TW202408555A - 使用微生物治療肥胖症的方法和組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供了用於治療肥胖以及相關疾病和病症或降低發展肥胖症以及相關疾病和病症的風險的組合物和方法。

Description

使用微生物治療肥胖症的方法和組合物

本發明涉及用於治療肥胖以及相關疾病和病症或降低發展肥胖症以及相關疾病和病症的風險的組合物和方法。

隨著全球範圍內生活水準不斷提高，患有不健康身體病況如肥胖症和相關代謝疾病(尤其是2型糖尿病)的個體數量也在迅速增加。世界衛生組織(WHO)估計到2030年，全世界患有糖尿病的人數將超過3.5億。由於肥胖症、糖尿病和其他代謝疾病的發病率升高，它們對健康的嚴重影響以及它們對經濟的深遠影響，迫切需要新的且有效的方法來治療高風險個體，尤其是那些已經表現出在未來有高可能性發展疾病的早期跡象的個體，如肥胖症、高於正常血液膽固醇或甘油三酯水準，包括高於低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的正常血液水準和/或低於高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的正常血液水準，以便降低或消除他們未來罹患2型糖尿病和其他相關病症(例如，高血壓和心血管疾病)的風險。

人類胃腸道中有大量微生物生活著，統稱為腸道真菌微生物組(mycobiome) 。腸道真菌微生物組中各種微生物的組成可用作人的一般健康狀況以及人發展某些疾病如代謝疾病的風險或傾向的指示。因此，最大種類的微生物可用作治療某些疾病的生物標誌物和/或治療劑。

迫切需要新的且有效的方法來治療或預防已經患有或未來可能發展糖尿病和/或其他代謝疾病的個體中的病況，從而可以採取預防或治療措施以延緩這些疾病在這些個體中發作、逆轉或消除這些個體中這些疾病的症狀，或者降低與這些疾病相關的有關症狀的嚴重程度/與這些疾病相關的風險。本發明通過鑒定有益的腸道微生物來滿足這種和其他相關的需要，以配製新的組合物並設計新的方法，其有效改善個體的代謝健康，尤其是在那些處於患有與肥胖症或糖尿病相關的各種代謝疾病的症狀的風險中的個體或者已經患有與肥胖症或糖尿病相關的各種代謝疾病的症狀的個體。

本申請的發明人在他們的研究中發現，某些腸道微生物物種及其相對豐度可以影響宿主個體的代謝，導致對個體體重和代謝健康的不同影響。他們的發現在預防和治療與肥胖症和代謝綜合症有關的疾病和病況中提供了重要的效用。這樣鑒定的微生物現在用於提供治療或預防肥胖症和相關病況的新的方法和組合物。

在第一方面，本發明提供了用於預防或治療人類個體中的肥胖症和相關病況，例如，代謝綜合症、2型糖尿病、脂肪肝、高血壓、心血管疾病等的組合物。所述組合物含有有效量的(1)粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)、新型隱球菌( Cryptococcus neoformans)和釀酒酵母( Saccharomyces cerevisae)中的一種或多種；或者耐熱克魯維酵母( Lachancea thermotolerans)、奇異酵母( Saccharomyces paradoxus)、太瑞斯梭孢殼黴( Thielavia terrestris)、小麥葉枯病菌( Parastagonospora nodorum)和嗜熱毀絲黴( Myceliophthora thermophila)的抑制劑中的一種或多種，以及(2)一種或多種生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物基本上由以上指定的組分組成或由以上指定的組分組成，所述以上指定的組分如：(1)粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；或者耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、小麥葉枯病菌和嗜熱毀絲黴中的一種或多種的抑制劑，以及(2)一種或多種生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物含有有效量的(1)粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌；或者(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母和太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑中的一種或多種。在一些實施方案中，所述組合物包含有效量的粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌，加上一種或多種生理上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物還包含至少一種益生元，例如菊粉和/或車前子殼。在一些實施方案中，所述組合物為食物物品或飲料的形式，其可以在進食之前、在進食同時或在進食之後服用。在一些實施方案中，將所述組合物例如通過結腸鏡檢查直接引入到個體胃腸道中。

在第二方面，本發明提供了通過將有效量的(1)粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；或者(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴的抑制劑中的一種或多種引入到個體胃腸道中，來治療肥胖個體或處於肥胖症風險的個體中的肥胖症的方法。在一些實施方案中，引入到個體的胃腸道中的是有效量的(1)粟酒裂殖酵母和新型隱球菌中的一種或多種；或者(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母和太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑中的一種或多種。在一些實施方案中，將有效量的粟酒裂殖酵母和新型隱球菌中的一種或兩種引入到個體的胃腸道中，例如通過結腸鏡檢查。

在一些實施方案中，在引入步驟之後，粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和/或釀酒酵母的水準增加約4-10倍。在一些實施方案中，在引入步驟之後，在個體的胃腸道中，粟酒裂殖酵母的相對水準占總腸道真菌大於約3.99%。在一些實施方案中，在引入步驟之後，在個體的胃腸道中，耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和/或嗜熱毀絲黴的相對水準降低至小於總腸道真菌的約0.1%。在一些實施方案中，在引入步驟之後，真菌α多樣性指數增加約1.2-6倍。

在一些實施方案中，要求保護的方法包括將組合物引入到個體的胃腸道中，所述組合物包含：A. (i)粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；或者(ii)耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、小麥葉枯病菌和嗜熱毀絲黴中的一種或多種的抑制劑，以及B. 一種或多種生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物包含粟酒裂殖酵母和新型隱球菌中的一種或兩種。在一些實施方案中，將所述組合物例如通過結腸鏡檢查直接遞送至個體的小腸、回腸或大腸。在一些實施方案中，所述組合物被配製用於個體的口服施用。在一些實施方案中，所述組合物以每天施用的每日劑量進行配製。在一些實施方案中，所述組合物為食物或飲料物品的形式。在一些實施方案中，所述組合物還包含益生元，如菊粉或車前子殼。在一些實施方案中，引入步驟通過糞便微生物群移植(FMT)進行。在一些實施方案中，粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和/或釀酒酵母來源於且部分純化自供體的糞便物質，或者從培養物獲得。在一些實施方案中，個體的體重降低，血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)水準降低，血清葡萄糖水平降低，葡萄糖耐量增加和/或胰島素反應性增加。

在相關的方面，本發明提供了組合物用於治療個體中的肥胖症和相關病況，如代謝綜合症、2型糖尿病(T2DM)、脂肪肝、高血壓、心血管疾病等，或者用於預防個體中的這些病況的新用途。所述組合物含有有效量的(1)粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；或者耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴的抑制劑中的一種或多種，以及(2)一種或多種生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物基本上由指定的組分組成或由指定的組分組成，所述指定的組分如(1)粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；或者耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴中的一種或多種的抑制劑，以及(2)一種或多種生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物含有有效量的(1)粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌；或者(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母和太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑中的一種或多種。在一些實施方案中，所述組合物包含有效量的粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌，加上一種或多種生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物還包含至少一種益生元，例如，菊粉和/或車前子殼。在一些實施方案中，所述組合物為食物物品或飲料的形式，其可以在餐前、餐中或餐後服用。在一些實施方案中，將所述組合物直接引入到個體胃腸道中，例如通過結腸鏡檢查。

在協力廠商面，本發明提供了用於促進個體的體重減輕或降低個體中肥胖症風險的試劑盒，其包含多種組合物，所述多種組合物各自包含有效量的一種或多種以下物質：粟酒裂殖酵母；新型隱球菌；釀酒酵母；耐熱克魯維酵母的抑制劑；奇異酵母的抑制劑；太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑；穎枯近殼多胞菌的抑制劑和嗜熱毀絲黴的抑制劑。在一些實施方案中，所述試劑盒包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含有效量的粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌，所述第二組合物包含耐熱克魯維酵母、奇異酵母和/或太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑。在一些實施方案中，所述試劑盒包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含有效量的粟酒裂殖酵母，所述第二組合物包含有效量的新型隱球菌。在一些實施方案中，要求保護的試劑盒中所包含的組合物可以配製用於口服施用或用於直接遞送至個體胃腸道，例如通過結腸鏡檢查。

