacB nucleic acid sequence preferably means a sequence according to SEQ ID NO:
  • the dsRNA sequence can also have insertions, deletions and individual point mutations in comparison to the RacB target sequence or a functionally equivalent target sequence and nevertheless bring about an efficient reduction in expression.
  • the homology according to the above definition is preferably at least 75 %, preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90%, most preferably 100% between the “sense” strand of an inhibitory dsRNA and at least part of the “sense” RNA transcript of a nucleic acid sequence coding for a RacB protein or a functional equivalent thereof (or between the "antisense” strand the complementary strand of a nucleic acid sequence coding for a RacB protein or a functional equivalent thereof).
  • the length of the section is at least 10 bases, preferably at least 25 bases, particularly preferably at least 50 bases, very particularly preferably at least 100 bases, most preferably at least 200 bases or at least 300 bases.
  • an "essentially identical" dsRNA can also be defined as a nucleic acid sequence which is capable of hybridizing with part of a storage protein gene transcript (for example in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA at 50 ° C or 70 C C for 12 to 16 h).
  • “Essentially complementary” means that the “antisense” RNA strand can also have insertions, deletions and individual point mutations in comparison to the complement of the “sense” RNA strand.
  • the homology is preferably at least 80%, preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, most preferably 100% between the "antisense" RNA strand and the complement of the "sense” RNA strand.
  • Part of the sense "RNA transcript" of a nucleic acid sequence coding for a RacB protein or a functional equivalent thereof means fragments of an RNA or mRNA transcribed from a nucleic acid sequence coding for a RacB protein or a functional equivalent of the same from a RacB gene.
  • the fragments preferably have a sequence length of at least 20 bases, preferably at least 50 bases, particularly preferably at least 100 bases, very particularly preferably at least 200 bases, most preferably at least 500 bases.
  • the complete transcribed RNA or mRNA is also included.
  • dsRNA molecules according to the invention in the methods according to the invention for generating pathogen resistance in plants.
  • the dsRNA can consist of one or more strands of polymerized ribonucleotides.
  • modifications of both the sugar-phosphate structure and the nucleosides For example, the phosphodiester bonds of natural RNA can be modified to include at least one nitrogen or sulfur heteroatom.
  • Bases can be modified such that the activity is restricted by adenosine deaminase, for example. Such and other modifications are described below in the methods for stabilizing antisense RNA.
  • dsRNA molecules each comprising one of the ribonucleotide sequence sections defined above, can also be introduced into the cell or the organism.
  • the dsRNA can be produced enzymatically or in whole or in part chemically and synthetically.
  • the double-stranded dsRNA structure can be formed from two complementary, separate RNA strands or - preferably - from a single, self-complementary RNA strand.
  • “sense” and “antisense” sequences can be linked by a connecting sequence (“linker”) and, for example, form a hairpin structure.
  • the connecting sequence can preferably be an intron which is spliced out after synthesis of the dsRNA.
  • the nucleic acid sequence coding for a dsRNA can contain further elements, such as, for example, transcription termination signals or polyadenylation signals.
  • the two strands of the dsRNA are to be brought together in a cell or plant, this can be done in different ways:
  • the formation of the RNA duplex can be initiated either outside the cell or inside the cell.
  • the dsRNA can also comprise a hairpin structure in that the "sense" and “antisense” strand are connected by a "linker” (for example an intron).
  • linker for example an intron.
  • the self-complementary dsRNA structures are preferred because they only require the expression of a construct and the complementary strands always comprise an equimolar ratio.
  • the expression cassettes coding for the “antisense” or “sense” strand of a dsRNA or for the self-complementary strand of the dsRNA are preferably inserted into a vector and are stable in the genome using the methods described below (for example using selection markers) inserted into a plant to ensure permanent expression of the dsRNA.
  • the dsRNA can be introduced using an amount that allows at least one copy per cell. Higher quantities (e.g. at least 5, 10, 100, 500 or 1000 copies per cell) can possibly result in an efficient reduction.
  • a 100% sequence identity between dsRNA and a RacB gene transcript or the gene transcript of a functionally equivalent gene is not absolutely necessary in order to bring about an efficient reduction in RacB expression.
  • the method is tolerant of sequence deviations, such as those which may arise as a result of genetic mutations, poly orphisms or evolutionary divergences. For example, it is possible to suppress RacB expression in another organism using the dsRNA that was generated from the RacB sequence of one organism.
  • the high sequence homology between the RacB sequences from rice, maize and barley suggests a high degree of conservation of this protein within plants, so that the expression of a dsRNA derived from one of the disclosed RacB sequences according to SEQ ID NO: 1, 3 or 5 also one should have an advantageous effect in other plant species.
  • the dsRNA preferably comprises the sequence region of RacB gene transcripts which correspond to conserved regions. Said conserved areas can easily be derived from sequence comparisons.
  • the dsRNA can be synthesized either in vivo or in vitro.
  • a DNA sequence coding for a dsRNA can be placed in an expression cassette under the control of at least one genetic control element (such as promoter, enhancer, silencer, splice donor or acceptor, polyadenylation signal).
  • at least one genetic control element such as promoter, enhancer, silencer, splice donor or acceptor, polyadenylation signal.
  • a dsRNA can be synthesized chemically or enzymatically.
  • Cellular RNA polymerases or bacteriophage RNA polymerases (such as T3, T7 or SP6 RNA polymerase) can be used for this.
  • Corresponding methods for in vitro expression of RNA are described (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693).
  • a chemically or enzymatically synthesized in vitro dsRNA can be completely or partially purified from the reaction mixture, for example by extraction, precipitation, electrophoresis, chromatography or combinations of these methods, before being introduced into a cell, tissue or organism.
  • the dsRNA can be introduced directly into the cell or it can also be applied extracellularly (e.g. in the interstitial space).
  • the plant is preferably transformed stably with an expression construct which realizes the expression of the dsRNA. Corresponding methods are described below.
  • the antisense nucleic acid olekül hybridizes or binds with the cellular mRNA and / or genomic DNA coding for the RacB target protein to be suppressed. This suppresses the transcription and / or translation of the target protein. Hybridization can occur in a conventional manner via the formation of a stable duplex or - in the case of genomic DNA - by binding of the antisense nucleic acid molecule with the duplex of the genomic DNA through specific interaction in the major groove of the DNA helix.
  • An antisense nucleic acid sequence suitable for reducing a RacB protein can be used using the nucleic acid sequence coding for this protein, for example the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or the nucleic acid sequence coding for a functional equivalent thereof, for example a sequence according to SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 or 69, derived from Watson and Crick's base pair rules.
  • the antisense nucleic acid sequence can be complementary to the entire transcribed mRNA of the said protein, limited to the coding region or consist only of an oligonucleotide which is complementary to a part of the coding or non-coding sequence of the mRNA.
  • the oligonucleotide can be complementary to the region that comprises the translation start for said protein.
  • Antisense nucleic acid sequences can have a length of, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides, but can also be longer and at least 100, 200, 500, 1000, 2000 or Include 5000 nucleotides.
  • Antisense nucleic acid sequences can be expressed recombinantly " or chemically or " .
  • nucleic acid sequence can be synthesized enzymatically using methods known to those skilled in the art. Natural or modified nucleotides can be used in chemical synthesis. Modified nucleotides can give the antisense nucleic acid sequence increased biochemical stability and lead to increased physical stability of the duplex formed from the antisense nucleic acid sequence and sense target sequence.
  • phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides such as 5-fluorouracil, 5-bromo-uracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) racil, 5-carboxymethylaminomethyl- 2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyl uracil, dihydrouracil, ⁇ -D-galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, ' 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine,
  • a RacB protein in a further preferred embodiment, can be inhibited by nucleotide sequences which are complementary to the regulatory region of a RacB gene (for example a RacB promoter and / or enhancer) and which form triple-helical structures with the DNA double helix there , so that the transcription of the RacB gene is reduced.
  • Appropriate procedures are (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6 (6) -.569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sei 660: 27-36; Mower LJ (1992) Bioassays 14 (12): 807 -815).
  • the antisense nucleic acid molecule can be an ⁇ -anomeric nucleic acid.
  • Such ⁇ -anomeric nucleic acid molecules form specific double-stranded hybrids with complementary RNA in which - in contrast to the conventional ⁇ -nucleic acids - the two strands run parallel to one another (Gautier C et al.
  • Nucleic acid molecules can also include 2'-O-methyl ribonucleotides (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6131-6148) or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327- 330).
  • RNA molecules or ribozymes can be adapted to any target RNA and cleave the phosphodiester framework at specific positions, whereby the target RNA is functionally deactivated (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 5 23 (3): 257-275 ). This does not modify the ribozyme itself, but is able to cleave further target RNA molecules analogously, which gives it the properties of an enzyme.
  • the incorporation of ribozyme sequences into "antisense” RNAs gives these "antisense” RNAs this enzyme-like, 0-RNA-cleaving property and thus increases their efficiency in inactivating the target RNA.
  • the production and use of corresponding ribozyme “antisense” RNA molecules is described, for example, by Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591. 5
  • ribozymes e.g. "Hammerhead” ribozymes; Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591
  • Ribozyme technology can increase the efficiency of an antisense strategy.
  • Methods for expressing ribozymes to reduce certain proteins are described in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). Ribozyme expression 5 is also described in plant cells (Steinecke P et al. (1992) EMBO
  • Suitable target sequences and ribozymes can for example as described in "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), pp. 449-460", by secondary structure calculations of ribozyme and target RNA and by their interaction are determined (Bayley CC et al. (1992) Plant
  • Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed which have regions complementary to the mRNA of the RacB protein to be suppressed (see also US Pat. No. 4,987,071 and US Pat. No. 5,116,742).
  • ribozymes can also be identified via a selection process from a library of diverse ribozymes (Bartel D and Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).
  • RNA with homology to an endogenous gene can reduce or switch off the expression of the same, similar to that described for antisense approaches (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31 (5): 957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-99).
  • the introduced construct can represent the homologous gene to be reduced in whole or in part.
  • the possibility of translation is not necessary.
  • the application of this technology to plants is described, for example, by Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 and in US 5,034,323.
  • the cosuppression is preferably implemented using a sequence which is essentially identical to at least part of the nucleic acid sequence coding for a RacB protein or a functional equivalent thereof, for example the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or the nucleic acid sequence coding for a functional equivalent thereof, for example a sequence according to SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 or 69 , e) Introduction of nucleic acid sequences coding for a dominant-negative RacB protein
  • the function or activity of a RacB protein can also be effectively achieved by expressing a dominant-negative variant of this RacB protein.
  • Methods for reducing the function or activity of a protein by means of co-expression of its dominant-negative form are known to the person skilled in the art (Lagna G and Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36: 75-98; Perlmutter RM and Alberola-Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8 (2): 285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11 (1): 1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329 (6136): 219-22).
  • a dominant-negative RacB variant can be realized, for example, by changing the amino acid threonine at position 20 in the RacB proteins from maize, rice or barley in preferably aspartic acid.
  • Threonine at position 20 in RacB from maize, rice or barley) in RacB homologues from other species can be determined, for example, by means of computer-aided comparison ("alignment").
  • These mutations to achieve a dominant-negative RacB variant are preferably carried out at the level of the nucleic acid sequence coding for RacB proteins.
  • a corresponding mutation can be implemented, for example, by PCR-mediated in vitro mutagenesis using appropriate oligonucleotide primers through which the desired mutation is introduced. Methods familiar to the person skilled in the art are used for this. For example, the "LA PCR in vitro mutagenesis kit" (Takara Shuzo, Kyoto) can be used for this purpose.
  • a method for producing a dominant-negative variant of the RacB protein from corn is also described in WO 00/15815 (Example 4, p. 69).
  • the dominant-negative variants of the RacB proteins from barley, rice or maize described under SEQ ID NO: 7, 8 and 9 are particularly preferred.
  • RhB gene expression can also be reduced with specific DNA-binding factors, for example with factors of the type of zinc finger transcription factors.
  • This Factors attach to the genomic sequence of the endogenous target gene, preferably in the regulatory areas, and bring about repression of the endogenous gene.
  • the use of such a method enables the expression of an endogenous RacB gene to be reduced without the sequence thereof having to be genetically manipulated. Appropriate processes for the production of such factors are described (Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276 (31): 29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303 (4): 489-502; Beerli RR et al.
  • RhoB RhoB Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arginine Arg, ArgucA, the gene of which is not present in the gene bank, by screening a genomic library for corresponding genomic clones. The processes required for this are familiar to the person skilled in the art.
  • proteins can be introduced into a cell that inhibit the RacB target protein itself.
  • the protein-binding factors can be, for example, aptamers (Faulok M and Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243: 123-36) or antibodies or antibody fragments or single-chain antibodies. The extraction of these factors is described and known to the person skilled in the art.
  • a cytoplasmic scFv antibody was used to modulate the activity of the phytochrome A protein in genetically modified tobacco plants (Owen M et al. (1992) Biotechnology (NY) 10 (7): 790-794; Franken E et al.
  • oligomers consist of the building blocks 3- (dimethylamino) propylamine, N-methyl-3-hydroxypyrrole, N-methylimidazole and N-methylpyrrole and can be adapted to each piece of double-stranded DNA in such a way that they bind sequence-specifically into the large furrow and block the expression of the genetic sequences there.
  • Appropriate methods have been described (see, inter alia, Bremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9 (8): 2093-103; Ansari AZ et al. (2001) Chem Biol. 8 (6).-583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol.
  • RhB expression can also be effectively achieved by induction of specific RacB RNA degradation by the plant using a viral expression system (Amplikon) (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20 (3): 357-362).
  • VGS viral induced gene silencing
  • a nucleic acid construct which contains at least part of an endogenous RacB gene which changes by deletion, addition or substitution of at least one nucleotide is, so that the functionality is reduced or completely canceled.
  • the change can also be the regulatory one
  • Affect elements e.g. the promoter
  • expression transcription and / or translation
  • the changed region at its 5 'and 3' ends is flanked by further nucleic acid sequences, which must be of sufficient length to enable the recombination.
  • the length is usually in the range from several hundred bases to several kilobases (Thomas KR and Capecchi MR (1987) Cell 51: 503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (8): 4368- 4373).
  • the host organism - for example a plant - is transformed with the recombination construct using the methods described below and successfully recombined clones are selected using, for example, antibiotic or herbicide resistance.
  • Homologous recombination is a relatively rare event in higher eukaryotes, especially in plants. Random integrations into the host genome predominate.
  • One way of removing the randomly integrated sequences and thus enriching cell clones with a correct homologous recombination is to use a sequence-specific recombination system as described in US Pat. No. 6,110,736, by means of which unspecifically integrated sequences can be deleted again, which makes the selection successful via homologues
  • sequence-specific recombination systems can be used, for example the Cre / lox system of Bacteriophagen Pl, the FLP / FRT system of yeast, the gin recombinase of Mu Phage, the pin recombinase from E. coli and the R / RS system of called pSRI plasmids.
  • the bacteriophage Pl Cre / lox and the yeast FLP / FRT system are preferred.
  • the FLP / FRT and cre / lox recombinase system has already been used in plant systems (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378)
  • Point mutations can also be generated using DNA-RNA hybrids, which are also known as "chimeraplasty” (Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27 (5): 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3) -.240-247).
  • PTGS post-transcriptional gene silencing
  • PTGS methods as well as the reduction in RacB function or activity with dominant-negative RacB variants are particularly advantageous because the requirements for homology between the endogenous gene to be suppressed and the transgenically expressed sense or dsRNA nucleic acid sequence (or between the endogenous gene and its dominant-negative variant) are lower than, for example, with a classic antisense approach.
  • Corresponding homology criteria are mentioned in the description of the dsRNAI method and are generally applicable for PTGS methods or dominant-negative approaches.
  • RhB proteins Due to the high homology between the RacB proteins from maize, rice and barley, a high degree of conservation of this protein in plants can be concluded. Using the RacB nucleic acid sequences from barley, maize or rice, one can probably also effectively suppress the expression of homologous RacB proteins in other species without the isolation and structural elucidation of the RacB homologues occurring there being absolutely necessary. This greatly eases the workload. Similarly, it is likely that the dominant-negative variants of a RacB protein from rice, maize or barley can effectively reduce or suppress the function / activity of its homolog in other plant species.
  • anti-RacB All substances and compounds which, directly or indirectly, reduce the amount of protein, amount of RNA, gene activity or protein activity of a RacB protein are consequently combined under the name "anti-RacB” compounds.
  • anti-RacB compound explicitly includes the in the nucleic acid sequences, peptides, proteins or other factors used in the methods described above.
  • introduction encompasses all processes which are suitable for introducing or generating an “anti-RacB” compound, directly or indirectly, into a plant or a cell, compartment, tissue, organ or seed thereof. Direct and indirect procedures are included. The introduction can lead to a temporary (transient) presence of an “anti-RacB” compound (for example a dsRNA) or else to a permanent (stable) one.
  • an “anti-RacB” compound for example a dsRNA
  • the "anti-RacB” compound can perform its function directly (for example by insertion into an endogenous RacB gene).
  • the function can also be exercised indirectly after transcription into an RNA (for example in the case of antisense approaches) or after transcription and translation in a protein (for example in the case of binding factors). Both direct and indirect "anti-RacB" compounds are included in the invention.
  • Introducing includes, for example, methods such as transfection, transduction or transformation.
  • Anti-RacB compounds thus also include, for example, recombinant expression constructs which express (ie transcription and possibly translation), for example, a RacB-dsRNA or a RacB "antisense” RNA - preferably in a plant or part, tissue, organ or Seeds of the same - condition.
  • nucleic acid molecule whose expression (transcription and possibly translation) generates an "anti-RacB" compound, preferably in functional linkage with at least one genetic control element (for example a promoter) which expresses in an organism, preferably in Plants, guaranteed.
  • a genetic control element for example a promoter
  • plant-specific genetic control elements for example promoters
  • the "anti-RacB” compound can also be generated in other organisms or in vitro and then introduced into the plant (as described in Examples 6 and 7). In this are all prokaryotic or eukaryotic genetic controls (For example promoters) preferred, which allow expression in the organism chosen for the production.
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of a promoter with the nucleic acid sequence to be expressed (for example an “anti-RacB” compound) and possibly other regulatory elements such as a terminator such that each of the regulatory elements can perform its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as enhancer sequences, can their function from more remote positions or even from other DNA molecules "made to" the
  • the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind the sequence which acts as a promoter, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • sequences can also be positioned between the two sequences, which for example have the function of a linker with certain restriction enzyme interfaces or a signal peptide.
  • the insertion of sequences can also lead to the expression of fusion proteins.
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • an expression cassette is, however, also to be understood as such constructions in which a promoter is placed behind an endogenous RacB gene, for example by means of a homologous recombination, and the expression of an antisense RacB RNA causes the reduction of a RacB protein according to the invention
  • an "anti-RacB" compound for example a nucleic acid sequence coding for a RacB dsRNA or a RacB antisense RNA
  • Both approaches lead to expression cassettes in the sense of the invention.
  • Plant-specific promoters basically means any promoter that can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants or plant parts, cells, tissues or cultures.
  • the expression can be, for example, constitutive, inducible or development-dependent.
  • “Constitutive” promoter means those 5 promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a relatively long period of plant development, preferably at all times during plant development.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is preferably used in particular. Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of the CaMV cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288; Gardner et al.
  • the constitutive promoter is the promoter of the nitrilase-1 (nitl) gene from A. thaliana (GenBank Acc. No.: Y07648.2, nucleotides 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170: 197-200 ).
  • promoters with specificities for the anthers, ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds.
  • Seed-specific promoters such as, for example, the promoter of phaseoline (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), of the 2S albuming gene (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), the legumin (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331), the USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 (3): 459-67), the Napin gene (US 5,608,152; Stalberg K et al.
  • seed-specific promoters are those of the genes coding for "high molecular weight glutenin” (HMWG), gliadin, branching enzyme, ADP glucose pyrophosphatase (AGPase) or starch synthase. Also preferred are promoters which allow seed-specific expression in monocots such as corn, barley, wheat, rye, rice etc.
  • HMWG high molecular weight glutenin
  • AGPase ADP glucose pyrophosphatase
  • starch synthase starch synthase.
  • promoters which allow seed-specific expression in monocots such as corn, barley, wheat, rye, rice etc.
  • the promoter of the lpt2 or Iptl gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzine gene, etc.) can be used advantageously Prolamin gene, the gliadin gene, the glutelin gene, the zein gene, the kasirin gene or the secalin gene).
  • Tuber-, storage root- or root-specific promoters such as the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato.
  • Leaf-specific promoters such as the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) from Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
  • Epidermis-specific promoters are very particularly preferred, such as the promoter of the OXLP gene (“oxalate oxidase like protein”; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36: 101-112).
  • Flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593).
  • Anther-specific promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the glob-1 promoter and the ⁇ -zein promoter.
  • the expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter (review article: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time ,
  • a chemically inducible promoter e.g. the PRP1 promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), promoter inducible by salicylic acid (WO 95/19443), a promoter inducible by benzenesulfonamide (EP 0 388 186), one by tetracycline - Inducible promoter (Gatz et al.
  • promoters are preferred which are induced by biotic or abiotic stress, such as the pathogen-inducible promoter of the PRPl gene (or gstl promoter), for example from potatoes (WO 96/28561; Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato (US 5,187,267), the cold-inducing alpha-amylase promoter from the potato (WO 96/12814), the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinll Promoter (EP-A 0 375 091).
  • the pathogen-inducible promoter of the PRPl gene or gstl promoter
  • pathogen-inducible promoters include the flax Fisl promoter (WO 96/34949), the Vstl promoter (Schubert et al. (1997) Plant Mol Biol 34: 417-426) and the EAS4 sesquiterpene cyclase promoter Tobacco (US 6,100,451).
  • Pathogen-inducible promoters include those of genes induced by pathogen attack such as genes from PR proteins, SAR proteins, ⁇ -1, 3-glucanase, chitinase etc. (e.g. Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335 -342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al.
  • wound-inducible promoters such as that of the pinll gene (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), the wunl and wun2 genes (US 5,428,148), the winl and win2 genes (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), the Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), the WIPl gene (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), the MPI gene (Corderok et al. (1994) _ Plant J 6 ( 2): 141-150) and the like.
  • the PR gene family is a source of further pathogen-inducible promoters.
  • a number of elements in these promoters have proven to be advantageous.
  • region -364 to -288 mediates in the promoter of PR-2d salicylate specificity (Buchel et al. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504).
  • the sequence 5 '-TCATCTTCTT-3' appears repeatedly in the promoter of barley ß-1, 3-glucanase and in more than 30 other stress-induced genes. This region binds a nuclear protein in tobacco, the abundance of which is increased by salicylate.
  • the PR-1 promoters from tobacco and Arabidopsis are also suitable as pathogen-inducible promoters.
  • aPR5 aeidie PR-5"
  • aPR5 proteins accumulate in about 4 to 6 hours after pathogen attack and show only a very low background expression (WO 99/66057).
  • An approach to To achieve an increased pathogen-induced specificity is the production of synthetic promoters from combinations of known pathogen-responsive elements (Rushton et al. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057).
  • Other pathogen-inducible promoters of various types are known to the person skilled in the art (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684;
  • promoters are, for example, early-maturation-specific promoters, such as, for example, the fruit-maturation-specific promoter from tomato (WO 94/21794, EP 409 625).
  • Development-dependent promoters partly include the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues is naturally development-dependent.
  • Constitutive and leaf and / or stem-specific, pathogen-inducible and epidermis-specific promoters are particularly preferred, pathogen-inducible and epidermis-specific promoters being most preferred.
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • all promoters described above can be used as plant promoters.
  • nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors according to the invention can be functionally linked to further genetic control sequences in addition to a promoter.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention preferably comprise 5'-upstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically, the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower and 3 'downstream a terminator sequence as an additional genetic control sequence, and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
  • Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties.
  • tissue-specific expression can additionally depend on certain stress factors.
  • Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131 -17135) and heat stress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3 ): 246-53, 1989).
  • control sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes such as the actin-1 intron, or the Adhl-S introns 1, 2 and 6 (general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes.
  • An example of translation enhancers is the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
  • the expression cassette can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially contain T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium turne faciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J
  • Control sequences are also to be understood as those which have a homologous recombination or insertion into the genome of a
  • the natural promoter of a specific gene can be exchanged for a promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower.
  • Methods like cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B (1998) Methods. 1 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal using the cre recombinase.
  • An expression cassette and the vectors derived from it can contain further functional elements.
  • Selection markers which confer resistance to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc.
  • herbicides such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc.
  • Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides.
  • Examples include: DNA sequences that code for phosphinothricin acetyltransferases (PAT) and inactivate glutamine synthase inhibitors (bar and pat gene), 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes (EPSP synthase genes) that are resistant to Glyphosat® (N- (phosphon methyl) glycine), the gox gene coding for the glyphosate ® degrading enzymes (glyphosate oxidoreductase), the deh gene (coding for a dehalogenase that inactivates dalapon), sulfonylurea and imidazolinone inactivating acetolactate synthases and bxn genes for nodinitrilynilenzymes , the aasa gene conferring resistance to the antibiotic apectinomycin, the streptomycin phosphotransferase (SPT) gene conferring resistance to streptomycin, the
  • reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency or of the expression site or time.
  • Reporter proteins Schoenborn E, Groskrutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as the "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997). Proc Natl Acad Sei USA- 94 (6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12): 5888-5893; Tian et al.
  • GFP green fluorescence protein
  • ß-galactosidase encodes a protein that inhibits the production of anthocyanin pigments (red color) in plant tissue regulated and thus a direct analysis of the promoter activity without the addition of additional auxiliaries or chromogenic substrates glicht; Dellaporta et al .. In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988), ß-glucuronidase is particularly preferred (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
  • origins of replication which, for example, an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention
  • E.coli examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a selectable marker which gives the successfully recombined cells resistance to a biocide 5 (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • the selection marker permits the selection of the transformed cells from untransformed ones (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • an expression cassette according to the invention into an organism or cells, tissues, organs, parts or seeds thereof (preferably into plants or plant cells, tissues, organs, parts or seeds) can advantageously be carried out using
  • the expression cassette can be inserted into the vector (for example a plasmid) via a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is first introduced into E. coli. Become correctly transformed E. coli
  • 25 vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or even agrobacteria.
  • the expression cassette is introduced by means of plasmid vectors.
  • Preferred vectors are those which ensure stable integration of the expression cassette into the host genome
  • the production of a transformed organism requires that the corresponding DNA, RNA or protein is introduced into the corresponding host cell.
  • transformation or transduction or transfection
  • the DNA or RNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion.
  • Electroporation is another suitable method for Introduction of DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical impulse.
  • Appropriate methods are described (for example in Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; 5 Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111 -116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73, - Howell et al.
  • a transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • the Agrobacterium -mediated transformation is best suited for dicotyledonous plant cells. The methods are described, for example, by Horsch RB et al. (1985) Science 225: 30 1229f).
  • the expression cassette is to be integrated into special plasmids, either into a shuttle or intermediate vector or one
  • a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, at least the right boundary, but mostly the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as the flanking region, is connected to the expression cassette to be inserted.
  • Binary vectors are preferably used.
  • Binary vectors can be used in E. replicate coli as well as in Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left
  • the selection marker gene allows selection transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene that confers resistance to kanamycin.
  • the Agrobacterium which acts as the host organism in this case, should already contain a plasmid with the vir region. This is necessary for the transfer of the T-DNA to the plant cell. .
  • Direct transformation techniques are suitable for every organism and cell type.
  • RNA in plant cells makes no special demands on the plasmid used. Simple plasmids such as the pUC series can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
  • Stably transformed cells ie those which contain the inserted DNA integrated into the DNA of the host cell, can be selected from untransformed cells if a selectable marker is part of the inserted DNA.
  • Any gene that can confer resistance to antibiotics or herbicides can act as a marker (see above).
  • Transformed cells that express such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of a corresponding antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type. Examples are mentioned above and preferably include the bar gene that confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al.
  • the selection marker allows the selection of trans formed cells from untransformed (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). The plants obtained can be grown and crossed in a conventional manner. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • the above-mentioned methods are described, for example, in Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R Wu, Aeademie Press, pp. 128-143 and in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225).
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f). , - - • ⁇
  • a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is based on the example of callus cultures. The formation of shoots and roots can be induced in a known manner from these still undifferentiated cell masses. The sprouts obtained can be planted out and grown.
  • the method according to the invention can advantageously be combined with other methods which bring about pathogen resistance (for example against insects, fungi, bacteria, nematodes etc.), stress resistance or another improvement in the plant properties.
  • pathogen resistance for example against insects, fungi, bacteria, nematodes etc.
  • stress resistance or another improvement in the plant properties. Examples include named at Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Page 487-96.
  • Another object of the invention relates to the RacB protein from barley according to SEQ ID NO: 2, and the dominant-negative variant thereof, for example described by SEQ ID NO: 7.
  • the invention further relates to nucleic acid sequences coding for the RacB protein from barley, preferably the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1, which complement this tary nucleic acid sequence and the sequences derived from degeneration of the genetic code.
  • Another object of the invention relates to the polypeptide coding for functional equivalents of the RacB protein from barley according to SEQ ID NO: 35, 37 or 39.
