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TW202346587A - 反義寡核苷酸 - Google Patents

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TW202346587A
TW202346587A TW112106127A TW112106127A TW202346587A TW 202346587 A TW202346587 A TW 202346587A TW 112106127 A TW112106127 A TW 112106127A TW 112106127 A TW112106127 A TW 112106127A TW 202346587 A TW202346587 A TW 202346587A
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吉特 弗里斯
海倫 瑪麗亞 吉林
丹尼斯 丘爾 漢生
埃里克 寇勒
安娜斯 艾琳 瑪麗 羅佩茲
迪妮爾 梅賴爾
蘇珊 莫爾
萊可 佩得森
文森 喬翰娜 瑪麗 波斯
莎賓 賽溫
克里斯蒂安 威勒
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瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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Abstract

本發明涉及降低 A1CF 之表現的反義寡核苷酸，以及其結合物、鹽及醫藥組成物。本發明也涉及此類反義寡核苷酸、結合物、鹽及醫藥組成物使用在降低 A1CF 表現的方法中以及在治療疾病、特定而言治療 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染的醫藥用途及方法中。

Description

反義寡核苷酸
本發明涉及降低 A1CF 之表現的反義寡核苷酸，以及其結合物、鹽及醫藥組成物。本發明也涉及此類反義寡核苷酸、結合物、鹽及醫藥組成物使用在降低 A1CF 表現的方法中以及在治療疾病、特定而言治療 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染的醫藥用途及方法中。
B 型肝炎係由 B 型肝炎病毒 (HBV) 引起之傳染病，B 型肝炎病毒係一種透過逆轉錄複製之小型嗜肝病毒。慢性 HBV 感染係導致嚴重肝病例如肝硬化、肝細胞癌之關鍵因素。當下對於慢性 HBV 感染之治療係基於投予聚乙二醇化第 1 型干擾素或核苷 (酸) 類似物，例如拉米夫定 (lamivudine)、阿德福韋 (adefovir)、恩替卡韋 (entecavir)、替諾福韋地索普西 (tenofovir disoproxil) 及替諾福韋艾拉酚胺 (tenofovir alafenamide)，該等藥物靶向病毒聚合酶，亦即一種多功能逆轉錄酶。治療成功通常以 B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) 之丟失來衡量。然而，由於 B 型肝炎病毒 DNA 在感染後仍然存在於體內，因此很少能完全清除 HBsAg。
HBV 之持久性由 HBV 基因體之游離形式媒介，該形式穩定地維持在細胞核中。該游離形式稱為「共價閉合環狀 DNA」(cccDNA)。HBV 為一種不完全雙股環狀 DNA 病毒。HBV 感染細胞之後，環狀 DNA 經轉移至細胞核中，並由 DNA 聚合酶修復為 cccDNA。cccDNA 作為所有 HBV 轉錄本 (包括前基因體 RNA (pgRNA)) 之模板。pgRNA 作為 HBV 基因體 DNA 之模板，因此係一種對病毒複製至關重要的病毒複製中間體。幾個 cccDNA 拷貝之存在可能足以重新引發完全型(full-blown) HBV 感染。當下對於 HBV 之治療並不靶向 cccDNA。然而，慢性 HBV 感染之治癒將會要求消除 cccDNA (由 Nassal，Gut.2015 Dec;64(12):1972-84. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809 綜述)。
A1CF ( APOBEC 1互補因子) 為脂蛋白元 B mRNA 編輯酶複合物之組分，其負責將 Gln 的 CAA 密碼子轉錄後編輯為 UAA 密碼子以終止於脂蛋白元 B mRNA 中。將終止密碼子引入脂蛋白元 B mRNA 改變胃腸道中之脂質代謝。編輯酶複合物包含由胞苷去胺酶 APOBEC1 (脂蛋白元 BmRNA 編輯酶催化次單元 1) 組成之最小核心及由 A1CF 基因編碼之互補因子。A1CF 蛋白具有三個不同的 RNA 辨識模體，且屬於 RNA 結合蛋白之 hnRNP R 家族。該蛋白與脂蛋白元 B mRNA 結合，並可能負責將催化次單元 APOBEC1 對接至該 mRNA，以便允許該 mRNA 將其標靶胞嘧啶去胺 (參見 Chester 等人，EMBO J. 2003 年 8 月 1 日；22(15):3971-82)。
關於脂蛋白元 B mRNA 編輯酶複合物之許多報告集中於胞苷去胺酶 APOBEC1 上，而非於 APOBEC1 互補因子上。已經表明，APOBEC1 不僅可編輯脂蛋白元 B mRNA，亦可編輯包括 HBV 在內之病毒基因體。
在針對 HBV 複製之小鼠模型中，Renard 等人指出小鼠 APOBEC1 於活體內編輯 HBV (Renard 等人，J Mol Biol. 2010 年 7 月 16 日；400(3):323-34. doi: 10.1016/j.jmb.2010.05.029)。與此相反，大鼠 APOBEC1 不抑制 HBV DNA 產生 (Rösler 等人，Hepatology.2005 年 8 月；42(2): 301-9)。
Gonzalez 等人指出人類 APOBEC1 編輯 HBV DNA。在以 HBV 及人類 APOBEC1 共轉染之細胞中，在 HBV 基因體中識別出幾個 G 至 A 超突變。此外，人類 APOBEC1 之存在影響了 HBV DNA 之複製。具體而言，已表明 APOBEC1表現之增加導致 HBV DNA 之量減少 (Gonzalez 等人，Retrovirology.(2009) 10 月 21;6:96. doi: 10.1186/1742-4690-6-96)。
據我們所知，在 cccDNA 穩定性及維持之背景下，A1CF 從未經識別為 cccDNA 依賴性因子，抑制 A1CF 之分子亦從未經建議作為 cccDNA 去穩定劑用於治療 HBV 感染。
此外，據我們所知，僅 WO 2016/142948 中提出對可能與 A1CF 表現之調節有關的寡核苷酸之揭露。然而，WO 2016/142948 涉及改變包括 A1CF 在內之許多所列標靶之剪接，以產生替代性剪接變異體。然而，寡核苷酸係編碼剪接因子結合位點之誘餌寡核苷酸，因此不與標靶結合。WO 2016/142948 亦提及一系列治療，包括癌症、發炎、免疫病症、神經退化、阿滋海默症、帕金森病、病毒感染 (HIV、HSV、HBV)。然而，不存在針對 A1CF 的寡核苷酸之具體實例，亦不存在其在 HBV 中之用途。
受感染之肝臟細胞中之 HBV cccDNA 負責持續的慢性感染及再活化，係所有病毒次基因體轉錄本及前基因體 RNA (pgRNA) 的模板，以確保新合成之病毒後代及經由細胞內核鞘循環之 cccDNA 池補充兩者。A1CF 與 cccDNA 穩定性有關。抑制 A1CF 導致經 HBV 感染之個體中 cccDNA 的去穩定，這繼而為慢性感染之 HBV 患者之完全治癒提供機會。
因此，本發明涉及能夠降低 A1CF 表現之反義寡核苷酸。A1CF 表現之降低可降低 cccDNA 含量，這可有助於治療 HBV 感染，特定而言慢性 HBV 感染。
本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列能夠與脂蛋白元 B mRNA 編輯酶催化次單元 1 (APOBEC1) 互補因子 (A1CF) mRNA 中之標靶序列結合，其中該標靶序列為下列序列中之任一者內的至少 17 個連續核苷酸之序列： GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、 GAGAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6970)、 AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989)、 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)、 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071) 及 AGACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78990)， 且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在一些實施例中，標靶序列係選自下列序列： GAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 31) (SEQ ID NO 45 之位置 6953 至 6970)、 GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、 AAGUAAAAUUAACAUGUCC (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16988)、 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071)、 AGACACACAAAACUCUA (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78989)、 AGAAAAACCUAUAAUGC (SEQ ID NO 36) (SEQ ID NO 45 之位置 6952 至 6968)、 GAAAAACCUAUAAUGCC (SEQ ID NO 37) (SEQ ID NO 45 之位置 6953 至 6969)、 GUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 45 之位置 16972 至 16989)、 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)、 GACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 40) (SEQ ID NO 45 之位置 78974 至 78990) 及 GAGAAAAACCUAUAAUGC (SEQ ID NO 41) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6968)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含與下列序列中之任一者具有至少 80% 同一性的序列或由其組成： AGGCATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 1)、 AAAAGTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 2)、 GGACATGTTAATTTTACTT (SEQ ID NO 3)、 TGAACTTGTTATATACETG (SEQ ID NO 4)、 TAGAGTTTTGTGTGTET (SEQ ID NO 5)、 GEATTATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 6)、 GGCATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 7)、 GGEATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 8)、 TGGACAUGTTAATTTTAE (SEQ ID NO 9)、 GGACATGUTAATTTTACTT (SEQ ID NO 10)、 GTTTTAAGATTGTGGTGTTT (SEQ ID NO 11)、 TAGAGTTTUGTGTGTET (SEQ ID NO 12)、 TAGAGTTTTGTGUGTET (SEQ ID NO 13)、 ATAGAFTTTTGTGTGTE (SEQ ID NO 14)、 AAAAFTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 15)、 AAAAGTTTCTCAFATAGGE (SEQ ID NO 16)、 AAAAGTTUCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 17)、 AGGCATTATAGGUTTTTE (SEQ ID NO 18)、 AGGCAUTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 19)、 GEATTATAGGTTTTTCTE (SEQ ID NO 20)、 GEATTATAGGTTTTUCTE (SEQ ID NO 21)、 GEATTATAGGTTTUTCTE (SEQ ID NO 22)、 GEATTATAGGTTUTTCTE (SEQ ID NO 23)、 GEATTATAGGTTUTTET (SEQ ID NO 24)、 GEATTATAGGTUTTTET (SEQ ID NO 25)、 GEATTATAGGUTTTTCTE (SEQ ID NO 26)、 GEATTATAGGUTTTTET (SEQ ID NO 27)、 GEATTAUAGGTTTTTET (SEQ ID NO 28)、 GEATUATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 29) 及 GEAUTATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 30)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1、14_1、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12、17_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1、30_1、11_2 及 11_3。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，其包含共價接附至至少一個結合物部分的本發明之反義寡核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1、14_1、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12、17_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1、30_1、11_2 及 11_3。
本發明亦提供一種選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸結合物： (a)      CNJ ID NO 1_1，如圖 1 所描繪； (b)      CNJ ID NO 2_1，如圖 2 所描繪； (c)      CNJ ID NO 3_1，如圖 3 所描繪； (d)      CNJ ID NO 4_1，如圖 4 所描繪； (e)      CNJ ID NO 4_2，如圖 5 所描繪； (f)       CNJ ID NO 5_1，如圖 6 所描繪；及 (g)      CNJ ID NO 5_2，如圖 7 所描繪。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 32。在一些此類實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 2、15、16 或 17 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 2_1、2_2、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12 及 17_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 2_1、2_2、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12 及 17_1。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列選自 SEQ ID NO 31、36、37 及 41。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、6、7、8、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 1_1、6_1、7_1、7_2、8_1、18_1、10_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1 及 30_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 1_1、6_1、7_1、7_2、8_1、18_1、10_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1及 30_1。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 33 或 SEQ ID NO 38。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 3、9 或 10 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 3_1、9_1 及 10_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 3_1、9_1 或 10_1。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 39。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 11 具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 11_1、11_2 或 11_3。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 11_1、11_2 或 11_3。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 34。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 4 具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 4_1、4_2 或 4_3。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 4_1、4_2 或 4_3。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 35 或 SEQ ID NO 40。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 5、12、13 或 14 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成 CMP ID NO 5_1、5_2、12_1、5_3、13_1 或 14_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 5_1、5_2、12_1、5_3、13_1 或 14_1。
本發明亦提供一種包含本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物的醫藥組成物及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
本發明亦提供一種降低標靶細胞中的 A1CF 表現之活體外或活體內方法，該方法包含向標靶細胞投予有效量的本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物。
本發明亦提供一種治療或預防疾病之方法，該方法包含向患有或易罹患疾病的個體投予治療或預防有效量的本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物。
本發明亦提供本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物，其用於治療或預防個體中之疾病。
本發明亦提供本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物於製備治療或預防個體中之疾病的藥物中之用途。
在一些實施例中，該疾病為 HBV 感染。在較佳之實施例中，該疾病為慢性 HBV 感染。
除非另有說明，否則所有範圍均包括起始值及結束值。
本文中對 SEQ ID NO (序列識別號) 的每次引用均指由該 SEQ ID NO 表示之序列。本文中對 CMP ID NO (化合物識別號) 的每次引用均指由該 CMP ID NO 表示之化合物。本文中對 CNJ ID NO (結合物識別號) 的每次引用均指由該 CNJ ID NO 表示之結合物。
本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列能夠與脂蛋白元 B mRNA 編輯酶催化次單元 1 (APOBEC1) 互補因子 (A1CF) mRNA 中之標靶序列結合，其中該標靶序列為下列序列中之任一者內的至少 17 個連續核苷酸之序列： GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、 GAGAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6970)、 AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989)、 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)、 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071) 及 AGACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78990)， 且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
寡核苷酸
如本文所用，術語「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，係指包含兩個或多個共價連接核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。
寡核苷酸通常在實驗室中經固相化學合成後再加以純化和分離來製備。提及寡核苷酸的序列時，係指共價連接核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，且通常經過純化或分離。
核苷酸和核苷
核苷酸和核苷為寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中，包括自然產生及非自然產生核苷酸和核苷。在本質上，核苷酸 (諸如 DNA 及 RNA 核苷酸) 包含核糖部分、核鹼基部分及一個或多個磷酸酯基團。核苷中不存在一個或多個磷酸酯基團。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
核鹼基
術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤 (例如腺嘌呤及鳥嘌呤) 和嘧啶 (例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶) 部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，核鹼基一詞亦涵蓋與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交期間具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變異體。此類變異體例如描述於 Hirao 等人，2012, Accounts of Chemical Research, 45, 2055-2065 及 Bergstrom, 2009, Curr. Protoc.Nucleic Acid Chem., 37, 1.4.1-1.4.32 中。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由以下經修飾：將嘌呤或嘧啶改變為經修飾嘌呤或嘧啶，諸如經取代嘌呤或經取代嘧啶，諸如選自異胞嘧啶、偽異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及 2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。