定義

術語“糞便微生物群移植(FMT)”或“糞便移植”是指這樣的一種醫療程式，在該程式中，將從健康個體獲得的含有活的糞便微生物(細菌、真菌等)的糞便物質轉移到接受者的胃腸道中以恢復已經被各種醫學病況擾亂或破壞的健康腸道微生物區系。通常，來自健康供體的糞便物質首先被加工成用於移植的適當形式，所述移植可以通過直接遞送到下胃腸道中(如通過結腸鏡檢查或通過鼻插管)或者通過口服攝入含有乾燥和冷凍的糞便物質的封裝材料來實現。

術語“抗真菌劑”是指能夠抑制、阻抑或防止真菌物種生長或增殖的任何物質，其通常或專門針對某些真菌物種，例如，耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌或嗜熱毀絲黴。具有一般殺真菌活性的已知試劑包括兩性黴素B、棘白黴素、氟康唑、制黴菌素和克黴唑。

“相對豐度百分比”，當在描述特定真菌物種(例如，粟酒裂殖酵母或新型隱球菌)相對於相同環境中存在的所有真菌物種存在的上下文中使用時，是指以百分比形式表示的特定真菌物種相對於所有真菌物種的量的量。例如，可以通過將一個給定樣品中粟酒裂殖酵母特異性DNA的量(例如，通過定量聚合酶鏈式反應測定的)與同一樣品中所有真菌DNA的量(例如，通過定量PCR和基於內部轉錄間隔區2或ITS2序列的測序測定的)進行比較，來確定真菌物種粟酒裂殖酵母的相對豐度百分比。

“絕對豐度”，當在描述糞便中特定真菌物種(例如，粟酒裂殖酵母或新型隱球菌)存在的上下文中使用時，是指糞便樣品中所有DNA的量中來源於真菌物種的DNA的量。例如，可以通過將一個給定樣品中粟酒裂殖酵母特異性DNA的量(例如，通過定量PCR測定的)與同一樣品中所有糞便DNA的量進行比較，來確定粟酒裂殖酵母的絕對豐度。

本文所用的糞便樣品的“總真菌載量”是指糞便樣品中所有DNA量中的所有真菌DNA的量。例如，可以通過將一個給定樣品中真菌特異性DNA(例如，通過定量聚合酶鏈式反應測定的18S rDNA)的量與同一樣品中所有糞便DNA的量進行比較，來確定真菌的絕對豐度。

關於真菌物種使用的術語“真菌α多樣性指數”描述了預定樣品或位點，例如，取自人胃腸道的糞便樣品中真菌群落的多樣性。在本公開內容中，“α多樣性”表示分別考慮每個物種的種類以及相對豐度時每個樣品中群落的複雜性：較高的α多樣性表示樣品含有較複雜的群落，包括較高數量的不同物種(種類)和較高頻率的不同物種(每個物種的相對豐度)。α多樣性的定義通常基於通過一個或多個多樣性指數給出的值，如物種豐富度(樣品中存在的不同物種數目的計數)、物種均勻度(物種之間個體分開程度的量度，其中低值表示一個或幾個物種佔優勢，高值表示相對相等數目的個體屬於每個物種)，以及香農指數或辛普森指數(其考慮了群落中的物種比例豐度)。

如本文所用，術語“肥胖”用於描述體質指數(BMI)為30或更高的非亞洲人和BMI為25或更高的亞洲人，而術語“超重”用於描述BMI為25或更高的非亞洲人和BMI為23或更高的亞洲人。

本文所用的術語“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指對目標生物過程的任何可檢測出的負面影響，如目標基因的RNA/蛋白表達、目標蛋白的生物活性、細胞信號轉導、細胞增殖、有機體，尤其是微生物的存在/水準、任何可測量的生物標誌物、生物參數或個體中的症狀等。通常，抑制反映在當與對照相比時，目標過程(例如，個體的體重或血糖/膽固醇水準，或者個體中的任何可測量的症狀或生物標誌物，如致病性傳染劑在個體間的感染率)或上述下游參數中的任一個中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的減少。“抑制”還包括100%的減少，即完全消除、防止或廢除目標生物過程或信號。其他相關術語如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“減少(reducing)”和“減少(reduction)”在本公開內容中以類似的方式用於指降低至不同的水準(例如，與對照水準相比，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的降低)，直至目標生物過程或信號的完全消除。另一方面，術語，如“活化(activate)”、“活化(activating)”、“活化(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促進(promote)”、“促進(promoting)”、“增強(enhance)”、“增強(enhancing)”或“增強(enhancement)”在本公開內容中用於涵蓋不同水準的正改變(例如，與目標過程、信號或參數中的對照水準相比，至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更高，如3、5、8、10、20倍的增加)。

如本文所用，術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”包括為解決疾病或病況的存在或以後發展此類疾病或病況的風險而採取的治療和預防措施。其涵蓋用於減輕進行中的症狀、抑制或減緩疾病進展、延遲症狀發作或者消除或減少由此類疾病或病況引起的副作用的治療或預防措施。本上下文中的預防措施及其變型不需要100%消除事件的發生；相反，它們是指阻抑或降低這種發生的可能性或嚴重程度或者延遲這種發生。

接受本發明的組合物或治療方法的“患者”或“個體”是任何年齡、性別和民族背景的人，包括成人和青少年，其可能未被診斷患有任何特定疾病或病症(例如，沒有糖尿病診斷的血糖測試結果)，但需要改善代謝健康(例如，減輕其體重或者消除其發展肥胖症或糖尿病的風險)。通常，接受根據本發明方法的治療以改善代謝健康如體重減輕或降低變得超重或肥胖的風險的患者或個體不另外需要通過相同的治療劑進行治療。例如，如果個體正在接受根據所要求保護的方法的組合物，則該個體不患有已知通過相同的治療活性劑進行治療的任何疾病。儘管患者可以是任何性別和任何年齡，但在一些情況下，患者至少為40、45、50、55、60、65、70、75、80或85歲；在一些情況下，患者可以是40-45歲，或者50-65歲，或者65-85歲。“兒童” 個體是年齡18歲以下的個體，例如，約5-17歲、9歲或10-17歲或12-17歲，包括“嬰兒”，其小於約12個月，例如，小於約10、8、6、4或2個月，而“成年”對像是18歲或以上的個體。

本文所用的術語“有效量”是指產生所施用物質的預期(例如，治療或預防)效果的量。所述效果包括預防、校正或抑制特定疾病/病況的症狀和相關併發症進展至任何可檢測的程度，例如，肥胖症、2型糖尿病、高血壓、心臟病等的發生率，這些病況和相關病症的一種或多種症狀。任何治療劑的確切“有效”量將取決於藥劑的性質以及治療的目的，並且將由本領域技術人員使用已知技術來確定(參見例如，Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1卷-第3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；以及Pickar, Dosage Calculations (1999))。

如本文所用，術語“約”表示指定值的+/-10%的值的範圍。例如，“約10”表示10 +/- 10 x 10%的值範圍，即9-11。

“藥學上可接受的”或“藥理學上可接受的”賦形劑為不是生物學上有害的或在其他方面不期望的物質，即賦形劑可以與生物活性劑一起施用至個體，而不引起任何不期望的生物效應。賦形劑也不會與包含它的組合物的任何組分以有害的方式相互作用。

術語“賦形劑”是指可以存在于本發明組合物的最終劑型中的任何實質上輔助的物質。例如，術語“賦形劑”可以包括但不限於媒介物、緩衝液、粘合劑、崩解劑、填充劑(稀釋劑)、潤滑劑、助流劑(流動增強劑)、壓縮助劑、著色劑、甜味劑、防腐劑、懸浮劑/分散劑、成膜劑/包衣劑、調味劑和印刷油墨。