  • Another object of the invention relates to nucleic acid sequences coding for functional equivalents of the RacB protein from barley, preferably the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 34, 36 or 38, the complementary nucleic acid sequence and the sequences derived from degeneracy of the genetic code.
  • Another object of the invention relates to transgenic
  • Expression cassettes which comprise one of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the nucleic acid sequence coding for the RacB protein from barley is linked with at least one genetic control element according to the above definition in such a way that expression (transcription and possibly translation) can be realized in any organism - preferably in plants. Suitable genetic control elements are described above.
  • the transgenic expression cassettes can also contain further functional elements as defined above.
  • the inserted nucleic acid sequence coding for a RacB protein from barley can be inserted into the expression cassette in sense or antisense orientation and thus lead to expression of sense or antisense RNA.
  • transgenic vectors that contain the transgenic expression cassettes.
  • transgene means all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods and in which either
  • a genetic control sequence functionally linked to the RacB nucleic acid sequence for example a promoter, or
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin or the presence in a genomic library.
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, particularly preferably at least 1000 bp, very particularly preferably at least 5000 bp.
  • non-natural, synthetic methods such as mutagenization.
  • Corresponding methods are described (US 5,565,350; WO 00/15815; see also above).
  • Another object of the invention relates to transgenic organisms, transformed with at least one nucleic acid sequence according to the invention, expression cassette or a vector according to the invention, and cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots, etc. in plant organisms - or propagation material derived from such organisms.
  • Organism is to be understood broadly and means prokaryotic and eukaryotic organisms, preferably bacteria, yeasts, fungi, animal and vegetable organisms.
  • Fungi such as Aspergillus, Eremothecium, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem
  • yeasts such as Candida, Saccharomyces, Hansenula or Pichia, Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris (ATCC Accessioh No. 201178) are particularly preferred,
  • Vertebrates and invertebrates are non-human mammals such as in dogs, cats, sheep, goats, chickens, mice, rats, cattle or horses.
  • Preferred animal cells include CHO, COS, HEK293 cells.
  • invertebrates include insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 or Sf21 cells,
  • prokaryotic organisms such as gram-positive or gram-negative bacteria such as Acetobacter, Gluconobacter, Coryne-
  • Preferred host or starting organisms as transgenic organisms are, above all, plants as defined above. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. The mature plants are also included,
  • Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development. Plants particularly preferred as 5 host organisms are plants to which the method according to the invention for achieving pathogen resistance can be applied in accordance with the above-mentioned criteria.
  • Monocotyledonous plants such as wheat, oats, millet, barley, rye, corn, rice, buckwheat, sorghum, triticale, spelled, linseed, sugar cane are very particularly preferred as cultivated plants such as rape, canola, cress, Arabidopsis, types of cabbage, Soy, alfalfa, peas, beans, peanut, potato, tobacco, tomato, eggplant, bell pepper, sunflower, tagetes, lettuce, calendula, melon, pumpkin or zucchini. 5
  • the production of the transgenic organisms can be carried out using the processes described above for the transformation or transfection of organisms.
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention and the cells, cell cultures, parts derived therefrom - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms, and transgenic propagation material such as seeds or fruits Production of 5 food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • a process for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms a host organism being transformed with one of the expression cassettes described above and this expression cassette containing one or more structural genes which code for the desired fine chemical or the biosynthesis of the desired fine chemical catalyze, the transformed host organism is grown and the desired fine chemical is isolated from the growth medium.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • the production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids is particularly preferred.
  • the cultivation of the transformed host organisms and the isolation from the host organisms or from the growth medium is carried out using methods known to the person skilled in the art.
  • the production of pharmaceuticals, such as, for example, antibodies or vaccines, is described in Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92.
  • SEQ ID NO: 1 nucleic acid sequence coding for the RacB protein from barley (Hordeum vulgare).
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence coding for the RacB protein from barley (Hordeum vulgare).
  • SEQ ID NO: 3 nucleic acid sequence coding for the RacB protein from rice (Oryza sativa).
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence coding for the RacB protein from rice (Oryza sativa).
  • SEQ ID NO: 5 nucleic acid sequence coding for the RacB protein from maize (Zea mays).
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence coding for the RacB protein from maize (Zea mays).
  • SEQ ID NO: 7 amino acid sequence coding for a dominant-negative variant of the RacB protein from (Hordeum vulgare).
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence coding for a dominant-negative variant of the RacB protein from rice (Oryza sativa).
  • SEQ ID NO: 9 amino acid sequence coding for a dominant-negative variant of the RacB protein from maize (Zea mays).
  • SEQ ID NO: 10 oligonucleotide primers ONP-1
  • SEQ ID NO: 13 GeneRacer TM 5 'primers:
  • SEQ ID NO: 14 GeneRacer TM 5'-Nested Primers:
  • SEQ ID NO: 16 RacB antisense primer 5 '-ttagcttcctcagttcttccctg-3'
  • SEQ ID NO: 21 UBI-sense primer 5 '-ccaagatgcagatcttcgtga-3'
  • SEQ ID NO: 22 UBI antisense primer
  • SEQ ID NO: 33 VI5 mutagenesis primer
  • SEQ ID NO: 34 Nucleic acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 35 amino acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 36 Nucleic acid sequence coding for the RacB-0 homolog HvRacD from barley (Hordeum vulgare).
  • SEQ ID NO: 37 amino acid sequence coding for the RacB-
  • HvRacD Homologous HvRacD from barley (Hordeum vulgare).
  • SEQ ID NO: 38 Nucleic acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 39 amino acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 40 Nucleic acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 42 nucleic acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 44 nucleic acid sequence coding for the RacB-
  • Homolog Oryza sativa R0P4 (GenBank Acc.-No .: AF380335)
  • SEQ ID NO: 45 amino acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 46 nucleic acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 47 amino acid sequence coding for the RacB-
  • SEQ ID NO: 49 nucleic acid sequence coding for a RacB homolog from Arabidopsis thaliana (At3g51300)
  • SEQ ID NO: 51 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 53 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 54 amino acid sequence coding for a RacB homolog from Arabidopsis thaliana (At4g35950)
  • SEQ ID NO: 55 nucleic acid sequence coding for a RacB
  • SEQ ID NO: 56 amino acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 57 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 59 nucleic acid sequence coding for a RacB homolog from Arabidopsis thaliana (Atlg20090)
  • SEQ ID NO: 61 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 63 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 64 amino acid sequence coding for a RacB homolog from Arabidopsis thaliana (At3g48040)
  • SEQ ID NO: 65 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 67 nucleic acid sequence coding for a RacB-
  • SEQ ID NO: 79 nucleic acid sequence coding for a RacB homolog from Arabidopsis thaliana (At2g44690)
  • SEQ ID NO: 72 oligonucleotide primer Fra 187
  • SEQ ID NO: 74 Transgenic expression vector pSUN3NIT_AtRacB_as for expression of Arbidopsis thaliana RacB in antisense orientation
  • SEQ ID NO: 75 transgenic expression vector pSUN3NIT_HvRacB_s for expression of a barley RacB fragment in sense orientation
  • SEQ ID NO: 76 Transgenic expression vector pSUN3NIT_HvRacB_as for expression of a barley RacB fragment in an antisense orientation
  • Fig. 1 Comparison of the amino acid sequences of barley RacB, rice RacB, maize RacB, and human Racl and Rac2 proteins.
  • Areas with a gray background show the position of the Gl element (GXXXXGKS / T; amino acid 13 to 20), the G2 effector region (amino acid 29 to 45), the G3 element (LWDTAGQ; amino acid 58 to 64), the G4 element (TKXD ; Amino acids 118 to 121), the G5 element (EXS) and the C-terminal isoprenylation motif (CXXX, Hassanain HH et al. (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272 (3): 783-8.).
  • Hyphens indicate sequence gaps.
  • Stars represent identical amino acids in all homologues. Amino acids that differ between barley on the one hand and corn and rice on the other are shown in white on a black background. The position which is advantageously changed to obtain a dominant-negative RacB variant is marked with a black triangle above the sequence.
  • Fig. 2 Expression of RacB in epidermal tissue
  • RT-PCR of RNA from the barley lines Pallas and BCPMlal2 (P10) 24 h after inoculation ("shark” hours after inoculation ") with BghA6 Abaxial epidermal strips (E, from inoculated areas of the leaves) from Mesophyll and the adaxial epidermis (M) separated Ubiquitin 1 (Ubi) acted as a marker for tissue-unspecific expression, OXLP as a positive control for gene expression in the epidermis, Bas as a positive control for gene expression in mesophyll cells.
  • RT-PCR was carried out with 25 amplification cycles as described below. RT-PCR products were denatured in the gel, blotted and detected using stringent conditions using antisense RNA probes.
  • Fig. 3 RacB is constitutively expressed in various resistant barley lines.
  • RNA became from the variety Ingrid (Mio, Rorl, Bgh susceptible), BCIngrid- ⁇ Io5 ⁇ mlo5, Rorl, Bgh resistant) and A89 (mlo5, rorl, BghA6 moderately susceptible) immediately before inoculation (0 0) or 8, 15, Isolated 24 h after inoculation with Bgh and 24 h afterwards from non-inoculated control plants (24 °).
  • Ubiquitin 1 (Ubi) was used as a marker for constitutive expression
  • OXLP as a positive control for Bgiz-induced gene expression in the epidermal layer. OXLP expression was detected by Northem blot.
  • the RT-PCR for RacB and Ubi was carried out as described with 25 amplification cycles. The PCR products were denatured in the gel, blotted and detected by means of antisense RNA samples under stringent conditions.
  • Fig. 4 "RNA interference" with i? A ⁇ B-dsRNA reduces the penetration efficiency of the powdery mildew BghA6 in barley.
  • the relative penetration efficiency was determined in six individual experiments when inoculated with Bgh from barley cv Pallas.
  • the RPE is calculated as the difference between the penetration efficiency in RacB-dsRNA transformed cells and the penetration efficiency in control dsRNA-transformed cells (here: average penetration efficiency 57%).
  • the percentage RPE (% -RPE) is calculated from the RPE minus 1 and multiplied by 100.
  • RPE TPE in RacB-dsRNA transformed cells!
  • the black columns represent the% -RPE when evaluating at least 100 interaction parts for each independent experiment.
  • the white column represents the Average% -RPE of the experiments with the RacB-dsRNA
  • the error bar indicates the standard error.
  • Control represents the parallel experiments with a control dsRNA.
  • The% -RPE was significantly reduced in cells bombarded with RacB-dsRNA compared to cells bombarded with a control dsRNA (TR: human thyroid receptor dsRNA).
  • The% -RPE was performed in 5 independent experiments
  • The% -RPE is significantly reduced in Pallas (Mio Rorl, black bars, experiment 1 and 2) or Ingrid (Mio Rorl, black bar, experiments 3, 4 and 5).
  • % -RPE of the susceptible mutant A89 was, however, not reduced.
  • White bars indicate the mean value, error bars the standard error.
  • Fig. 6 Overexpression of a constitutively active RacB-
  • a constitutively active mutant of barley RACB (exchange G-> V at position 15; RacB-Vl5) was overexpressed transiently in barley of the variety Pallas using the expression construct pGY-RacBVl5 in 5 independent experiments. In comparison, corresponding experiments were carried out with the vector alone without a RacB insert (pGY).
  • Fig. 7 Plasmid map for expression vector pGY-1 (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Shinshi H et al. (1990) Plant Mol Biol 14: 357-368). Examples
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sabrook et al , (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules takes place with a laser fluorescence DNA sequencer from MWG-Licor according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463-5467).
  • the barley variety Ingrid comes from James McKey, University of Uppsala, Sweden.
  • the Pallas variety and the BCIngrid-ml o5 back line was provided by Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Copenhagen, Denmark. Their production has been described (K0lster P et al. (1986) Crop Sei 26: 903-907). Line A89 was provided by Paul Schulze-Lefert (Max Plank Institute for Plant Breeding Research, Cologne, Germany).
  • the seeds which had been pre-germinated in the dark on moist filter paper for 12 to 36 hours, were, unless otherwise stated, placed on the edge of a square pot (8x8cm) in Fruhstorfer earth of type P, 5 grains, covered with earth and regularly watered with tap water. All plants were grown in climatic cabinets or chambers at 16 to 18 ° C, 50 to 60% relative humidity and a 16-hour light / 8-hour dark cycle with 3000 or 5000 lux (50 or 60 umols - ⁇ - m- 2 Photon flux density) cultured for 5 to 8 days and used in the seedling stage in the experiments. In experiments in which applications were carried out on primary blades, these were fully developed.
  • the plants were placed in climatic chambers or chambers at 24 ° C during the day, 20 ° C at night, 50 to 60% relative humidity and a 16-hour cultivated against light / 8-hour dark cycle with 30,000 lux.
  • RNA Extraction Buffer AChinsky RNA Extraction Buffer
  • the central primary leaf segment of 5 cm in length was harvested and homogenized in liquid nitrogen in mortars.
  • the homogenate was stored at -70 ° C. until the RNA extraction.
  • the concentration of the RNA was determined photometrically.
  • the concentrations of the RNA solutions were then adjusted to 1 ⁇ g / ⁇ L with DEPC water and checked in the agarose gel.
  • RNA concentrations in the horizontal agarose gel 1% agarose in 1 x MOPS buffer with 0.2 ⁇ g / mL ethidium bromide
  • 1 ⁇ L RNA solution with 1 ⁇ L 10 ⁇ MOPS, 1 ⁇ L color marker and 7 ⁇ L DEPC water added, separated according to their size at 120 V voltage in the gel in 1 x MOPS running buffer for 1.5 h and photographed under UV light. Any differences in concentration of the RNA extracts were compensated with DEPC water and the adjustment was checked again in the gel.
  • the cDNA fragments required to isolate the HvRacB cDNA, its cloning, sequencing and preparation of probes were analyzed by RT-PCR using the "One Step RT-PCR Kit” (Life Technologies, Düsseldorf, Germany or
  • RNA from barley seedlings was used as a template.
  • the RNA was isolated from Pallas 3, 5 and 7 days after germination.
  • RNA was isolated from Pallas and the back-crossed lines with mlo5, Mlg or Mlal2 1, 2 and 5 days after inoculation with BghA6 on the 7th day after germination.
  • the following primers are used for the RT-PCR:
  • the PCR product was separated using 2% w / v agarose gel electrophoresis.
  • An RT-PCR product with a total of 642 bp was obtained, which is composed of the RacB sequence (SEQ ID NO: 1) and terminal sequences coding for restriction endonuclease interfaces.
  • the fragment codes for an open reading grid of -591 bp coding for a polypeptide of 197 amino acids.
  • the corresponding cDNA was isolated from an agarose gel and cloned into the pGEM-T vector (Promega, Mannheim, Germany) by means of T-overhang ligation.
  • the cDNAs were sequenced from the plasmid DNA using the "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Germany).
  • RNA was then precipitated by centrifugation for 20 min at 20,000 g and 4 ° C. The supernatant was discarded, 500 ⁇ l 75% ethanol was added, vortexed briefly and centrifuged again for 2 min (20,000 g).
  • RNA CAP structures were removed by adding 1 ⁇ l lOxTAP buffer, 10 units RNAsin and 1 unit TAP ("tobacco acid pyrophosphatase"). The mixture was incubated for 1 h at 37 ° C and then cooled on ice. The RNA was again precipitated as described above and placed in a reac- transferred to 0.25 ⁇ g GeneRacer oligonucleotide primer. The oligonucleotide primer was resuspended in the RNA solution, the mixture was incubated for 5 min at 70 ° C.
  • the mixture (total volume 25 ⁇ L) had the following composition:
  • the PCR conditions were:
  • the PCR showed a product of approx. 400 bp product.
  • a "nested” PCR was carried out with the RacB-specific oligonucleotide primer and the "GeneRacer Nested 5 'primer":. , , , ..
  • the PCR product obtained was isolated on a gel, extracted from the gel and cloned into pGEM-T by means of T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence in the region of the primer OPN-1 was absolutely identical to that of racB from rice, so that no point mutations were generated using the primer.
  • the sequence reproduced under SEQ ID NO: 1 is therefore identical to the RacB sequence from barley.
  • RNA production see above
  • cDNA reverse transcription
  • the sought-after cDNA was amplified in a subsequent PCR reaction with specific primers.
  • the amplification was interrupted during the exponential phase in order to reflect differences in the target RNA.
  • the PCR products were separated on an agarose gel, denatured, blotted on nylon membranes and with stringent, non-radioactive labeled probes Standard conditions detected. Hybridization, washing steps and immunodetection were carried out as described under "Northern Blot".
  • the PCR products were separated on the IxTBE agarose gel with ethidium bromide.
  • All fragments obtained were also ligated into the vector pGEM-T by means of T-overhang ligation and served as starting plasmids for the production of probes (e.g. for Northem blot) or dsRNA.
  • the individual constructs were called pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI. ... ,
  • RNA was separated in the agarose gel under denaturing conditions. A portion of RNA solution (corresponding to 5 ⁇ g RNA) was mixed with the same volume of sample buffer (with ethidium bromide), denatured for 5 min at 94 ° C., placed on ice for 5 min, briefly centrifuged and applied to the gel.
  • sample buffer with ethidium bromide
  • the 1 x MOPS gel (1.5% agarose, ultra pure) contained 5% by volume concentrated formaldehyde solution (36.5% [v / v]).
  • the RNA was separated at 100 V for 2 h and then blotted.
  • Northem blotting was carried out as an upward RNA transfer in the capillary flow.
  • the gel was first swung in 25 mM sodium hydrogen / dihydrogenphosphate buffer (pH 6.5) and cut to size. Whatman paper was prepared so that it rested on a horizontal plate and protruded on two sides in a tub with 25 mM sodium hydrogen / dihydrogen phosphate buffer (pH 6.5). The gel was placed on this paper, covering uncovered parts of the Whatman paper with a plastic film. The gel was then covered with a positively charged nylon membrane (Boehringer-Mannheim) free of air bubbles, after which the membrane was again covered with absorbent paper in several layers about 5 cm high.
  • a positively charged nylon membrane Boehringer-Mannheim
  • the absorbent paper was weighed down with a glass plate and a 100 g weight. The blotting was carried out overnight at room temperature.
  • the membrane was briefly distilled in A. pivoted and irradiated with a light energy of 125 mJ in the crosslinker (biorad) for light fixation with UV light.
  • the uniform RNA transfer to the membrane was checked on the UV light bench.
  • 10 ⁇ g of total RNA from each sample were separated on an agarose gel and blotted onto a positively charged nylon membrane by capillary transfer. The detection was carried out with the DIG systems. 5
  • RNA probes labeled with digogygenin or fluorescein were produced. These were created by in vitro transcription of a PCR product using a T7 or SP6 RNA polymerase 10 with labeled UTPs.
  • the plasmid vectors pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI described above served as template for the PCR-supported amplification.
  • RNA 15 polymerases were used to produce the antisense strand.
  • the T7 RNA polymerase was used for pGEMT-BAS and pGEMT-OXLP, the SP6 RNA polymerase for pGEMT-RACl and pGEMT-UBI.
  • the insert of the individual vectors was amplified by PCR with flanking 20 standard primers (M13 fwd and rev). The reaction proceeded with the following final concentrations in a total volume of 50 ⁇ L PCR buffer (Silverstar):
  • Ml3-fwd 5 '-GTAA ⁇ ACGACGGCCAGTG-3' (SEQ ID NO: 23)
  • Ml3-Rev 5 '-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 24)
  • the amplification was temperature controlled in a thermal cycler (Perkin-Elmar 35 2400):
  • RNA polymerization, hybridization and immunodetection were largely carried out according to the manufacturer of the kit for non-radioactive RNA detection (DIG).
  • RNA probe was detected in the ethidium bromide gel and stored at -20 ° C.
  • the membranes were first swung for 20 hours at 68 ° C. in 2 ⁇ SSC (salt, sodium citrate), 0.1% SDS buffer (sodium dodecyl sulfate), the buffer being renewed 2 to 3 times.
  • the membranes were then placed on the inner wall of preheated hybridization tubes at 68 ° C. and incubated for 30 min with 10 mL Dig-Easy hybridization buffer in the preheated hybridization oven.
  • 10 ⁇ L probe solution in 80 ⁇ L hybridization buffer was denatured at 94 ° C. for 5 min, then placed on ice and briefly centrifuged.
  • the probe was then transferred to 10 ml of 68 ° C. warm hybridization buffer, and the buffer in the hybridization tube was replaced by this probe buffer. The hybridization then also took place at 68 ° C. overnight.
  • RNA-RNA hybrids were washed twice for 20 min each in 0.1% (w / v) SDS, 0.1 x SSC at 35 68 ° C.
  • the blots were first swirled twice for 5 min at RT in 2 x SSC, 0.1% SDS. This was followed by 2 stringent washing steps at 68 ° C in 0.1 x SSC, 0.1% SDS for
  • DEPC water Distilled water is treated overnight at 37 ° C with diethyl pyrocarbonate (DEPC, 0.1%, w / v) and then autoclaved
  • MOPS buffer 0.2 M MOPS (morpholine-3-propanesulfonic acid), 0.05 M sodium acetate, 0.01 M EDTA, pH adjusted to pH 7.0 with 10 M NaOH
  • RNA sample buffer 760 ⁇ L formamide, 260 ⁇ L formaldehyde, 100 ⁇ L ethidium bromide (10 mg / mL), 80 ⁇ L glycerol, 80 ⁇ L bromophenol blue (saturated), 160 ⁇ L 10 x MOPS, 100 ⁇ L water.
  • 10 x wash buffer without tween 1.0 M maleic acid, 1.5 M NaCl; without DEPC, adjust to pH 7.5 with NaOH (solid, approx. 77 g) and 10 M NaOH.
  • 10 x blocking reagent Suspend 50 g blocking powder (Boehringer-Mannheim) in 500 mL wash buffer without Tween.
  • Substrate buffer Adjust 100 mM Tris (trishydroxymethylamino-methane), 150 mM NaCl with 4 M HC1 to pH 9.5.
  • 10 x color markers 50% glycerol (v / v), 1.0 mM EDTA pH 8.0, 0.25% bromophenol blue (w / v), 0.25% xylenecanol (w / v).
  • All plasmids (pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI) which were used for in vitro transcription contain the T7 and SP6 promoter (pGEM-T, Promega) at the respective ends of the inserted nucleic acid sequence, which is what Synthesis of sense or antisense RNA enabled.
  • the plasmids can be linearized with suitable restriction enzymes in order to ensure correct transcription of the inserted nucleic acid sequence and to prevent reading through in vector sequences.
  • plasmid DNA 10 ⁇ g were cut with the side of the insert located distally from the promoter.
  • the cut plasmids are extracted in 200 ⁇ l of water with the same volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol, transferred to a new Eppendorf reaction vessel (RNAse free) and centrifuged at 20,000 g for 5 min.
  • 420 ⁇ l of ethanol were added to 180 ⁇ l of the plas id solution, placed on ice and then precipitated by centrifugation for 30 min at 20,000 g and ⁇ 4 ° C. The precipitate was taken up in 10 ul TE buffer.
  • RNA polymerases were obtained from Röche Molecular Biology, Mannheim, Germany.
  • dsRNA 4 ⁇ l of the dsRNA were ethanol-precipitated (by adding 6 ⁇ l water, 1 ⁇ l 3M sodium acetate solution and 25 ⁇ l ethanol, and centrifugation for at least 5 min at 20,000 g and 4 ° C.) and resuspended in 500 ⁇ l water.
  • the absorption spectrum between 230 and 300 nm was measured, or the absorption at 280 and 260 nm was determined in order to determine the purity and the concentration of the dsRNA.
  • 80 to 100 ⁇ g dsRNA with an OD2so / OD280 ratio of 1.80 to 1.95 were obtained. Digestion with DNase I can be carried out as an option, but does not significantly affect the following results.
  • the human thyroid receptor dsRNA (starting vector pT7betaSal (Norman C et al. (1988) Cell 55 (6): 989-1003) provided as control dsRNA, provided by Dr. Baniahmad, Institute of Genetics, Giessen, Germany; the sequence of the insert is described under GenBank Acc.-No .: NM_000461).
  • the plasmid was digested with PvuII, for the antsense RNA with HindIII and the RNA was then transcribed with T7 or SP6 RNA polymerase.
  • the individual process steps for producing the control dsRNA are carried out analogously to those described above for the RacB dsRNA.
  • Example 7 Transient transformation, RNAi and evaluation of fungal pathogen development
  • Barley cv Pallas leaf segments were transformed with a RacB-dsRNA together with a GFP expression vector. The leaves were then inoculated with Bgh and the result was analyzed after 48 h using light and fluorescence microscopy. The penetration in GFP-expressing cells was assessed by detecting home tories in living cells and by evaluating fungal development on these cells.
  • bombarding barley cv Pallas with RacB-dsRNA resulted in a reduced number of successful cells richly penetrated by Bgh compared to cells bombarded with a foreign control dsRNA (human thyroid hormone receptor dsRNA, TR).
  • the resistance-inducing effect of the J ⁇ a ⁇ B-dsRNA caused an average decrease in penetration efficiency by Bgh by 44% (FIG. 4).
  • Tungsten particles with a diameter of 1.1 ⁇ m were coated with dsRNA (preparation see above) together with plasmid DNA of the vector pGFP (GFP under the control of the CaMV 35S promoter) as transformation markers.
  • the following amounts of dsRNA or reporter plasmid were used for coating per shot: 1 ⁇ g pGFP and 2 ⁇ g dsRNA. Double stranded RNA was synthesized by fusing "sense” and "antisense” RNA in vitro (see above).
  • tungsten particles M 17, diameter 1.1 ⁇ m; Bio-Rad, Kunststoff
  • 1 ml of autoclave distilled water washed twice with 1 ml of autoclave distilled water and once with 1 ml of absolute ethanol, dried and in 1 ml of 50% strength Glycerin taken up (approx. 50 mg / ml stock solution).
  • the solution was diluted to 25 mg / ml with 50% glycerol, mixed well before use and suspended in an ultrasonic bath.
  • plasmid 1 ⁇ g plasmid, 2 ⁇ g dsRNA (1 ⁇ L), 12.5 ⁇ l tungsten particle suspension (25 mg / ml), 12.5 ⁇ l IM Ca (N03) 2 solution (pH 10 ) added dropwise with constant mixing, left to stand at RT for 10 min, centrifuged briefly and 20 ⁇ l removed from the supernatant. The rest with the tungsten particles is resuspended (ultrasonic bath) and used in the experiment.
  • the pressure in the chamber was reduced by 0.9 bar and the tungsten particles were shot at 9 bar helium gas pressure onto the surface of the plant tissue.
  • the chamber was immediately ventilated.
  • the leaves were plasmid (pGFP; pUC18-based vector, CaMV 35S promoter / terminator cassette with inserted GFP gene; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54 ; provided by Dr. P. Schweizer Schweizer P, Institute for Plant Genetics IPK, Gatersleben, Germany).
  • the macro carrier was thoroughly cleaned with water.
  • the leaves were inoculated with 100 conidia / mm 2 of the powdery mildew of mildew of barley (breed A6) and incubated for a further 36 to 48 h under the same conditions.
  • the relative penetration efficiency is calculated as the difference between the penetration efficiency in transformed cells (transformation with RacB or control dsRNA) and the penetration efficiency in untransformed cells (here:. Average penetration efficiency 57%).
  • the percentage RPE (% -RPE) is calculated from the RPE minus 1 and multiplied by 100.
  • RPE FPE in RacB-dsRNA transformed cells!
  • The% -RPE value (deviation from the average penetration efficiency of the control) is used to determine the susceptibility of cells transfected with RacB-dsRNA (FIG. 4).
  • Example 8 Constitutively active mutant of RACB
  • RACB As a susceptibility factor, a putatively constitutive mutant of barley RACB was created (exchange G-> V at position 15; RacB-V15) and overexpressed in Pallas barley.
  • RACB was shown full-length via RT-PCR. The following oligonucleotide primers were used for this:
  • the cDNA was cloned into pGEM-T and then cut out via the primer interfaces and cloned into pGY-1 (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; FIG. 7) via BamHI / Sall interfaces ,
  • the construct is called pGYl-RacB.
  • the nucleic acid sequence coding for the constitutively active RacB mutant RACB-V15 was produced using the "Transformer®Site-Directed Mutagenesis Kit" (Clonetech, Heidelberg) according to the manufacturer's instructions.
  • PGYl-RacB was used as the starting vector.
  • the following oligonucleotide was used as mutagenesis primer:
  • RACB-V15 was then transiently overexpressed in 5 independent experiments in Pallas barley under the control of the 35S CamV promoter.
  • the experiments were carried out as in Schultheiss et al. (Schultheiss H et al. (2002) Plant Physiol 128: 1447-1454), only after the particle bombardment, the wait was 24 instead of 4 hours before the inoculation.
  • the coating of the particles ran as in Schweizer et al. (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54).
  • Example 10 Preparation of sense and antisense constructs with the gene AtRacB for expression in Arabidopsis thaliana
  • a fragment of an Arabidopsis RacB homolog (MLPS code: AT4g35950; SEQ ID NO: 53; as a result of AtRacB) is isolated from an Arabidopsis thaliana cDNA library via PCR.
  • the primer sequences used are:
  • the amplification is temperature-controlled in a Thermocycler T3 from Biometra:
  • the PCR products are cloned into the vector pCR2.1 (according to the pCR Script Cloning Kit, from Stratagene, Heidelberg) according to the manufacturer's instructions.