該核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如 A、T、G、C 或 U，其中各字母可視情況包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，該核鹼基部分係選自 A、T、G、C、5-甲基胞嘧啶及 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤。視情況，5-甲基胞嘧啶 LNA 核苷可用於 LNA 缺口體。5-甲基胞嘧啶可表示為「E」。7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤可表示為「F」。
反義寡核苷酸
該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
本文所用的「反義寡核苷酸」一詞定義為能夠藉由與標靶核酸雜交，特別地與標靶核酸上的連續序列雜交而調節標靶基因之表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是 siRNA 或 shRNA。在一些實施例中，反義寡核苷酸為單股反義寡核苷酸。應了解的是，只要跨寡核苷酸全長的序列內或序列間自補程度低於大約 50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙鏈體結構（同一寡核苷酸的兩個分子之間的雙鏈體）。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸不含有 RNA 核苷。
術語「反義寡核苷酸」在本文中可縮寫為「ASO」。
反義寡核苷酸之長度
本發明之反義寡核苷酸長度為 12 至 30 個核苷酸。在一些實施例中，該反義寡核苷酸之長度為 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 15 至 25 個核苷酸，諸如長度為 15 至 24、23、22、21 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 16 至 25 個核苷酸，諸如長度為 16 至 24、23、22、21 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 17 至 25 個核苷酸，諸如長度為 17 至 24、23、22、21 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為17、18、19 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 17 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 18 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 19 個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為 20 個核苷酸。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」意指反義寡核苷酸之與 A1CF mRNA 結合之區域。換言之，媒介本發明之反義寡核苷酸與 A1CF mRNA 的結合的係連續核苷酸序列。連續核苷酸序列媒介本發明之反義寡核苷酸與 A1CF mRNA 中之標靶序列的結合。因此，連續核苷酸序列與標靶序列互補，且在一些情況下與其完全互補。術語「連續核苷酸序列」在本文中與術語「連續核鹼基序列」可互換使用。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，且可視情況包含進一步的核苷酸，例如可用於將官能基團 (例如，結合物基團) 接附至該連續核苷酸序列之核苷酸連接子序列。該核苷酸連接子序列可與標靶核酸互補或不互補。
連續核苷酸序列之長度
應當理解，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列不能比反義寡核苷酸本身長，且反義寡核苷酸不能短於連續核苷酸序列。
本發明之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列之長度為 12 至 30 個核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 15 至 25 個核苷酸，諸如長度為 15 至 24、23、22、21 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 16 至 25 個核苷酸，諸如長度為 16 至 24、23、22、21 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 17 至 25 個核苷酸，諸如長度為 17 至 24、23、22、21 或 20 個核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 17、18、19 或 20 個核苷酸。於一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 17 個核苷酸。於一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 18 個核苷酸。於一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 19 個核苷酸。於一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 20 個核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由連續核苷酸序列組成。在一些實施例中，連續核苷酸序列的長度與反義寡核苷酸的長度相同。在一些實施例中，反義寡核苷酸為連續核苷酸序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之全部核苷組成連續核苷酸序列。在一些實施例中，術語「反義寡核苷酸」及「連續核苷酸序列」係可互換的。
A1CF mRNA
本發明之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列能夠與 A1CF mRNA 中之標靶序列結合。
術語「A1CF mRNA」指從 A1CF 基因轉錄之 RNA 分子。換言之，A1CF mRNA 為由 A1CF 基因編碼之 mRNA。人類 A1CF 基因位於第 10 號染色體之反向股上的位置 50,799,409 至 50,885,675 (基因體版本 GRCh38.p13，Ensembl ID ENSG00000148584) 處。在一些實施例中，A1CF 基因可包含根據 NCBI 參考序列 NG_029916.1 之人類 A1CF 基因體序列。人類 A1CF 基因之 DNA 序列之有義股在本文中表示為 SEQ ID NO 45。
A1CF 基因經轉錄為前驅 mRNA。因此，在一些實施例中，A1CF mRNA 為人類 A1CF 前驅 mRNA。A1CF 前驅 mRNA 之序列在本文中視為對應於 SEQ ID NO 45 (人類 A1CF 基因之有義股之 DNA 序列)。如此項技術所熟知，DNA 序列中之各胸腺嘧啶核鹼基在對應 RNA 序列中以尿嘧啶核鹼基置換。因此，A1CF 前驅 mRNA 序列對應於 SEQ ID NO 45，其中各胸腺嘧啶核鹼基以尿嘧啶核鹼基置換。因此，本文對 SEQ ID NO 45 之引用可指基因 DNA 序列 (包含胸腺嘧啶) 或前驅 mRNA RNA 序列 (其中各胸腺嘧啶以尿嘧啶置換)。本文的該等表中之位置指人類 A1CF 基因/前驅 mRNA (即 SEQ ID NO 45) 中之位置。對 A1CF 基因序列之任何引用亦涵蓋對與 A1CF 基因序列相對應的 A1CF 前驅 mRNA 序列的引用。因此，A1CF mRNA 可以為由 SEQ ID NO 45 編碼之 mRNA 序列。
人類 A1CF 前驅 mRNA 替代性地剪接至 10 種變異轉錄本中之任一種，其中 8 種包含可轉譯為蛋白的開讀框。這些經剪接之 mRNA 在本文中可稱為「成熟 mRNA」。因此，在一些實施例中，A1CF mRNA 為人類 A1CF 成熟 mRNA。NCBI 資料庫 (ncbi.nlm.nih.gov) 中人類 A1CF 基因/前驅 mRNA 及該等 8 種蛋白編碼成熟 mRNA 變異體之 NCBI 參考序列與對應 SEQ ID NO 呈現於下列表 1 中。
表 1- 人類 A1CF 基因及 mRNA 序列
序列 NCBI 參考序列 SEQ ID NO
人類 A1CF 基因/前驅 mRNA NG_029916.1 45
人類 A1CF-201 (轉錄變異體 1) NM_014576.4 46
人類 A1CF-202 (轉錄變異體 2) NM_138932.3 47
人類 A1CF-203 (轉錄變異體 3) NM_138933.3 48
人類 A1CF-204 (轉錄變異體 4) NM_001198818.2 49
人類 A1CF-205 (轉錄變異體 5) NM_001198819.2 50
人類 A1CF-206 (轉錄變異體 6) NM_001198820.2 51
人類 A1CF-205 (轉錄變異體 7) NM_001370130.1 52
人類 A1CF-205 (轉錄變異體 8) NM_001370131.1 53
因此，在一些實施例中，A1CF mRNA 包含選自由以下所組成之群組之序列：SEQ ID NO 45、46、47、48、49、50、51、52 及 53。在一些實施例中，A1CF mRNA 由選自由以下所組成之群組之序列組成：SEQ ID NO 45、46、47、48、49、50、51、52 及 53。在一些實施例中，A1CF mRNA 包含 SEQ ID NO 45。在一些實施例中，A1CF mRNA 由 SEQ ID NO 45 組成。
SEQ ID NO 45 在本文中作為參考序列提供，且應當理解，標靶核酸可以為 SEQ ID NO 45 之變異體，諸如自然產生變異體，諸如包含人類 A1CF 序列中之一個或多個多型性之等位基因變異體。術語「自然產生變異體」指與 A1CF mRNA 源自相同基因座但可有差異的 A1CF 基因或轉錄本之變異體，該差異可例如為出於基因碼簡併造成多重密碼子編碼同一個胺基酸，或因前驅 mRNA 之替代性剪接或多型性 (諸如單核苷酸多型性 (SNP)) 及等位基因變異體之存在。基於與寡核苷酸的足夠互補序列之存在，本發明之寡核苷酸因此可以靶向 A1CF mRNA 及其自然產生變異體。
因此，在一些實施例中，A1CF mRNA 包含以下或由以下組成：與選自由 SEQ ID NO 45、46、47、48、49、50、51、52 及 53 所組成之群組之序列具有至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% (即完全) 序列同一性的序列。在一些實施例中，A1CF mRNA 包含以下或由以下組成：與根據 SEQ ID NO 45 之序列具有至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% (即完全) 序列同一性的序列。
結合至 A1CF mRNA
本發明之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列能夠與 A1CF mRNA 中之標靶序列結合。
術語「能夠結合」、「結合」及「可以結合」在本文中係可互換的。術語「能夠結合」意指連續核苷酸序列可以與 A1CF mRNA 中之標靶序列關聯。如本文所述，這藉由互補鹼基配對實現。連續核苷酸序列不需要結合至整個標靶序列。同樣，並非所有連續核苷酸序列均需要結合至標靶序列。連續核苷酸序列之至少部分能夠結合至標靶序列之至少部分，從而足以將反義寡核苷酸與 A1CF mRNA 關聯。因此，在一些實施例中，至少部分之連續核苷酸序列能夠結合至至少部分之標靶序列。
因此，連續核苷酸序列媒介反義寡核苷酸與 A1CF mRNA 之結合。因此，在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列。