當在描述含有活性成分或多種活性成分的組合物的上下文中使用時，術語“基本上由....組成(consisting essentially of)”是指以下事實：組合物不含有具有活性成分的任何類似或相關生物活性或者能夠增強或阻抑活性的其他成分，然而一種或多種非活性成分如生理或藥學上可接受的賦形劑可以存在於組合物中。例如，基本上由有效減輕個體體重或改善個體中的代謝健康的活性劑(例如，包含粟酒裂殖酵母或新型隱球菌的組合物)組成的組合物是以下組合物，其不含有對同一目標過程(例如，體重減輕，血糖、脂質或膽固醇水準的降低，葡萄糖耐量的改善或胰島素敏感性的改善)可能具有任何可檢測到的積極或消極作用或者可以增加接受個體中的疾病或症狀或者可以將接受個體中的疾病或症狀降低到任何可測量的程度的任何其他試劑。

I. 引言

本發明的目的涉及用於預防、改善和治療涉及特定真菌物種的肥胖症和肥胖症相關病況的新的方法和組合物。在本發明中，本申請的發明人發現某些真菌物種在患有肥胖症的個體中處於改變的水準。可以通過調節患者腸道中這些真菌物種的水準，例如通過口服施用有益物種或能夠阻抑不期望物種的藥劑，來實現健康益處，如預防和減輕肥胖症和肥胖症相關的病況。糞便微生物群移植(FMT)技術是實施本發明的一種優選方法。

II. 藥物組合物和施用

本發明提供了包含有效量的粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種的藥物組合物，用於減輕人的體重，以降低肥胖症或與肥胖症相關的病況如糖尿病、高血壓或心血管疾病的風險。本發明的藥物組合物適用於多種藥物遞送系統。用於本發明的合適製劑可在Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版(1985)中找到。關於藥物遞送方法的簡要綜述，參見Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)。

在本發明的另一方面，用於改善人的代謝健康，例如用於體重減輕或用於降低人發展肥胖症的風險的替代組合物含有能夠阻抑以下真菌物種中的至少一種，可能兩種或更多種(例如，3種、4種或5種)的增殖的抑制劑或特定抗真菌劑：耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴。這種抑制劑或抗真菌劑優選不是廣譜殺真菌劑；相反，它應該是特異性靶向一種或多種上述物種的特定抗真菌劑。例如，它可以是例如小抑制性RNA、microRNA、miniRNA、lncRNA或反義寡核苷酸性質的短多核苷酸，其能夠破壞目標真菌物種的生命週期中的至少一個關鍵基因的表達，使得藥劑能夠僅特異性靶向物種，而不顯著影響其他密切相關的真菌物種。

本發明的藥物組合物可以通過各種途徑施用，例如經由口服攝入的全身施用或使用直腸栓劑的局部遞送。例如，施用藥物組合物的優選途徑是以約106至約1012 CFU的每日劑量口服施用粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種。任選地，組合物還含有至少一種益生元，如菊粉或車前子殼。另外，組合物可以以每日劑量形式配製。適當的劑量可以以單次每日劑量或以適當間隔，例如以每天兩次、三次、四次或更多次的亞劑量呈現的分劑量施用。施用的持續時間範圍可以為約2周至約4周，例如約1週至約2週。

為了製備本發明的藥物組合物，使用一種或多種惰性和藥學上可接受的載體。藥物載體可以是固體或液體。固體形式製劑包括例如，散劑、片劑、可分散顆粒、膠囊、扁囊劑和栓劑。固體載體可以是一種或多種還可以充當稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑或片劑崩解劑的物質；它也可以是封裝材料。

在散劑中，載體通常是細碎的固體，其與細碎的活性組分，例如粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種混合。在片劑中，將活性成分與具有所需結合特性的載體以合適的比例混合，並壓制成所需的形狀和大小。

為了製備栓劑形式的藥物組合物，首先將低熔點蠟如脂肪酸甘油酯和可哥脂的混合物熔化，並通過例如攪拌將活性成分分散在其中。然後將熔化的均勻混合物倒入尺寸方便的模具中並使其冷卻和固化。

散劑和片劑優選含有約5重量%至約100重量%的活性成分(例如，粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種)。合適的載體包括例如，碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、乳糖、糖、果膠、糊精、澱粉、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可脂等。

藥物組合物可以包括活性成分，例如粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種的製劑，其中封裝材料作為提供膠囊的載體，在膠囊中，活性成分(具有或不具有其他載體)被載體包圍，使得載體因此與活性成分結合。以類似的方式，也可以包括藥囊。片劑、散劑、藥囊和膠囊可以用作適於口服施用的固體劑型。

液體藥物組合物包括例如，適於口服施用或局部遞送的溶液，適於口服施用的懸浮液和乳液。通過在包含水、緩衝水、鹽水、PBS、乙醇或丙二醇的溶劑中，將活性組分(例如，粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種)加入到先前滅菌的水溶液中製備的水基溶液是適於口服施用或局部遞送(如通過直腸栓劑)的液體或半液體組合物的實例。組合物可以含有一種或多種接近生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，如pH調節劑和緩沖劑、張力調節劑、潤濕劑、洗滌劑等。

可以首先製備無菌溶液(例如，水溶液)，然後將活性組分(例如，粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種，其可以從培養物獲得或者可以已經例如通過加熱或通過化學處理滅活)加入到所需的溶劑系統中。根據活性成分/組分的性質，可以使用不同的方法製備合適的基於溶劑的遞送系統。例如，可以首先將一種或多種活性化合物溶解在溶液中，然後使所得溶液通過膜濾器以對其進行滅菌，或者可選地，可以在無菌條件下將先前滅菌的一種或多種活性化合物溶解在先前滅菌的溶劑中。在活性組分是一種或多種微生物的情況下，它們可以任選地首先被純化以將不相關的微生物物種去除至基本上檢測不到的水準(例如，不大於背景信號的110%、120%或150%)，然後置於無菌溶液中以產生基於溶液的遞送系統。可以將所得水溶液包裝以供原樣使用或凍幹，在施用之前將凍幹製劑與無菌水性載體組合。製劑的pH通常為3-11，更優選5-9，且最優選7-8。

可以利用由治療醫生選擇的劑量水準和模式進行組合物的單次或多次施用。在任何事件中，藥物製劑應提供一定量的活性劑，所述量足以有效增強預防或治療方案(如飲食、體育鍛煉和其他生活方式變化的計畫)的功效和/或減少或消除來自體重相關病況(如2型糖尿病、高血壓、心臟病等)的不期望影響。

III. 試劑盒

本發明還提供了根據本文公開的方法用於改善個體的代謝健康或者用於預防與肥胖症相關的疾病的試劑盒。試劑盒通常包括多個容器，每個容器包含組合物，所述組合物包含：(1)粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴中的一種或多種的抑制劑。任選地，組合物中可以包括另外的成分，如一種或多種益生元(例如，菊粉或車前子殼)。此外，已知在治療上有效用於預防和/或治療相關病況，尤其是與肥胖症相關的代謝疾病，包括改善這些疾病的症狀和減輕這些疾病的嚴重程度，以及用於促進從疾病(如在最後章節中描述的那些或相關技術領域中已知的那些)中恢復的另外藥劑或藥物可以包括在試劑盒中。試劑盒中的多個容器各自可以含有不同的活性劑/藥物或者兩種或更多種活性劑或藥物的不同組合。

試劑盒還可以包括提供關於如何分配藥物組合物的說明的資訊材料，包括對可以治療的患者類型(例如，超重或肥胖或已經被認為具有發展與超重或肥胖症相關的代謝疾病的高風險，並因此試圖改善代謝健康的人類患者，以及不包括在所要求保護的方法中的患者亞群，例如，已經被診斷患有已經需要施用活性組分如粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種，或者耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴中的一種或多種的抑制劑的預先存在的病況的那些)，施用的劑量、頻率和方式等的描述。