  • a fragment is cut from the vector construct via the restriction enzyme EcoRI (company Röche, Mannheim).
  • the fragment can be isolated by gel electrophoresis with subsequent purification using anion exchange columns (QIAex Purification Kit, Qiagen, Hilden).
  • the binary vector pSUN3-Nit is cut open using the enzymes Xmal and EcoRI and subjected to purification by gel electrophoresis with subsequent elution using anion exchange columns (QIAex Purification Kit, Qiagen, Hilden).
  • both the eluted AtRacB fragment and the eluted pSUN3-Nit fragment with 2 ⁇ l dNTP mix I (each 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Pharmacia, Freiburg) and 1.6 ⁇ l Klenow fragment (from USB / Amersham, Braunschweig, 2 U / ⁇ l) treated to fill up the overhang and 30 min at 37 ° C incubated.
  • the vectors are first cleaned using a QIAquick Spin Column (Frima Qiagen, Hilden), treated with CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, GibcoBRL, Eggenstein, 1 U / ⁇ l) and finally using a 0.8 % agarose gel cleaned.
  • QIAquick Spin Column Ferturea Qiagen, Hilden
  • CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, GibcoBRL, Eggenstein, 1 U / ⁇ l
  • control digests can be used to isolate constructs in which the AtRacB gene in sense orientation or antisense orientation is behind the constitutively active nitrilase-1 (nitl) gene from A. thaliana (GenBank Acc.-No .: Y07648.2, nucleotides 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170: 197-200) is cloned.
  • nitrilase-1 nitl gene from A. thaliana
  • These constructs are designated with pSUN3NIT_AtRacB_s and used for the transformation of Arabidopsis' Bflanzen (SEQ ID NO: 73) and pSUN3NIT_atRacB_as (74 SEQ ID NO).
  • the constructs contain the complete sequence of AtRacB, so that the expression vector pSUN3NIT_HvRacB_s, which contains the fragment in sense orientation, is able to express a functional AtRacB protein.
  • the vector primarily serves as a negative control and in most cases results in a reduced pathogen resistance, but in some cases (see below) also an increase in the pathogen resistance presumably via a cosuppression effect.
  • Example 11 Preparation of sense and antisense constructs with the HvRacB gene for expression in Arabidopsis thaliana
  • plasmid which subcloned the tfvRacB gene into the bacterial vector pGEM-T is digested with the enzyme combinations BamHI / Hindill (company Röche, Mannheim). Overhanging 5 single strands are filled in by treatment with the Klenow polymerase in the presence of a mixture of nucleotides (see above).
  • 25 constitutively active promoter of the nitrilase-1 gene from A.thalina is cloned.
  • These constructs are designated pSUN3NIT_HvRacB_s (SEQ ID NO: 75) and pSUN3NIT_HvRacB_as (SEQ ID NO: 76) and are used for the transformation of Arabidopsis plants.
  • the constructs contain a shortened one
  • the expression vector pSUN3NIT_HvRacB_s which contains the fragment in sense orientation, is also unable to express a functional HvRacB protein.
  • the vector primarily serves as a negative control, but also results in an increase in the pathogen response in some cases (see below).
  • the A. t ⁇ mefaciens cells used are pre-transformed with the plasmids pSUN3NIT_AtRacB_s (SEQ ID NO: 73), pSUN3NIT_atRacB_as (SEQ ID NO: 74), pSUN3NIT_HvRacB_s (SEQ ID NO: 75) and pSUN3NIT_as (SE) ID: 76).
  • i Seeds of the Agrobacterium-transformed primary transformants are selected on the basis of the kanamycin resistance. Antibiotic-resistant seedlings are planted in soil and used as fully developed plants for biochemical analysis.
  • Plants 5 to 8 weeks old are sprayed with a conidia spore suspension (approx. 10 6 spores / ml).
  • the inoculated plants are kept overnight in a refrigerator at approx. 16 ° C. covered with a plastic bag, dark and moist. After a day, the plastic bag is opened a little and later completely removed. Six days after inoculation, the plants are covered again with the plastic bag overnight, which induces sporulation. The following day, the leaves are examined for the appearance of conidiophores.
  • the intercellular growth of the fungus leads to the induction of weak chlorosis to severe necrosis in the leaves in the next few days. These symptoms are quantified and tested for significance.
  • the biotrophic mildew fungus is cultivated on Arabidopsis plants.
  • conical supports are removed from the surface of the leaves with a fine brush and brushed onto the leaves of the transgenic plants.
  • the plants are incubated for 7 days at 20 ° C. 7 days after inoculation, the conidia are visible on the leaves, and chlorosis and necrosis appear in the following days. These symptoms are quantified and tested for significance.
  • transgenic Arabidopsis plants which expand antisense sequences for AtRacB or HvRacB, show one against both Peronospora parasitica and against Erysiphe cichoracearum significantly increased resistance compared to non-transgenic wild-type plants.
  • transgenic Arabidopsis plants which expand sense sequences for the complete AtRacB, in most cases show a significantly increased susceptibility to both Peronospora parasitica and Erysiphe cichoracearum compared to non-transgenic wild-type plants. In some cases, however, increased resistance (presumably via a cosuppression effect) can be observed.
  • transgenic Arabidopsis plants which expand the sense sequences for the one fragment of HvRacB show in some cases a significantly increased resistance both to Peronospora parasitica and to Erysiphe cichoracearum compared to non-transgenic wild-type plants.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue RacB cDNA Sequenzen aus Gerste, sowie Expressionskassetten und Vektoren, die diese Promotorsequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Pathogenresistenz in Pflanzen durch Verminderung der Expression eines RacB-Protein oder eines funktionellen Äquivalentes desselben.

Description

Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue RacB cDNA Sequenzen aus Gerste, sowie Expressionskassetten und Vektoren, die diese Sequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Pa- thogenresistenz in Pflanzen durch Verminderung der Expression eines RacB-Protein oder eines funktioneilen Äquivalentes desselben.
Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96) - Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze gegen Pathogene unzureichend. Allein Pilzerkrankungen führen zu Ernteverlusten in der Höhe von vielen Milliarden US-$ jährlich. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression von Baclllus thuringiensis Endotoxinen unter Kontrolle des 35 S CaMV Promoters (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promoters (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Die meisten der beschriebenen Ansätze gewähren jedoch nur eine Resistenz gegen ein einzelnes Pathogen oder gegen ein schmales Spektrum von Pathogenen.
Es gibt nur wenige Ansätze, die Pflanzen eine Resistenz gegen ein breiteres Spektrum von Pathogenen, vor allem Pilzpathogene, verleihen. Die systemische erworbene Resistenz ("systemic acquired resistance" ; SAR) - ein Abwehrmechanismus bei verschiedenen Pflanze/Pathogen-Interaktionen - kann durch Applikation von endogene Botenstoffe wie Jasmonat (JA) oder Salicylsäure (SA) vermittelt werden (Ward, et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4 (6) : 645-656) . Ähnliche Effekte können auch durch synthetische Verbindungen wie 2 , 6-Dichloriso- nikotinsäure (INA) oder Benzo (1,2, 3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure- S-methylester (BTH; Bion®) (Friedrich et al. (1996) Plant J 10(1) : 61-70; Lawton et al . (1996) Plant J. 10:71-82) bewirkt werden. Auch die Expression der im Rahmen eines SAR hochregulierten "pathogenesis related" (PR) Proteine vermag zum Teil eine Pathogenresistenz zu bewirken.
In Gerste ist bereits seit längerem der Mlo-Locus als negativer Regulator der Pathogenabwehr beschrieben. Der Verlust oder Funktionsverlust ( "loss-of-function") des Mio-Gens bedingt eine erhöhte und vor allem rassen-unspezifische Resistenz beispiels- weise gegen zahlreiche Arten von Mehltau (Büschges R et al .
(1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995) Plant Pathol 44:786-790). Der Mlo- Phänotyp wird rezessiv vererbt, was ebenfalls für eine Funktion als Suszeptibilitätsgen spricht. Durch klassische Züchtung er- haltene Mlo-defiziente Gerstensorten werden bereits breit in der Landwirtschaft verwendet . Vermutlich aufgrund der Rezessivität hat sich trotz eines intensiven Anbaus diese Resistenz als außerordentlich dauerhaft erwiesen. Durchbrechungen der Resistenz sind bislang nicht aufgetreten. Mio-ähnliche Resistenzen in anderen Pflanzen v.a. in Getreidearten sind nicht beschrieben, obgleich auch Weizen, Roggen und andere Getreide von vergleichbaren Mehl- tau-Pathogenen befallen werden. Ursache bei Weizen kann zum Beispiel das Vorliegen eines hexaploiden Genoms sein, was die Identifizierung von Mutanten, bei denen jede der sechs Genkopien inaktiviert wurde, extrem erschwert.
Das Mio-Gen wurde erst kürzlich kloniert (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sei. 5:343-348). Infolge verschiedene Homo- löge aus anderen Getreidearten isoliert. Verschiedene Verfahren unter Verwendung dieser Gene zum Erzielen einer Pathogenresistenz sind beschrieben (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552).
Die Mio-bedingte Resistenz einer Pflanze gegen Mehltau-Pathogene äußert sich in zwei wesentlichen Ereignissen, die beide eine
Penetrationsresistenz bewirken: Eine Papillenbildung ("cell wall apposition"; CWA) unterhalb des Penetrationsortes des Pathogens, der epidermalen Zellwand. Die Ausbreitung des Pilzpathogens bleibt fast ausschließlich auf diese subzellulare Struktur beschränkt (Jorgensen JH und Mortensen K (1977) Phytopathology 67:678-685; Freialdenhoven A et al. (1996) Plant Cell 8:5-14). Bedingt wird diese Reaktion durch die für die Mio-Wirkung erforderlichen Gene Rorl und Ror2 (Peterhänsel C et al. (1997) 9:1397-1409) . Nachteilig bei der Mio-bedingten Pathogenresistenz ist, dass Mlo- defiziente Pflanzen - auch in Abwesenheit eines Pathogens - einen Abwehrmechanismus initiieren, der sich beispielsweise in einem spontanen Absterben von Blattzellen äußert (Wolter M et al . (1993) -Mol Gen Genet 239:122-128). Nachteilig ist ferner, dass die Mlo-defizienten Genotypen eine Hypersuszeptibilität gegen hemibiotrophe Pathogene wie Magnaporte grisea (M. gri$ea) sowie Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) zeigen (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Ku ar J et al. (2001) Phytopathology 91:127-133). Das Mio-Gen scheint also ein negativer Regulator des Zelltods zu sein. Ursache ist ebenfalls vermutlich die Induktion von Zelltod bei Abwesenheit des Mio-Gens, was die Suszeptibilität gegenüber diesen eher nekrotrophen Pathogenen steigert. Diese ambivalente Wirkung, die die biotechnologische Anwendung von Mio limitiert, beruht vermutlich darauf, dass nekrotrophe Pilze die stärkere HR der Mlo-defizienten Wirtspflanze für ihren Infektionsprozess ausnutzen können. Wünschenswert wäre eine der Mlo-Defizienz vergleichbare Resistenz, der jedoch das Merkmal der Zelltodinduktion fehlt.
Die Proteine Rho, Rac und Cdc42 sind Mitglieder der Familie der kleinen GTP-(Guanosintriphosphat) Bindeproteine und regulieren als "molekulare Schalter" zahlreiche intrazelluläre Prozesse, sowohl in pflanzlichen als auch in tierischen Organismen. Sie haben als Bausteine der Signaltransduktion eine wichtige Rolle bei der Umsetzung extrazellulärer Stimuli. Sie regulieren beispielsweise die NADPH Oxidase und damit die Freisetzung reaktiver Sauerstoffmoleküle ("oxidative burst"). Tierisches oder ensch- liches Racl ist essentiell für die Bildung des aktiven NADPH Oxidasekomplexes, der wiederum wichtig für die Bildung von Superoxid ist, und so einen Beitrag zur Pathogenabwehr liefert (Irani K und Goldschmidt-Clermont PJ (1998) Biochem Phar acol 55: 1339-1346) . Die Funktion in der Pathogenabwehr ist weitgehend analog in Pflanzen und in Tieren (Kwong et al. (1995) J Biol Chem 270(34): 19868-19872; Dusi et al . (1996) Biochem J 314:409-412; Diek ann et al. (1994) Science 265:531-533; Purgin et al. (1997) The Plant Cell 9:2077-2091; Kleinberg et al. (1994) Bioσhemistry 33:2490-2495; Prigmore et al. (1995) Journal of Biol Chem 27(18): 10717-10722; Irani et al. (1997) Science 275:1649-1652; Low et al. (1994) Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions 3:361-369 (1994) eds. MJ Daniels, Kluwer Acadmic Publishers, Netherlands; Mehdy et'al. (1994) Plant Physiol 105: 467-472; Sundaresan et al. (1996) Biochem J 318:379-382). Darüber hinaus haben GTP-Bindeproteine eine Funktion bei der Umstrukturierung des Zytoskeletts und der Zelltransformation (Symon M. (1996) TIBS 21: 178-181), sowie bei der Aktivierung der Transkription (Hill et al. (1995) Cell 81:1159-1170; Chandra et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93:13393-13397).
In Pflanzen besteht eine größere Familie an Rac-ähnlichen Proteinen (Winge et al. (1997) Plant Mol Biol 35:483-495), die auch als Rop-Familie bezeichnet werden (Lin et al. (1997) The Plant Cell 9:1647-1659). In Pflanzen scheinen die Rac Proteine eine Funktion in der Freisetzung reaktiver Sauerstoffmoleküle infolge eines Pathogenbefalls zu haben (Groo QJ et al. (1996) Plant J 10: 515-522; Hassanain HH et al. (2000) Biochem Biophys Res Com un 272 (3) :783-788; Ono E et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 759-764). Rac moduliert u.a. die Zellwandarchitektur, die Signaltransduktion im Meristem und die Abwehr von Pathogenen (Valster AH et al. (2000) Trends Cell Biol 10 (4) :141-14β) . Racl aus Reis vermag bei Überexpression der konstitutiv-aktiven Form eine hypersensitive Antwort ("hypersensitive response"; HR) an den Stellen eines M. grisea-Befalls zu induzieren und bewirkt so eine Pathogenresistenz . Analog bewirkt die Expression einer dominant-negative Form von Racl eine erhöhte Suszeptibilität gegen M. grisea (Kawasaki T et al. (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96:10922-10926; Ono E et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 759-764) . Diese Befunde deuten darauf hin, dass durch eine Überexpression von Rac-Proteinen in der Pflanze vorteilhafte Effekte bezüglich einer Pathogenabwehr bewirkt werden können.
WO 00/15815 beschreibt fünf Rac-Gene aus Mais. Obgleich hier sowohl Verfahren für eine Hoch- als auch Runterregulation von Rac-Proteinen beschrieben und spekulativ in den Zusammenhang mit der Erzielen einer Pathogenresistenz gebracht werden (S.55/Z.25ff . ) , ist die einzige technische Lehre die diese Verwendung konkret beschreibt allein auf eine Überexpression der beanspruchten Rac-Gene zum Erreichen einer Pathogenresistenz gerichtet (S.60/Z.21ff. ) . Ganz eindeutig - und im Einklang mit dem im Stand der Technik beschriebenen Sachverhalt - wird hier postuliert (S.60/Z .31ff) : "Demzufolge ist die Erfindung nützlich, um Pflanzen vor Pathogenen zu schützen. Sobald eine Pflanze mit einem Polynukleotid kodierend für ein Rac Polypeptid transformiert ist, wird die Expression des Polypeptides in der Pflanze eine Resistenz gegen Pflanzenpathogene bewirken." Das hinter dieser Hypothese stehende Rational (Pathogenabwehr über reaktive Sauerstoffmoleküle) wird nachfolgend dargelegt und mit zahlreichen Literaturstellen untermauert. Darüberhinaus wird keine Differenzierung zwischen den fünf beanspruchten Rac-Genen vorgenommen. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verfahren zur Pathogenabwehr in Pflanzen bereitzustellen, die eine effiziente Abwehr eines möglichst breiten Spektrum von Pathogenen in möglichst vielen verschiedene Pflanzenarten, bevorzugt den in der Landwirtschaft verwendeten Kulturpflanzen bewirken. Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst.
Ein erster Gegenstand der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung der Resistenz gegen mindestens ein Pathogen in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass nachfolgende Arbeitsschritte umfasst sind
a) Verminderung der Proteinmenge, Aktivität oder Funktion eines RacB-Proteins in einer Pflanze oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle derselben und
b) Auswahl der Pflanzen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangspflanze - die Resistenz gegen mindestens ein Pathogen besteht oder erhöht ist.
Überraschenderweise zeigt das Rac-Homolog RacB aus Gerste (Hordeum vulgäre) (SEQ ID NO: 1) (infolge: hvRacB) - trotz einer hohen Ähnlichkeit zu Reis-Racl - im Gegensatz zu diesem eine negative Kontrollfunktion bei einem Befall durch den Gersten- Mehltau Blumeria (syn. Erysxphe) gramxnis f.sp. hordei (Bgh): Die Verminderung der hvRacB Expression in der epidermalen Zelle durch einen seguenzespezifischen RNA-Interferenz Ansatz unter Verwendung doppelsträngiger vRacB-dsRNA ("Gene-Silencing") , verhinderte signifikant die Haustorium-Ausbildung infolge einer Bgh- Infektion. Weitere Experimente zeigten (vgl. Beispiel 7), dass dieser Phänotyp nicht in einem ml o5-rorl- utanten Genotyp - der Gerste A89 - beobachtet werden kann. Dies legt nahe, dass RacB in funktioneller Verbindung zu Mio oder Rorl oder beiden steht, also vermutlich in einer Signalkette wirken.
Ähnlich wie der Funktionsverlust von Mio vermittelt der von HvRacB eine breite Resistenz gegen verschiedene Isolate von Blumeria grainis f.sp. hordei. In transienten "Gene-Silencing"-Ex- perimenten reduziert HvRacB die Penetrationseffizienz (Hausto- rien-Bildung) von Bgh um 44 % (vgl. Beispiel 7)- ein Effekt, der in seiner Stärke dem mittels Mlo-dsRNA erreichten entspricht (Schweizer et al. (2000) Plant J 24:895-903). In der Wildtyp Gerstensorte Ingrid führen ca. 60 % der Pilzp:enetrationen zu einer Haustorien-Bildung, wohingegen die Penetrationsrate in BCIngrid- mlo5 nahezu 0 % beträgt. Die Gerstensorte A89 (mlo-rorl-Doppelmu- tante) zeigt eine Penetrationseffizienz von ca. 20 bis 35 %. In keiner dieser Varianten war eine geänderte RacB Expression in- folge der Bgh-Inokulation zu beobachten (vgl. Beispiel 7; Fig. 3). Die Tatsache, dass auch in pathogen-e pfindlichen Wildtyp- Sorten wie Pallas oder Ingrid nur eine Penetration von ca. 50 % beobachtet werden kann, ist auf die stets vorhandene Basalresi- 5 stenz zurückzuführen.
Interessanterweise verstärkt das "Gene-Silencing" von hvRacB nur die Papillenbildung, aber anscheinend nicht den spontanen Zelltod der Pflanze - im Gegensatz zu Mio. Damit unterscheidet
10 sich HvRacB von OsRacl, einem Reis-Homolog von Racl (Ono E et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98:759-764). HvRacB wirkt vorwiegend als negativer Regulator der Papillenbildung. Für die Verwendung zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen ist dieser Unterschied von herausragender Bedeutung. Wie bereits oben be-
15 schrieben wird die Mio-Resistenz gegen biotrophe Pilze (z.B.
Mehltaupilze) zwar auch durch eine verstärkte Papillenbildung bedingt, ist jedoch mit einer höheren Anfälligkeit gegen nekrotro- phe Pilze teuer erkauft (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Ku ar J et al. (2001) Phytopathology
20 91:127-133). Da HvRacB nur die Papillenbildung beeinflusst, kann dieses Ambivalenz-Problem umgangen werden.
RacB ist aufgrund der oben genannten Befunde als Schlüsselelement für das erfolgreiche Eindringen eines Pathogens wie Bgh in die 25 pflanzliche Zelle zu verstehen. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet demnach alle Vorzüge der Mlo-Defizienz, ohne zugleich deren größten Nachteil - den erhöhten spontanen Zelltod - aufzuweisen.
30 Darüberhinaus ist das Verfahren allen Verfahren überlegen, bei denen ein pathogen-resistenter Phänotyp durch Überexpression eines resistenzvermittelnden Proteins realisiert wird. Das Ausschalten eines Gens, lässt sich ohne Expression eines (Fremd) -Proteins realisieren. Im Idealfall wird lediglich das
35 endogene Gen deaktiviert . Dies hat nicht zu vernachlässigende Vorteile bei der Zulassung und der Akzeptanz durch den Verbraucher, der Pflanzen mit Fremdproteinen oft mit Vorbehalt begegnet. Ganz besonders vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang die Verwendung von induzierbaren Promotoren zur Verminderung der
40 RacB-Proteinmenge, Aktivität oder Funktion, was beispielsweise bei Verwendung von pathogeninduzierbaren Promotoren eine Expression nur im Bedarfsfall (d.h. Pathogenbefall) ermöglicht.
Eine partielle Sequenz der Gerste RacB cDNA (HvRacB-cDNA) ist be- 5 schrieben (GenBank Acc.-No. : AJ290240) , die hochkonserviert zum Reis-RacB (GenBank Acc . -No . : AF250327) und Mais RacB (GenBank Acc.-No.: AF126053) und sehr ähnlich zum Reis Racl ist. Mais RacB ist auch eines der fünf Rac-Gene in der oben genannten Anmeldung WO 00/15815 (Sequenz Nr. 3) . Die vollständige kodierende Sequenz des HvRacB-Protein ist bislang nicht beschrieben (s. Beispiel 1). Gerste RacB hat eine Homologie von 95 % Identität zu Reis RacB und Mais RacB und ist mehr als 55 % identisch zu dem humanen RACl oder RAC2 (Hassanain et al. 2000, Fig. 1) . HvRacB wird konstitu- tiv in den Primärblättern der Gerste (epidermis-spezifisch) exprimiert und wird durch einen Bg -Befall nicht wesentlich in seiner Expressionshöhe beeinflusst. Insofern erfolgt die Expression in dem Gewebe, das unmittelbar mit dem Bgh-Pathogen interagier .
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf alle Pflanzenarten angewendet werden. Bevorzugt auf solche, in denen natür- licherweise ein RacB-Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben exprimiert wird. Da die Funktion von RacB in engem funktionellem Zusammenhang mit dem Mio-Gen steht und dieses in zahlreichen Pflanzen - auch in Dikotyledonen - identifiziert wurde (Devoto A et al. (1999) J Biol Chem 274 (49) :34993-5004) , ist eine ähnlich breite Verteilung auch für RacB und seine Homologen zu vermuten. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten RacB Sequenzen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen (beispielsweise Arabidopsis thaliana) können z.B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken - unter Verwendung der RacB-Sequenzen als Suchsequenz vzw. Sonde - leicht aufgefunden werde .
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches . Ein- geschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflansenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. "Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispiel- haft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinu , Heterocallis, Nemesis, Pelar- goniu , Panieu , Pennisetuia, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Loliu , Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Der Begriff "Pflanze" umfasst bevorzugt monokotyle Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis, Sorghum oder Hafer sowie Zuckerrohr.
Ferner umfasst der Begriff dikotyle Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
- Brassicacae wie Raps, Canola, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnen- gewachsen oder Erdnuss
- Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula,
Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Klee, Spinat, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Rübe, Rettich, Zuckerrübe, Süßkartoffel, Gurke, Chicoree, Blumenkohl, Brokkoli, Spargel, Zwiebel, Knoblauch, Sellerie, Erdbeere, Himbeere, Brombeere, Ananas, Avocado, und den verschiedenen Baum-, Strauch-, Nuss- und Weinarten. Baumarten umfasst bevorzugt Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Banane, Papaya, Mango, Apfel, Birne, Quitte.
Ferner umfasst sind Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen wie beispielhaft aber nicht einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weih- nachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsamina- ceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Im Rahmen der Erfindung sind solche Pflanzen bevorzugt, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, ganz besonders bevorzugt monokotyle Gattungen und Arten, wie die beschriebenen Getreidearten. Ganz besonders bevorzugt wird das Verfahren auf monokotyle Pflanzen, am meisten bevorzugt auf Pflanzen mit landwirtschaftlicher Bedeutung wie Weizen, Hafer, Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Triticale, Dinkel, Leinsamen oder Zuckerrohr angewendet.
"Pathogenresistenz" meint das Vermindern oder Abschwächen von Krankheitssymptomen einer Pflanze infolge eines Befalls durch ein Pathogen. Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrages, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel führen oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Erntegutes erschweren.
"Verleihen", "bestehen" , "erzeugen" oder "erhöhen" einer Pathogenresistenz meint, dass die Abwehrmechanismen einer bestimmten Pflanzenart oder -sorte durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu dem Wildtyp der Pflanze ("Ausgangs- pflanze"), auf den das erfindungsgemäße Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Bedingungen (wie beispielsweise Klima- oder Anbaubedingungen, Pathogenart etc.) eine erhöhte Resistenz gegen ein und mehr Pathogene aufweist. Dabei äußert sich die erhöhte Resistenz bevorzugt in einer verminderten Ausprägung der Krankheitssymptome, wobei Krankheitssymptome - neben den oben erwähnten Beeinträchtigungen - auch beispielsweise die Penetrationseffizienz eines Pathogens in die Pflanze oder pflanzliche Zellen oder die Proliferationseffizienz in oder auf denselben umfasst. Dabei sind die Krankheitssymptome bevorzugt um mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 % vermindert .
"Auswahl" meint in Bezug auf Pflanzen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangspflanze - die Resistenz gegen mindestens ein Pathogen besteht oder erhöht ist, all die Verfahren, die eine zur Erkennung einer vorliegenden oder erhöhten Pathogenresistenz geeignet sind. Dies können Symptome der Pathogen- infektion sein (z.B. Haustorium-Ausbildüng bei Pilzinfektion) aber auch die oben beschriebenen Symptome umfassen, die die Qualität der Pflanze, die Quantität des Ertrages, die Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel usw. betreffen.
"Pathogen" meint im Rahmen der Erfindung beispielsweise jedoch nicht einschränkend Viren oder Viroide, Bakterien, Pilze, tierische Schädlinge, wie beispielsweise Insekten oder Nematoden. Besonders bevorzugt sind Pilze wie beispielsweise der Mehltau. Es ist jedoch anzunehmen, dass die Verminderung der Expression eines RacB-Proteins, seiner Aktivität oder Funktion auch eine Resistenz gegen weitere Pathogene bewirkt. Veränderungen in der Zellwandstruktur können einen grundlegenden Mechanismus der Pathogenresistenz darstellen.
Beispielsweise jedoch nicht einschränkend seien nachfolgende Pathogene zu nennen:
1. Pilzpathogene oder pilz-ähnliche Pathogene:
Pilzpathogene oder pilz-ähnliche Pathogene (wie z.B. Chro i- sta) stammen vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Plasmodio- phoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomyceten, Zygo y- ceten, Basidiomycota und Deuteromyceten (Fungi imperfecti) . Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 und 2 genannten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 1: Pflanzliche Pilzerkrankungen
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Tabelle 2: Falscher Mehltau
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Erkrankung Pathogen
Leaf spots , minor Altemaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae = Hel inthosporium victoriae
(teleomorph: Cochliobolus victoriae) , C. sativus (anamorph: Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum) , Epicoccum nigrum, Exserohilu prolatum = Drechslera prolata (teleomorph: Setosphaeria prolata)
Graphium penicillioides, Leptosphaeria maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha,
(anamorph: Scolecosporiella sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S . zeina
Northern com leaf Setosphaeria turcica (anarnorph: blight (white blast, Exserohilum turcicum = Helmincrown stalk rot, stripe) thosporium turcicum)
Northern co leaf spot Cochliobolus carbonum (anamorph: Helminthosporium ear rot Bipolaris zeicola = Helminthosporium (race 1) carbonum)
Penicillium ear rot Penicillium spp. , P. chrysogenum, (blue eye, blue old) P. expansu , P. oxalicum
Phaeocytostroma stalk Phaeocytostroma ambiguum, = Phaeocyto- rot and root rot sporella zeae
Phaeosphaeria leaf spot Phaeosphaeria maydis = Sphaerulina maydis
Physalospora ear rot Botryosphaeria festucae = Physalospora (Botryosphaeria ear rot) zeicola (anamorph: Diplodia frumenti)
Purple leaf sheath Hemiparasitic bacteria and fungi
Pyrenochaeta stalk rot Phoma terrestris = and root rot Pyrenochaeta terrestris
Pythium root rot Pythium spp . , P. arrhenomanes, P. graminicola
Pythium stalk rot Pythium aphanidermatu = P. butleri L.