標靶序列
本發明之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列能夠與 A1CF mRNA 中之標靶序列結合。
術語「標靶序列」指連續核苷酸序列或反義寡核苷酸所結合至的 A1CF mRNA 區域。術語「標靶序列」可與術語「標靶位點」、「標靶核酸」、「標靶位點序列」、「標靶核酸序列」及「標靶位點核酸序列」互換。
本發明之連續核苷酸序列或反義寡核苷酸所能夠結合至之標靶序列位於 A1CF mRNA 序列中之六個區域中。這些區域位於 A1CF 基因/前驅 mRNA 序列 (SEQ ID NO 45) 之位置 2181 至 2199、6951 至 6970、16970 至 16989、26358 至 26377、38053 至 38071 及 78973 至 78990 處。在一些實施例中，這些區域為本發明之連續核苷酸序列或反義寡核苷酸所能夠結合至之標靶序列。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列能夠結合至這些區域內之較短標靶序列。特定而言，於位置 6951 至 6970 處之標靶序列內，至少四個標靶序列位於位置 6951 至 6968、6952 至 6968、6953 至 6969 及 6953 至 6970；於位置 16970 至 16988 處之標靶序列內，至少兩個標靶序列位於位置 16970 至 16988 及 16972 至 16989 處；且於位置 78973 至 78990 處之標靶序列內，至少兩個靶標序列位於位置 78973 至 78989 及 78974 至 78990 處。所有這些標靶序列均在下文列於表 2 中。
表 2- 標靶序列核鹼基之代碼：A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，E = 5-甲基胞嘧啶，F = 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤，G = 鳥嘌呤，T = 胸腺嘧啶，U = 尿嘧啶
標靶 SEQ ID NO 標靶核鹼基序列 A1CF 基因中之位置 NG029916.1 (SEQ ID NO 45)
32 GCCUAUCUGAGAAACUUUU 2181-2199
41 GAGAAAAACCUAUAAUGC 6951-6968
36 AGAAAAACCUAUAAUGC 6952-6968
37 GAAAAACCUAUAAUGCC 6953-6969
31 GAAAAACCUAUAAUGCCU 6953-6970
42 GAGAAAAACCUAUAAUGCCU 6951-6970
33 AAGUAAAAUUAACAUGUCC 16970-16988
38 GUAAAAUUAACAUGUCCA 16972-16989
43 AAGUAAAAUUAACAUGUCCA 16970-16989
39 AAACACCACAAUCUUAAAAC 26358-26377
34 CAGGUAUAUAACAAGUUCA 38053-38071
35 AGACACACAAAACUCUA 78973-78989
40 GACACACAAAACUCUAU 78974-78990
44 AGACACACAAAACUCUAU 78973-78990
因此，本發明之反義寡核苷酸之標靶序列為下列序列中之任一者內的至少 17 個連續核苷酸之序列： GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、 GAGAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6970)、 AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989)、 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)、 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071) 及 AGACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78990)。
在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 32、42、43、39、34 或 44 中之任一者內的至少 18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 32、42、43、39、34 或 44 中之任一者內的 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，標靶序列係選自下列序列： GAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 31) (SEQ ID NO 45 之位置 6953 至 6970)、 GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、 AAGUAAAAUUAACAUGUCC (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16988)、 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071)、 AGACACACAAAACUCUA (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78989)、 AGAAAAACCUAUAAUGC (SEQ ID NO 36) (SEQ ID NO 45 之位置 6952 至 6968)、 GAAAAACCUAUAAUGCC (SEQ ID NO 37) (SEQ ID NO 45 之位置 6953 至 6969)、 GUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 45 之位置 16972 至 16989)、 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)、 GACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 40) (SEQ ID NO 45 之位置 78974 至 78990) 及 GAGAAAAACCUAUAAUGC (SEQ ID NO 41) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6968)。
在一些實施例中，標靶序列係選自 SEQ ID NO 31、32、33、34、35、36、37、38、39 及 40。在一些實施例中，標靶序列係選自 SEQ ID NO 31、32、33、34 及 35。
在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 31。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 32。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 33。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 34。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 35。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 36。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 37。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 38。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 39。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 40。在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 41。
降低 A1CF 表現
本發明之反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
術語「A1CF 表現」指從 A1CF 基因產生多少基因產物。在一些實施例中，A1CF 表現為從 A1CF 基因產生之 A1CF mRNA 之量 (即所表現之 A1CF mRNA 之量)。所表現之 A1CF mRNA 之量可藉由此項技術中已知之技術 (諸如定量 PCR 或北方墨點法 (Northern blotting)) 確定。在一些實施例中，A1CF 表現為從 A1CF 基因產生之 A1CF 蛋白之量 (即所表現之 A1CF 蛋白之量)。所表現之 A1CF 蛋白之量可藉由此項技術中已知之技術 (諸如西方墨點法) 確定。
本文所用的術語「表現之降低」應理解為寡核苷酸抑制標靶細胞中 A1CF 之量或活性的能力之總稱。活性之降低可藉由測量 A1CF 前驅 mRNA 或 A1CF mRNA 之含量確定。因此可以在 活體外或 活體內確定表現之降低。
術語降低或減少「reduction」或「reduce」亦可以稱為下調、抑制、抑制、減輕、削減 A1CF 諸如 A1CF 前驅 mRNA 之表現。
表現之降低可藉由前驅 mRNA 或 mRNA (例如使用 RNase H 招募寡核苷酸，諸如缺口體 (gapmer)) 之降解而發生。
反義寡核苷酸對 A1CF 表現之影響可藉由將細胞暴露於本發明之反義寡核苷酸，諸如藉由以本發明之反義寡核苷酸轉染細胞及隨後測定 A1CF 表現量來評定。因此，在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠降低細胞中之 A1CF 表現。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠降低表現 A1CF 的細胞中之 A1CF 表現。在一些實施例中，A1CF 表現為細胞中所表現之 A1CF mRNA 之量。在一些實施例中，A1CF 表現為細胞中所表現之 A1CF 蛋白之量。
在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠將 A1CF 表現降低至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100% (即完全消除 A1CF 表現)。
熟悉此項技術者知悉任何生物學參數之定量均需要與對照進行比較。一般而言，藉由比較對標靶細胞投予有效量的該反義寡核苷酸而產生的活性之降低，並將該量與不投予該反義寡核苷酸而從標靶細胞獲得的參考量或已知的參考量 (例如在投予有效量的該反義寡核苷酸之前的表現量或預定的或其他已知的表現量) 進行比較 (對照實驗) 來確定表現之降低。例如，對照實驗可以為動物或人，或用鹽水組成物或參考寡核苷酸處理的標靶細胞 (通常是加擾的對照)。在一些實施例中，對照為未暴露於反義寡核苷酸的細胞。
在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠將 A1CF 表現降低至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100% (即完全消除 A1CF 表現)。
減少 HBV 核酸
如本文所述，本發明之反義寡核苷酸可用於治療或預防 HBV 感染。因此，在一些實施例中，以 HBV 感染細胞。在一些實施例中，該細胞為肝細胞。
以 HBV 感染之細胞可包含各種 HBV 核酸 (即由於 HBV 感染而存在於細胞中的核酸) 或與其關聯。此類 HBV 核酸包括細胞內 HBV DNA、分泌型 HBV DNA、前基因體 RNA (pgRNA) 及共價閉合環狀 DNA (cccDNA)。
本發明之反義寡核苷酸及反義寡核苷酸結合物可減少任何或所有這些類型之 HBV 核酸。換言之，以本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物處理以 HBV 感染之細胞可減少任何或所有這些類型之 HBV 核酸。
這些類型之 HBV 核酸之含量 (及因此減少之程度) 可藉由此項技術中已知的及本文所述的技術 (諸如定量 PCR) 來測定。應當理解，這些類型之 HBV 核酸之減少係與對照相比確定的。在一些實施例中，對照為未暴露於反義寡核苷酸的細胞。
減少 HBV DNA