實施例

以下實施例僅通過說明的方式提供，並且不是通過限制的方式提供。本領域技術人員將容易認識到可改變或修改各種非關鍵參數，以產生基本上相同或相似的結果。

方法

研究對象

從香港和昆明招募體質指數(BMI) ≥ 28 kg/m2的年齡18-70歲的肥胖個體和BMI為18.5至23 kg/m2的年齡18-70歲的瘦個體。如果個體患有當前嚴重的胃腸疾病，包括炎性腸病(IBD)、癌症、晚期腺瘤或胃腸炎；或者經常具有消化系統症狀，包括便血、腹瀉、腹痛或嘔吐；或者患有當前的風濕性免疫疾病、活動性感染或獲得性免疫缺陷綜合症，則將其排除在外。如果個體具有已知的器官功能障礙或衰竭史，包括心肺系統或泌尿系統等；或者具有已知的腹部手術、放射-化療或免疫治療史；或者患有當前不能治癒的癌症，則將其排除在外。還排除懷孕或計畫在1年內懷孕的個體。

從所有個體獲得了書面知情同意書。記錄他們關於年齡、性別、BMI、酒精攝入、吸煙、2型糖尿病(T2DM)和藥物的資訊。收集來自研究個體的糞便樣品，然後將其儲存在-80℃以用於下游腸道真菌微生物組分析。本研究得到了香港中文大學—新界東醫院聯網臨床研究倫理聯席委員會(The Joint Chinese University of Hong Kong—New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee) (編號：2014.026)和昆明醫科大學臨床研究倫理學委員會(The Clinical Research Ethics Committee of Kunming Medical University) (編號：2019L23)的批准。

DNA提取、文庫製備和宏基因組測序

根據Zuo等 ¹報導的方法(進行了小修改)進行DNA提取。用1 ml ddH ₂O預洗100 mg糞便樣品，並通過13,000×g離心1 min沉澱。將糞便沉澱重懸於補充有16 μL β-巰基乙醇和250 U細胞溶解酶(Sigma)的800 μL TE緩衝液(pH 7.5)中，並在37 ℃下孵育90 min。然後將樣品以13,000×g離心3 分鐘，隨後根據製造商的說明，使用Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit(Promega, Madison, Wisconsin)，從沉澱中提取糞便DNA。簡而言之，將800 mL西曲溴銨(CTAB)緩衝液加入到糞便沉澱中並渦旋30秒，然後將混合物在95℃下孵育5分鐘。然後，將樣品與珠子一起充分渦旋15 min。接著，將40μL蛋白酶K和20μL RNA酶A加入到樣品中，並將混合物在70℃下孵育10分鐘。然後通過以13,000×g離心5 min獲得上清液，並將其加入到Maxwell® RSC機器中，用於DNA提取。通過末端修復、純化和PCR擴增的過程構建DNA文庫。利用Novogene, Beijing, China的配對末端150 bp測序策略，在Illumina NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, California, USA)上進行樣品的全基因組鳥槍測序。

生物資訊學和統計學分析

利用Kneaddata (網站：huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata)，從原始資料中丟棄適配子污染和低品質讀段。經由HumanMycobiomeScan2進行真菌序列注釋，並使用MetaPhlAn2分類器 ³進行細菌分類分析。使用FUNGuild (網站：github.com/UMNFuN/FUNGuild)資料庫注釋真菌功能 ⁴。將真菌微生物組和細菌組豐度表導入R (3.6.1版)中，用於統計分析。

利用R包Vegan 2.5-6計算和視覺化α多樣性指數，包括觀測到的物種、chao1、辛普森和香農多樣性指數。還使用Vegan包進行非度量多維尺度分析(NMDS)。使用R包Vegan 2.5-6通過置換多元方差分析(PERMANOVA)，檢查地區、BMI、性別、年齡、生活方式(酒精攝入和吸煙)、2型糖尿病(T2DM)因素以探索哪一種因素與建立的真菌微生物組相關。使用線性判別分析效應量(LEfSe)鑒定與香港和昆明中的肥胖症和瘦相關的生物標誌物。線性判別分析(LDA)評分≥2.0的那些被認為是與肥胖症和瘦相關的重要生物標誌物。

為了鑒定單個操作分類單元(OTU)之間的正相關和負相關，開發了成分資料的稀疏相關性(SparCC)，用於量化界內和界間關係。然後使用Cytoscape 3.7.2視覺化真菌內的共現和互斥網路。使用R包Corrplot創建界內和界間相關矩陣分析。

在適當的情況下使用學生t核對總和威爾克遜秩和檢驗來確定不同組之間的統計學顯著差異，並且用邦費羅尼(Bonferroni correction)校正來調整以進行多重比較。

動物實驗

29隻雄性C57BL/6J小鼠(6-8周齡，n=4隻/組或5隻/組)獲自香港中文大學的實驗動物服務中心(Laboratory Animal Services Centre)。在12 h光-暗迴圈下，于恒定溫度和濕度(分別為23±1℃和55%±5%)下，將所有動物飼養在標準塑膠籠(每個籠中四隻或五隻小鼠)中，動物自由獲取食物和水。示意圖顯示在圖6A中。馴化1周後，將小鼠分成六組(n=4隻/組或5隻/組)，三組接受正常飲食(ND) (Labdiet Picolab Select Mouse diet 50 IF/9F Irradiated，含有18重量%的蛋白質、8.0重量%的脂肪和5重量%的纖維；P.O. BOX 19788, BRENTWOOD, MO 63144)，並同時通過管餵法分別施用0.2 mL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (ND)、含有釀酒酵母(ATCC 36375，1×107 CFU/隻小鼠)的0.2 mL PBS (ND+SC)或含有粟酒裂殖酵母(ATCC 16979，1×107 CFU/隻小鼠)的0.2 mL PBS (ND+SP)，持續11周。另外三組接受高蔗糖膽固醇飲食(HF) (SF11-078，23重量%的脂肪、42.4重量%的蔗糖和19.4重量%的蛋白質；Specialty Feeds, Perth, Australia)，並同時通過管餵法分別施用0.2 mL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (HF)、含有釀酒酵母(ATCC 36375，1×107 CFU/隻小鼠)的0.2 mL PBS (HF+SC)或含有粟酒裂殖酵母(ATCC 16979，1×107 CFU/隻小鼠)的0.2mL PBS(HF+SP)，持續11周。每週測量每隻單獨小鼠的體重。

在第10周(圖6A)，使用標準口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)評價葡萄糖不耐受。簡而言之，禁食14 h後，通過口服管餵法將20% (w/v)葡萄糖溶液以1 g/kg體重的劑量施用至小鼠。在施用葡萄糖之前(0)和施用葡萄糖之後15、30、60和90 min，從尾部切口(通過去除尾部末端2 mm)收集血樣。用掌上型血糖儀(Sannuo; Changsha Sinocare, Inc., Changsha, China)分析葡萄糖水平。一周後，進行胰島素耐量試驗(ITT)。在非禁食條件下，將稀釋的常規人胰島素(Sigma-Aldrich)以0.75單位/kg體重的劑量經腹腔內注射到小鼠中。在胰島素注射之前(0)和胰島素注射之後15、30、60和90 min，從尾部切口(通過去除尾部末端2 mm)收集血樣，也用掌上型血糖儀分析葡萄糖水平。在12周實驗結束時(圖6A)，通過頸椎脫位將小鼠安樂死。精確地解剖肝臟和脂肪組織(皮下、附睾和腎周)，並稱重。肝臟指數被定義為肝臟重量除以體重的比率。脂肪指數被定義為脂肪重量除以體重的比率。根據製造商的說明，使用從南京建成生物工程研究所(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) ((Nanjing, China)購買的商業酶試劑盒，測量血清中的總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水準。所有動物實驗都得到了香港中文大學動物實驗倫理委員會(AEEC)的批准，並按照香港中文大學動物實驗倫理委員會(AEEC)的要求執行。

粟酒裂殖 酵母和釀酒酵母培養物

在37°C、200 rpm下，在酵母和黴菌瓊脂培養基(3 g/L酵母提取物、3 g/L麥芽提取物、5 g/L蛋白腖、10 g/L右旋糖、20 g/L瓊脂用於固體培養基，pH 6.2±0.2)中使粟酒裂殖酵母生長。隨後，將培養物冷凍，並用甘油儲存在-80°C。在通過口服管餵法施用前一天，將甘油儲存液解凍並在相同條件下培養過夜，然後在口服管餵法當天，將其稀釋至最終濃度。