Red kernel disease (ear Epicoccum nigrum mold, leaf and seed rot)
Rhizoctonia ear rot Rhizoctonia zeae (teleomorph: Waitea (sclerotial rot) circinata)
Rhizoctonia root rot and Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae stalk rot
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Besonders bevorzugt sind
Plasmodiophoromycota wie Piasmodiophora brassicae (Kohl- hernie, clubroot of crucifers) , Spongospora subterranea (powdery scab of potato tubers) , Polymyxa graminis (root disease of cereals and grasses) ,
Oo ycota wie Bre ia lactucae (Falscher Mehltau an Salat) , Peronospora (Falscher Mehltau) bei snapdragon (P. antirrhini) , Zwiebel (P. destructor) , Spinat (P. effusa) , Sojabohne (P. manchurica) , Tabak ("blue mold" = Blauschimmel; P. tabacina) Alfalfa und Klee (P. trifolium) , Pseudo- peronospora humuli (Falscher Mehltau an Hopfen) , Plasmopara (Falscher Mehltau bei Trauben) (P. viticola) und Sonnenblume (P. halstedii) , Sclerophtohra macrospora (Falscher Mehltau bei Cerealien und Gäsern) , Pythium (seed rot, seedling da ping-off, and root rot and all types of plants, z.B. Wurzelbrand an Beta-Rübe durch P. debaryanum) , Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule bei Kartoffel, Braunfäule bei Tomate etc.), Albugo spec. (white rust on cruciferous plants .
Asσomycota wie Microdochium nivale {Schneeschimmel an Roggen und Weizen) , Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule v.a. bei Weizen), Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate), Blumeria graminis (Echter Mehltau an Gerste (f.sp. hordei) und Weizen (f.sp. tritici) ) , Erysiphe pisi (Erbsen- mehltau) , Nectria galligena (Obstbaumkrebs) , Uniσnula necator (Echter Mehltau der Weinrebe) , Pseudopeziza tracheiphila (Roter Brenner der Weinrebe) , Claviceps purpurea (Mutterkorn an z.B. Roggen und Gräsern), Gaeumannomyces graminis (Schwarzbeinigkeit an Weizen, Roggen u.a. Gräsern) , Magna- porthe grisea (rice blast disease) , Pyrenophora graminea (Streifenkrankheit an Gerste), Pyrenophora teres (Netzfleckenkrankheit an Gerste) , Pyrenophora tritici-repentis (Blattfleckenkrankheit (Blattdürre) an Weizen) , Venturia inaequalis (Apfelschorf) , Sclerotinia sclerotium (Weiß- stengeligkeit, Rapskrebs), Pseudopeziza medicaginis (Klappenschorf an Luzerne, Weiß- und Rotklee) .
- Basidiσmyceten wie Typhula incarnata (Typhula-Fäule an Gerste, Roggen, Weizen) , Ustilago maydis (Beulenbrand an
Mais) , Ustilago nuda (Flugbrand an Gerste) , Ustilago tritici (Flugbrand an Weizen, Dinkel) , Ustilago avenae (Flugbrand an Hafer) , Rhizoctonia solani (Wurzeltöter an Kartoffeln) , Sphacelotheca spp. (head smut of Sorghum) , Melampsora lini (rust of flax) , Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen, Hafer) , Puccinia recondita (Braunrost an Weizen) , Puccinia dispersa (Braunrost an Roggen) , Puccinia hordei (Braunrost an Gerste) , Puccinia coronata (Kronenrost an Hafer) , Puccinia striifor is (Gelbrost an Weizen, Gerste, Roggen sowie zahlreichen Gräsern) , Uromyces appendiculatus
(Bohnenrost) , Sclerotium rolfsii (root and ste rots of any plants) .
- Deuteromyceten (Fungi imperfecti) wie Septoria nodorum (Spelzenbräune) an Weizen (Septoria tritici) , Pseudocerco- sporella herpotrichoides (Halmbruchkrankheit an Weizen, Gerste, Roggen) , Rynchosporium secalis (Blattfleckenkrankheit an Roggen und Gerste) , Alternaria solani (Dürrfleckenkrankheit an Kartoffel, Tomate), Phoma betae (Wurzelbrand an Beta- Rübe) , Cercospora beticola (Cercospora-Blattfleckenkrankheit an Beta-Rübe), (Alternaria brassicae (Rapsschwärze an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern), Verticillium dahliae (Rapswelke und -Stengelfäule) , Colletotrichum lindemuthianum {Brennfleckenkrankheit an Bohne) , Phoma Ungarn - Umfallkrankheit (Schwarz- beinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps) ,
Botrytis cinerea (Grauschimmel an Weinrebe, Erdbeere, Tomate, Hopfen etc . ) .
Am meisten bevorzugt sind Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule, Braunfäule bei Tomate etc.), Microdochium nivale (vormals Fusarium nivale; Schneeschimmel an Roggen und Weizen) , Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule an Weizen) , Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate) , Blumeria graminis (Echter Mehltau an Gerste (f. sp. hordei) und Weizen (f. sp. tritici) ) , Magnaporthe. grisea (rice blast disease) , Sclerotinia sclerotium (Weißstengeligkeit, Rapskrebs) , Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen) , Alternaria brassicae (Rapsschwärze an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern), Phoma lingam (Umfallkrankheit, Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps) .
2. Bakterielle Pathogene :
Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 3 genannten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 3 : Bakterielle Erkrankungen
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Ganz besonders bevorzugt sind nachfolgende pathogene Bakterien: Corynebacterium sepedonicum (Bakterienringfäule an Kartoffel) , Erwinia carotovora (Schwarzbeinigkeit an Kartoffel) , Erwinia amylovora (Feuerbrand an Birne, Apfel, Quitte), Streptomyces scabies (Kartoffelschorf ) , Pseudomonas syringae pv. tabaci (Wildfeuer an Tabak) , Pseudomonas syringae pv . phaseolicola (Fett fleckenkrankheit an Buschbohne) , Pseudomonas syringae pv. tomato ( "bacterial speck" an Tomate ) , Xanthomonas campestris pv. malvacearum (Blatt fleckenkrankheit an Baumwolle) und Xanthomonas campestris pv . oryzae (Bakterienfäule an Reis und anderen
Gräsern) .
Virale Pathogene:
"Virale Pathogene" schließt sämtliche Pflanzenviren ein wie beispielsweise Tabak- oder oder Cucumber-Mosaiv Virus, Ringspot-Virus, Nekrose-Virus , Mais Dwarf-Mosaic Virus etc.
Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in
Tabelle 4 genannten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 4: Virale Erkrankungen
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4. Tierische Schädlinge
4.1 Insekten Pathogene:
Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien Insekten wie beispielsweise Käfer, Raupen, Läuse oder Milben zu nennen. Bevorzugt sind Insekten der Gattungen Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc.. Besonders bevorzugt sind Coleoptera and Lepidoptera Insekten, wie beispielsweise den Maiszünsler (European Corn Borer (ECB) ) , Diabrotica barberi ("northern corn rootworm") , Diabrotica undecim- punctata ("southern corn rootworm"), Diabrotica virgifera ("Western corn" rootworm" ) , Agrotis" ipsilon ("black cutworm"), Crymodes devastator ("glassy cutworm"), Feltia ducens ("dingy cutworm"), Agrotis gladiaria ("claybacked cutworm"), Melano- tus spp., Aeolus mellillus ( "wireworm" ) , Aeolus mancus ("wheat wireworm"), Horistonotus uhlerii ("sand wireworm"), Sphenophorus maidis ("maize billbug") , Sphenophorus zeae ("timothy billbug"), Sphenophorus parvulus ("bluegrass billbug"), Sphenophorus callosus ("southern corn billbug"), Phyllogphaga spp. ("white grubs"), Anuraphis maidiradicis ("corn root aphid"), Delia platura ("seedcorn maggot"), Colaspis brunnea ("grape colaspis"), Stenolophus lecontei ("seedcorn beetle") und Clivinia impressifrons ("lender seedcorn beetle") .
Ferner sind zu nennen: Das Getreidehähnchen (Oulema melanopus) , die Fritfliege (Oscinella frit) , Drahtwürmer
(Agrotis lineatus) und Blattläuse (wie z.B. Haferblattlaus Rhopalosiphum padi, Grosse Getreideblattlaus Sitobion avenae) .
4.2 Nematoden:
Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 6 genannten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
Tabelle 6 : Parasitäre Nematoden
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Ganz besonders bevorzugt sind Globodera rostochiensis und G. pallida (Zystenälchen an Kartoffel, Tomate u.a. Nachtschattengewächsen) , Heterodera schachtii (Rübenzystenälchen an Zuckerund Futterrübe, Raps, Kohl etc.), Heterodera avenae (Haferzystenälchen an Hafer u.a. Getreidearten) , Ditylenchus dipsaci (Stengel- oder Stockälchen, Rübenkopfälchen an Roggen, Hafer, Mais, Klee, Tabak, Rübe), Anguina tritici (Weizenälchen, Radekrankheit an Weizen (Dinkel, Roggen) , Meloidogyne hapla (Wurzelgallenälchen an Möhre, Gurke, salat, . tomate, Kartoffel, Zuckerrübe, Luzerne) .
Als für die einzelnen Sorten bevorzugte Pilz- oder Virus-Patho- gene sind beispielsweise zu nennen.-
1. Gerste:
Pilz-, bakterielle und virale Pathogene: Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem rust), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. hordei (Barley Powdery Mildew), barley yellow dwarf virus (BYDV) , Pathogene Insekten / Nematoden: Ostrinia nubilalis (European corn borer) ; Agrotis ipsilon (black cutworm) ,- Schizaphis gra- minum (greenbug) ; Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug) ; Acrosternum hilare (green stink bug) ; Euschistus servus (brown stink bug) ; Deliaplatura (seedcorn maggot) ; Mayetiola destructor (Hessian fly) ; Petrobia latens (brown wheat ite) .
2. Sojabohne:
Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene: Phytophthora megas- per a fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. so ae (Phomopsis sojae) , Diaporthe phaseo- lorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kiku- chii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colleto- trichum dematium (Colletotrichum truncatum) , Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, Sojabohnen Mosaikvirus, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus, Tobacco Streak virus, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphaniderm tum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato spotted wilt virus , Heterodera glycines Fusarium solani .
Pathogene Insekten / Nematoden: Pseudoplusia includens (soy- bean looper) ; Anticarsia gemmatalis (velvetbean Caterpillar) ; Plathypena scabra (green cloverworm) ; Ostrinia nubilalis (European corn borer) ; Agrotis ipsilon (black cutworm) ; Spodop- tera exigua (beet armyworm) ; Heliothis virescens (cotton bud- worm) ,- Helicoverpa zea (cotton bollworm) ; Epilachna varive- stis (Mexican bean beetle) ; Myzus persicae (green peach aphid) ; Empoasca fabae (potato leaf hopper) ; Acrosternum hilare (green stink bug) ,- Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper) ; Melanoplus differentialis (differential grass- hopper) ; Hylemya platura (seedcorn maggot) ; Sericothrips va- riabilis (soybean thrips) ; Thrips tabaci (onion thrips) ; Te- tranychus turkestani (strawberry spider mite) ; Tetranychus urticae (twospotted spider mite) ;
Canola:
Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia so- lani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola,
Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata. Älfalfa :
Pilz , , bakterielle oder virale Pathogene : Clavibater michiga- nese subsp . insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irreguläre, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphaniderma- tum, Phytophthora megasperma , Peronospora trifoliorum, Phoma edicaginis var . medicaginis , Cercospora medicaginis , Pseudopeziza medicaginis , Leptotrochila medicaginis , Fusarium, Xanthomonas campestris p .v. alfalfae, Aphanomyces euteiches , Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae .
Weizen:
Pilz-,bakterielle oder virale Pathogene: Pseudomonas syringae -p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocerco- sporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley Yellow Dwarf Virus, Brome Mosaic Virus, Soil Borne Wheat Mosaic Virus, Wheat Streak Mosaic Virus, Wheat Spindle Streak Virus, American Wheat Striate Virus, Claviσeps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrheno annes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, High Plains Virus, European wheat striate virus, Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat ste rust), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (Wheat Powdery Mildew)
Pathogene Insekten / Nematoden: Pseudaletia unipunctata (army worm) ; Spodoptera, frugiperda (fall armyworm) ; Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer) ; Agrotis orthogonia (we- stern cutworm) ; Elasmopalpus Zignosellus (lesser cornstalk borer) ; Oule a melanopus (cereal leaf beetle) ; Hypera punc- tata (clover leaf weevil) ; Diabrotica undecimpunctata howardi (southern corn rootworm) ,- Russian wheat aphid; Schizaphis graminum (greenbug) ; Macrosiphum avenae (English grain aphid) ; Melanoplus femurrübrum (redlegged grasshopper) ,- Melanoplus differentialis (differential grasshopper) ; Melano- plus sanguinipes (migratory grasshopper) ; Mayetiola destructor (Hessian fly) ; Sitodiplosis mosellana (wheat midge) ; Meromyza americana (wheat ste maggot) ; Hylemya coarctata (wheat bulb fly) ; Frankliniella fusca (tobacco thrips) ; Cephus cinctus (wheat stem sawfly) ; Aceria tulipae (wheat curl mite) ;
6. Sonnenblume :
Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene: Plasmophora halste- dii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria he- lianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zi niae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macropho- mina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis .
Pathogene Insekten / Nematoden: Suleima helianthana (sunflo- wer bud moth) ; Homoeosoma electellum (sunflower moth) ; zygo- gramma exclamationis (sunflower beetle); Bothyrus gibbosus (carrot beetle) ; Neolasioptera murtfeldtiana (sunflower seed midge) ;
Mais :
Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium onili- forme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum) , Stenocarpella maydi (Diplodia maydis) , Pythium irregul re, Pythium debarya- num, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoder a maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macro- phomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequa- lis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Wheat Streak Mosaic Virus, Maize Chlorotic Dwarf Virus, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, Maize Chlorotic Mottle Virus, High Plains Virus, Maize Mosaic Virus, Maize Rayado Fino Virus, Maize Streak Vi- rus (MSV, Maisstrichel-Virus) , Maize Stripe Virus, Maize Rough Dwarf Virus.
Pathogene Insekten / Nematoden: Ostrinia nubilalis (European corn borer) ; Agrotis ipsilon (black cutworm) ; Helicoverpa zea (corn earworm) ; Spodoptera frugiperda. (fall armyworm) ; Dia- traea grandiosella (southwestern corn borer) ; Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer) ; Diatraea saccharalis (surgarcane borer) ; Diabrotica virgifera (western corn rootworm) ; Diabrotica longicornis barberi (northern com rootworm) ; Diabrotica undecimpunctata howardi (southern co rootworm) ; Melanotus spp. (wireworms) ; Cyclocephala borealis (northern masked chafer; white grub) ; Cyclocephala immaculata (southern masked chafer; white grub) ; Popillia japonica (Japanese beetle) ; Chaetocnema pulicaria (corn flea beetle) ; Sphenophorus maidis (maize billbug) ; Rhopalosiphum maidis
(corn leaf aphid) ; Anuraphis aidiradicis (corn root aphid) ,- Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug) ; Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper) ; Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper) ; Hylemva platura (seedcorn maggot) ; Agromyza parvicornis (corn blot leafminer) ; Anaphothrips obscrurus (grass thrips) ; Solenopsis milesta (thief ant) ; Tetranychus urticae (twospotted spider mite) .
8. Sorghu :
Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola) , Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorg- hina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campes- tris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium onilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans) , Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Spori- sorium reilianum (Sphacelotheca reiliana) , Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Sugarcane mosaic H, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Perono- sclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola.
Pathogene Insekten / Nematoden: Chilo partellus (Sorghum bo- rer) ; Spodoptera frugiperda (fall armyworm) ; Helicoverpa zea (com ear-worm) ; Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer) ; Feltia subterranea (granulate cutworm) ; Phvllophaga crinita (white grub) ; Eleodes, Conoderus und Aeolus spp. (wireworm) ; Oulema melanopus (cereal leaf beetle) ; Chaetocnema pulicaria (corn flea beetle) ; Sphenophorus maidis (maize billbug) ; Rhopalosiphum maidis (corn leaf aphid) ; Siphaflava (yellow sugarcane aphid) ; Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug) ; Contarinia sorghicola (sorghummidge) ; Tetrany- chus cinnabarinus (carmine spider mite) ; Tetranychus urticae (two spotted spider mite) .
9. Baumwolle:
Pathogene Insekten / Nematoden: Heliothis virescens (cotton budworm) ; Helicoverpa zea (cotton bollwor ) ; Spodoptera ex- igua (beet armyworm) ; Pectinophora gossypiella (pink bollworm) ; Änthonomus grandis grandis (boll weevil) ; Aphis gossy- pii (cotton aphid) ; Pseudatomoscelis seriatus (σotton flea- hopper) ; Trialeurodes abutilonea (bandedwinged whitefly) ; Lygus lineolaris (tarnished plant bug) ; Melanoplus fe ur- rubrum (redlegged grasshopper) ; Melanoplus differentialis (differential grasshopper) ; Thrips tabaci (onion thrips) ; Franklinkiella fusca (tobacco thrips) ; Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite) ; Tetranychus urticae (two- spotted spider mite) ;
10. Reis:
Pathogene Insekten / Nematoden: Diatraea saccharalis (sugar- cane borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (corn earworm) ; Colaspis brunnea (grape colaspis) ; Lissorhoptrus oryzophilus (rice water weevil); Sitophilus oryzae (rice weevil) ; Nephotettix nigropictus (rice leafhopper) ; Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug) ,- Acroster- num hilare (green stink bug) ;
11. Raps :
Pathogene Insekten / Nematoden: Brevicoryne brassicae (cab- bage aphid) ; Phyilotreta crucif erae (Flea beetle) ; Mamestra conjgurata (Bertha armyworm) ; Plutella xylostella (Diamondback moth) ; Delia ssp. (Root maggots) .
"RacB-Protein" meint im Rahmen der Erfindung das RacB-Protein aus Gerste gemäß SEQ ID NO: 2, sowie seine Homologen aus Reis (Oryza sative) gemäß SEQ ID NO: 4 und Mais (Zea mays) gemäß SEQ ID NO: 6 als auch funktioneile Äquivalente der vorgenannten.
"Proteinmenge" meint die Menge eines RacB-Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zell- kompartiment . "Verminderung" der Proteinmenge meint die mengenmäßige Verminderung der Menge eines RacB-Proteins in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment
- beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren - im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc . ) . Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 %.
""Aktivität" meint bevorzugt die GTPase Aktivität eines RacB-Poly- peptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment. "Verminderung" der Aktivität meint die Verminderung der Gesamt-Aktivität eines RacB-Proteins in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment
- beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren - im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc . ) . Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 %.
"Funktion" meint bevorzugt die Substratbindekapazität eines RacB- Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment. Als Substrate kommen niedermolekulare Verbindungen wie GTP aber auch die Proteininteraktionspartner eines RacB-Proteins in Frage. "Verminderung" der Funktion meint beispielsweise die mengenmäßige Verminderung der Bindekapazität oder Bindestärke eines RacB-Proteins zu mindestens einem Substrat in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment - beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren - im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc . ) . Unter Verminderung ist auch die Ver- änderung der Substratspezifität zu verstehen, wie sie beispielsweise durch den kcat/Km-Wert ausgedrückt werden kann. Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20%, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 %. Bindepartner für RacB können beispielsweise durch das Hefe-2-Hybridsystem in der dem Fachmann geläufigen Weise identifiziert werden.
Verfahren zur Bestimmung der Proteinmenge, der Aktivität von GTPasen oder der Substratbindekapazität sind dem Fachmann bekannt und vielfach für GTPasen, wie auch für Rac-Proteine aus verschiedenen Gattungen und Arten beschrieben (u.a. Benard V et al. (1999) J Biol Chem 274 (19) : 13198-204;Burstein ES (1998) Oncogene. 17(12) .1617-23) .
"Funktionelle Äquivalente" eines RacB-Proteins meint bevorzugt solche Sequenzen, die von einem RacB-Protein beschrieben durch SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 abgeleitet oder zu diesem homolog sind und im wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweisen.
"Im wesentlichen gleiche Eigenschaften" eines funktioneilen Äquivalentes meint vor allem die Verleihung eines pathogenresistenten Phänotypes oder die Verleihung oder Steigerung der Pathogenresistenz gegen zumindest ein Pathogen bei Verminderung der Protein- menge, Aktivität oder Funktion des besagten funktioneilen RacB Äquivalentes in einer Pflanze bzw. in einem Gewebe, Teil oder Zellen derselben. Ferner ist das Ausbleiben eines spontan-indu- zierten Zelltodes bei besagter Verminderung der Proteinmenge, Aktivität oder Funktion des funktionellen Äquivalentes als wesentliche Eigenschaft zu verstehen.
Dabei kann die Effizienz der Pathogenresistenz sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Wert erhalten bei Verminderung eines der RacB-Proteine gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 abweichen. Bevorzugt sind solche funktioneile Äquivalente, bei denen sich die Effizienz der Pathogenresistenz - gemessen beispielsweise an der Penetrationseffizienz eines Pathogens (Haustoriumbildung) - um nicht mehr als 50 %, bevorzugt 25 %, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert erhalten unter Verminderung eines RacB-Proteins gemäß NO:2, 4 oder 6 unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, bei deren Verminderung die Effizienz der Pathogenresistenz quanti- tativ um mehr als 50 %, bevorzugt 100 %, besonders bevorzugt 500 %, ganz besonders bevorzugt 1000 % einen Vergleichswert erhalten bei Verminderung eines der RacB-Protein gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 übersteigt.
Der Vergleich wird bevorzugt unter analogen Bedingungen durch geführt. "Analoge Bedingungen" bedeutet, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Kultur- oder Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate, Pathogen- konzentration etc.) zwischen den zu vergleichenden Versuchen identisch gehalten werden und die Ansätze sich allein durch die Sequenz der zu vergleichenden RacB-Polypeptide, ihrem Ursprungsorganismus und gegebenenfalls dem Pathogen unterscheiden. Bei Wahl des Pathogens ist für den Vergleich jeweils das Pathogen zu wählen, das dem jeweils anderen - unter Berücksichtigung der Artspezifität - am nächsten kommt.
"Funktionelle Äquivalente" meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der RacB-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 sowie homologe Polypeptide aus anderen Pflanzen, welche weiterhin im wesentlichen gleiche Eigenschaften aufweisen. Bevorzugt sind homologe Polypeptide aus oben beschriebenen bevorzugten Pflanzen. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten RacB Sequenzen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen (beispiels- weise Arabidopsis thaliana) können z.B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken - unter Verwendung der RacB-Sequenzen als Suchsequenz vzw. Sonde - leicht aufgefunden werden.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste. Somit werden beispielsweise auch solche Polypeptide durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation eines Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 erhält.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatσh: 0 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurefoasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programm- algorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge ver- standen, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, Uni ersity of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2, 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einem der erfindungsgemäßen Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 durch Substitution, Insertion oder Deletion, haben eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % zu einem der erfindungsgemäßen Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 und zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Eigenschaften wie das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 aus .
Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 durch Substitution, Insertion oder Deletion, haben eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % zu einem der erfindungsgemäßen Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 und kodieren für Polypeptide mit im wesentlichen den gleiche Eigenschaften wie das Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6.
Bevorzugt weisen die als funktioneile Äquivalente umfassten racB- Proteine mindestens eines der nachfolgenden sequenzmotive auf: a) Eine Gl-Elementes GXXXXGKS/T bevorzugt im N-terminalen Bereich. Ganz besonders bevorzugt ein Element mit der Sequenz GDGAVGKT, am meisten bevorzugt ein Element mit der Sequenz KCVTVGDGAVGKTC .
b) Eine G2-Effektorregion beinhaltend ein Sequenzmotiv mit PTVFDN, besonders bevorzugt NTFPTDYVPTVFDNFSANW.
c) Ein G3-Elemente beinhaltend LWDTAGQ, besondes bevorzugt NLGLWDTAGQEDYN
d) Ein G4-Elementes TKXD, besonders bevorzugt TKLD, ganz besonders bevorzugt LVGTKLDLRDDKQ
e) Ein. G5.Elementes EXS,.. bevorzugt ECSS, ganz besonder bevorzugt ECSSKTG
f) Ein C-terminales Isoprenylierungsmotives (CXXX, Hassanain HH et al. (2000) Biochem Biophys Res Com un. 272 (3) :783-8.) , besonders bevorzugt CSIL.
Besonders bevorzugt kommen mindestens 2 oder 3 dieser Motive (a bis f) in einem funktioneil äquivalenten RacB-Protein vor, ganz besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, am meisten bevor- zugt alle Motive a bis f. Weitere RacB typischen Sequenzmotive, insbesondere auch Motive zur Abgrenzung gegen Racl-Proteine, kann der Fachmann unschwer aus dem Sequenzvergleich der bekannten RacB (bzw. Raσl) Proteine - wie in Fig. 1 dargestellt - ableiten.
Beispiele für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu vermindernden funktioneilen Äquivalente zu den RacB-Proteinen gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, durch Homologievergleiche aus Datenbanken auffinden.
Auch die Durchmusterung von cDNA- oder genomischen-Bibliotheken anderer Organismen, bevorzugt von den weiter unten genannten als Wirt zur Transformation geeigneten Pflanzenarten, unter Verwendung der unter SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 beschriebene Nukleinsäure- sequenzen oder Teilen derselben als Sonde, ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren, um Homologe in anderen Arte zu identifizieren. Dabei haben die von den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 abgeleiteten Sonden eine Länge von mindestens 20 bp, bevorzugt mindestens 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 100 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 bp, am meisten bevorzugt mindestens 400 bp. Für die Durchmusterung der Bibliotheken kann auch ein zu den unter SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 beschriebenen Sequenzen komplementärer DNA-Strang eingesetzt werden.
Funktionelle Äquivalente umfasst demgemäß DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der durch SEQ ID NO:l, 3 oder 5 beschriebenen RacB Nukleinsäuresequenz, der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenz oder teilen der vorgenannten hybridisieren und als vollständige Sequenzen für Proteine kodieren, die die gleichen Eigenschaften, wie die unter SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 beschriebenen Proteine verfügen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungs- bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschriebe .
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0, 3M Natriumeitrat, 3M NaCl, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein.-
a) 4X SSC bei 65°C,
b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C,
d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, Lachssperma- DNA bei 68°C,
e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C.
f) 50 % Formamid, 4XSSC bei 42°C, oder
g) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1 %
Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumeitrate bei 42°C, oder
h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung),
i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung) .
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumeitrat/0, 1 % SDS bei 50°C.
b) 0.1X SSC bei 65°C.
c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C.
d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C.
e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C.
f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) .
Funktionelle Äquivalente abgeleitet von einem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 umfasst insbesondere auch die Proteine mit der SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 oder 70. Insbesondere meint funktionelle Äquivalente Proteine, die durch eine Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 oder 69 kodiert werden. Die Verminderung der Expression eines RacB-Proteins, der RacB- Aktivität oder der RacB-Funktion kann auf vielfältige Art und Weise realisiert werden.
"Verminderung" oder "vermindern" ist im Zusammenhang mit einem RacB Protein, einer RacB Aktivität oder RacB-Funktion weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität eines RacB-Proteins in einer Pflanze oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen. Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmäßige Verringerung eines RacB-Proteins bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des RacB-Proteins (d.h. fehlende Nachweisbarkeit von RacB-Aktivität bzw. RacB-Funktion oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des RacB-Proteins) . Dabei wird die Expression eines bestimmten RacB-Proteins oder die RacB-Aktivität bzw. RacB-Funktion in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um mehr als 50 %, besonders bevorzugt um mehr als 80 %, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90% vermindert .
Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verminderung der Expression eines RacB-Proteins, der RacB-Aktivität oder RacB- Funktion umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung stehen, um die Expression eines RacB-Proteins, die RacB-Aktivität oder die RacB-Funktion in gewünschter Weise zu beeinflussen.
Eine Verminderung der RacB-Aktivität oder der RacB-Funktion wird bevorzugt durch eine verminderte Expression eines endogenen RacB- Proteins erreicht .
Eine Verminderung der RaσB-Proteinmenge, RacB-Aktivität oder RacB-Funktion kann unter Verwendung nachfolgender Verfahren realisiert werden:
a) Einbringung einer doppelsträngigen RacB RNA-Nukleinsäure- sequenz (RacB-dsRNA) oder einer deren Expression gewähr- leistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten;
b) Einbringung einer RacB antisense-Nukleinsäuresequenzen oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette. Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die antisense-Nukleinsäuresequenz gegen ein RacB-Gen (also genomische DNA-Sequenzen) oder ein RacB-Gentranskript (also RNA-Sequenzen) gerichtet ist. Umfasst sind auch α-anomere Nukleinsäuresequenzen.
c) Einbringung einer RacB antisense-Nukleinsäuresequenzen kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
d) Einbringung von RacB sense-Nukleinsäuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
e) Einbringung einer Nukleinsäuresequenz kodierend für dominant-negatives RacB Protein oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
f) Einbringung DNA-oder Protein-bindende Faktoren gegen RacB -Gene, -RNAs oder -Proteine oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
g) Einbringung von den RacB RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten oder einer deren Expression gewährleistenden Expressiσns- kassette
h) Einbringung von Konstrukten zur Induktion einer homologen Rekombination an endogenen RacB-Genen beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten.
i) Einführung von Mutationen in endogenen RacB Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z.B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)
Dabei kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der RacB-Expression, RacB-Aktivität oder RacB-Funktion im Sinne der Erfindung bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung des RacB- Proteins, des Transports des RacB-Proteins oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens , Induktion eines RacB-RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termination umfassen.