以 HBV 感染之細胞可包含細胞內 HBV DNA，即 HBV 基因體。細胞內 HBV DNA 可能包含在活病毒中，該活病毒可能正在細胞中複製。細胞內 HBV DNA 可能包含在死病毒中。
以 HBV 感染之細胞可將 HBV DNA 分泌至環境中。就經培養之細胞而言，環境可以為培養基。就活生物體中之細胞而言，環境可以為細胞外環境，諸如血清。分泌型 HBV DNA 可能包含在活病毒中。分泌型 HBV DNA 可能包含在死病毒中。
因此，在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠減少細胞中之總細胞內 HBV DNA。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠將細胞中之總細胞內 HBV DNA 減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠減少細胞中之總細胞內 HBV DNA。在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠將細胞中之總細胞內 HBV DNA 減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠減少由細胞分泌的 HBV DNA 之量。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠將由細胞分泌的 HBV DNA 之量減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠減少由細胞分泌的 HBV DNA 之量。在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠將由細胞分泌的 HBV DNA 之量減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
減少 cccDNA
共價閉合環狀 DNA (cccDNA) 為 HBV 基因體之游離形式，該形式穩定地維持在細胞核中。在感染細胞之後，HBV 的環狀 DNA 基因體經轉移至細胞核中，並由 DNA 聚合酶修復為 cccDNA。cccDNA 作為所有 HBV 轉錄本之模板。cccDNA 係生產性感染所必需，且係慢性 HBV 感染之自然過程期間病毒持續存在的原因 (Locarnini & Zoulim, 2010 Antivir Ther. 15 Suppl 3:3-14. doi: 10.3851/IMP1619)。cccDNA 充當病毒儲庫，為治療停止後病毒反彈之來源，需要長期，通常是終生治療。因此，迫切需要能夠為大多數 CHB 患者提供完全治癒之新型療法，即降解或消除 HBV cccDNA。
在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠減少細胞中 cccDNA 之量。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠將由細胞中 cccDNA 之量減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠減少細胞中 cccDNA 之量。在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠將細胞中 cccDNA 之量減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
減少 pgRNA
前基因體 RNA (pgRNA) 為一種從 cccDNA 轉錄而來的 RNA 分子，其作為 HBV 基因體 DNA 之逆轉錄之模板。因此，pgRNA 為 HBV 複製中之關鍵中間體。
在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠減少細胞中 pgRNA 之量。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠將由細胞中 pgRNA 之量減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠減少細胞中 pgRNA 之量。在一些實施例中，與對照相比，反義寡核苷酸能夠將細胞中 pgRNA 之量減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。
RNase H 活性與招募
核糖核酸酶 H (RNase H) 指切割 RNA/DNA 雙股螺旋 (duplex) 之 RNA 成分的核酸內切酶家族。由反義寡核苷酸將 RNase H 招募至 RNA 標靶序列 (隨後為 RNase H 所媒介之 RNA 標靶降解) 被視為由反義寡核苷酸媒介 RNA 標靶之抑制的一種機制。
反義寡核苷酸的 RNase H 活性是指當其與互補 RNA 分子在雙鏈體中時，招募 RNase H 的能力。WO01/23613 提供判定 RNaseH 活性的體外方法，可用於判定招募 RNaseH 的能力。通常，如果當提供互補標靶核酸序列時，寡核苷酸具有初始速率 (以 pmol/l/min 為單位) 為當使用與受測經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列，但僅僅寡核苷酸中所有單體之間含有具有硫代磷酸酯鍵結的 DNA 單體，且使用 WO01/23613 (以引用方式併入) 的實例 91 至 95 所提供的方法所判定之初始速率的至少 5%、諸如至少 10%、至少 20% 或多於 20%，則將寡核苷酸視為能夠招募 RNase H。在判定 RHase H 活性時可使用瑞士琉森 Lubio Science GmbH 的重組型 RNase H1。
已知 DNA 寡核苷酸可有效地招募 RNaseH，缺口體寡核苷酸也是，包含 DNA 核苷區域 (通常至少 5 或 6 個連續的DNA核苷)、在 5' 及 3' 側翼為包含 2' 糖修飾核苷的區域，通常具有高親和力 2 糖修飾的核苷，諸如 2'-O-MOE 及/或 LNA。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸為缺口體。
為了有效地促進空間阻斷，並不期望前驅 mRNA 之降解，且由此較佳的是避免標靶之 RNaseH 降解。因此，在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸非招募 RNaseH 缺口體寡核苷酸。可以藉由限制寡核苷酸中連續 DNA 核苷酸之數量來避免 RNaseH 招募。因此可以使用混合聚體及全聚體設計。
在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠招募 RNase H。在一些實施例中，反義寡核苷酸具有 RNase H 活性。換言之，當反義寡核苷酸結合至 (即與之雜交) A1CF mRNA 上的至少部分之標靶序列時，招募 RNAse H，導致 A1CF mRNA 由 RNase H 切割，並因此導致 A1CF 表現之降低。
核酸酶中介降解意指一寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙股螺旋時，居中影響所述序列的降解。
在一些實施例中，該寡核苷酸可經由核酸酶媒介之標靶核酸的降解而發揮作用，其中本發明之寡核苷酸能夠招募核酸酶，特別是核酸內切酶，較佳是核糖核酸酶 (RNase)，例如核糖核酸酶 H。經由核酸酶媒介機轉而運作之寡核苷酸設計的實例為寡核苷酸，該等寡核苷酸通常包含長度為至少 5 或 6 個接連 DNA 核苷的區域，且在一側或兩側上側接有親和力增強型核苷，例如間隙子。
互補性
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與 A1CF mRNA 中之標靶序列互補。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸與 A1CF mRNA 中之標靶序列互補。
「互補性」一詞是用來形容核苷/核苷酸的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對能力。Watson-Crick 鹼基對為胞嘧啶-鳥嘌呤 (C-G) 及腺嘌呤-胸腺嘧啶/尿嘧啶 (A-T/U)。
應當理解，寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基的核苷。例如，可以使用 5-甲基胞嘧啶 (E) 來代替胞嘧啶，且可以使用 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤 (F) 來代替鳥嘌呤。因此，術語互補性涵蓋未修飾及經修飾核鹼基之間的 Watson-Crick 鹼基配對 (參見例如 Hirao 等人，2012, Accounts of Chemical Research, 45, 2055 及 Bergstrom, 2009, Curr. Protoc.Nucleic Acid Chem., 37, 1.4.1)。特定而言，Watson-Crick 鹼基配對涵蓋 E-G、C-F 及 E-F 鹼基對。
本文所用的「% 互補」係指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列中與參考序列 (例如標靶序列) 互補的核苷酸所佔的比例 (百分比)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。互補性百分率的計算方式為先算出兩個序列間互補 (形成 Watson-Crick 鹼基對) 的對齊核鹼基 (當對齊於標靶序列 5'-3' 及連續核苷酸序列 3'-5') 的數量，將該數量除以該連續核苷酸序列中的核苷酸總數，再乘以 100。在該等比對中，未對齊 (形成鹼基對) 的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的 % 互補性時不可進行插入和刪除。應當理解，在確定互補性時，只要核鹼基形成 Watson-Crick 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基之化學修飾 (例如在計算 % 互補性時，5'-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同，且 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤與鳥嘌呤視為相同)。
術語「互補」(諸如片語「連續核苷酸序列與標靶序列互補」) 不需要 100% 互補性。相反，在本發明中，術語「互補」需要連續核苷酸序列與標靶序列 (諸如選自 SEQ ID NO 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 及 41 的靶序列) 至少 75% 互補、至少 80% 互補、至少 85% 互補、至少 90% 互補、至少 95% 互補或 100% 互補。在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與標靶序列至少 75%、至少 80%、至少 81%、至少 82%、至少 83%、至少 84%、至少 85%、至少至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 互補或 100% 互補。