類似地，在37°C、200 rpm下，在酵母蛋白腖右旋糖(YPD)培養基(20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白腖、10 g/L酵母提取物、20 g/L瓊脂用於固體培養基)中使釀酒酵母生長。隨後，將培養物冷凍，並用甘油儲存在-80°C。在通過口服管餵法施用前一天，將甘油儲存液解凍，並在相同條件下培養過夜，然後在口服管餵法當天，將其稀釋至最終濃度。

結果

研究個體 的臨床特徵

本研究納入了來自中國兩個地區(香港和昆明)的總共217名個體。在香港招募了118名個體(59名瘦個體和59名肥胖個體)，在昆明招募了99名個體(49名瘦個體和50名肥胖個體)。在香港群組中，瘦參與者和肥胖參與者的中值年齡分別為45.88歲和47.85歲。在昆明群組中，瘦參與者和肥胖參與者的中值年齡分別為48.14歲和40.56歲。香港群組中的瘦個體和肥胖個體之間的吸煙狀況、T2DM和藥物使用有顯著差異，昆明群組中的瘦個體和肥胖個體之間的年齡和性別有顯著差異。其他臨床特徵是可比較的( 表1)。

表1-研究個體的臨床特徵

群組	因素	瘦	肥胖症	p值 a
香港 (n=118)	樣本大小，n	59	59	NA
BMI b, c，kg/m2	20.99±1.61	35.91±5.47	＜0.001
年齡 c，歲	45.88±13.69	47.85±11.51	0.5780
男性，n	32	37	0.4551
酒精，n	8	5	0.6536
吸煙，n	6	4	0.0276
T2DM，n	2	42	＜0.0001
	藥物使用 d，n	2	51	＜0.0001
昆明 (n=99)	樣本大小，n	49	50	NA
BMI b, c	20.69±1.18	31.09±3.51	＜0.0001
年齡 c	48.14±12.94	40.56±13.66	0.0027
男性，n	15	33	0.0177
酒精，n	6	13	0.1287
吸煙，n	10	9	0.5937
T2DM，n	0	6	0.0853
	藥物使用 d，n	21	21	＞0.9999

a 對於連續變數，來自威爾克遜秩和檢驗；對於分類變數，來自Fisher精確檢驗； b BMI，體質指數。 c 在適當的情況下以平均值±SD或中值(第25至第75百分位數，P25–P75)表示 d 任何藥物，包括二甲雙胍、磺醯脲類、他汀類、質子泵抑制劑和非甾體抗炎藥、抗生素、血管緊張素轉化酶抑制劑和鈣通道阻滯劑。

地區間瘦個體 和肥胖個體中腸道真菌微生物組組成的變化

在門水準上，子囊菌門(Ascomycota)是在所有樣品中檢測到的最主要的真菌，而在屬水準上，酵母屬(Saccharomyces)是在香港(平均相對豐度：48.53%)和昆明(平均相對豐度：34.85%)個體中檢測到的最普遍的真菌( 圖1A)。最豐富的物種是釀酒酵母(在90.68%的香港個體中檢測到，且在86.87%的昆明個體中檢測到)和絲孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum) (在84.75%的香港個體中檢測到，且在95.96%的昆明個體中檢測到) ( 圖2A)。其他真菌物種的廣泛性顯示在 表 2中。

表2-香港和昆明群組中檢測到的所選腸道真菌物種的廣泛性

物種	香港	昆明
都柏林念珠菌( Candida dubliniensis)	36.44%	55.56%
新型隱球菌	54.24%	67.68%
耐熱克魯維酵母	18.64%	30.30%
嗜熱毀絲黴	23.73%	37.37%
小麥葉枯病菌	29.66%	32.32%
粟酒裂殖酵母	52.54%	68.69%
太瑞斯梭孢殼黴	30.51%	51.52%

在所有臨床變數(地區、性別、酒精攝入、肥胖症、吸煙、T2DM、年齡和藥物)中，地區(效應量R ²=0.015，p＜0.001)和肥胖症(效應量R ²=0.010，p＜0.05)顯示出對糞便真菌微生物組變化的最大效應量( 圖1B, 表3)。通過非度量多維尺度分析(NMDS)，昆明個體(黃色點)與香港個體(藍色點)聚類分離，增強了香港和昆明個體之間顯著的真菌微生物組組成差異的發現(PERMANOVA檢驗，p＜0.001， 圖 7A)。

表3-通過PERMANOVA分析的肥胖症、地區、性別、糖尿病、吸煙和酒精對腸道真菌區系的影響

因素	d. f.	R 2	F	P值
地區	1	0.014846	3.239889	＜0.001***
性別	2	0.011992	1.298706	0.251
酒精	3	0.01006	0.70117	0.788
肥胖症	1	0.01005	2.1215	0.046*
吸煙	2	0.00853	0.89435	0.502
T2DM	1	0.00763	1.6068	0.055
年齡	1	0.00486	1.0197	0.35
藥物	1	0.00322	0.6787	0.677

然後評價地區之間和肥胖個體相對於瘦個體之間的糞便真菌微生物組多樣性。昆明個體中的糞便真菌微生物組多樣性和豐富度顯著高於香港個體中的糞便真菌微生物組多樣性和豐富度(t檢驗，分別為p＜0.01和p＜0.001， 圖 1C和1E)。關於肥胖症，與香港群組中的瘦個體相比，在肥胖個體中觀察到較低的糞便真菌均勻度，而不是多樣性(t檢驗，分別為p＜0.05和p=0.079， 圖 1C和1D)。然而，在昆明群組中的瘦個體和肥胖個體之間顯示出更均勻的糞便真菌組成(t檢驗，分別為多樣性中p=0.763；均勻度中p=0.664；豐富度中p=0.61， 圖 1C-1E)。總的來說，與瘦個體相比，肥胖症個體中腸道真菌區系的破壞模式在地區間是不同的。

另外，進一步探索了藥物與腸道真菌微生物組組成之間的關聯。β阻滯劑、非甾體抗炎藥(NSAID)、質子泵抑制劑(PPI)、他汀類和磺醯脲類(SU)被記錄在所納入的參與者的醫療史中( 圖8)。結果表明，這五種藥物的使用與真菌多樣性或豐富度之間沒有顯著的相關性( 圖8A和8B)。此外，T2DM沒有顯示出對糞便真菌組成的顯著影響( 圖8C和8D)。

地區間瘦個體 和肥胖個體中糞便真菌營養模式和功能群預測

為了進一步探索肥胖症和地區如何影響腸道真菌微生物組的功能，對與地區有關的肥胖個體和瘦個體進行了糞便真菌微生物組營養模式和生態功能群預測(圖3)。根據基於營養底物偏好的分類，將真菌分成十二種功能群(糞便腐生菌、木材腐生菌、土壤腐生菌、動物病原體、植物病原體、附生菌、內生菌、動物內共生體、真菌寄生物和未確定的腐生菌)和三種營養模式(病理營養型(pathotroph)、腐生營養型(saprotroph)和共生營養型(symbiotroph)) (圖3A)。在糞便真菌微生物組中大部分檢測到的真菌是腐生營養型的，占群落的79%以上，主要包括分類群酵母目( Saccharomycetales)。

真菌功能在地理區域間變化很大( 圖3)。與昆明個體相比，香港個體的糞便真菌微生物組中動物內共生真菌(t檢驗，p＜0.05)、動物致病性真菌(t檢驗，p＜0.05)、內生真菌(t檢驗，p＜0.01)、寄生真菌(t檢驗，p＜0.05)、土壤腐生真菌(t檢驗，p＜0.05)和木材腐生真菌(t檢驗，p＜0.01)更豐富( 圖10)。糞便真菌微生物組的營養模式也顯示出與肥胖症顯著相關，所述肥胖症也是地區特異性的( 圖3)。在香港，瘦群組糞便中動物內共生真菌的含量要高得多(t檢驗，p＜0.05)，而植物致病性真菌較少(t檢驗，p＜0.05) ( 圖3B和3D)。在昆明，附生真菌和植物腐生性真菌在肥胖組的糞便中比在瘦組的糞便中相對更豐富，分別表現出約74.48% (威爾克遜秩和檢驗，p＜0.05)和79.24% (威爾克遜秩和檢驗，p=0.01)的較高相對豐度( 圖3C和3E)。這些資料暗示地區和肥胖症對腸道真菌功能格局具有組合影響。