Die einzelnen bevorzugten Verfahren seien infolge kurz beschrieben: Einbringung einer doppelsträngigen RacB RNA-Nukleinsäure- sequenz (RacB-dsRNA)
Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference" ; dsRNAi) ist vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z.B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364) . Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Eine effiziente Gensuppression kann auch bei transienter Expression oder nach transienter Transformation beispielsweise infolge einer biolistischen Transformation* gezeigt werden (Schweizer -P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903) . dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplementären Strang- und Gegenstrang eines Gentranskriptes eine hocheffiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens bewirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechenden knock-out Mutanten sehr ähnlich (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95:13959-64) .
Das dsRNAi-Verfahren hat sich bei der Verminderung der RacB- Expression als besonders effizient und vorteilhaft erwiesen. Wie u.a. in WO 99/32619 beschrieben sind dsRNAi-Ansätze klassischen antisense-Ansätzen deutlich überlegen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich daher auf doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNA-Moleküle) , die bei Einführung in eine Pflanze (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Samen) die Verminderung eines RacB bewirken.
Das doppelsträngiges RNA-Molekül zur Verminderung der Expression eines RacB Proteins ist dadurch gekennzeichnet, dass
a) einer der beiden RNA Stränge im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil einer RacB-Nukleinsäure- sequenz, und
b) der jeweils andere RNA Strang im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil des komplementären Stranges einer RacB Nukleinsäuresequenz . In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfasst das doppelsträngige RNA-Molekül zur Verminderung der Expression eines RacB Proteins
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB Protein, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementären ist.
In Bezugt auf die doppelsträngigen RNA-Moleküle meint RacB- Nukleinsäuresequenz bevorzugt eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:
1, 3 oder 5 oder ein funktionelles Äquivalent derselben gemäß SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 oder 69
Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der RacB Zielsequenz oder einer funktioneil äquivalenten Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirken. Bevorzugt be- trägt die Homologie nach obiger Definition mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkript s einer Nukleinsäurese- quenz kodierend für ein RacB Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben (bzw. zwischen dem "antisense"-Strang dem komplementären Strang einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben) .
Die Länge des Teilabschnittes beträgt mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 25 Basen, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen.
Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Speicherprotein Gentranskriptes zu hy- bridisieren (z.B. in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70CC für 12 bis 16 h) . "Im wesentlichen komplementär" meint, dass der "antisense"- RNA-Strang auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement des "sense"-RNA- Stranges aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie min- destens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 100% zwischen dem "antisense"-RNA-Strang und dem Komplement des "sense"-RNA-Strangs .
"Teil des "sense"-RNA-Transkriptes" einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben meint Fragmente einer RNA oder mRNA transki- biert von einer für ein RacB-Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben kodierenden Nukleinsäuresequenz , bevor- zugt von einem RacB-Gen. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von mindestens 20 Basen, bevorzugt mindestens 50 Basen, besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 500 Basen. Umfasst ist auch die vollstän- dige transkribierte RNA oder mRNA.
Umfasst ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen dsRNA- Moleküle in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung einer Pathogenresistenz in Pflanzen.
Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen polymerisierter Ribonukleotide bestehen. Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside vorliegen. Beispielsweise können die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Solche und weitere Modifikationen sind weiter unten bei den Verfahren zur Stabilisierung von antisense-RNA beschrieben.
Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequenzabschnitte umfassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden.
Die dsRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemischsynthetisch hergestellt werden. Die doppeisträngige dsRNA Struktur kann ausgehend von zwei komplementären, separaten RNA-Strängen oder - bevorzugt - ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären RNA- Strang gebildet werden.
Bei einem einzelnen, selbstkomplementären Strang, können "sense"- und "antisense"-Sequenz durch eine verbindende Sequenz ("Linker") verknüpft sein und beispielsweise eine Haarnadeistruktur ausbilden. Bevorzugt kann die verbindende Sequenz ein Intron sein, das nach Synthese der dsRNA heraus- gespleißt wird.
Die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptions- terminationssignale oder Polyadenylierungssignale.
Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies auf verschiedene Art geschehen:
a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst,
b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.
c) Kreuzung von zwei Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.
Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden. Wie in WO 99/53050 kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch einen "Linker" (beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie ledigliσh die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.
Die Expressionskassetten kodierend für den "antisense"- oder "sense"-Strang einer dsRNA oder für den selbstkomplementären- Strang der dsRNA, werden bevorzugt in einen Vektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren stabil (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkem) in das Genom einer Pflanze insertiert, um eine dauerhafte Expression der dsRNA zu gewährleisten.
Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingeführt werden, die zumindest ein Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z.B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken.
Wie bereits beschrieben, ist eine 100%ige Sequenzidentitat zwischen dsRNA und einem RacB Gentranskript oder dem Gentranskript eines funktioneil äquivalenten Gens nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der RacB Expression zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie- infolge genetischer Mutationen, Poly orphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise möglich mit der dsRNA, die ausgehend von der RacB Sequenz des einen Organismus generiert wurde, die RacB Expression in einem anderen Organismus zu unterdrücken. Die hohe Sequenzhomologie zwischen den RacB Sequenzen aus Reis, Mais und Gerste lässt auf einen hohen Konservierungsgrad dieses Proteins innerhalb von Pflanzen schließen, so dass die Expression einer dsRNA abgeleitet von einer der offenbarten RacB Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 auch einen vor- teilhaften Effekt in anderen Pflanzenarten haben dürfte.
Auch ist es aufgrund der hohen Homologie zwischen den einzelnen RacB-Proteinen und ihren funktionellen Äquivalenten möglich mit einer einzigen dsRNA, die ausgehend von einer be- stimmten RacB-Sequenz eines Organismus generiert wurde, die Expression weiterer homologer RacB-Proteine und/oder deren funktioneller Äquivalente des gleichen Organismus oder aber auch die Expression von RacB-Proteinen in anderen verwandten Arten zu unterdrücken. Zu diesem Zweck umfasst die dsRNA be- vorzugt Sequenzbereich von RacB-Gentranskripten, die konservierten Bereichen entsprechen. Besagte konservierte Bereiche können aus Sequenzvergleichen leicht abgeleitet werden.
Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Dazu kann eine DNA-Sequenz kodierend für eine dsRNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle mindestens eines genetischen Kontrollelementes (wie beispielsweise Promotor, Enhancer, Silencer, Splice-Donor oder -Akzeptor, Poly- adenylierungssignal) gebracht werden. Entsprechend vor- teilhafte Konstruktionen sind weiter unten beschrieben. Eine Polyadenylierung ist nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur Initiierung einer Translation vorhanden sein.
Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Dazu können zelluläre RNA Polymerasen oder Bakterio- phagen RNA Polymerasen (wie z.B. T3-, T7- oder SP6 RNA- Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro syntetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Die dsRNA kann unmittelbar in die Zelle eingeführt werden oder aber auch extrazellulär (z.B. in den interstitialen Raum) appliziert werden.
Bevorzugt wird die Pflanze jedoch stabil mit einem Expressionskonstrukt, das die Expression der dsRNA realisiert, transformiert. Entsprechende Verfahren sind weiter unten beschrieben.
Einbringung einer RacB antisense-Nukleinsäuresequenz
Verfahren zur Suppression eines bestimmten Proteins durch Verhinderung der Akkumulation seiner mRNA durch die "antisense"-Technologie sind vielfach - auch in Pflanzen - beschrieben (Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN et al. (1990) FEBS Lett
268 (2) :427-430) . Das antisense Nukleinsäure olekül hybridisiert bzw. bindet mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA kodierend für das zu supprimierende RacB-Ziel- protein. Dadurch wird die Transkription und/oder Translation des Zielproteins unterdrückt. Die Hybridisierung kann auf konventionelle Art über die Bildung einer stabilen Duplex oder - im Fall von genomischer DNA - durch Bindung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit der Duplex der genomischen DNA durch spezifische Wechselwirkung in der großen Furche der DNA-Helix entstehen.
Eine antisense Nukleinsäuresequenz geeignet zur Verminderung eines RacB-Proteins kann unter Verwendung der für dieses Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, beispielsweise der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5, oder der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent derselben, beispielsweise einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 oder 69, nach den Basenpaarregeln von Watson und Crick abgeleitet werden. Die antisense Nukleinsäuresequenz kann zu der gesamten transkribierten mRNA des besagten Pro- teins komplementär sein, sich auf die kodierende Region beschränken oder nur aus einem Oligonukleotid bestehen, das zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz der mRNA komplementär ist. So kann das Oligonukleotid beispielsweise komplementär zu der Region sein, die den Translations- start für das besagte Protein umfasst. Antisense-Nukleinsäu- resequenzen können eine Länge von zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide haben, können aber auch länger sein und mindestens 100, 200, 500, 1000, 2000 oder 5000 Nukleotide umfassen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können rekombinant exprimiert " oder chemisch bzw". enzymatisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Bei der chemischen Synthese können natürlich oder modifizierte Nukleotide verwendet werden. Modifizierte Nukleotide können der antisense Nukleinsäuresequenz eine er- höhte biochemische Stabilität verleihen und zu einer erhöhten physikalischen Stabilität der Duplex gebildet aus antisense- Nukleinsäuresequenz und sense-Zielsequenz führen. Verwendet werden können beispielsweise Phosphorothioatderivative und Acridin-substitierte Nukleotide wie 5-Fluorouracil, 5-Bromo- uracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5- (Carboxyhydroxylmethyl) racil, 5-Carboxy- methylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyl- uracil, Dihydrouracil, ß-D-Galactosylqueosin, Inosine, N6-Isopentenyladenin, '1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin,
3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio- uracil, ß-D-mannosylqueosin, 5 ' -Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil- 5-oxyessigsäure, Pseudouracil , Queosine, 2-Thiocytosin,
5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil , 5-Methyl- uraσil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessig- säure, 5-Methyl- 2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxy- propyl)uracil und 2 , 6-Diaminopuri .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Expression eines RacB-Proteins durch Nukleotidsequenzen inhibiert werden, die komplementär zu der regulatorisehen Region eines RacB-Gens (z.B. einem RacB Promoter und/oder Enhancer) sind und triple-helikale Strukturen mit der dortigen DNA-Doppelhelix ausbilden, so dass die Transkription des RacB-Gens vermindert wird. Entsprechende Verfahren sind be- schrieben (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6 (6) -.569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sei 660:27-36; Mäher LJ (1992) Bioassays 14 (12) : 807-815 ) .
In einer weiteren Ausführungsform kann das antisense Nuklein- 5 säuremolekül eine α-anomere Nukleinsäure sein. Derartige α-anomere Nukleinsäuremoleküle bilden spezifische doppel- strängige Hybride mit komplementärer RNA in denen - im Unterschied zu den konventionellen ß-Nukleinsäuren - die beiden Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier C et al.
10 (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). Das antisense
Nukleinsäuremolekül kann ferner auch 2 ' -O-Methylribonukleo- tide (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148) oder chimäre RNA-DNA Analoge beinhalten (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215:327-330).
15. c) Einbringung einer RacB antisense-Nukleinsäuresequenz kombiniert mit einem Ribozym.
Vorteilhaft kann die oben beschriebene antisense-Strategie
20 mit einem Ribozy-Verfahren gekoppelt werden. Katalytische
RNA-Moleküle oder Ribozyme können an jede beliebige Ziel-RNA angepasst werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 5 23 (3) :257-275) . Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält. Der Einbau von Ribozymsequenzen in "antisense"-RNAs verleiht eben diesen "antisense"-RNAs diese enzymähnliche, 0 RNA-spaltende Eigenschaft und steigert so deren Effizienz bei der Inaktivierung der Ziel-RNA. Die Herstellung und Verwendung entsprechender Ribozym-"antisense"-RNA-Moleküle ist beispielsweise beschrieben bei Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591. 5
Auf diese Art können Ribozyme (z.B. "Hammerhead"-Ribozyme; Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591) verwendet werden, um die mRNA eines zu supprimierenden Enzyms - z.B. RacB - katalytisch zu spalten und die Translation zu ver- 0 hindern. Die Ribozym-Technologie kann die Effizienz einer antisense-Strategie erhöhen. Verfahren zur Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine sind beschrieben in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). In pflanzlichen Zellen ist eine Ribozym-Expression 5 ebenfalls beschrieben (Steinecke P et al. (1992) EMBO
J 11(4) :1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250 (3) :329-338) . Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant
Mol Biol. 18(2) :353-361; Lloyd AM and Davis RW et al . (1994) Mol Gen Genet. 242 (6) : 653-657) . Beispielsweise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu supprimierenden RacB Proteins aufweisen (siehe auch US 4,987,071 und US 5,116,742). Alternativ können solche Ribozyme auch über einen Selektionsprozess aus einer Bibliothek diverser Ribozyme identifiziert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418).
Einbringung einer RacB sense-Nukleinsäuresequenz zur Induktion eines Kosuppression
Die Expression einer RacB Nukleinsäuresequenz in sense- Orientierung kann zu einer Kosuppression des entsprechenden homologen, endogenen Gens führen. Die Expression von sense- RNA mit Homologie zu einem endogenen Gen kann die Expression desselben vermindern oder ausschalten , ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31 (5) : 957-973 ; Goring et al . (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-99). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu vermindernde, homologe Gen ganz oder nur teilweise representieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Die Anwendung dieser Technologie auf Pflanzen ist beispielsweise beschrieben bei Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 und in US 5,034,323.
Bevorzugt wird die Kosuppression unter Verwendung einer Sequenz realisert, die im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-Protein oder ein funktionelles Äquivalent desselben, beispielsweise der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 , oder der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent derselben, beispielsweise einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 oder 69. e) Einbringung von Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein dominant-negatives RacB Protein
Die Funktion oder Aktivität eines RacB Protein kann effektiv auch durch Expression einer dominant-negativen Variante dieses RacB-Proteins realisiert werden. Verfahren zur Verminderung der Funktion bzw. Aktivität eines Protein mittels Koexpression seiner dominant-negativen Form sind dem Fachmann bekannt (Lagna G und Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM und Alberola-Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11(1): 1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329 (6136) :219-22 ) .
Eine dominant-negative RacB Variante kann beispielsweise durch Veränderung der Aminosäure Threonin an Position 20 bei den RacB Proteinen aus Mais, Reis oder Gerste in bevorzugt Asparagin-Säure realisiert werden. Das bevorzugt zu mutie- rende Threonin oder eventuell auch Serin (analog zu dem
Threonin an Position 20 in RacB aus Mais, Reis oder Gerste) in RacB Homologen aus anderen Arten kann beispielsweise mittels Computer-unterstützte Vergleich ("Alignment") ermittelt werden. Diese Mutationen zum Erreichen einer dominant-negativen RacB Variante werden bevorzugt auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz kodierend für RacB Proteine durchgeführt. Eine entsprechende Mutation kann beispielsweise durch PCR vermittelte in vitro Mutagenese unter Verwendung entsprechender Oligonukleotidprimer, durch welche die ge- wünschte Mutation eingeführt wird, realisiert werden. Dazu werden dem Fachmann geläufige Verfahren verwendet. Beispielsweise kann zu diesem Zweck der "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto) verwendet werden. Ein Verfahren zur Herstellung einer dominant-negativen Variante des RacB- Proteins aus Mais ist auch in WO 00/15815 (Beispiel 4, S. 69) beschrieben.
Besonders bevorzugt sind die unter den SEQ ID NO: 7, 8 und 9 beschriebenen dominant-negativen Varianten der RacB-Proteine aus Gerste, Reis oder Mais.
f) Einbringung DNA-oder Protein-bindende Faktoren gegen RacB Gene, -RNAs oder Proteine
Eine Verminderung einer RacB Genexpression ist auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z.B. mit Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Sequenz des endogenen Zielgens, bevorzugt in den regulatorischen Bereichen, an und bewirken eine Repression des endogenen Gens. Die Verwendung eines solchen Verfahrens ermöglicht die Ver- minderung der Expression eines endogenen RacB Gens, ohne dass dessen Sequenz gentechnisch manipuliert werden muss. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben (Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276(31) :29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303(4) :489-502; Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (4) :1495-1500; Beerli RR et al . (2000) J Biol Chem 275(42) :32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(1) : 34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12) :8742-8748; Beerli RR et al . (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (25) : 14628- 14633; Kim JS et al .- (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(8).-3616 -3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2) :215-218; Tsai SY et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3) :23-31; Mapp AK et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97(8) :3930-3935; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29 (12) : 1371-1387; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275(43) :33850-33860) .
Die Selektion dieser Faktoren kann unter Verwendung eines beliebigen Stückes eines RacB-Gens erfolgen. Bevorzugt liegt dieser Abschnitt im Bereich der Promotorregion. Für eine Genunterdrückung kann er aber auch im Bereich der kodierenden Exons oder Introns liegen. Die entsprechenden Abschnitte sind für den Fachmann mittels Datenbankabfrage aus der Genbank oder - ausgehend von einer RacB cDNA, deren Gen nicht in der Genbank vorhanden ist, durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek nach korrespondierenden genomischen Klonen erhältlich. Die dazu erforderlichen Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das RacB Zielprotein selber inhibieren. Die proteinbindenden Faktoren können z.B. Aptamere (Faulok M und Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36) oder Antikörper bzw. Antikörperfragmente oder einzelkettige Antikörper sein. Die Gewinnung dieser Faktoren ist beschrieben und dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wurde ein cytoplasmatischer scFv Antikörper eingesetzt, um die Aktivität des Phyto- chrom A Proteins in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen zu modulieren (Owen M et al. (1992) Biotechnology (N Y) 10(7) :790-794; Franken E et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4) :411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sei 1:286-272). Die Genexpression kann auch durch maßgeschneiderte, niedermolekulare synthetische Verbindungen unterdrückt werden, beispielsweise vom Polyamid-Typ (Dervan PB und Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9 (1-2) :77-91) . Diese Oligomere bestehen aus den Bausteinen 3- (Dimethylamino)propylamin, N-Methyl-3-hydroxypyrrol, N-Methylimidazol und N-Methyl- pyrrole und können an jedes Stück doppeisträngiger DNA so angepasst werden, dass sie sequenzspezifisch in die große Furche binden und die Expression der dortigen Genesequenzen blockieren. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (siehe unter anderem Bremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8) :2093-103; Ansari AZ et al. (2001) Chem Biol . 8(6) .-583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol. 309 (3) :615-29; Wurtz NR et al . (2001) Org Lett 3 (8) : 1201-3 ; Wang CC et al. (2001) Bioorg Med Chem 9 (3): 653-7; Urbach AR und Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98 (8) :4343-8; Chiang SY et al. (2000) J Biol Chem. 275 (32) :24246-54) .
g) Einbringung von den RacB RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten
Die RacB Expression kann effektiv auch durch Induktion des spezifischen RacB RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20 (3) :357-362) realisiert werden. Diese Systeme - auch als "VIGS" (viral induced gene silencing) bezeichnet - bringen Nukleinsäureseuqnzen mit Homologie zu den zu suppri ierenden Transkripten mittels viraler Vektoren in die Pflanze ein. Die Transkription wird sodann - vermutlich mediiert durch pflanzliche Abwehrmechanismen gegen Viren - abgeschaltet. Entsprechende Techniken und Verfahren sind beschrieben (Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25 (2) :237-45; Fagard M und Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43 (2-3) :285-93 ; Anandalakshmi R et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (22) :13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6) : 937-46) .
h) Einbringung von Konstrukten zur Induktion einer homologen Rekombination an endogenen RacB-Genen beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten.
Zur Herstellung eines homolog rekombinanten Organismus mit verminderter RacB-Aktivität verwendet man beispielsweise ein Nukleinsäurekonstrukt, das zumindest einen Teil eines endogenen RacB Gens enthält, das durch eine Deletion, Addition oder Substitution mindestens eines Nukleotids so verändert wird, so dass die Funktionalität vermindert oder gänzlich aufgehoben wird. Die Veränderung kann auch die regulativen
Elemente (z.B. den Promotor) des Gens betreffen, so dass die kodierende Sequenz unverändert bleibt, eine Expression (Transkription und/oder Translation) jedoch unterbleibt und vermindert wird.
Bei der konventionellen homologen Rekombination ist die veränderte Region an ihrem 5'- und 3 '-Ende von weiteren Nuklein- säuresequenzen flankiert, die eine ausreichende Länge für die Ermöglichung der Rekombination aufweisen müssen. Die Länge liegt in der Regel in einem Bereich von mehreren einhundert Basen bis zu mehreren Kilobasen (Thomas KR und Capecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp et al . (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 (8) :4368-4373) . Für die homologe Rekombination wird der Wirtsorganismus - zum Beispiel eine Pflanze - mit dem Rekombinationskonstrukt unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren transformiert und erfolgreich rekombinierte Klone unter Verwendung zum Beispiel einer Antibiotika- oder Herbizidresistenz selektioniert .
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zeilklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben, durch welche unspezifisch integrierte Sequenzen wieder deletiert werden können, was die Selektion erfolgreich über homologe
Rekombination integrierter Ereignisse erleichtert. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen Pl, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Rekombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSRl Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen Pl Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378)
Einführung von Mutationen in endogene RacB Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z.B. Generierung von Stopp-Kodons , Verschiebungen im Leseraster etc . ) Weitere geeignete Methoden zur Verminderung der RacB-Aktivität sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in endogene RacB Gene zum Beispiel mittels Einführung von RNA/DNA-Oligo- nukleotiden in die Pflanze (Zhu et al. (2000) Nat Biotechnol 18 (5) :555-558) sowie die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20 (5) .-963-976) , ENU- (N-Ethyl-N-nitrosoharn- stoff) - Mutagenese oder homoiger Rekombination (Hohn B und Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sei USA 96:8321-8323.). Punkt- mutationen können auch mittels DNA-RNA Hybriden erzeugt werden, die auch als "chimeraplasty" bekannt sind (Cole- Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27 (5) :1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3) -.240-247) .
Die -Methoden der dsRNAi, der Kosuppression mittels sense-RNA und der "VIGS" ("virus induced gene silencing") werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet. PTGS- Verfahren wie auch die Verminderung der RacB-Funktion oder Aktivität mit dominant-negativen RacB-Varianten sind besonders vor- teilhaft, weil die Anforderungen an die Homologie zwischen dem zu supprimierenden endogenem Gen und der transgen exprimierten sense- oder dsRNA-Nukleinsäuresequenz (bzw. zwischen dem endogenen Gen und seiner dominant-negativen Variante) geringer sind als beispielsweise bei einem klassischen antisense-Ansatz . Ent- sprechende Homologie-Kriterien sind bei der Beschreibung des dsRNAI-Verfahrens genannt und allgemein für PTGS-Verfahren oder dominant-negative Ansätze übertragbar. Aufgrund der hohen Homologie zwischen den RacB-Proteinen aus Mais, Reis und Gerste kann auf einen hohen Konservierungsgrad dieses Protein bei Pflanzen geschlossen werden. So kann man voraussichtlich unter Verwendung der RacB-Nukleinsäuresequenzen aus Gerste, Mais oder Reis auch die Expression von homologen RacB-Proteinen in anderen Arten effektiv supprimieren, ohne dass die Isolierung und Strukturaufklärung der dort vorkommenden RacB-Homologen zwingend erforderlich wäre. Dies erleichtert erheblieh den Arbeitsaufwand. Analog kann man voraussichtlich auch unter Verwendung von dominant-negativen Varianten eines RacB-Proteins aus Reis, Mais oder Gerste die Funktion/Aktivität seines Homologs in anderen Pflanzenarten effektiv vermindern oder unterdrücken.
Alle Substanzen und Verbindungen die direkt oder indirekt eine Verminderung der Proteinmenge, RNA-Menge, Genaktivität oder Proteinaktivität eines RacB-Proteins bewirken, seien infolge unter der Bezeichnung "anti-RacB"-Verbindungen zusa mengefasst . Der Begriff "anti-RacB"-Verbindung schließt explizit die in den oben beschriebenen Verfahren zum Einsatz kommenden Nukleinsäuresequenzen, Peptide, Proteine oder andere Faktoren ein.
"Einbringung" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet eine "anti-RacB"-Verbindung, direkt oder indirekt, in eine Pflanze oder eine Zelle, Kompartiment, Gewebe, Organ oder Samen derselben einzuführen oder dort zu generieren. Direkte und indirekte Verfahren sind umfasst. Die Einbringung kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz einer "anti- RacB"-Verbindung (beispielsweise einer dsRNA) führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen) .
Gemäß der unterschiedlichen Natur der oben beschriebenen Ansätze kann die "anti-RacB"-Verbindung ihre Funktion direkt ausüben (zum Beispiel durch Insertion in .ein endogenes RacB Gen) . Die - Funktion kann aber auch indirekt nach Transkription in eine RNA (zum Beispiel bei antisense Ansätzen) oder nach Transkription und Translation in ein Protein (zum Beispiel bei Bindungsfaktoren) ausgeübt werden. Sowohl direkte als auch indirekt wirkende "anti-RacB"-Verbindungen sind erfindungsgemäß umfasst.
Einführen umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation.
"Anti-RacB" Verbindungen umfasst somit beispielsweise auch rekombinante Expressionskonstrukte, die eine Expression (d.h. Transkription und ggf. Translation) beispielsweise einer RacB- dsRNA oder einer RacB "antisense"-RNA - bevorzugt in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe, Organ oder Samen derselben - bedingen.
In besagten Expressionskonstrukten steht ein Nukleinsäuremolekül, dessen Expression (Transkription und ggf. Translation) eine "anti-RacB"-Verbindung generiert, bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor) , das eine Expression in einem Organismus, bevorzugt in Pflanzen, gewährleistet. Soll das Expressionskonstrukt direkt in die Pflanze eingeführt und die "anti-RacB"-Verbindung (beispielsweise die RacB dsRNA) dort in plantae erzeugt werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt. Die "anti-RacB"-Verbindung kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erzeugt und dann in die Pflanze eingebracht werden (wie in Beispiel 6 und 7 beschrieben) . In diesem sind all prokaryotisehen oder eukaryotischen genetischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in den jeweils für die Herstellung gewählten Organismus erlauben.
Unter einer funktioneilen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu expri- mierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel einer "anti-RacB"- Verbindung) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer- Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen"aus auf" die
Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktioneilen Verknüpfung als auch die Herstellung einer Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusions- proteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden. Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen ein Promoter - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - hinter ein endogenes RacB-Gen platziert wird, und durch Expression einer antisense RacB-RNA die 5 erfindungsgemäße Verminderung eines RacB-Proteins bewirkt wird. Analog kann auch eine "anti-RacB" Verbindung (zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eines RacB dsRNA oder eine RacB antisense RNA) derart hinter einen endogenen Promotor platziert werden, dass der gleiche Effekt auftritt. Beide Ansätze führen 10 zu Expressionskassetten im Sinne der Erfindung.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen 15.steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise, konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:
20 a) Konstitutive Promotoren
Bevorzugt sind Vektoren, die eine konstitutive Expression in Pflanzen ermöglichen (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). "Konstitutiver" Promotor meint solche 5 Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, 0 der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewaker et al . (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al . (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228) 5 oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Pro otσr ist der "Rübiscσ s all subunit (SSU) "-Promotor (US 4, 962, 028) , der Legu inB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677) , der Promotor der Nopalinsynthase 0 aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin
Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 5 86:9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydro- genase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) , sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. Als konstitutiver Promotor insbesondere bevorzugt ist der Promotor des Nitrilase-1 (nitl) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc .-No. : Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200).
Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.
Samenspezifische Promotoren wie -zum Beispiel der Promotor des Phaseolins' (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9) : 839-53) , des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 (3) :459-67) , des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al . (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2) .-233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13 (10) :1090f) , der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461) , der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980) . Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG) , Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyro- phosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind femer Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder Iptl-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens , des Glutelin-Gens , des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens) .
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren wie Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . (1989) EMBO J 8:2445-2451). Ganz besonders bevorzugt sind Epidermis- spezifische Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des OXLP-Gens ( "Oxalat-Oxidase like protein" ; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112).
Blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Antheren-spezifisσhe Promotoren wie den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob-1 Promotor und den γ-Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzier- barer Promotor (EP 0 388 186) , ein durch Tetrazyklin- induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon- induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRPl-Gens (bzw. gstl Promotor) z.B. aus Kartoffel (WO 96/28561; Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzie- rare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814) , der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinll-Promoter (EP-A 0 375 091) . Weitere pathogen-induzierbare Promoren umfassen den Flachs Fisl-Promotor (WO 96/34949), den Vstl-Promotor (Schubert et al. (1997) Plant Mol Biol 34:417-426) sowie den EAS4 Sesqui- terpene-Cyclase-Promotor aus Tabak (US 6,100,451).
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al . (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al . (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al . (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinll Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wunl und wun2-Gens (US 5,428,148), des winl- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), des WIPl-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994)_ Plant J 6 (2) : 141-150) und dergleichen.