術語「完全互補」意指具有 100% 互補性。於一些實施例中，該連續核苷酸序列與標靶序列完全互補。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸內之連續核苷酸序列可包括一個、兩個、三個、或更多個錯配，其中錯配係連續核苷酸序列內之核苷酸，其與其標靶鹼基無配對。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組之標靶序列互補：SEQ ID NO 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 及 41。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 31 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 32 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 33 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 35 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 36 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 37 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 38 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 39 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 40 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 41 互補。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 32 (如 SEQ ID NO 45 所描繪之 A1CF 基因/前驅 mRNA 之位置 2181 至 2199) 之序列內之標靶序列互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 32 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 32 至少 90%、至少 95% 或 100% 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 32 100% 互補。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 42 (如 SEQ ID NO 45 所描繪之 A1CF 基因/前驅 mRNA 之位置 6951 至 6970) 之序列內之標靶序列互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組之標靶序列互補：SEQ ID NO 31、36、37 及 41。在一些實施例中，連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組的標靶序列至少 90%、至少 95% 或 100% 互補：SEQ ID NO 31、36、37 及 41。在一些實施例中，連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組之標靶序列 100% 互補：SEQ ID NO 31、36、37 及 41。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 43 (如 SEQ ID NO 45 所描繪之 A1CF 基因/前驅 mRNA 之位置 16970 至 16989) 之序列內之標靶序列互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 33 或 SEQ ID NO 38 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 33 或 SEQ ID NO 38 至少 90%、至少 95% 或 100% 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 33 或 SEQ ID NO 38 100% 互補。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 39 (如 SEQ ID NO 45 所描繪之 A1CF 基因/前驅 mRNA 之位置 26358 至 26377) 之序列內之標靶序列互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 39 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 39 至少 90%、至少 95% 或 100% 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 39 100% 互補。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 34 (如 SEQ ID NO 45 所描繪之 A1CF 基因/前驅 mRNA 之位置 38053 至 38071) 之序列內之標靶序列互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 34 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 34 至少 90%、至少 95% 或 100% 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 34 100% 互補。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 44 (如 SEQ ID NO 45 所描繪之 A1CF 基因/前驅 mRNA 之位置 78973 至 78990) 之序列內之標靶序列互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 35 或 SEQ ID NO 40 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 35 或 SEQ ID NO 40 至少 90%、至少 95% 或 100% 互補。在一些實施例中，連續核苷酸序列與 SEQ ID NO 35 或 SEQ ID NO 40 100% 互補。
雜交
本文所用的術語「雜交 (hybridizing 或 hybridizes)」應理解為兩條核酸股 (例如連續核苷酸序列及標靶序列) 在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙股螺旋。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度 (T m) 來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與標靶核酸形成雙股螺旋時的溫度。在生理條件下，T m並非嚴格地與親和力成比例 (Mergny 與 Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515–537)。標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數 (K d) 之間具有 ΔG° = -RTln(K d) 的關係，其中 R 是氣體常數，而 T 是絕對溫度。因此，寡核苷酸與該標靶核酸之間的反應的非常低的 ΔG° 體現該寡核苷酸與該標靶核酸之間的強勢雜交。ΔG° 為與其中含水濃度為 1M、pH 為 7、溫度為 37℃ 之反應關聯的能量。寡核苷酸與標靶核酸之雜交為自發性反應，而自發性反應之 ΔG° 小於零。ΔG° 可經由實驗來測量：例如，利用如 Hansen 等人 1965 年在 Chem.Comm.36–38 及 Holdgate 等人, 2005, Drug Discov Today中所述之等溫滴定量熱法 (ITC)。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量 ΔG° 的商用設備。ΔG° 亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用 SantaLucia 於 1998 年在 Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460-1465 中描述的最近鄰模型或利用 Sugimoto 等人，1995, Biochemistry 34:11211-11216 及 McTigue 等人，2004, Biochemistry 43:5388-5405 中描述的適當取得之熱力學參數。
在一些實施例中，對於長度為 12 至 30 個核苷酸的寡核苷酸，以低於 -10 kcal 的估計 ΔG° 值，本發明的反義寡核苷酸與標靶核酸雜交。
於一些實施例中，該雜交之程度或強度藉由標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 來測量。長度為 8 至 30 個核苷酸的寡核苷酸可以低於 -10 千卡範圍的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸，例如低於 -15 千卡，例如低於 -20 千卡，及例如低於 -25 千卡。在某些實施例中，以 -10 至 -60 kcal、諸如 -12 至 -40 kcal、諸如 -15 至 -30 kcal、或 -16 至 -27 kcal、諸如 -18 至 -25 kcal 的估計 ΔG° 值，該寡核苷酸與標靶核酸雜交。
序列
本文所用的術語「序列」指核酸 (諸如反義寡核苷酸或連續核苷酸序列) 中核鹼基之順序。當用於指本發明之連續核苷酸序列、反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物時，術語「序列」不限制核酸之糖部分之形式且不限制核酸之核苷間鍵結之形式。因此，連續核苷酸序列、反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之給定序列可包含呈任何組合的任何類型之核苷糖部分 (例如 RNA、DNA、LNA、2'-O-甲基-RNA、MOE-RNA，如本文所述)，且可包含任何類型之核苷間鍵結 (例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，如本文所述)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含與下列序列中之任一者具有至少 80% 同一性的序列或由其組成： AGGCATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 1)、 AAAAGTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 2)、 GGACATGTTAATTTTACTT (SEQ ID NO 3)、 TGAACTTGTTATATACETG (SEQ ID NO 4)、 TAGAGTTTTGTGTGTET (SEQ ID NO 5)、 GEATTATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 6)、 GGCATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 7)、 GGEATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 8)、 TGGACAUGTTAATTTTAE (SEQ ID NO 9)、 GGACATGUTAATTTTACTT (SEQ ID NO 10)、 GTTTTAAGATTGTGGTGTTT (SEQ ID NO 11)、 TAGAGTTTUGTGTGTET (SEQ ID NO 12)、 TAGAGTTTTGTGUGTET (SEQ ID NO 13)、 ATAGAFTTTTGTGTGTE (SEQ ID NO 14)、 AAAAFTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 15)、 AAAAGTTTCTCAFATAGGE (SEQ ID NO 16)、 AAAAGTTUCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 17)、 AGGCATTATAGGUTTTTE (SEQ ID NO 18)、 AGGCAUTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 19)、 GEATTATAGGTTTTTCTE (SEQ ID NO 20)、 GEATTATAGGTTTTUCTE (SEQ ID NO 21)、 GEATTATAGGTTTUTCTE (SEQ ID NO 22)、 GEATTATAGGTTUTTCTE (SEQ ID NO 23)、 GEATTATAGGTTUTTET (SEQ ID NO 24)、 GEATTATAGGTUTTTET (SEQ ID NO 25)、 GEATTATAGGUTTTTCTE (SEQ ID NO 26)、 GEATTATAGGUTTTTET (SEQ ID NO 27)、 GEATTAUAGGTTTTTET (SEQ ID NO 28)、 GEATUATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 29) 及 GEAUTATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 30)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 及 30 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 及 14 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1，2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列包含以下：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由以下組成：與 SEQ ID NO 1、2、3、4 及 5 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