地區間肥胖症中的糞便真菌微生物組中降低的真菌 -真菌界內生態相互作用

在宿主中，真菌通過菌絲或搭便車(hitchhike)彼此相互作用，以促進在腸道中的定殖。為了研究肥胖症是否影響真菌-真菌相互作用，進行了網路分析以描繪兩個群組中真菌物種之間的關係( 圖4)。

當與肥胖症中的共豐度相關性(圖4B和4D)相比時，在來自香港( 圖4A)和昆明( 圖4C)群組的兩個瘦組中，觀察到糞便真菌微生物組內更複雜的界內共豐度關係。有趣的是，在所有四個組中都鑒定出了絲孢堆黑粉菌和釀酒酵母之間的負相關(香港的瘦個體，r=-0.18，p＜0.001；香港的肥胖個體，r=-0.08，p=0.14；昆明的瘦個體，r=-0.05，p=0.32；昆明的肥胖個體，r=-0.13，p=0.32， 圖 4)，儘管不是全部顯著的，但是可能暗示人類腸道內這兩種物種之間的拮抗關係。另外，在來自香港(SparCC相關性，r=0.26，p＜0.001)和昆明(SparCC相關性，r=0.33，p＜0.001)的兩個瘦組中都觀察到了粟酒裂殖酵母和新型隱球菌之間的穩健相關性( 圖4A和4C)，然而，在它們的肥胖組中沒有觀察到這種相關性。

瘦組和肥胖組之間的真菌-真菌相互作用網路也是地區依賴性的( 圖4)。在香港群組的共現網路中獨特地鑒定出了大麗輪枝菌( Verticillium dahliae)和茄鏈格孢菌( Alternaria solani)，並且在肥胖組中，茄鏈格孢菌與大麗輪枝菌(r=0.15，p=0.01)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) (SparCC相關性，r=-0.13，p＜0.05)密切相關，這意味著在香港肥胖個體的腸道中，茄鏈格孢菌可能是關鍵的參與者 (圖4A和4B)。同時，昆明個體與香港個體通過腸道中的嗜松籃狀菌( Talaromyces pinophilus)和德爾布有孢圓酵母( Torulaspora delbruckli)特異性區分，並且在瘦個體的糞便中，嗜松籃狀菌與都柏林念珠菌呈正相關(SparCC相關性，r=0.16，p＜0.05)，然而這種共生或協同關係在肥胖個體的腸道中明顯不存在( 圖4C和4D)。

總之，健康的腸道真菌微生物組生態網路的特徵在於複雜的腸道真菌-真菌相互作用，不同的真菌物種與宿主中的每一種競爭或協作。然而，在肥胖個體中，當在肥胖症中沒有顯示出顯著的真菌多樣性降低時，生態網路變得少得多。存在減少的相互作用，其特徵取決於地區。

地區間肥胖症中的糞便真菌微生物組中降低的真菌 -細菌界間生態相互作用

先前的研究提供了以下證據，即界間相互作用在人類代謝健康中起著潛在的作用。通過研究肥胖個體和瘦對照中真菌微生物組和細菌組的α多樣性(多樣性和豐富度)之間的相關性，進一步探索了糞便中腸道真菌與細菌之間的關係。

如圖5所示，在來自香港( 圖5A)和昆明( 圖5C)群組的兩個瘦組中顯示了真菌-細菌α多樣性量度之間的正相關性。然而，與香港( 圖5A，細菌組多樣性和真菌微生物組多樣性，SparCC相關性，r=0.23，p＜0.01)和昆明群組( 圖5C，細菌組多樣性和真菌微生物組多樣性，SparCC相關性，r=0.40，p＜0.05)的瘦組相比，香港( 圖5B，細菌組多樣性和真菌微生物組多樣性，SparCC相關性，r=-0.007，p＜0.01)和昆明群組( 圖5D，細菌組多樣性和真菌微生物組多樣性，SparCC相關性，r=-0.01，p＜0.01)的肥胖組中真菌-細菌多樣性的相關性較弱或甚至喪失，說明與瘦對照相比，肥胖症中的真菌-細菌網路發生了改變。此外，肥胖組中的相關性變得與瘦組中觀察到的相關性相反( 圖5)。例如，在香港，瘦個體的腸道真菌微生物組均勻度與他們的細菌組多樣性( 圖5A，SparCC相關性，r=0.19，p＜0.05)、細菌組均勻度( 圖5A，r=0.13，p＜0.05)和細菌組豐富度( 圖5A，SparCC相關性，r=0.24，p=0.06)呈正相關，然而在肥胖組中存在顯著的負相關性( 圖5B，SparCC相關性，分別為r=-0.04，p＜0.01；r=-0.06，p＜0.01；r=-0.18，p＜0.001)。

總之，這些結果表明真菌-細菌界間的緊密且協同的相互作用可能有助於維持瘦個體中腸道微生物群的健康生態網路，這與肥胖症中的不同。

來自香港和昆明的肥胖個體 和瘦個體 中改變的腸道真菌微生物組組成

為了避免地理影響，通過分別比較來自香港和昆明的肥胖個體和瘦個體的LEfSe分析鑒定了與肥胖症相關的真菌物種。通過威爾克遜秩和檢驗證實了相對豐度的差異。與來自香港(平均值：1.26% vs 0.66%，p＜0.05，威爾克遜秩和檢驗)和昆明(平均值：5.41% vs 0.83%，p＜0.05，威爾克遜秩和檢驗)的肥胖個體相比，瘦個體中都柏林念珠菌的相對豐度顯著更高。

在香港群組中，新型隱球菌和粟酒裂殖酵母在瘦個體中富集(新型隱球菌：平均相對豐度2.41% vs 1.36%，p＜0.05；粟酒裂殖酵母：平均相對豐度3.99% vs 0.92%，p＜0.05；威爾克遜秩和檢驗)。耐熱克魯維酵母、奇異酵母和太瑞斯梭孢殼黴在來自香港的肥胖個體中富集(耐熱克魯維酵母：平均相對豐度0.01% vs 0.05%，p＜0.05；粟酒裂殖酵母：平均相對豐度0.18% vs 0.26%，p＜0.05；太瑞斯梭孢殼黴：平均相對豐度0.57% vs 0.84%，威爾克遜秩和檢驗)。在昆明群組中，小麥葉枯病菌和嗜熱毀絲黴與肥胖症相關( 圖2B)。

高脂飲食誘導的肥胖小鼠中粟酒裂殖酵母的抗肥胖作用

在通過LEfSe分析鑒定的差異富集的真菌物種中，香港群組中粟酒裂殖酵母的差異是統計學上最顯著的(瘦相對於肥胖中的log相對豐度：3.99 ± 7.49 vs0.92 ± 2.46，p＜0.01， 圖 2B)。進一步的相關性研究顯示了在香港群組中其與體質指數(BMI)呈負相關(r2=0.08，p=0.002， 圖 9B)。這表明粟酒裂殖酵母可以防止肥胖症和潛在的肥胖症相關病況，如糖尿病和血脂異常。

為了確定粟酒裂殖酵母對肥胖症的因果效應，將粟酒裂殖酵母(ATCC 16979)同時施用至用高脂肪飲食(HF)餵養的小鼠。除了PBS對照外，還包括釀酒酵母(ATCC 36375)作為對照(ND+SC組和HF+SC組， 圖 6A)。處理11周後，粟酒裂殖酵母而不是釀酒酵母的補充正常化了HF飲食誘導的體重增加。與用HF和PBS處理的小鼠相比，用HF和粟酒裂殖酵母處理的小鼠的體重降低了20.86% ( 圖6B，p＜0.001)，並且與用HF和釀酒酵母處理的小鼠相比，用HF和粟酒裂殖酵母處理的小鼠的體重降低了13.87% ( 圖6B，p＜0.05)。有趣的是，用補充了粟酒裂殖酵母的ND餵養的小鼠的體重保持與用ND和PBS餵養的小鼠的體重相似(p=0.101)。這表明粟酒裂殖酵母是良好耐受的。