Eine Quelle für weitere pathogen-induzierbare Promotoren stellt die PR-Genfamilie dar. Eine Reihe von Elementen in diesen Promotoren haben sich als vorteilhaft erwiesen. So vermittelt die Region -364 bis -288 im Promotor von PR-2d Sa- licylat-Spezifität (Buchel et al. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504). Die Sequenz 5 ' -TCATCTTCTT-3 ' taucht im Promotor der Gersten ß-1, 3-Glucanase und in mehr als 30 weiteren stressinduzierten Genen wiederholt auf. Diese Region bindet in Tabak ein nukleares Protein, dessen Abundanz durch Salicylat erhöht wird. Die PR-1-Promotoren aus Tabak und Arabidopsis (EP-A 0 332 104, WO 98/03536) eignen sich ebenfalls als pathogen-induzierbare Promotoren. Bevorzugt, da besonders spezifisch durch Pathogen-induziert, sind die "aeidie PR-5"-(aPR5) -Promotoren aus Gerste (Schweizer et al. (1997) Plant Physiol 114:79-88) und Weizen {Rebmann et al. (1991) Plant Mol Biol 16:329-331) . aPR5-Proteine akkumulieren in ca. 4 bis 6 Stunden nach Pathogenbefall und zeigen nur eine sehr geringe Hintergrundsexpression (WO 99/66057) . Ein Ansatz, um eine erhöhte pathogen-induzierte Spezifität zu erreichen, bildet die Herstellung synthetischer Promotoren aus Kombinationen von bekannten pathogen-responsiven Elementen (Rushton et al. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057) . Weitere pathogen-induzierbare Promotoren aus verschiedenen Arten sind dem Fachmann bekannt (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684;
e) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruσht- reifungs-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungs-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625) . Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die Gewebespezifischen Promotoren ein, da die- Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt .
Besonders bevorzugt sind konstitutive, sowie Blatt und/oder Stengel-spezifische, pathogen-induzierbare und epidermis- spezifische Promotoren, wobei pathogen-induzierbar und epidermis- spezifische Promotoren am meisten bevorzugt sind.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotisehen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-strom- aufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz den Promoter mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz . Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions- steuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135) und Hitzestress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3) :246-53, 1989) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren -
Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungs- gemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3 '-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds . , Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 ' -untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebs- spezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440) .
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium turne faciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al . (1984) EMBO J
3 : 835 ff ) oder funktioneile Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-
Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase) -Terminator .
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines
Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promoter eines bestimmten Gens gegen einen Promoter mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie. erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods . 1 (4) :381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Eine Expressionskassetten und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der
Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) , Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen) , 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthase- gene) , die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N- (phosphono- methyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase) , das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert) , Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin ver- leih, das Streptomycinphosphotransferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycin- phosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphospho- transferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation) .
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Gros- kreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(l):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5) :777-784; Haseloff et al. (1997) . Proc Natl Acad Sei USA- 94(6) :2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12) :5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL et al . (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al . (1997) Biotechniques . 23 (5) :912-8) , die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234.-856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), das Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3) .1259-1268) , die ß-Galactosidase, R-Locus Gen (kodieren ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al.. In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs- gemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel
E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al . : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region. Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid 5 (zum Beispiel ein Herbizid) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).
10
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) , kann vorteilhaft unter Verwendung von
15 Vektoren, realisiert werden, in denen die Expressionskassetten enthalten sind. Die Expressionskassette kann in den Vektor (zum Beispiel ein Plasmid) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden
20 selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
25 Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmid- vektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom
30 ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA, RNA oder Protein in die entsprechende Wirts- 35 zelle eingebracht wird.
Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology
40 185:527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA
45 kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; 5 Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al . (1987) Nature 327:70-73 ,- Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology 10 (Weissbach and Weissbach, eds.) Aeademie Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Aeademie Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans- 15 formation und.Regeneration.. on Pflanzen aus, Pflanzengeweben, oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte 20 "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Trans- 25 formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 30 1229f) .
Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen
35 binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.
40
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet . Binäre Vektoren können sowohl in E . coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken
45 T-DNA Begrenzungssequenz . Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al . (1978) Mol Gen Genet 163 : 181-187) . Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als WirtsOrganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Über- tragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanz- "licher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. , Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Weitere zur- Expression in- Pflanzen geeignet Pro otoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:8402-8406).
Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organismus und Zelltyp eignen.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw.
RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier- barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.) . Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines ent- sprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5) .-871-884) , das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von trans- formierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Aeademie Press, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f) . . - -• ■
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Dem Fachmann sind such Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al . (1994) Theor Appl Genet 89:525-533 verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft mit weiteren Verfahren die eine Pathogenresistenz (beispielsweise gegen Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden etc.), Stressresistenz oder eine andere Verbesserung der pflanzlichen Eigenschaften bewirken kombiniert werden. Beispiele sind u.a. genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft das RacB Protein aus Gerste gemäß SEQ ID NO: 2, sowie dominant-negative Variante desselben, beispielsweise beschrieben durch SEQ ID NO: 7.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäure- Sequenzen kodierend für das RacB-Protein aus Gerste, bevorzugt die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die dazu komplemen- täre Nukleinsäuresequenz und die durch Entartung (Degeneration) des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft das Polypeptide kodierend für funktioneile Äquivalente des RacB Protein aus Gerste gemäß SEQ ID NO: 35, 37 oder 39.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen kodierend für funktioneile Äquivalente des RacB Protein aus Gerste, bevorzugt die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 34, 36 oder 38, die dazu komplementäre Nukleinsäuresequenz und die durch Entartung (Degeneration) des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene
Expressionskassetten, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfassen. In den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-Protein aus Gerste mit mindestens einem genetischen Kontrollelement nach obiger Definition derart verknüpft, das die Expression (Transkription und ggf. Translation) in einem beliebigen Organismus - bevorzugt in Pflanzen - realisiert werden kann. Dazu geeignete genetische Kontrollelemente sind oben beschrieben. Die transgenen Expressionskassetten können auch weitere Funktionselementen gemäß obiger Definition enthalten. Die insertierte Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-Protein aus Gerste kann in sense- oder antisense-Orientierung in die Expressionskassette insertiert sein, und damit zu Expression von sense- oder antisense-RNA führen. Erfindungsgemäß sind auch transgene Vektoren, die die transgenen Expressionskassetten beinhalten.
"Transgen" meint bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder
a) die RacB Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine mit der RacB Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b) sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des RacB-Promotors mit dem entsprechenden RacB-Gen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815; siehe auch oben).
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassette oder einem erfindungs- gemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen. Organismus ist breit zu verstehen und meint prokaryotisehe und eukaryotisehe Organismen, bevorzugt Bakterien, Hefen, Pilze, tierische und pflanzliche Organismen.
Bevorzugt sind
a) Pilze, wie Aspergillus, Eremothecium, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem
Eng. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze. Besonders bevorzugt ist der filamentöse Hemiascomycet Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii .
b) Hefen wie Candida, Saccharomyces , Hansenula oder Pichia, besonders bevorzugt sind Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris (ATCC Accessioh No. 201178),
c) Pflanzen gemäß der obengenannten Definition für "Pflanzen" d) Vertebraten und Invertebraten. Besonders bevorzugte Verte- braten sind nicht-humane Säuger wie in Hund, Katze, Schaf, Ziege, Huhn, Maus, Ratte, Rind oder Pferd. Bevorzugte tierische Zellen umfassen CHO, COS, HEK293 Zellen. Bevorzugte
5 Invertebraten umfassen Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 oder Sf21 Zellen,
e) prokaryontische Organismen wie gram-positive oder gramnegative Bakterien wie Acetobacter, Gluconobacter, Coryne-
10 bacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyano- bacter, Escherichia (vor allem Escherichia coli) , Serratia, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium oder Klebsiella genannt.
15.Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen,
20 Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. Insbesondere als 5 Wirtsorganismen bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, auf die der erfindungsgemäße Verfahren zum Erzielen einer Pathogenresistenz gemäß oben genannten Kriterien angewendet werden kann. Ganz besonders bevorzugt sind monokotyle Pflanzen wie Weizen, Hafer, Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Triti- 0 cale, Dinkel, Leinsamen, Zuckerrohr, als diktoyledone Kulturpflanzen wie Raps, Canola, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten, Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen, Erdnuss, Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine, Paprika, Sonnenblume, Tagetes, Salat, Calendula, Melone, Kürbis oder Zucchini. 5
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
0 Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und trans- genes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von 5 Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein- chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Fein- chemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungs- medium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten WirtsOrganismen sowie die Isolierung aus den WirtsOrganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92.
Sequenzen
1 . SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB Protein aus Gerste (Hordeum vulgäre) .
SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz kodierend für das RacB Protein aus Gerste (Hordeum vulgäre) .
3. SEQ ID NO: 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB Protein aus Reis (Oryza sativa) .
4. SEQ ID NO: 4 Aminosäuresequenz kodierend für das RacB Protein aus Reis (Oryza sativa) .
5, SEQ ID- NO : 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB Protein aus Mais (Zea mays) .
6. SEQ ID NO: 6 Aminosäuresequenz kodierend für das RacB Protein aus Mais (Zea mays) .
SEQ ID NO: 7 Aminosäuresequenz kodierend für eine dominant-negative Variante des RacB Proteins aus (Hordeum vulgäre) .
8. SEQ ID NO: 8 Aminosäuresequenz kodierend für eine dominant-negative Variante des RacB Proteins aus Reis (Oryza sativa) .
9. SEQ ID NO: 9 Aminosäuresequenz kodierend für eine dominant-negative Variante des RacB Proteins aus Mais (Zea mays) .
10. SEQ ID NO: 10 Oligonukleotidprimer ONP-1
5 ' -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3 '
11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotidprimer ONP-2
5 ' -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3 '
12. SEQ ID NO: 12 RACE-RacB Primer
5 ' -gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3 '
13. SEQ ID NO: 13 GeneRacer™ 5 ' -Primer:
5 ' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3
14. SEQ ID NO: 14 GeneRacer™ 5'-Nested Primer:
5 ' -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 15. SEQ ID NO: 15 RacB-sense Primer
5 ' -gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3 '
16. SEQ ID NO: 16 RacB-antisense Primer 5 '-ttagcttcctcagttcttccctg-3 '
17. SEQ ID NO: 17 BAS-sense Primer
5 ' -cgcgccgcagccgagtacgac-3 '
18. SEQ ID NO: 18 BAS-antisense Primer
5 ' -gtcacaaaaacacatgtaacc-3 '
19. SEQ ID NO: 19 OXLP-sense Primer
5 ' -ggccgacatgcattcaccag-3 '
20. SEQ ID NO: 20 OXLP-antisense Primer
5 ' -catctgatattgctgggtctg-3 '
21. SEQ ID NO: 21 UBI-sense Primer 5 ' -ccaagatgcagatcttcgtga-3 '
22. SEQ ID NO: 22 UBI-antisense Primer
5 ' -ttcgcgataggtaaaagagca-3 '
23. SEQ ID NO: 23 M13-fwd Primer
5 ' -GTAAAACGACGGCCAGTG-3 '
24. SEQ ID NO: 24 M13-Rev Primer
5 ' -GGAAACAGCTATGACCATG-3 '
25. SEQ ID NO: 25 HvRop6 LEFT PRIMER
5 ' -GTGGAGGCGCGGCGAGA-3 '
26. SEQ ID NO: 26 HvRop6 RIGHT PRIMER 5 ' -CCATGCTTCATCTCCATAGTCA-3 '
27. SEQ ID NO: 27 HvRacD LEFT PRIMER
5 ' -ggatccCGATTCCATCAGGAAAGCAT-3 '
28. SEQ ID NO: 28 HvRacD RIGHT PRIMER
5 ' -gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3 '
29. SEQ ID NO: 29 HvRop4 LEFT PRIMER
5 ' -GGATCCttctcgtccatttagccggc-3 ' 30. SEQ ID NO: 30 HvRop4 RIGHT PRIMER
5 ' -GTCGACtgatcacttgaagcatgccag-3 '
31. SEQ ID NO: 31 RacB5'BamHI Primer
5 5 ' -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3 '
32. SEQ ID NO: 32 RacB3'SalI Primer
5 ' -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3 '
10 33. SEQ ID NO: 33 VI5 Mutagenese Primer
5 ' -ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3 '
34. SEQ ID NO: 34 : Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog HvRop6 aus Gerste (Hordeum vulgäre) . 15
35. SEQ ID NO: 35 : Aminosäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog HvRopδ aus Gerste (Hordeum vulgäre) .
36. SEQ ID NO: 36 : Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB- 0 Homolog HvRacD aus Gerste (Hordeum vulgäre) .
37. SEQ ID NO: 37 : Aminosäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog HvRacD aus Gerste (Hordeum vulgäre) .
5 38. SEQ ID NO: 38 : Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog HvRop4 aus Gerste (Hordeum vulgäre) .
39. SEQ ID NO: 39 : Aminosäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog HvRop4 aus Gerste (Hordeum vulgäre) . 0
40. SEQ ID NO: 40 : Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Zea mays ROP6 (GenBank Acc.-No.: AJ278665)
5 41. SEQ ID NO: 41 Aminosäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Zea mays ROP6
42. SEQ ID NO: 42 Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Oryza sativa subsp. japonica RACDP 0 (RACD) (GenBank Acc.-No. : AF218381)
43. SEQ ID NO: 43 Aminosequenz kodierend für das RacB-
Homolog Oryza sativa subsp. japonica RACDP
5 44. SEQ ID NO: 44 Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Oryza sativa R0P4 (GenBank Acc.-No.: AF380335)
45. SEQ ID NO: 45 Aminosäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Oryza sativa R0P4
46. SEQ ID NO: 46 Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Zea mays RACA (GenBank Acc.-No.: AF126052)
47. SEQ ID NO: 47 Aminosäuresequenz kodierend für das RacB-
Homolog Zea mays RACA
48. SEQ ID NO:.48 . Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Hordeum vulgäre (GenBank Acc.- No.: BM816965)
49. SEQ ID NO : 49 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB- Homolog aus Arabidopsis thaliana (At3g51300)
50. SEQ ID NO: 50 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At3g51300)
51. SEQ ID NO: 51 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At2gl7800)
52. SEQ ID NO: 52 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At2gl7800)
53. SEQ ID NO: 53 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At4g35950)
54. SEQ ID NO: 54 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB- Homolog aus Arabidopsis thaliana (At4g35950)
55. SEQ ID NO: 55 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (Atlg75840)
56. SEQ ID NO: 56 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (Atlg75840)
57. SEQ ID NO: 57 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At4g35020) 58. SEQ ID NO: 58 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At4g35020)
59. SEQ ID NO: 59 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB- Homolog aus Arabidopsis thaliana (Atlg20090)
60. SEQ ID NO: 60 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (Atlg20090)
61. SEQ ID NO: 61 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At5g45970)
62. SEQ ID NO: 62 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At5g45970)
63. SEQ ID NO: 63 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At3g48040)
64. SEQ ID NO: 64 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB- Homolog aus Arabidopsis thaliana (At3g48040)
65. SEQ ID NO: 65 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At5g62880)
66. SEQ ID NO: 66 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At5g62880)
67. SEQ ID NO: 67 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At4g28950)
68. SEQ ID NO: 68 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At4g28950)
69. SEQ ID NO: 79 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB- Homolog aus Arabidopsis thaliana (At2g44690)
70. SEQ ID NO: 70 Aminosäuresequenz kodierend für ein RacB-
Homolog aus Arabidopsis thaliana (At2g44690)
71. SEQ ID NO: 71 Oligonukleotidprimer Fra 186
5 λ -ATGAGCGCGTCCAGGTTCATA-3 *
72. SEQ ID NO: 72 Oligonukleotidprimer Fra 187
5 ' -ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3 Λ 73. SEQ ID NO: 73 Transgener Expressionsvektor pSUN3NIT_AtRacB_s für Expression von Arbidopsis thaliana RacB in sense Orientierung
74. SEQ ID NO: 74 Transgener Expressionsvektor pSUN3NIT_AtRacB_as für Expression von Arbidopsis thaliana RacB in antisense Orientierung
75. SEQ ID NO: 75 Transgener Expressionsvektor pSUN3NIT_HvRacB_s für Expression eines Gerste RacB Fragmentes in sense Orientierung
76. SEQ ID NO: 76 Transgener Expressionsvektor pSUN3NIT_HvRacB_as für Expression eines Gerste RacB Fragmentes in antisense Orientierung
Abbildungen
1. Fig. 1: Vergleich der Aminosäuresequenzen von Gerste RacB, Reis RacB, Mais RacB, sowie humanen Racl und Rac2 Proteinen.
Grauhinterlegte Bereiche zeigen die Position des Gl-Elementes (GXXXXGKS/T; Aminosäure 13 bis 20), der G2-Effektorregion (Aminosäure 29 bis 45), des G3-Elemeήtes (LWDTAGQ; Aminosäure 58 bis 64) , des G4-Elementes (TKXD; Aminosäure 118 bis 121) , des G5 Elementes (EXS) und des C-terminalen Isoprenylierungs- motives (CXXX, Hassanain HH et al. (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272 (3) : 783-8.) an. Bindestriche zeigen Sequenzlücken an. Sterne stellen identische Aminosäuren in allen Homologen dar. Aminosäuren die zwischen Gerste einerseits und Mais und Reis andererseits differieren sind weiß auf schwarzem Grund dargestellt. Die Position die zum Erhalt einer dominantnegativen RacB-Variante vorteilhaft verändert wird, ist oberhalb der Sequenz mit einem schwarzen Dreieck markiert.
Fig. 2: Expression von RacB in epidermalen Gewebe
RT-PCR von RNA aus den Gerste-Linien Pallas und BCPMlal2 (P10) 24 h nach Inokulation ("hai" hours after inoculation" ) mit BghA6. Zur Extraktion der RNA wurden abaxial epidermale Streifen (E, aus inokulierten Stellen der Blätter) vom Mesophyll und der adaxialen Epidermis (M) abgetrennt. Ubiquitin 1 (Ubi) fungierte als Marker für eine gewebsunspezifische Expression, OXLP als Positivkontrolle für die Genexpression in der Epidermis, Bas als Positivkontrolle für die Genexpression in Mesophyllzellen. RT-PCR wurde mit 25 Ampli- fikationszyklen wie unten beschrieben ausgeführt. RT-PCR- Produkte wurden im Gel denaturiert, geblotted und mittels antisense RNA-Sonden unter stringenten Bedingungen detek- tiert .
3. Fig. 3: RacB wird konstitutiv in verschiedenen resistenten Gerste-Linien exprimiert.
RNA wurde aus der Sorte Ingrid (Mio, Rorl, Bgh suszeptibel) , BCIngrid-ιπIo5 {mlo5, Rorl, Bgh resistent) und A89 (mlo5, rorl, BghA6 moderat suszeptibel) unmittelbar vor Inokulation (0 0) bzw. 8, 15, 24 h nach Inokulation mit Bgh, sowie 24 h danach aus nicht-inokulierten Kontrollpflanzen (24 0) isoliert. Ubiquitin 1 ( Ubi) wurde als Marker für eine konstitutive Expression verwendet, OXLP als Positivkontrolle für eine Bgiz-induzierte Genexpression in der epidermalen Schicht Die OXLP-Expression wurde per Northem-Blot nachgewiesen. Die RT-PCR für RacB und Ubi wurde wie beschrieben mit 25 Ampli- fikationszyklen durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden im Gel denaturiert, geblotted und mittels antisense RNA-Proben unter stringenten Bedingungen detektiert.
4. Fig. 4: "RNA Interference" mit i?aαB-dsRNA vermindert die Penetrationseffizienz des Echten Gerstenmehltau BghA6 in Gerste.
Die relative Penetrationseffizienz (RPE) wurde in sechs individuellen Experimenten bei Inokulation mit Bgh aus Gerste cv Pallas bestimmt. Die RPE errechnet sich als Differenz aus der Penetrationseffizienz bei RacB-dsRNA transformierten Zellen und der Penetrationseffizienz bei Kontroll-dsRNA transformierten Zellen (hier: durchschnittliche Penetrationseffizienz 57 %) . Die prozentuale RPE (%-RPE) errechnet sich aus der RPE minus 1 und multipliziert mit 100.
RPE = TPE bei RacB-dsRNA transformierten Zellen!
[PE bei Kontroll-dsRNA transformierten Zellen]
%-RPE = 100 * (RPE-1)
Die schwarzen Säulen stellen die %-RPE bei Evaluierung von mindesten 100 Interaktionssteilen für jeweils ein unabhängiges Experiment dar. Die weiße Säule stellt die durch- schnittliche %-RPE der Experimente mit der RacB-dsRNA dar
( "RACB-dsRNA" ) . Der Fehlerbalken gibt den Standardfehler an.
"Control" stellt die parallelen Experimente mit einer Kontroll-dsRNA.
Die %-RPE war in Zellen, die mit RacB-dsRNA beschossen wurden, deutlich vermindert im Vergleich zu Zellen, die mit einer Kontroll-dsRNA ( TR: humaner Thyroidrezeptor-dsRNA) bombardiert wurden.
5. Fig 5 : Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die Funktion von RacB
Die %-RPE wurde in 5 unabhängigen Experimenten durch
Inokulation von Gerste cv Pallas, Ingrid oder A89 mit BghAδ untersucht, die zuvor mit RacB-dsRNA transformiert wurden.
Die %-RPE ist in Pallas (Mio Rorl, Schwarze Balken, Experi- ment 1 und 2) oder Ingrid (Mio Rorl, Schwarze Balken, Experiment 3, 4 und 5) deutlich reduziert. %-RPE der suszeptiblen Mutante A89 (mlo5 rorl, schwarze Balken, Experimente 1 bis 5) war jedoch nicht vermindert. Weiße Balken geben den Mittelwert an, Fehlerbalken den Standardfehler.
6. Fig.6: Überexpression einer konstitutiv aktiven RacB-
Mutante in Gerste der Sorte Pallas
Eine konstitutiv aktive Mutante von Gerste RACB (Austausch G->V an Position 15; RacB-Vl5) wurde unter Verwendung des Ex- pressionskonstruktes pGY-RacBVl5 in 5 unabhängigen Experimenten transient in Gerste der Sorte Pallas überexprimiert . Im Vergleich wurden entsprechende Versuche mit dem Vektor alleine ohne RacB-Insert (pGY) durchgeführt.
Die Expression einer konstituiven RacB-Mutante bewirkt eine signifikant erhöhte Anfälligkeit gegen Pathogenbefall mit Gerstenmehltau im Vergleich zu den Kontrollen (Fig. 6-A) . Die relative Suszeptibilität gegenüber dem Pilzpathogen ist in allen Fällen erhöht (Fig. 6-B) . Auch diese Ergebisse belegen die Schhlüsselfunktion von racB bei der Pathogenabwehr.
7. Fig. 7: Plasmidkarte zu Expressionsvektor pGY-1 (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Shinshi H et al. (1990) Plant Mol Biol 14:357-368). Beispiele
Allgemeine Methoden:
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro- phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sabrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma MWG-Licor nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467) .
Beispiel 1: Pflanzen, Pathogene und Inokulation
Die Gerstensorte Ingrid stammt von James McKey, University of Uppsala, Schweden. Die Sorte Pallas und die rückgekreuzte Linie BCIngrid-ml o5 wurde von Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Ihre Herstellung ist beschrieben (K0lster P et al. (1986)Crop Sei 26: 903-907). Die Linie A89 wurde durch Paul Schulze-Lefert (Max-Plank-Institut für Züchtungsforschung, Köln, Deutschland) bereitgestellt.
Das 12 bis 36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wurde, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8x8cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen wurden in Klimaschränken oder -kammern bei 16 bis 18°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16-stündigen Licht / 8-stündigen Dunkelheitszyklus mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 umols-^-m-2 Photonenflussdichte) 5 bis 8 Tage lang kultiviert und im KeimlingsStadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primär- blättem durchgeführt wurden, waren diese vollständig entwickelt.
Vor Durchführung der transienten Transfektionsexperimente wurden die Pflanzen in Klimaschränken oder -kammern bei tagsüber 24°C, nachts 20°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16stündi- gen Licht / 8stündigen Dunkelheitszyklus mit 30000 lux kultiviert .
Für die Inokulation von Gerstenpflanzen wurde Echte Gerstenmehl- tau Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em. Marchai der Rasse A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6) verwendet. Dieser wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen bereitgestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgte in Klimakammern zu den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Pflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise bei einer Dichte von 100 Konidia/mm2.
Die Inokulation mit BghA6 erfolgte unter Verwendung von
7 Tagen alten Keimlingen durch Abschütteln der Konidien bereits befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit ca. 100' Konidien/mm2 (soweit nicht anders angegeben) .
Beispiel 2: RNA-Extraktion
Gesamt RNA wurde aus 8 bis 10 primären Blattsegmenten (Länge 5 cm) mittels "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany) extrahiert .
Dazu wurden die zentrale Primärblattsegment von 5 cm Länge geerntet und in flüssigem Stickstoff in Mörsern homogenisiert. Das Homogenisat wurde bis zur RNA-Extraktion bei -70°C gelagert.
Aus dem tiefgefrorenen Blattmaterial wurde mit Hilfe eines RNA- Extraktions-Kits (AGS, Heidelberg) Gesamt-RNA extrahiert. Dazu wurden 200 mg des tiefgefrorenen Blattmaterials in einem Mikro- zentrifugenröhrchen (2 mL) mit 1,7 mL RNA-Extraktionspuffer (AGS) überschichtet und sofort gut durchmischt. Nach Zugabe von 200 μL Chloroform wurde erneut gut gemischt und bei Raumtemperatur
45 min auf einem Horizontalschüttler bei 200 U/min geschüttelt. Anschließend wurde zur Phasentrennung 15 min bei 20000 g und 4°C zentrifugiert, die obere wäsige Phase in ein neues Mikrozentri- fugenröhrchen überführt und die untere verworfen. Die wässrige Phase wurde erneut mit 900 μL Chloroform gereinigt, indem 3 mal für 10 sec homogenisiert und erneut zentrifugiert (s.o.) und abgehoben wurde. Zur Fällung der RNA wurde dann 850 μL 2-Propanol hinzugegeben, homogenisiert und für 30 bis 60 min auf Eis gestellt. Im Anschluss daran wurde für 20 min zentrifugiert (s.o), vorsichtig der Überstand dekantiert, 2 mL 70 %iges Ethanol (-20°C) hinzu pipettiert, durchmischt und erneut 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dann wiederum dekantiert und das Pelet vor- sichtig mit einer Pipette von Flüssigkeitsresten befreit, bevor es an einem Reinluftarbeitsplatz im Reinluftstrom getrocknet wurde. Danach wurde die RNA in 50 μL DEPC-Wasser auf Eis gelöst, durchmischt und 5 min zentrifugiert (s.o.). 40 μl des Überstandes wurden als RNA-Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei -70°C gelagert.
Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bestimmt. Dazu wurde die RNA-Lösung 1:99 (v/v) mit destilliertem Wasser verdünnt und die Extinktion (Photometer DU 7400, Beckman) bei 260 nm gemessen (E26O nm = ! bei 40 μg RNA/mL) . Gemäß der errechneten RNA- Gehalte wurden die Konzentrationen der RNA-Lösungen anschließend mit DEPC-Wasser auf 1 μg/μL angeglichen und im Agarosegel überprüft .
Zur Überprüfung der RNA-Konzentrationen im horizontalen Agarosegel (1 % Agarose in 1 x MOPS-Puffer mit 0,2 μg/mL Ethidiumbromid) wurde 1 μL RNA-Lösung mit 1 μL 10 x MOPS, 1 μL Farbmarker und 7 μL DEPC-Wasser versetzt, nach Ihrer Größe bei 120 V Spannung im Gel in 1 x MOPS-Laufpuffer über 1,5 h aufgetrennt und unter UV-Licht fotographiert . Eventuelle Konzentrationsunterschiede der RNA- Extrakte wurden mit DEPC-Wasser ausgeglichen und die Anpassung erneut im Gel überprüft.
Beipiel 3 : Klonierung der RacB cDNA Sequenz aus Gerste
Die zur Isolation der HvRacB cDNA, ihrer Klonierung, Sequenzierung und Herstellung von Sonden benötigten cDNA Fragmente wurden mittel RT-PCR unter Verwendung des "One Step RT-PCR Kit" (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland oder
Qiagen, Hilden, Deutschland) erhalten. Dazu wurde Gesamt-RNA aus Gerste-Sämlingen als Matrize verwendet. Die RNA wurde aus Pallas 3, 5 und 7 Tage nach Keimung isoliert. Darüberhinaus wurde RNA aus Pallas und den rückgekreuzten Linien mit mlo5, Mlg oder Mlal2 1, 2 und 5 Tage nach Inokulation mit BghA6 am 7 Tag nach Keimung isoliert. Für die RT-PCR werden die folgenden Primer verwendet:
ONP-1 5 ' -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3 ' (SEQ ID NO: 10) und
ONP-2 5 ' -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3 ' (SEQ ID NO: 11)
Für die Reaktion (25 μL-Ansatz) wurden je 1000 ng Gesamt-RNA, 0,4 mM dNTPs, je 0,6 mM OPN-1 und OPN-2 Primer, 10 μl RNase- Inhibitor und 1 μl Enzymmix in lx RT-Puffer ( one step RT-PCR Kit, Qiagen, Hilden) eingesetzt. Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts) :
1 Zyklus mit 30 min bei 50°C 1 Zyklus mit 150 sec bei 94°C
30 Zyklen mit 94°C für 45 sec, 55°C für 1 min und 72°C für 2 min
1 Zyklus mit 72°C für 7 min
Die PCR Produkt wurde mittels 2% w/v Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Es wurde ein RT-PCR Produkt von insgesamt 642 bp erhalten, dass sich aus der RacB-Sequenz (SEQ ID NO: 1) und termi- nalen Sequenzen kodierend für Restriktionsendonukleasaeschnitt- stellen zusammensetzt . Das Fragment kodiert für ein offnes Lese- raster von -591 bp kodierend für ein Polypeptid aus 197 Aminosäuren. Die entsprechende cDNA wurde aus einem Agarosegel isoliert und in den pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim, Deutschland) mittels T-Überhang-Ligation kloniert. Die cDNAs wurden ausgehend von der Plasmid-DNA unter Verwendung des "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Deutschland) sequenziert.