相同度
本文所用的術語「同一性 (identity)」指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列與參考序列 (例如標靶序列) 完全相同的核苷酸所佔的比例 (以百分比表示)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。
同一性百分比的計算方式是，算出兩個序列 (在連續核苷酸序列中及在參考序列中) 之間相同 (為一個匹配) 的對齊核鹼基的數目，將該數字除以連續核苷酸序列中的核苷酸總數，再乘以 100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域 (例如連續核苷酸序列) 長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時不可對序列進行插入和刪除。應當理解，在確定同一性時，只要核鹼基形成 Watson-Crick 鹼基配對的功能保留，即可不考量核鹼基之化學修飾 (例如在計算 % 同一性時，5-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同，且 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤與鳥嘌呤視為相同)。
糖修飾
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含一種或多種糖修飾核苷。換言之，本發明之反義寡核苷酸可包含一個或多個具有經修飾糖部分的核苷，亦即與 DNA 及 RNA 中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環 (HNA)，或通常在核糖環上的 C2 與 C4 碳原子之間具有雙自由基橋的雙環 (LNA)，或通常在 C2 與 C3 碳原子之間無鍵結的未連結核糖環 (例如 UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸 (WO 2011/017521) 或三環核酸 (WO 2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸 (PNA) 或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在 DNA 及 RNA 核苷中自然存有的氫或 2'-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在 2'、3'、4' 或 5' 位置導入。
在一些實施例中，糖修飾核苷係獨立地選自由 2'-O-甲基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE-RNA) 及 LNA 核苷所組成之群組。
在一些實施例中，不包含糖修飾核苷的本發明之反義寡核苷酸中之各核苷酸包含 DNA 核苷。
2' 糖修飾核苷
2' 糖修飾核苷係在 2' 位置 (2' 經取代核苷) 具有非 H 或 -OH 的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的 2' 碳與第二碳之間形成架橋的 2' 連結雙自由基的核苷，諸如 LNA (2' 至 4' 雙自由基架橋) 核苷。
更確切地，2' 糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多 2' 經取代核苷在併入寡核苷酸中時具有有益特性。例如，2' 經修飾糖可加強該寡核苷酸的結合親和力及/或增加該寡核苷酸的核酸酶抗性。2' 經取代修飾核苷之實例為 2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA (2'OMe)。2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA 基 2'-F-ANA 核苷。更多實例請參見例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 203-213 及 Deleavey 與 Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為 2' 經取代修飾核苷之圖解。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含一種或多種 2' 糖修飾核苷。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含一種或多種 2'-O-甲基-RNA 核苷。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含一種或多種 2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE-RNA) 核苷。
鎖核酸核苷 (LNA 核苷 )
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含一種或多種 LNA 核苷。
「LNA 核苷」為一種 2'-經修飾核苷，該 2'-經修飾核苷包含連結該核苷的核糖環之 C2' 與 C4' 的雙自由基 (此雙自由基亦稱為「2' - 4' 架橋」)，其可限制或鎖定該核糖環之構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸 (BNA)。鎖定核糖的構造，可在將 LNA 併入寡核苷酸中而產生互補 RNA 或 DNA 分子時提升雜交親和力 (雙股螺旋穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙股螺旋的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示性 LNA 核苷揭示於以下文獻中：WO 99/014226；WO 00/66604；WO 98/039352；WO 2004/046160；WO 00/047599；WO 2007/134181；WO 2010/077578；WO 2010/036698；WO 2007/090071；WO 2009/006478；WO 2011/156202；WO 2008/154401；WO 2009/067647；WO 2008/150729；Morita 等人, Bioorganic & Med.Chem.12, 73-76, Seth 等人 J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81，Mitsuoka 等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 及 Wan 與 Seth，J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667 中揭示。
方案 1 中揭露了其他非限制性例示 LNA 核苷。
方案 1：
特定 LNA 核苷為 β-D-氧-LNA、6’-甲基-β-D-氧 LNA，例如 (S)-6’-甲基-β-D-氧-LNA (ScET) 及 ENA。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含一種或多種 LNA β-D-氧-LNA 核苷。
經修飾的核苷間鍵結
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸可包含一種或多種經修飾核苷間鍵結。
術語「經修飾核苷間鍵結」，如具有通常技術者所知之定義，指除磷酸二酯 (PO) 鍵結以外，可將兩個核苷共價連結在一起的鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸中之所有核苷間鍵結為經修飾核苷間鍵結。
在一些實施例中，各經修飾核苷間鍵結係獨立地選自由硫代磷酸酯核苷間鍵結及二硫代磷酸酯核苷間鍵結所組成之群組。硫代磷酸酯核苷間鍵結及二硫代磷酸酯核苷間鍵結係有用的，因為它們可以使反義寡核苷酸對由核酸酶進行的降解更具抵抗力。在硫代磷酸酯核苷間鍵結中，相對於自然產生的磷酸二酯核苷間鍵結，磷酸基團中未結合至核苷糖部分之碳的一個氧原子以硫原子置換。在二硫代磷酸酯核苷間鍵結中，磷酸基團中兩個氧原子中未結合至核苷糖部分之碳的每一者以硫原子置換。因此，在磷酸二酯鍵可由式 -O-P(O) 2-O- 表示的情況下，硫代磷酸酯核苷間鍵結可由式 -O-P(O,S)-O- 表示，且二硫代磷酸酯核苷間鍵結可由式 -O-P(S) 2-O- 表示。
區域 D' 及 D''
本發明之反義寡核苷酸可在一些實施例中包含以下各項或由以下各項組成：寡核苷酸之連續核苷酸序列，該等連續核苷酸序列與標靶核酸互補；及進一步的 5' 及/或 3' 核苷。進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷可與或不與標靶核酸為互補、諸如完全互補。該等進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷本文中可稱為區域 D’ 及 D’’。
區域 D' 或 D'' 的加入可用於將連續核苷酸序列 (諸如混合聚體或全聚體) 連接至結合物部分或另一官能基團。當用於接合該連續核苷酸序列與結合物部分時，其可做為生物可切斷型連接子。替代性地，其可用於提供核酸外切酶保護或促進合成或製造。
區域 D’ 或 D’’ 可獨立包含或具有 1、2、3、4 或 5 個外加核苷酸，其可與所述標靶核酸為互補或不為互補。鄰接 F 或 F’ 區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如 DNA 或 RNA 或其鹼基修飾版本。D’ 或 D’’ 區域可做為對核酸酶易感的生物可切斷型連接子 (見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加 5’ 及/或 3’ 端核苷酸是與磷酸二酯鍵結連結，且為 DNA 或 RNA。適用為區域 D’ 或 D’’ 的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照 WO2014/076195 的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA 二核苷酸。生物可切斷型連接子在聚寡核苷酸構造中的使用是揭示於 WO2015/113922，在該案中其係用於連結單一寡核苷酸中的多重反義構造。
在一實施例中，本發明之反義寡核苷酸除包含連續核苷酸序列之外，還包含區域 D' 及/或 D''。
在一些實施例中，定位在區域 D' 或 D'' 與連續核苷酸序列之間的核苷間鍵結為磷酸二酯鍵結。
化合物
術語「化合物」在本文中用於指給定核酸 (諸如本發明之反義寡核苷酸) 中序列 (即核鹼基之順序)、糖部分及核苷間鍵結之組合。對於給定化合物，核鹼基、糖部分之類型及各核苷酸之核苷間鍵結皆為明確的。因此，亦在給定化合物中指定糖部分及核苷間鍵結之順序。然而，除非另有說明，否則化合物可包含除指定序列、糖部分及核苷間鍵結之外的其他元素。
在一些實施例中，術語「反義寡核苷酸」可與術語「化合物」互換。換言之，在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸為本發明之化合物，反之亦然。