與超重或肥胖症相關的風險主要與脂肪組織的沉積有關。雖然皮下和內臟脂肪貯備均與代謝風險狀況逐步惡化相關，但內臟脂肪更有害 ⁵。接下來評價粟酒裂殖酵母對皮下和內臟(附睾和腎周)脂肪組織的作用。如所預期的，相對於ND，HF導致脂肪重量顯著增加(HF vs ND的脂肪品質指數，p＜0.001，t檢驗； 圖 6C)。口服補充粟酒裂殖酵母而不是釀酒酵母減弱了HF誘導的脂肪堆積，如與用HF和PBS餵養的小鼠相比所示的，皮下(p＜0.001； 圖 6D)和腎周(p＜0.01； 圖 6F)脂肪組織重量減少。

血脂異常是一種與肥胖症相關的常見代謝病症。在本研究中，觀察到與用ND餵養的小鼠相比，HF顯著增加低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)的血清水準(p＜0.01)，並降低高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的血清水準(p＜0.001) ( 圖11B和11C)。口服補充粟酒裂殖酵母維持了與用ND餵養的小鼠類似的血清LDL-C水準( 圖11B)。與用HF和PBS餵養的小鼠相比，在用補充有粟酒裂殖酵母的HF餵養的小鼠中的血清HDL-C水準也顯著增加(p＜0.05， 圖 11C)。由於脂肪肝通常與血脂異常相關，並且在用HF餵養的小鼠中檢測到升高的LDL-C水準，因此接下來通過評估肝臟品質指數評價肝臟組織中的脂質積累。觀察到相對於用ND餵養的小鼠，HF顯著增加了肝臟品質指數，並且口服補充粟酒裂殖酵母防止用HF餵養的小鼠出現肝臟品質指數的這種增加(p＜0.001， 圖 11A)。

已知非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和2型糖尿病(T2DM)經常共存並有協同作用。NAFLD的存在增加了附隨的T2DM的風險，其相對風險為1.86 (95% CI，1.76–1.95) ⁶，而NAFLD的改善通常與降低的T2DM風險相關 ⁷。因此評價了粟酒裂殖酵母對葡萄糖耐量和胰島素抵抗的影響。用HF餵養的小鼠發展了葡萄糖不耐受，如通過從與用ND餵養的小鼠相比口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)得到的曲線下面積(AUC)的顯著增加所示的(p＜0.001， 圖 6I-6J)。儘管補充釀酒酵母沒有導致OGTT的AUC的任何顯著變化，但補充粟酒裂殖酵母顯著降低了AUC (p＜0.001， 圖 6I-6J)。然後通過胰島素耐量試驗(ITT)評估胰島素反應性。與用ND餵養的小鼠相比，用HF餵養的小鼠顯示ITT的AUC顯著增加(p＜0.001， 圖 6G-6H)。儘管補充釀酒酵母(p＜0.05， 圖 6G-6H)導致ITT的AUC降低，但補充粟酒裂殖酵母的效果要顯著得多(p＜0.001， 圖 6G-6H)。

總之，這些結果表明，補充粟酒裂殖酵母改善了HF誘導的肥胖症、脂肪過多、血脂異常、脂肪肝和T2DM (葡萄糖耐量和胰島素敏感性)。重要的是，粟酒裂殖酵母在用ND和HF餵養的小鼠中均是良好耐受的。這些發現為使用粟酒裂殖酵母作為靶向肥胖症和肥胖症相關病況如脂肪過多、血脂異常、脂肪肝和T2DM的治療選擇提供了支援。

使用這種物種，即粟酒裂殖酵母(NCBI:txid4896)——一種裂殖酵母，適於預防或改善以及治療上述疾病。這可以通過調節或調整有需要的個體的GI道中粟酒裂殖酵母水準來實現。優選地，應將粟酒裂殖酵母的水準增加至3.99%的相對豐度，這是來自香港群組的瘦個體中的平均相對豐度。

用於減輕體重的其他有益物種

比較來自香港的瘦物件和肥胖物件之間的真菌微生物組，發現與肥胖物件相比，除了粟酒裂殖酵母之外，新型隱球菌(NCBI:txid5207)也在瘦個體中富集。因此，總之，為了減輕有需要的物件的體重， 表 4所示的一種或多種真菌物種在GI道中的水準可以通過向物件的GI道中遞送有效量的這些物種來調節或調整。優選地，這些物種的水準應至少增加至瘦個體中的平均相對豐度( 表4)。

表4-用於減輕體重的真菌物種

			瘦個體中的相對豐度(%)
物種	群組	NCBI:txid	平均值	中值	下四分位數	上四分位數
新型隱球菌	香港	5207	2.41	0.19	0	2.41
粟酒裂殖酵母	香港	4896	3.99	0.37	0	3.6

施用真菌物種用於預防或改善肥胖症和肥胖症相關病況或者維持腸道健康以抵抗致病性念珠菌 (Candida)

可以從足夠量的真菌培養物中獲得粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、漢遜德巴厘酵母(D. hansenii)和表4中列出的真菌物種，然後將其配製成合適的組合物，以通過口服、鼻或直腸施用引入到個體中。組合物中每種真菌或酵母的量為約1×106 - 1×1012 CFU或50-1000 mg。理想地，相對豐度應當達到中值相對豐度(截止值)，或者在表4中列出的下四分位數和上四分位數的範圍內。儘管這些物種中的一些僅以低相對豐度(＜0.005%)存在，但仍然在預防或改善肥胖症和肥胖症相關病況中起著重要作用。對於中值相對豐度＜0.005%的那些物種，可檢測水準(例如，至少0.005%)可以用作截止值。