Da als Ausgangsprimer OPN-1 ein Primer von der RacB-Sequenz aus Reis abgeleitet worden ist (GenBank Acc.-No.: AF250327) wurde dieser Bereich (d.h. das 5 '-Ende) der RacB-cDNA aus Gerste nochmals mittel der RACE-Technologie unter Verwendung des "GeneRacer Kit" (INVITROGENE Life Technologies) verifiziert. Dazu wurden 100 ng poly-A mRNA, 1 μL lOxCIP-Puffer, 10 Units RNAse-Inhibitor, 10 Units CIP ("calf intestinal phosphatase") und DEPC-behandeltes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 μL für 1 h bei 50°C behandelt. Zur Präzipitation der RNA wurden weitere 90 μL DEPC- Wasser und 100 μL Phenol : Chloroform hinzugegeben und intensiv für ca. 30 sec durchmischt. Nach 5 min Zentrifugation bei 20.000 g wurde die obere Phase mit 2 μl 10 mg/ml Mussei Glycogen, 10 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) in einem neuen Mikroreaktionsgefäß versetzt. 220 μl 95 % Ethanol wurden hinzugegeben und die Mischung auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die RNA durch Zentrifugation für 20 min bei 20.000 g und 4°C präzipitiert . Der Überstand wurde verworfen, 500 μl 75 % Ethanol hinzugegeben, kurz gevortext und wieder für 2 min zentrifugiert (20000 g) . Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Präzipitat für 2 min bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und anschließend in 6 μl DEPC-Wasser suspendiert. mRNA CAP-Strukturen wurden durch Zugage von 1 μl lOxTAP Puffer, 10 Units RNAsin und 1 Unit TAP ("tobacco acid pyrophosphatase") entfernt. Die Mischung wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Die RNA wurde wiederum- wie oben beschrieben - präzipitiert und in ein Reak- tionsgefäß mit 0,25 μg GeneRacer Oligonukleotid-Primer überführt. Der Oligonukleotid-Primer wurde in der RNA-Lösung resuspendiert, die Mischung für 5 min bei 70°C inkubiert und dann auf Eis gekühlt. 1 μl lOxLigasepuffer, 10 mM ATP, 1 Unit RNAsin und 5 Units T4 RNA-Ligase wurden hinzugegeben und der Reaktionsansatz für 1 h bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde wiederum - wie oben beschrieben - präzipitiert und in 13 μl DEPC-Wasser resuspendiert. 10 pMol oligo-dT Primer wurden zu der RNA gegeben, sofort auf 70°C erhitzt und wieder auf Eis gekühlt. 1 μL jeder dNTP-Lösung (25 mM) , 2 μL lOxRT buffer, 5u (1 μl) AMV reverse Transkriptase und 20 Units RNAsin wurden hinzugegeben und die Reaktionslösung für 1 h bei 42°C und anschließend für 15 min bei 85°C inkubiert. Die so hergestellte Erststrang-cDNA wurde bei -20°C gelagert.
Zur Amplifikation der 5 ' -cDNA-Endes wurde nachfolgender Primer- verwendet :
RACE-RacB Primer:
5 ' -gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3 ' (SEQ ID NO: 12)
GeneRacer™ 5 ' -Primer:
5 ' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 (SEQ ID NO: 13)
GeneRacer™ 5'-Nested Primer: 5 ' -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 (SEQ ID NO: 14)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 25 μL) hatte nachfolgende Zusammensetzung:
1 μl Primer RACE-RacB (5 pmol/μL) ,
0,5 μl GeneRacer 5 '-Primer (10 pmol/μL)
2,5 μl lOxPuffer Qiagen,
2,5 μl dNTPs (2mM)
0,5 μl cDNA 0,2 μl QiagenTAG (5 u/microL) 17,8 μl H20
Die PCR-Bedingungen lauteten:
94°C 5 min Denaturierung
5 Zyklen mit 70°C 30 sek (Annealing) , 72°C 1 min (Extension) , 94°C 30 sek (Denaturierung) 5 Zyklen mit 68°C 30 sek (Annealing) , 72°C 1 min (Extension) , 94°C 30 sek (Denaturierung)
28 Zyklen mit 66°C 30 sek (Annealing) ,
72°C 1 min (Extension) , 94°C 30 sek (Denaturierung)
72°C 10 min abschließende Extension 4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung
Die PCR ergab ein Produkt von ca. 400 bp Produkt. Davon ausgehend wurde eine "nested"-PCR mit dee RacB-spezifischen Oligonukleotidprimer und dem "GeneRacer Nested 5 '-Primer" durch- - geführt :. . . . . ..
94°C 5 min Denaturierung
30 Zyklen mit 64°C 30 sek (Annealing) , 72°C 1 min (Extension) ,
94°C 30 sek (Denaturierung)
72°C 10 min abschließende Extension
4°C Kühlung bis zur Weiterverarbei
Das erhaltene PCR-Produkt wurde über ein Gel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pGEM-T mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die Sequenz im Bereich des Primers OPN-1 war absolut identisch zu der von racB aus Reis, so dass mittels' Primers keine Punktmutationen erzeugt wurden. Die unter SEQ ID NO: 1 wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der RacB-Sequenz aus Gerste.
Beispiel 4: Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)
Für die semi-quantitative RT-PCR wurde der "OneStep RT-PCR Kit" (Qiagen, Hilden, Germany) verwendet. Dabei wurde RNA (herstellung s.o.) zuerst in cDNA übersetzt (Reverse Transkription) und in einer anschließenden PCR-Reaktion mit spezifischen Primern die gesuchte cDNA amplifiziert . Um die Ausgangsmenge an matrizen RNA abzuschätzen, wurde die Amplifikation während der exponentiellen Phase unterbrochen um Unterschiede in der Ziel-RNA wiederzu- spiegeln. Die PCR Produkte wurden über ein Agarosegel aufge- trennt, denaturiert, auf Nylonmembranen geblottet und mit spezifischen, nicht-radioaktiv-markierten Sonden unter stringenten Standardbedingungen detektiert. Hybridisierung, Waschschritte und Immunodetektion erfolgten wie unter "Northern Blot" beschrieben.
Für die einzelnen Reaktionen (25 μL-Ansatz) wurden unter Ver- 5 wendung des "One Step RT-PCR Kit" (Qiagen, Hilden, Deutschland) zusammengegeben:
1000 ng Gesamt-RNA einer bestimmten Probe 0,4 mM dNTPs, 10 jeweils 0,6 μM sense- und antisense-Primer 0 , 1 μl RNase-Inhibitor 1 μL Enzymmix in lx RT-Puffer Die cDNA-Synthese (reverse Transkription) erfolgte für 30 min bei 50°C. Anschließend wurde die Reverse Transkriptase für 15 min bei 15 95°C inaktiviert, was zugleich Aktivierung der DNA-Polymerase und Denaturierung der cDNA bewirkt. Anschließend folgt eine PCR gemäß nachfolgendem Programm:
1 min 94 °C Denaturierung 20 25 Zyklen mit 1 min 54°C Primeranlagerung
1 min 72°C Primerverlängerung 10 min 72°C Komplettierung der DNA-Doppelstränge abschließend: 4°C Abbruch der Reaktion 5
Die PCR-Produkte wurden im IxTBE-Agarosegel mit Ethidiumbromid aufgetrennt .
Für die einzelnen Ansätze wurden mit den nachfolgenden Parren 0 von Oligonukleotid-Primern amplifiziert :
a) Amplifikation eines 387 bp Fragment der Gerste RacB cDNA
RacB-sense 5 ' -gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3 ' (SEQ ID NO: 15) 5 RacB-antisense 5'-ttagcttcctcagttcttccctg-3 ' (SEQ ID NO: 16)
b) Amplifikation eines 674 bp Fragment der Gerste BAS cDNA (GenBank Acc.-No Z34917)
0 BAS-sense 5 ' -cgcgccgcagccgagtacgac-3 ' (SEQ ID NO: 17) BAS-antisense 5'-gtcaσaaaaacacatgtaacc-3 ' (SEQ ID NO: 18)
c) Amplifikation eines 506 bp OXLP cDNA Fragments (GenBank Acc.- No X93171) 5 OXLP-sense 5 ' -ggccgacatgcattcaccag-3 ' (SEQ ID NO: 19) OXLP-antisense 5 ' -catctgatattgctgggtctg-3 ' (SEQ ID NO: 20)
d) Amplifikation eines 513 bp Ubi cDNA Fragment (GenBank accession M60175)
UBI-sense 5 ' -ccaagatgcagatcttcgtga-3 ' (SEQ ID NO: 21) UBI-antisense 5 ' -ttcgcgataggtaaaagagca-3 ' (SEQ ID NO: 22)
Alle erhaltenen Fragmente wurden zudem in den Vektor pGEM-T mittels T-Überhang-Ligation ligiert und dienten als Ausgangsplasmide für die Herstellung von Sonden (z.B. für Northem-Blot) bzw. dsRNA. Die einzelnen Konstrukte trugen die Bezeichnung pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI. .. . .
Beispiel 5 : Northern-Blot Analyse
Zur Vorbereitung des Northern-Blottings wurde die RNA im Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt . Ein Teil RNA-Lösung (entsprechend 5 μg RNA) wurde dazu mit gleichem Volumen Probenpuffer (mit Ethidiumbromid) gemischt, 5 min bei 94°C denaturiert, 5 min auf Eis gestellt, kurz zentrifugiert und aufs Gel aufgetragen. Das 1 x MOPS-Gel (1,5 % Agarose, ultra pure) enthielt 5 Volumenprozent konzentrierte Formaldehydlösung (36,5 % [v/v]) . Die RNA wurde bei 100 V 2 h lang aufgetrennt und anschließend geblottet.
Das Northem-Blotting erfolgte als aufwärtsgerichteter RNA- Transfer im Kapillarström. Das Gel wurde dazu zunächst 30 min in 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) geschwenkt und zurechtgeschnitten. Ein Whatmanpapier wurde so vorbereitet, dass es auf einer horizontalen Platte auflag und auf 2 Seiten in eine Wanne mit 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogen- phosphat-Puffer (pH 6,5) ragte. Auf dieses Papier wurde das Gel aufgelegt, wobei nicht bedeckte Teile des Whatmanpapiers mit einer Plastikfolie abgedeckt wurden. Das Gel wurde dann mit einer positiv geladenen Nylonmembran (Boehringer-Mannheim) luftblasenfrei abgedekt, wonach die Membran wiederum mit saugfähigem Papier in mehreren Lagen etwa 5 cm hoch bedeckt wurde. Das saugfähige Papier wurde noch mit einer Glasplatte und einem 100 g Gewicht beschwert. Das Blotting erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Die Membran wurde kurz in A. bidest. geschwenkt und zur RNA- Fixierung mit einer Lichtenergie von 125 mJ im Crosslinker (Biorad) UV-Licht bestrahlt. Die Überprüfung des gleichmäßigen RNA-Transfers auf die Membran erfolgte auf der UV-Lichtbank. Zur Detektion von Gersten mRNA wurden 10 μg Gesamt-RNA aus jeder Probe über ein Agarosegel aufgetrennt und mittels Kapillartransfer auf eine positiv-geladene Nylonmembran geblottet. Die Detektion erfolgte mit dem DIG-Systeme. 5
Herstellung der Sonden: Zur Hybridisierung mit den zu detektie- renden RNAs wurden mit Digogygenin oder Fluoreszein markierte RNA Sonden hergestellt. Diese wurden durch in vitro Transkription eines PCR-Produktes mittels einer T7 oder SP6 RNA Polymerase 10 mit markierten UTPs erstellt. Als Vorlage für die PCR gestützte Amplifikation dienten die oben beschriebenen Plasmidvektoren pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI .
Je nach Orienttierung des Inserts wurden unterschiedliche RNA- 15 Polymerasen zur Herstellung des antisense-Stranges herangezogen. Die T7-RNA-Polymerase wurde für pGEMT-BAS und pGEMT-OXLP verwendet, die SP6-RNA-Polymerase für pGEMT-RACl und pGEMT-UBI.
Das Insert der einzelnen Vektor wurde über PCR mit flankierenden 20 Standard-Primern (M13 fwd und rev) amplifiziert . Die Reaktion lief dabei mit folgenden Endkonzentrationen in einem Gesamtvolumen von 50 μL PCR-Puffer (Silverstar) ab:
Ml3-fwd: 5 ' -GTAAÄACGACGGCCAGTG-3 ' (SEQ ID NO: 23) 25 Ml3-Rev: 5 ' -GGAAACAGCTATGACCATG-3 ' (SEQ ID NO: 24)
10 % Di ethylsulfoxid (v/v) je 2 ng/μL Primer (M13 forward und reversed) ■ 1,5 mM MgCl2, 30 0,2 mM dNTPs,
4 Units Taq-Polymerase (Silverstar) ,
2 ng/μL Plas id-DNA.
Die Amplifikation verlief in einem Thermocycler (Perkin-Elmar 35 2400) temperaturgesteuert:
94°C 3 min Denaturierung
30 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung) 40 58°C 30 sek (Annealing) ,
72°C 1,2 min (Extension),
72°C 5 min abschließende Extension
4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung
45 Der Erfolg der Reaktion wurde im 1 %igen Agarosegel überprüft.
Die Produkte wurden anschließend mit einem "High Pure PCR-Product
Purification Kit" (Boehringer-Mannheim) aufgereinigt . Man erhielt etwa 40 μL Säuleneluat, das erneut im Gel überprüft und bei -20°C
5 gelagert wurde.
Die RNA Polymerisation, die Hybridisierung und die Imuno- detektion wurden weitestgehend nach Angaben des Herstellers des Kits zur nicht-radioaktiven RNA-Detektion durchgeführt (DIG
10 System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer- Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Physiol 106:1264-1277) . 4 μl gereinigtes PCR-Produkt wurden mit 2 μL Transskriptionspuffer, 2 μl NTP-Markierungsmix, 2 μl-NTP-Mix und 10 μl DEPC-Wasser versetzt . Anschließend wurden 2 μL der T7-RNA-Polymeraselösung zu
15 pipettiert. Die Reaktion- urde dann 2 h bei 37°C durchgeführt und anschließend mit DEPC-Wasser auf 100 μL aufgefüllt. Die RNA-Sonde wurde im Ethidiumbromidgel detektiert und bei -20°C gelagert.
Zur Vorbereitung der Hybridisierung wurden die Membranen zunächst 20 1 h bei 68°C in 2 x SSC (Salt, Sodiumcitrate) , 0,1 % SDS-Puffer (Sodiumdodecylsulfate) geschwenkt, wobei der Puffer 2 bis 3 mal erneuert wurde. Die Membranen wurden anschließend an die Innenwand auf 68°C vorgeheizter Hybridisierungsröhren angelegt und 30 min mit 10 mL Dig-Easy-Hybridisierungspuffer im vorgeheizten 25 Hybridisierungsofen inkubiert. Währenddessen wurden 10 μL Sondenlösung in 80 μL Hybridisierungspuffer bei 94°C für 5 min denaturiert, anschließend auf Eis gestellt und kurz zentrifugiert. Zur Hybridisierung wurde die Sonde dann in 10 mL 68°C warmem Hybridisierungspuffer überführt, und der Puffer in der Hybridisierungs- 30 röhre durch diesen Sondenpuffer ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte dann ebenfalls bei 68°C über Nacht.
Vor Immundetektion von RNA-RNA Hybriden wurden die Blots strin- gent zweimal für jeweils 20 min in 0.1 % (w/v) SDS, 0.1 x SSC bei 35 68°C gewaschen.
Zur Immunodetektion wurden die Blots zunächst zweimal für 5 min bei RT in 2 x SSC, 0,1 % SDS geschwenkt. Anschließend erfolgten 2 stringente Waschschritte bei 68°C in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS für
40 je 15 min. Die Lösung wurde anschließend durch Waschpuffer ohne Tween ersetzt. Es wurde 1 min geschüttelt und die Lösung durch Blockingreagenz ausgetauscht. Nach weiteren 30 min Schütteln wurden 10 μL Anti-Fluoreszein-Antikörperlösung hinzugefügt und weitere 60 min geschüttelt. Es folgten zwei 15 inütige Wasch-
45 schritte in Waschpuffer mit Tween. Die Membran wurde anschließend 2 min in Substratpuffer äquilibriert und nach Abtropfen auf eine Kopierfolie überführt. Auf der "RNA-Seite" der Membran wurde dann ein Gemisch aus 20 μL CDP-Star™ und 2 L Substratpuffer gleichmäßig verteilt . Im Anschluss wurde die Membran mit einer zweiten Kopierfolie abgedeckt und an den Rändern mit Hitze luftblasenfrei und wasserdicht verschweißt. Die Membran wurde dann in einer Dunkelkammer für 10 min mit einem Roentgenfilm bedeckt und dieser anschließend entwickelt. Je nach Stärke der Lumineszenzreaktion wurde die Belichtungszeit variiert.
Wenn nicht extra gekennzeichnet waren die Lösungen im Liefer- umfang des Ki ts enthalten (DIG-Luminescence detection Kit,
Boehringer-Mannheim) . Alle anderen wurden aus folgenden Stammlösungen durch Verdünnung mit autoklaviertem, destilliertem Wasser hergestellt. Alle Stammlösungen wurden, wenn nicht anders spezifiziert, mit DEPC (wie DEPC-Wasser) angesetzt und anschließend autoklaviert .
DEPC-Wasser: Destilliertes Wasser wird über Nacht bei 37°C mit Diethylpyrokarbonat (DEPC, 0,1 %, w/v) behandelt und anschließend autoklaviert
10 x MOPS-Puffer: 0,2 M MOPS (Morpholin-3-propansulfonsäure) , 0,05 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, pH mit 10 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt
- 20 x SSC (Natriumchlorid-Natriumzitrat, Salt-Sodiumcitrate) .- 3 M NaClo, 0.3 M triNatriu citrat x 2 H20, pH mit 4 M HC1 auf pH 7 , 0 eingestellt .
1 % SDS (Natriumdodecylsufat, Sodiumdodecylsulfate)Natrium- dodecylsulfat (w/v) , ohne DEPC
RNA-Probenpuffer: 760 μL Formamid, 260 μL Formaldehyd, 100 μL Ethidiumbromid (10 mg/mL) , 80 μL Glycerol, 80 μL Bromphenolblau (gesättigt), 160 μL 10 x MOPS, 100 μL Wasser.
10 x Waschpuffer ohne Tween: 1,0 M Maleinsäure, 1,5 M NaCl; ohne DEPC, mit NaOH (fest, ca. 77 g) und 10 M NaOH auf pH 7,5 einstellen.
- Waschpuffer mit Tween: aus Waschpuffer ohne Tween mit Tween (0,3 %, v/v)
10 x Blockingreagenz : 50 g Blockingpulver (Boehringer- Mannheim) in 500 mL Waschpuffer ohne Tween suspendieren. Substratpuffer: 100 mM Tris (Trishydroxymethylamino-methan) , 150 mM NaCl mit 4 M HC1 auf pH 9 , 5 einstellen.
10 x Farbmarker: 50 % Glycerol (v/v), 1,0 mM EDTA pH 8,0, 0,25 % Bromphenolblau (w/v), 0,25 % Xylencyanol (w/v).
Beispiel 6 : In vitro Synthese der RacB dsRNA
Alle Plasmide (pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI) die für die in vitro Transkription eingesetzt wurden beinhalten den T7 und SP6 Promotor (pGEM-T, Promega) an den jeweiligen Enden der insertierten Nukleinsäuresequenz, was die Synthese von sense- bzw. antisense RNA ermöglicht. Die Plasmide können mit geeigneten Restriktionsenzymen linearisiert werden, um eine korrekte Transkription der insertierten Nukleinsäuresequenz zu gewährleisten und ein Durchlesen in vektorielle Sequenzen zu verhindern.
Dazu wurden 10 μg Plasmid-DNA jeweils mit an der distal vom Promoter gelegenen Seite des Inserts geschnitten. Die geschnittenen Plasmide werden in 200 μl Wasser mit gleichem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, in ein neues Eppendorfreaktionsgefäß (RNAse frei) transferiert und 5 min bei 20000 g zentrifugiert. 180 μl der Plas id-Lösung wurden mit 420 μl Ethanol versetzt, auf Eis gestellt und anschließend durch Zentrifugation für 30 min bei 20000 g und - 4°C präzipitiert. Das Präzipitat wurde in 10 μl TE Puffer aufgenommen.
Zur Herstellung der RacB-dsRNA wurde das Plasmid pGEMT-Racl mit Spei verdaut und sense-RNA mit der T7-RNA-Polymerase transkribiert. Ferner wurde pGEMT-Racl mit Ncol verdaut und antisense-RNA mit der SP6-RNA-Polymerase transkribiert. RNA Polymerasen wurden von Röche Molecular Biology, Mannheim, Deutschland bezogen.
Jeder Transkriptionsansatz beinhaltete in einem Volumen of 40 μl:
2 μl linearisierte Plasmid DNA (1 μg)
2 μl NTP's (25 mM) (1,25 mM von jedem NTP) 4 μl lOxReaktionspuffer (Röche Molecular Biology) ,
1 μl RNAsin RNAsin (27 Units; Röche Molecular Biology),
2 μl RNA Polymerase (40 Units) 29 μl DEPC-Wasser
Nach einer Inkubation von 2 h bei 37°C wurde jeweils ein Teil der Reaktionsansätze aus der Transktiption des "sense"- bzw. "antisense"-Stranges gemischt, für 5 min bei 95°C denaturiert und an- schließend durch Abkühlung über 30 min auf eine Endtemperatur von 37°C miteinander hybridisiert ("annealing"). Alternativ kann nach der Denaturierung das Gemisch aus sense- und antisense-STrang auch für 30 min bei -20°C gekühlt werden. Das Proteinpräzipitat, das sich während Denaturierung und Hybridisierung bildet wurde durch kurze Zentrifugation bei 20.800 g abgetrennt und der Überstand direkt zur Beschichtung von Wolframpartikeln verwendet (s. unten). Zur Analyse wurden jeweils 1 μl jeden RNA-Stranges und der dsRNA auf einem nicht-denaturierenden Agarosegel auf- getrennt. Eine erfolgreiche Hybridisierung zeigte sich, durch eine Bandenverschiebung zu höherem Molekulargewicht im Vergleich zu den Einzelsträngen.
4 μl der dsRNA wurden Ethanol-präzipitiert (durch Zugabe von 6 μl Wasser, 1 μl 3M Natriumacetat-Lösung und 25 μl Ethanol, sowie Zenrifugation für mindestens 5 min bei 20000 g und 4°C) und in 500 μl Wasser resuspendiert. Das Absorbtionsspektrum zwischen 230 und 300 nm wurde gemessen, bzw. die Absorption bei 280 und 260 nm bestimmt, um die Reinheit und die Konzentration der dsRNA zu bestimmen. In der Regel wurden 80 bis 100 μg dsRNA mit einem OD2so/OD280 -Verhältnis von 1,80 bis 1,95 erhalten. Ein Verdau mit DNase I kann optional durchgeführt werden, beeinflusst jedoch nachfolgende Ergebnisse nicht wesentlich.
Als Kontroll-dsRNA fungierte die dsRNA des humanen Thyroi- drezeptors (Ausgangsvektor pT7betaSal (Norman C et al. (1988) Cell 55(6) :989-1003) zur Verfügung gestellt von Dr. Baniahmad, Institut für Genetik, Gießen, Deutschland; die Sequenz des Insert ist beschrieben unter der GenBank Acc.-No.: NM_000461) . Für die Herstellung der sense-RNA wurde das Plasmid mit PvuII, für die antsense-RNA mit Hindlll verdaut und die RNA dann mit T7- bzw. SP6 RNA-Polymerase transkribiert. Die einzelnen Verfahrensschritte zur Herstellung der Kontroll-dsRNA werden analog den oben für die RacB-dsRNA beschriebenen durchgeführt.
Beispiel 7: Transiente Transformation, RNAi und Evaluation der Pilzpathogenentwicklung
Gerste cv Pallas Blattsegmente wurden mit einer RacB-dsRNA zusammen mit einem GFP-Expressionsvektor transformiert. Anschließend wurden die Blätter mit Bgh inokuliert und das Ergebnis nach 48 h mittels Licht- und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Penetration in GFP-expri ierenden Zellen wurde mittels Detektion von Haustorien in lebenden Zellen und durch Bewertung der Pilzentwicklung auf eben diesen Zellen beurteilt. In allen sechs Experimenten führte die Bombardierung von Gerste cv Pallas mit RacB-dsRNA zu einer verminderten Anzahl von erfolg- reich durch Bgh penetrierten Zellen im Vergleich zu Zellen die mit einer fremden Kontroll-dsRNA (humaner Thyroidhormonrezeptor dsRNA, TR) bombardiert wurden. Der resistenzinduzierende Effekt der JϊaαB-dsRNA bedingte eine durchschnittliche Verminderung der Penetrationseffizienz durch Bgh um 44 % (Fig. 4) .
Es wurde ein Verfahren zur transienten Transformation eingesetzt das bereits für die biolistische Einführung von dsRNA in epidermale Zellen von Gerstenblättern beschrieben wurde (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Wolframpartikel mit einem Durchmesser von 1,1 μm (Partikeldichte 25 mg/ml) wurden mit dsRNA (Herstellung siehe oben) zusammen mit Plasmid-DNA des Vektors pGFP (GFP unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors) als Transformationsmarker beschichtet. Dazu wurden pro Schuss die nachfolgender Mengen an dsRNA bzw. Reporterplasmid zur Beschichtung verwendet: 1 μg pGFP und 2 μg dsRNA. Dopplesträngige RNA wurde mittels Verschmelzens von "sense" und "antisense"-RNA in vitro synthetisiert (s.o.).
Für Microcarrier-Präparation wurden 55 mg Wolframpartikel (M 17, Durchmesser 1,1 μm; Bio-Rad, München) zweimal mit 1 ml auto- klaviertem Destilliertem Wasser und einmal mit 1 mL absolutem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 ml 50 %igem Glycerin auf- genommen (ca. 50 mg/ml Stammlösung) . Die Lösung wurde mit 50 %igem Glycerin auf 25 mg/ml verdünnt, vor Gebrauch gut gemischt und im Ultraschallbad suspendiert. Zur Microcarrier-Beschichtung wurden pro Schuss 1 μg Plasmid, 2 μg dsRNA (1 μL) , 12,5 μl Wolframp- artikel-Suspension (25 mg/ml), 12,5 μl I M Ca(N03)2-Lösung (pH 10) tropfenweise unter ständigem Mischen zusammengegeben, 10 min bei RT stehengelassen, kurz zentrifugiert und 20 μl vom Überstand abgenommen. Der Rest mit den Wolframpartikel wird resuspendiert (Ultraschallbad) und ins Experiment eingesetzt.
Es wurden ca. 4 cm lange Segmente von Gerstenprimärblättern verwendet. Die Gewebe wurden auf 0,5 % Phytagar (GibcoBRL™ Life Technologies™ , Karlsruhe) mit 20 μg/ml Benzimidazol in Petri- schalen (6,5 cm Durchmesser) gelegt und direkt vor dem Partikel- beschuss an den Rändern mit einer Schablone mit einer recht- eckigen Aussparung von 2,2 cm x 2,3 cm abgedeckt. Die Schalen wurden nacheinander auf den Boden der Vakuumkammer (Schweizer p et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54) gestellt, über dem ein Nylonnetz (Maschenweite 0,2 mm, Millipore, Eschborn) als Diffusor auf einer Lochplatte eingeschoben war (5 cm über dem Boden, 11 cm unterhalb des Macrocarriers, s.u.), um Partikelklumpen zu zerstreuen und den Partikelstrom abzubremsen. Der oben an der Kammer angebrachte Macrocarrier (Plastik-Sterilfilter- halter, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK) wurde je Schuss mit 5,8 μL DNA-beschichteten Wolframpartikeln (Microcarrier, s.u.) beladen. Mit einer Membranvakuumpumpe (Vacuubrand, Wertheim) wurde der Druck um 0 , 9 bar in der Kammer reduziert und die Wolframpartikel mit 9 bar Heliumgasdruck auf die Oberfläche des Pflanzengewebes geschossen. Sofort danach wurde die Kammer belüftet. Zur Markierung transformierter Zellen wurden die Blätter mit dem Plasmid (pGFP; Vektor auf pUC18-Basis, CaMV 35S- Promoter/Terminator-Kassette mit insertiertem GFP-Gen; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; zur Verfügung gestellt von Dr. P. Schweizer Schweizer P, Institut für Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Deutschland) beschossen. Vor dem Schießen eines anderen Plasmids wurde der Macrocarrier jeweils gründlich mit Wasser gereinigt. Nach vierstündiger Inkubation nach dem Beschuss bei leicht geöffneten-Petrischalen, RT und Tageslicht wurden die Blätter mit 100 Konidien/mm2 des Echten Gerstenmehltaupilzes (Rasse A6) inokuliert und für weitere 36 bis 48 h unter gleichen Bedingungen inkubiert.
Blattsegmente wurden mit den beschichteten Partikeln unter
Verwendung einer "particle inflow gun" bombardiert. Pro Schuss wurden 312 μg Wolframpartikel appliziert. 4 h nach der Bombardierung wurde Inokulation mit Blumeria graminis f. sp. hordei Mehltau (Rasse A6) inokuliert und nach weiteren 40 h bezüglich der Infektionsanzeichen ausgewertet. Das Ergebnis (z.B. die Penetrationseffizienz, definiert als prozentualer Anteil angegriffener Zellen mit reifem Haustorium und einer Sekundärhyphe ("secondary elongating hyphae"), wurde mittels Fluoreszens- und Lichtmikroskopie analysiert. Eine Inokulation mit 100 Conidia/mm2 ergibt eine Angriffsfrequenz von ca. 50 % der transformierten Zellen. Für jedes einzelne Experiment wurde eine minimale Anzahl von 100 Interaktionsstellen ausgewertet. Transformierte (GFP exprimierende) Zellen wurden unter Anregung mit blauem Licht identifiziert. Drei verschiedene Katagorien von transformierten Zellen konnten unterschieden werden:
1 Penetrierte Zellen, die ein leicht erkennbares Haustorium beinhalten. Eine Zelle mit mehr als einem Haustorium wurde als eine Zelle gewertet.
Zellen, die durch ein Pilz-Appressorium zwar angegriffen wurden, aber kein Haustorium beinhalten. Eine Zelle die mehrfach von Bgh angegriffen wurden, aber kein Haustorium enthält, wurde als eine Zelle gewertet.
Zellen die nicht durch Bgh angegriffen sind. Stomatazellen und Stomatanebenzellen wurden von der Bewertung ausgeschlossen. Oberflächenstrukturen von Bgh wurden mittels Lichtmikroskopie oder Fluoreszenzfärbung des Pilzes mit 0,1 % Calcofluor (w/v in Wasser) für 30 sec analysiert. Die Ent- wicklung des Pilzes kann leicht durch Fluoreszenzmikroskopie nach Anfärbung mit Calcofluor evaliert werden. In RacB-dsRNA transformierten Zellen entwickelt der Pilz zwar ein primäres und ein appressoriales Keimschlauch ("Germ-Tube") aber kein Haustorium. Haustoriumausbildung ist eine Vorbedingung für die Bildung einer Sekundärhyphae .
Die relative Penetrationseffizien (RPE) errechnet sich als Differens aus der Penetrationseffizien bei transformierten Zellen (Transformation mit RacB- oder Kontrol-dsRNA) und der Penetrationseffizienz bei untransformierten Zellen (hier: .durchschnittliche Penetrationseffizienz 57 %) . Die prozentuale RPE (%-RPE) errechnet sich aus der RPE minus 1 und multipliziert mit 100.
RPE = FPE bei RacB-dsRNA transformierten Zellen!
[PE bei Kontroll-dsRNA transformierten Zellen]
%-RPE = 100 * (RPE-1)
Der %-RPE-Wert (Abweichung von der durchschnittlichen Penetrationseffizienz der Kontrolle) dient der Bestimmung des Suszeptibilität von Zellen, die mit RacB-dsRNA transfiziert sind (Fig. 4) .
Bei der Kontrol-dsRNA wurde bei fünf unabhängigen Versuchen kein Unterschied zwischen der Transfektion mit der Kontroll dsRNA und Wasser bezüglich der Penetrationseffizienz von Bgh beobachtet.
Ferner wurde die Abweichung der PE in verschiedenen Genotypen untersucht. Um die funktioneile Verbindung zum Mio-Gen zu demonstrieren wurde ein mlo5-Genotyp (A89, mlo5 rorl, Hintergrund: Ingrid) eingesetzt, der nur moderat anfällig gegen einen Bgh Befall aufgrund einer Mutation des orl-Gen ist ( Freialdenhoven A et al. (1996) Plant Cell 8:5-14). In diesem doppelt-mutantem Ge- notyp wurde die Effizienz von RacB-dsRNA im Vergleich zu einem Wildtyp Mio-Genotyp untersucht. In fünf unabhängigen Experimenten konnte jedoch keine Verhinderung der Haustorium-Ausbildung in A89 beobachtet werden. Wohingegend die PE bei parallelen Experimenten mit Pallas und Ingrid deutlich reduziert war (Fig. 5) . Interes- santerweise war der Effekt der RacB-dsRNA in Pallas ausgeprägter als in Ingrid (Fig. 5, Experiments 1 und 2 im Vergleich zu 3, 4 und 5) .
Um einen Einfluss auf der dsRNA auf die Transformationsrate oder Überlebensrate der angegriffenen Zellen auszuschließen, wurde die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen zwischen Kontroll- und RacB-dsRNA Experimenten verglichen (Tabelle 7) . Die RacB-dsRNA hatten keinen Einfluss auf die Gesamtanzahl- oder die Anzahl der angegriffenen GFP-exprimierenden Zellen.
Tabelle 7 : Transformationsraten an Gerstenblätterm nach Bombardierung mit dsRNA
Anzahl der GFP exprimierenden Zellen pro Schuss3
Gesamt Angegriffen
Gesamt Angegriffen (Kontroll- (Kontroll-
Linie (Äαc-9-dsRNA) (RacB-dsKNA) dsRNA) dsRNA)
Pallas 34.3+4.6 16.012.2 33.9+4.8 15.511.4 6(21) (Mio Rorl) Ingrid 51.0+8.9 27.618.7 49.9+5.6 31.5+7.8 3(11) (Mo Rorl) A89 34.4±5.4 18.1+4.0 34.115.5 16.7+3.8 5(22) (mlo5 rorl)
a: 4 Blätter wurden pro Schuss bombardier.
Angegeben sind Mittelwerte und Standardfehler c: Anzahl der unabhängigen Versuche (Schüsse n jeweils für
Kontroll- und RacB-dsRNA) .
Beispiel 8 : Konstitutiv aktive Mutante von RACB
Zur Positiv-Identifizierung von RACB als Suszeptibilitätsfaktor wurde eine putativ konstitutiv aktive Mutante von Gerste RACB erstellt (Austausch G->V an Position 15; RacB-V15) und in Gerste der Sorte Pallas überexprimiert . Zunächst wurde RACB full-lenght über RT-PCR dargestellt. Dazu wurden nachfolgende Oligonukleotidprimer eingesetzt:
RacB5'BamHI : 5 ' -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3 ' (SEQ ID NO: 31)
RacB3'SalI 5 ' -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3 ' (SEQ ID NO: 32)
Die cDNA wurde in pGEM-T kloniert und anschließend über die Pri- merschnittstellen ausgeschnitten und in pGY-1 (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Fig. 7) über BamHI / Sall Schnittstellen kloniert. Das Konstrukt trägt die Bezeichnung pGYl-RacB. Die Nukleinsäuresequenz kodierend für die konstitutiv aktive RacB-Mutante RACB-V15 wurde hergestellt mit dem "Transfor- mer®Site-Directed Mutagenesis Kit" (Clonetech, Heidelberg) nach Anleitung des Herstellers. Als Ausgangsvektor wurde pGYl-RacB eingesetzt. Als Mutagenese-Primer wurde nachfolgendes Oligonukleotid verwendet :
VI5 : 5 ' -ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3 ' (SEQ ID NO: 33)
RACB-V15 wurde dann in 5 unabhängigen Experimenten transient in Gerste der Sorte Pallas unter Kontrolle des 35S CamV Promotors überexprimiert . Die Experimente wurden wie in Schultheiss et al . (Schultheiss H et al . (2002) Plant Physiol 128:1447-1454) beschrieben durchgeführt, nur wurde nach dem Partikelbeschuss 24 statt 4 h vor der Inokulation gewartet . Das coating der Partikel lief wie in Schweizer et al. (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54) beschrieben.
Die Expression einer konstituiven RacB-Mutante bewirkt eine sig- nifikant erhöhte Anfälligkeit gegen Pathogenbefall mit Gerstenmehltau im Vergleich zu den Kontrollen. Auch diese Ergebisse belegen die Schlüsselfunktion von RacB bei der Pathogenabwehr. Die RACB-V15 Effekte (s.Fig 6-A/B) sind im t-test signifikant, wenn man einen zweiseitigen gepaarten Test macht. Die relative Suszep- tibilität gegenüber dem Pilzpathogen ist in allen Fällen erhöht (Fig. 6-B) .
Beispiel 9 : Weitere HvRac-Homologe
Alle Vollänge-Sequenzen wurden mit spezifischen Primern aus RNA Isoliert und in pGEM-T kloniert und sequenzierT (Hückelhoven et al. (2001) Plant Mol Biol; Schultheiss et al. (2002) Plant Physiol 128:1447-1454). Die Sequenzen sind RacB z.T. sehr ähnlich.
a) HvRopδ:
LEFT PRIMER 5 ' -GTGGAGGCGCGGCGAGA-3 ' (SEQ ID NO: 25)
RIGHT PRIMER' 5 ' -CCATGCTTCATCTCCATAGTCA-3 ' (SEQ ID NO: 26)
b) HvRacD:
LEFT PRIMER 5 ' -ggatccCGATTCCATCAGGAAAGCAT-3 ' (SEQ ID NO: 27) RIGHT PRIMER 5 ' -gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3 ' (SEQ ID NO: 28)
c) HvRop4:
LEFT PRIMER 5 ' -GGATCCttctcgtccatttagccggc-3 ' (SEQ ID NO: 29) RIGHT PRIMER 5 ' -GTCGACtgatcacttgaagcatgσcag-3 ' (SEQ ID NO: 30)
Beispiel 10: Herstellung von Sense- und Antisense-Konstrukten mit dem Gen AtRacB zur Expression in Arabidopsis thaliana
Ein Fragment eines RacB-Homologs aus Arabidopsis (MlPS-Code: AT4g35950; SEQ ID NO: 53; infolge AtRacB) wird via PCR aus einer Arabidopsis thaliana cDNA-Bibliothek isoliert. Die verwendeten Primersequenzen lauten:
Fra 186: 5 x -ATGAGCGCGTCCAGGTTCATA-3 λ (SEQ ID NO: 71)
Fra 187: 5 λ-ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3 λ (SEQ ID NO: 72)
Die Amplifikation verläuft in einem Thermocycler T3 der Firma Biometra temperaturgesteuert:
35 Zyklen mit 1 min 95°C, 0,5 min 59°C und 3 min 72°C. Abschließende Extension für 5 min bei 72°c.
Die PCR-Produkte wird in den Vektor pCR2.1 (gemäß pCR Script Clo- ning Kit, Firma Stratagene, Heidelberg) nach Herstellerangaben kloniert. Über das Restrikitionsenzym EcoRI (Firma Röche, Mannheim) wird ein Fragment aus dem Vektorkonstrukt geschnitten. Das Fragment läßt sich über eine Gelelektrophorese mit anschließender Aufreinigung über Anionenaustauschersäulen (QIAex Purification Kit, Fa. Qiagen, Hilden) isolieren. Entsprechend wird der binäre Vektor pSUN3-Nit über die Enzyme Xmal und EcoRI aufgeschnitten und einer Reinigung mittels Gelektrophorese mit anschließender Elution über Anionenaustauschersäulen (QIAex Purification Kit, Fa. Qiagen, Hilden) unterzogen.
Da für die Klonierung Insert und Vektor mit 5 ' -überhängenden Enden glatte Enden ("blunt ends") generiert werden müssen, wird so- wohl das eluierte AtRacB-Fragment als auch das eluierte pSUN3-Nit-Fragment mit 2 μl dNTP-Mix I (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Firma Pharmacia, Freiburg) und 1,6 μl Klenow-Fragment (Fa. USB/ Amersham, Braunschweig, 2 U/μl) zum Auffüllen des Überhanges behandelt und 30 min bei 37°C inkubiert. Um eine Religation zu verhindern, werden die Vektoren zuerst über eine QIAquick Spin Column (Frima Qiagen,Hilden) gereinigt, mit CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Fa. GibcoBRL, Eggenstein, 1 U/μl) behandelt und abschließend über ein 0,8%-iges Agarosegel aufgereinigt .
Für den folgenden Ligationsansatz in einem Gesamtvolumen von 50 μl wird zu den 10 μl geschnittener DNA noch 34 μl H0, 5 μl Liga- tionspuffer und 1 μl T4 Ligase (Firma Röche, Mannheim) gegeben. Dieser Ansatz wird über Nacht bei 16°C inkubiert. Anschließend wird die Ligase bei 65°C für 10 min inaktiviert. An die Ligation schließt sich wieder eine Fällung mit 0,1 Volumen Natriumacetat (pH5,2) und 2,5 Volumen Ethanol an. Nach Zentrifugation (30 min, 15000 g, 4°C) wird das Pellet in 70% Ethanol getrocknet und in 10 μl H0 resuspendiert. 2 μl dieses Pellets werden durch Elektropo- ration (E. coli-Pulser, Firma Bio-Rad) in Escherichia coli-Bakte- rien Stamm DH5α transformiert. Die mit der DNA behandelten Bakterien werden auf LB-Platten plattiert, die das Antibiotikum Ampi- cillin (50 mg/1) enthalten. Nach einer Inkubation über 16 h bei 37°C werden von den gewachsenen Kolonien Bakterien abgestrichen und in jeweils Reagenzgläser mit 3 ml LB-Amp-Flüssigmedium überführt. Nach einer Inkubation von 16 h bei 37°C werden die dicht gewachsenen Kulturen zentrifugiert. Aus den Bakterienpellets wird mittels QIAprep DNA-Minipräparationskit (Firma Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben Plasmid-DNA isoliert und analytischen Ver- daus mit verschiedenen Enzymkombinationen unterzogen. Durch diese Kontrollverdaus lassen sich Kontrukte isolieren, bei denen das Gen AtRacB in sense-Orientierung bzw. antisense-Orientierung hin- ter den in Pflanzen konstitutiv aktiven des Nitrilase-1 (nitl) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200) kloniert vorliegt. Diese Konstrukte werden mit pSUN3NIT_AtRacB_s (SEQ ID NO: 73) und pSUN3NIT_atRacB_as (SEQ ID NO: 74) bezeichnet und für die Transformation von Arabidopsis-'Bflanzen verwendet. Die Konstrukte beinhalten die vollständige Sequenz von AtRacB, so dass der Expressionsvektor pSUN3NIT_HvRacB_s, der das Fragment in sense-Orientierung enthält, befähigt ist ein funktionelles AtRacB- Protein zu exprimieren. Der Vektor dient primär als Negativkon- trolle und ergibt in den meisten Fällen eine verminderte Pathogenresistenz, in einigen Fällen (s.u.) jedoch auch eine Erhöhung der Pathogenresistenz vermutlich über einen Cosuppressionseffekt .
Beispiel 11: Herstellung von Sense- und Antisense-Konstrukten mit dem Gen HvRacB zur Expression in Arabidopsis thaliana
Von dem Gen HvRacB sollen verschiedene nicht-funktioneile Fragmente zur Expression in Arabidopsis-Pflanzen hergestellt werden. Dazu wird das Plasmid, welches das tfvRacB-Gen subkloniert in den bakteriellen Vektor pGEM-T enthielt mit den Enzymkombinationen BamHI / Hindill (Firma Röche, Mannheim) verdaut. Durch eine Behandlung mit der Klenow-Polymerase in Anwesenheit eines Gemischs von Nukleotiden (s.o.) werden überhängende 5 -Einzelstränge aufgefüllt. Das entstehende HvR cB-Fragment mit den auf diese Weise geglätteten Enden wird direkt in einen pSUN3NIT-Vektor kloniert, der in seiner Multiple Cloning Site mit den Enzymen Bglll und Spei (Firma Röche, Mannheim) geöffnet wird und dessen 5'-überhän- gende Enden mittels Behandlung mit Klenow-Polymerase (wie oben beschrieben) aufgefüllt werden. Für die Ligationsansätze jeweils in einem Gesamtvolumen von 50 μl werden zu den 10 μl geschnittener DNA noch 34 μl H20, 5 μl Ligationspuffer und 1 μl T4 Ligase (Firma 5 Röche, Mannheim) gegeben. Dieser Ansatz wird über Nacht bei 16°C inkubiert. Anschließend wird die Ligase bei 65°C für 10 min inaktiviert. An die Ligation schließt sich wieder eine Fällung mit 0,1 Volumen Natriumacetat (pH5,2) und 2,5 Volumen Ethanol an. Nach Zentrifugation (30 min, 15000 g, 4°C) wird das Pellet in 70%
10 Ethanol getrocknet und in 10 μl H20 resuspendiert. 2 μl dieses Pellets werden durch Elektroporation (E. σoli-Pulser, Firma Bio- Rad) in Escherichia coli-Bakterien Stamm DH50C transformiert . Die mit der DNA behandelten Bakterien werden auf LB-Platten plattiert, die das Antibiotikum Ampicillin (50 mg/1) enthalten. Nach
15 einer Inkubation über 16 h bei 37°C werden von den gewachsenen Kolonien Bakterien abgestrichen und in jeweils Reagenzgläser mit 3 ml LB-Amp-Flüssigmedium überführt. Nach einer Inkubation von 16 h bei 37°C werden die dicht gewachsenen Kulturen zentrifugiert. Aus den Bakterienpellets wird mittels QIAprep DNA-Minipräparationskit
20 (Firma Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben Plasmid-DNA isoliert und analytischen Verdaus mit verschiedenen Enzymkombinationen unterzogen. Durch diese Kontrollverdaus lassen sich Kon- strukte identifizieren, bei denen das entsprechende Genkonstrukt in sense bzw. in antisense-Orientierung hinter den in Pflanzen
25 konstitutiv aktiven Promotor des Nitrilase-1 Gens aus A.thalina (s.o.) kloniert vorliegt. Diese Konstrukte werden mit pSUN3NIT_HvRacB_s (SEQ ID NO: 75) und pSUN3NIT_HvRacB_as (SEQ ID NO: 76) bezeichnet und für die Transformation von Arabidopsis- Pflanzen verwendet. Die Konstrukte beinhalten ein verkürztes
30 Fragment von hvRacB, so dass auch der Expressionsvektor pSUN3NIT_HvRacB_s, der das Fragment in sense-Orientierung enthält, nicht befähigt ist ein funktionelles HvRacB-Protein zuex- primieren. Der Vektor dient primär als NegativKontrolle, ergibt aber auch in einigen Fällen (s.u.) eine Erhöhung der Pathogenre-
35 sistenz vermutlich über einen Cosuppressionseffekt .
Beispiel 12: Transformation von Arabidopsis thaliana und Analyse der Pilzresistenz
40 Wildtyp A. thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agräbacte- rium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Methode (Steve Clough und Andrew Bent (1998) Plant J 16(6) : 735- 743) der Vacuum Infiltrationsmethode nach Bechtold et al.(Beσh- told N et al. (1993) CR Acad Sei Paris, Life Sciences 316:1194-
45 1199) . Die verwendeten A. tυmefaciens Zellen werden im Vorfeld mit den Plasmiden pSUN3NIT_AtRacB_s (SEQ ID NO: 73) , pSUN3NIT_atRacB_as (SEQ ID NO : 74 ) , pSUN3NIT_HvRacB_s (SEQ ID NO : 75 ) und pSUN3NIT_HvRacB_as (SEQ ID NO : 76) transformiert . i Samen der Agrobacterium-transformierten Primärtrans formanden werden auf Grundlage der Kanamycin-Resistenz selektioniert . Antibiotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet .
Zur Analyse der Resistenz der transgene AraJbidqpsis-Pflanzen gegenüber pathogene Pilzen werden Inokulationen mit den biotrophen Pilzen Peronospora parasitica und Erysiphe cichoracearum vorgenommen .
a) Peronospora parasitica
5 bis 8 Wochen alte Pflanzen werden mit einer Konidiensporensus- pension (ca. 106 Sporen / ml) besprüht. Die inokulierten Pflanzen werden über Nacht in einem Kühlschrank bei ca. 16°C mit einer Plastiktüte überdeckt dunkel und feucht gehalten. Nach einem Tag wird die Plastiktüte etwas geöffnet und später vollständig entfernt. Sechs Tage nach Inokulation werden die Pflanzen wieder über Nacht mit der Plastiktüte zugedeckt, wodurch die Sporulation induziert wird. Am folgenden Tag werden die Blätter auf das Auftreten von Konidiophoren untersucht. Das interzelluläre Wachstum des Pilzes führt in den nächsten Tagen zur Induktion von schwachen Chlorosen bis hin zu starken Nekrosen in den Blättern. Diese Symptome werden quantifiziert und auf Signifikanz getestet .
b) Erysiphe cichoracearum
Der biotrophe Mehltau-Pilz wird auf Arabidopsis-Pflanzen kultiviert . Zur Infektion der 4 Wochen alten transgenen RacB-exprimie- renden Arai>idopsis-Pflanzen werden mit einem feinen Pinsel Koni- dienträger auf der Oberfläche der Blätter abgenommen und auf die Blätter der transgene Pflanzen gestrichen. Die Pflanzen werden für 7 Tage bei 20°C inkubiert. 7 Tage nach Inokulation werden die Konidienträger auf den Blättern sichtbar, und es treten in den folgenden Tagen Chlorosen und Nekrosen zutage. Diese Symptome werden quantifiziert und auf Signifikanz getestet.
c) Ergebnisse
Die transgenen Arabidopsis Pflanzen die antisense-Sequenzen für AtRacB oder HvRacB expimieren, zeigen in zeigen sowohl gegen Peronospora parasitica als auch gegen Erysiphe cichoracearum eine signifikant erhöhte Resistenz im Vergleich zu nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen .
Die transgenen Arabidopsis Pflanzen die sense-Sequenzen für das vollständige AtRacB expimieren, zeigen in zeigen in den meisten Fällen sowohl gegen Peronospora parasitica als auch gegen Erysiphe cichoracearum eine signifikant erhöhte Anfälligkeit im Vergleich zu nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen. In einigen Fällen kann jedoch auch eine erhöhte Resistenz (vermutlich über einen Cosuppressionseffekt) beobachtet werden.
Die transgenen Arabidopsis Pflanzen die sense-Sequenzen für das ein Fragment von HvRacB expimieren, zeigen in zeigen in einigen Fällen sowohl gegen Peronospora parasitica als auch gegen Erysi- phe cichoracearum eine signifikant erhöhte Resistenz im Vergleich zu nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen.

Claims

Patentansprüσhe
1. Verfahren zum Erzielen oder Erhöhen der Resistenz gegen mindestens ein Pathogen in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass nachfolgende Arbeitsschritte umfasst sind
a) Verminderung der Proteinmenge, Aktivität oder Funktion eines RacB-Proteins in einer Pflanze oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle derselben und
b) Auswahl der Pflanzen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangspflanze - die Resistenz gegen mindestens ein Pathogen besteht oder erhöht ist .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das RacB Protein ausgewählt ist aus der Gruppe der Proteine bestehend aus
a) einem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6, und
b) einem funktioneilen Äquivalent eines Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 2, 4 oder 6.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das funktioneile Äquivalent eine Homologie von mindestens 64 % zu einem der Polypeptide gemäss SEQ ID NO: 2 , 4 oder 6 hat.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 , wobei das funktioneile Äquivalent beschrieben ist durch ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 oder 70.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekenn- zeichnet, dass die Verminderung des RacB-Proteins gewährleistet wird durch Anwendung eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Einbringen einer doppelsträngigen RacB RNA-Nukleinsäure- sequenz (RacB-dsRNA) oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten,
b) Einbringen einer RacB antisense-Nukleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressions- kassette,
Sequ. + Zeichn. c) Einbringen einer RacB antisense-Nukleinsäuresequenz kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,
d) Einbringen von RacB sense-Nukleinsäuresequenzen zur
Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,
e) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz kodierend für dominant-negatives RacB Protein oder einer deren
Expression gewährleistenden Expressionskassette,
f) Einbringen DNA-oder Protein-bindende Faktoren gegen RacB -Gene, -RNAs oder -Proteine oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,
g) Einbringen von den RacB RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten oder einer deren Expression gewährleistenden Expressions- kassette,
• h) Einbringen von Konstrukten zur Induktion einer homologen Rekombination an endogenen RacB-Genen und
i) Einführung von Mutationen in ein endogenes RacB Gen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , umfassend
(a) die stabile Transformation einer pflanzlichen Zelle mit einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor eine Nukleinsäuresequenz kodierend für
a) eine doppeisträngigen RacB RNA-Nukleinsäuresequenz oder
b) eine RacB antisense-Nukleinsäuresequenz oder
c) eine RacB antisense-Nukleinsäuresequenz kombiniert mit einem Ribozym oder
d) eine RacB sense-Nukleinsäuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression oder
e) ein dominant-negatives RacB Protein f) DNA-oder Protein-bindende Faktoren gegen RacB -Gene, -RNAs oder -Proteine
g) den RacB RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäure- 5 Sequenzen
(b) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und
(c) Expression besagter Nukleinsäuresequenz in einer Menge 10 und für eine Zeit hinreichend um eine Pathogenresistenz in besagter Pflanze zu erzeugen oder zu erhöhen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, dass das Pathogen ausgewählt aus der Gruppe
15 bestehend aus Bakterien, Pilzen, Insekten, Viren und Nematoden .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Pathogen ausgewählt ist aus der Gruppe
20 der Pilze bestehend aus Piasmodiophoramycota, Oomycota, Asco- myσota, Chytridiomyceten, Zygomyceten, Basidiomycota und Deuteromyceten.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn- 25 zeichnet, dass die Pflanze aus den monokotyledonen und dikto- tyledonen Pflanzen ausgewählt ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe der
30 monokotyledonen Pflanzen bestehend aus Weizen, Hafer, Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Triticale, Dinkel, Leinsamen oder Zuckerrohr.
11. RacB-Protein aus Gerste gemäß SEQ ID NO: 2. 35
12. Polypeptid kodierend für ein funktionelles Äquivalent des RacB Protein aus Gerste gemäß SEQ ID NO: 35, 37 oder 39.
13. Dominant-negative Variante eines RacB-Proteins aus Gerste ge- 40 maß Anspruch 11.
14. Dominant negative Variante nach Anspruch 13 beschrieben durch SEQ ID NO: 7.
45 15. Nukleinsäuresequenz kodierend für das RacB-Protein aus Gerste gemäß Anspruch 11.
16 . Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 15 beschrieben durch SEQ ID NO : 1, die dazu komplementäre Nukleinsäuresequenz und die durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
5
17. Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent des RacB Protein aus Gerste gemäß Anspruch 12.
18. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 17 beschrieben durch SEQ 10 ID NO: 34, 36 oder 38, die dazu komplementäre Nukleinsäuresequenzen und die durch Entartung (Degeneration) des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
19. Nukleinsäuresequenz kodierend für eine dominant-negative 15 Variante eines RacB-Proteins gemäß einem "der Ansprüche 13 oder 14.
20. Doppelsträngiges RNA-Molekül zur Verminderung der Expression eines RacB Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass
20 a) einer der beiden RNA Stränge im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil einer RacB-Nukleinsäure- sequenz , und
25 b) der jeweils andere RNA Strang im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil des komplementären Stranges einer RacB-Nukleinsäuresequenz .
21. Doppelsträngiges RNA-Molekül zur Verminderung der Expression 30 eines RacB Proteins umfassend
a) einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribo- nukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer
35 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB Protein, und
b) einen "antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter a) im wesentlichen komplementären ist.
40 22. dsRNA-Molekül nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden RNA-Stränge kovalent miteinander verbunden sind.
23. dsRNA-Molekül nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei einer 45 der beiden RNA-Stränge kodiert wird durch zumindest einen
Teil einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-Protein gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 oder eines funktioneilen Äquiva- lentes derselben gemäß SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 oder 69.
24. Transgene Expressionskassette enthalten in funktioneller Ver- 5 knüpfung mit einem Promotor eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19 oder eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 20 bis 23.
10 25. Transgene Expressionskassette enthaltend zumindest einen Teil einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein RacB-Protein gemäß SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 oder eines funktioneilen Äquivalentes derselben gemäß SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 oder 69, wobei besagte
15 Nukleinsäuresequenz in antisense-Orientierung mit einem Promotor funktionell verknüpft ist.
26. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 24 oder 25, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäurese-
20 quenz funktionell mit einem in Pflanzen funktionellen Promotor verknüpft ist.
27. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 26, wobei der in Pflanzen funktionelle Promotor ein pathogen-induzierbarer
25 Promotor ist.
28. Transgener Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27.
30 29. Transgener Organismus enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 20 bis 23, eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27 oder einen Vektor gemäß Anspruch 28.
35 30. Transgener Organismus nach Anspruch 29 ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Tieren und Pflanzen.
31. Transgener Organismus nach Anspruch 29 oder 30, ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzen bestehend aus Weizen, Hafer,
40 Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Tri- ticale, Dinkel, Leinsamen, Zuckerrohr, Raps, Canola, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten, Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen, Erdnuss, Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine, Paprika, Sonnenblume, Tagetes, Salat, Calendula, Melone, Kürbis und
45 Zucchini .
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