本申請中引用的所有專利、專利申請和其他出版物，包括GenBank登錄號和等同物，均出於所有目的通過引用整體併入本文中。

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無

圖1為 香港和昆明群組中的糞便真菌群落結構。(A)兩個地區中與肥胖症相關的腸道真菌微生物組在屬水準上的組成變化。(B)人類腸道真菌微生物組變化中中繼資料變數的效應量。*P＜0.05，***P＜0.001。(C-E)兩個地區中與肥胖症相關的人類腸道真菌微生物組的α-多樣性的變化。比較了兩個地區的瘦組和肥胖組之間的糞便真菌多樣性(C)、均勻度(D)和豐富度(E)。HK，香港；KM，昆明。通過t檢驗確定統計學顯著性，並且柱條上的數位代表p值。對於箱形圖，垂直線延伸四分位距(框的頂部和底部邊界)和框內水平線所描繪的中值的1.5倍； 圖2為 香港和昆明群組中與肥胖症相關的以物種水準表示的腸道真菌微生物組組成的變化 (A)和主要真菌分類群的相對豐度的差異(B)。使用線性判別分析效應量(LEfSe)分析檢測豐度的差異。僅顯示了優勢物種(相對豐度≥1.0%)，並且當用LefSE分析進行分析時，FDR校正具有＜.05的調整p值和＞2的效應量。相對豐度的對數轉化顯示在箱形圖中。HK，香港；KM，昆明。*P＜0.05，**P＜0.01。通過威爾克遜秩和檢驗(Wilcoxon rank-sum test)確定P值； 圖3為 來自香港和昆明群組的瘦個體 和肥胖個體 的糞便樣品中推定的真菌功能特徵。(A)糞便樣品中12種功能群(guild)的圓形圖。Lean in HK：香港的瘦個體；Obesity in HK：香港的肥胖個體；Lean in KM：昆明的瘦個體；Obesity in KM：昆明的肥胖個體。(B-E)糞便樣品中動物內共生真菌(B)、附生真菌(C)、植物病原性真菌(D)、植物腐生性真菌(E)的相對豐度。所有資料均表示為平均值±SEM。具有數字的柱條表示統計學差異。p值來自t檢驗。HK，香港；KM，昆明； 圖4為 來自香港和昆明群組的瘦個體 和肥胖個體 的糞便中真菌分類群之間的共現網路。(A)來自香港群組的瘦組；(B)來自香港群組的肥胖組；(C)來自昆明群組的瘦組；(D)來自昆明群組的肥胖組。彩色節點代表分配給主要屬的操作分類單元(OTU)。節點之間的邊代表使用SparCC方法從OTU豐度特徵推斷的正(藍色)或負(紅色)共現關係(偽p＜0.05，相關值＜-0.6或＞0.6)。HK，香港；KM，昆明； 圖5為 來自香港和昆明群組的瘦個體 和肥胖個體 中糞便細菌和真菌的α多樣性 (多樣性、均勻度和豐富度)之間的相關性。(A)來自香港群組的瘦組；(B)來自香港群組的肥胖組；(C)來自昆明群組的瘦組；(D)來自昆明群組的肥胖組。計算斯皮爾曼相關係數(Spearman’s correlation coefficient)，同時確定所有成對比較的統計學顯著性。用星號顯示顯著相關性(p＜0.05)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。藍色圓圈表示正相關，紅色圓圈表示負相關。大小和陰影表示相關性的幅度，其中較暗的陰影表示比亮陰影更強的相關性。HK，香港；KM，昆明； 圖6為 粟酒裂殖 酵母對肥胖症和血清學參數的影響。(A)示意圖，(B)體重增加，(C)脂肪指數，(D)皮下脂肪組織重量，(E)附睾脂肪組織重量，(F)腎周脂肪重量，(G)胰島素耐量試驗(ITT)的血清葡萄糖分佈圖，(H)在ITT期間測量的曲線下麵積(AUC)，(I)口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)的血清葡萄糖分佈圖，(J)在OGTT期間測量的AUC。資料顯示為平均值±SEM (n=4或5)。用錯誤發現率(FDR)校正p值。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns表示無顯著差異。p值來自單因素方差分析。ND：正常飲食；HF：高脂肪飲食；SE：用釀酒酵母處理的組；SP：用粟酒裂殖酵母處理的組；OGTT：口服葡萄糖耐量試驗；ITT：胰島素耐量試驗； 圖7為 真菌微生物組組成相對於地區和肥胖症的變化。(A)來自香港和昆明的肥胖個體和瘦個體的糞便真菌的β-多樣性。基於真菌物種水準上的Bray-Curtis相異度的NMDS (非度量多維尺度分析)圖。香港(B)和昆明(C)的瘦個體和肥胖個體之間的糞便真菌群落結構差異； 圖8為 根據藥物和 2型糖尿病(T2DM)的人類腸道真菌微生物組的α-多樣性的變化。調解對腸道真菌微生物組豐富度(A)和多樣性(B)的影響。2型糖尿病對腸道真菌微生物組豐富度(C)和多樣性(D)的影響(如分別在Chao1豐富度和辛普森多樣性指數中測量的)。帶數字的柱條表示統計學差異。通過威爾克遜(Wilcoxon)確定Y和N之間的統計學顯著性。HK，香港；KM，昆明。Y，是；N，否； 圖9為 粟酒裂殖 酵母與 BMI之間的負相關。(A)分別在香港和昆明群組中的粟酒裂殖酵母與BMI之間的負相關。(B)主要真菌物種與BMI之間的關聯。p值來自t檢驗。HK，香港；KM，昆明； 圖10為 香港和昆明群組之間的糞便樣品中推定的真菌功能特徵的相對豐度的差異。所有資料均表示為平均值±SEM。帶有數字的柱條表示統計學差異。p值來自t檢驗； 圖11為 小鼠的肝臟品質指數和血脂水準。(A)肝臟品質指數；(B)高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)；(C)低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)；(D)總膽固醇(TC)；(E)總甘油三酯(TG)。資料顯示為平均值±SEM (n=4或5)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns表示無顯著差異。p值來自單因素方差分析。

Claims (20)

1. 治療肥胖個體或處於肥胖症風險的個體中的肥胖症的方法，其包括將有效量的(1)粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)、新型隱球菌( Cryptococcus neoformans)和釀酒酵母( Saccharomyces cerevisae)中的一種或多種；或者(2)耐熱克魯維酵母( Lachancea thermotolerans)、奇異酵母( Saccharomyces paradoxus)、太瑞斯梭孢殼黴( Thielavia terrestris)、小麥葉枯病菌( Parastagonospora nodorum)和嗜熱毀絲黴( Myceliophthora thermophila) 的抑制劑中的一種或多種引入到所述個體的胃腸道中。
2. 如請求項1所述的方法，其包括將有效量的(1)粟酒裂殖酵母和新型隱球菌中的一種或多種；或者(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母和太瑞斯梭孢殼黴中的一種或多種的抑制劑引入所述個體的胃腸道中。
3. 如請求項1所述的方法，其中在所述引入步驟之後，該粟酒裂殖酵母、該新型隱球菌和/或該釀酒酵母水準增加約4-10倍。
4. 如請求項1所述的方法，其中在所述引入步驟之後，在所述個體的胃腸道中，該粟酒裂殖酵母相對水準占總腸道真菌大於約3.99%。
5. 如請求項1所述的方法，其中在所述引入步驟之後，在所述個體的胃腸道中，該耐熱克魯維酵母、該奇異酵母、該太瑞斯梭孢殼黴、該穎枯近殼多胞菌和/或該嗜熱毀絲黴相對水準占總腸道真菌小於約0.1%。
6. 如請求項1所述的方法，其中在所述引入步驟之後，真菌α多樣性指數增加約1.2-6倍。
7. 如請求項1所述的方法，其包括將組合物引入到所述個體的胃腸道中，所述組合物包含： (1) 粟酒裂殖酵母、新型隱球菌和釀酒酵母中的一種或多種；或者(2)耐熱克魯維酵母、奇異酵母、太瑞斯梭孢殼黴、穎枯近殼多胞菌和嗜熱毀絲黴的抑制劑中的一種或多種，以及生理學上可接受的賦形劑。
8. 如請求項7所述的方法，其中所述組合物包含粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌。
9. 如請求項7或8所述的方法，其中將所述組合物直接遞送至所述個體的小腸、迴腸或大腸。
10. 如請求項7或8所述的方法，其中所述組合物被配製用於口服攝入。
11. 如請求項10所述的方法，其中所述組合物以每日劑量配製。
12. 如請求項10所述的方法，其中所述組合物為食物或飲料物品的形式。
13. 如請求項10所述的方法，其中所述組合物還包含益生元。
14. 如請求項1-13中任一項所述的方法，其中所述引入步驟通過糞便微生物群移植(FMT)進行。
15. 如請求項14所述的方法，其中所述粟酒裂殖酵母、所述新型隱球菌和/或所述釀酒酵母來源於供體的糞便物質。
16. 如請求項1-15中任一項所述的方法，其中所述個體的體重降低、血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)水準降低、血清葡萄糖水平降低、葡萄糖耐量增加和/或胰島素反應性增加。
17. 一種用於促進減輕個體體重或降低個體的肥胖症風險的試劑盒，其包含多種組合物，所述組合物各自包含有效量的一種或多種以下物質：粟酒裂殖酵母；新型隱球菌；釀酒酵母；耐熱克魯維酵母的抑制劑；奇異酵母的抑制劑；太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑；穎枯近殼多胞菌的抑制劑和嗜熱毀絲黴的抑制劑。
18. 如請求項17所述的試劑盒，其包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含有效量的粟酒裂殖酵母和/或新型隱球菌，所述第二組合物包含耐熱克魯維酵母、奇異酵母和/或太瑞斯梭孢殼黴的抑制劑。
19. 如請求項17所述的試劑盒，其包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含有效量的粟酒裂殖酵母，所述第二組合物包含有效量的新型隱球菌。
20. 如請求項18或19所述的試劑盒，其中所述組合物被配製用於口服施用或直接遞送至所述個體的胃腸道。