在本文中使用 X_Y 形式之化合物識別號 (CMP ID NO) 來引用具體化合物，其中 X 及 Y 各自為數字。對於各 CMP ID NO，X 為對應於化合物之序列的 SEQ ID NO 之編號。例如，指定為 CMP ID NO 2_1 的化合物具有與 SEQ ID NO 2 相同的核鹼基序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1、14_1、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12、17_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1、30_1、11_2 及 11_3。在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下中之任一者組成：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1、14_1、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12、17_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1、30_1、11_2 及 11_3。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1 及 14_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下中之任一者組成：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1 及 14_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1 及 5_2。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1 及 5_2。在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下中之任一者組成：CMP ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1 及 5_2。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)， (b)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)， (c)    [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)， (d)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)， (e)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2)， (f)     [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)， (g)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)， (h)    [LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1)， (i)     [MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1)， (j)     [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2)， (k)    [MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1)， (l)     [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2)， (m)   [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1)， (n)    [LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1)， (o)    [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1)， (p)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3)， (q)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1)， (r)     [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3)， (s)    [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1)， (t)     [LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1)， (u)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 15, CMP ID NO 15_1)， (v)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_1)， (w)   [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_2)， (x)    [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_3)， (y)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_3)， (z)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_4)， (aa)  [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_5)， (ab)  [LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_6)， (ac)  [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_7)， (ad)  [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_8)， (ae)  [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_9)， (af)   [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_10)， (ag)  [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_11)， (ah)  [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_12)， (ai)   [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 17_1)， (aj)   [LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 18_1)， (ak)  [LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 19, CMP ID NO 19_1)， (al)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_1)， (am) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_2)， (an)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_3)， (ao)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_4)， (ap)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_5)， (aq)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_6)， (ar)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_2)， (as)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_3)， (at)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_4)， (au)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_5)， (av)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_6)， (aw) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_7)， (ax)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_8)， (ay)  [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_9)， (az)  [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_10)， (ba)  [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_11)， (bb)  [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_12)， (bc)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 21, CMP ID NO 21_1)， (bd)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 22, CMP ID NO 22_1)， (be)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 23, CMP ID NO 23_1)， (bf)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 24, CMP ID NO 24_1)， (bg)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_1)， (bh)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_2)， (bi)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 26, CMP ID NO 26_1)， (bj)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_1)， (bk)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_2)， (bl)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 28, CMP ID NO 28_1)， (bm) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 29, CMP ID NO 29_1)， (bn)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 30, CMP ID NO 30_1)， (bo)  [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)(SEQ ID NO 11，CMP ID NO 11_2)，及 (bp)  [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)， (b)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)， (c)    [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)， (d)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)， (e)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2)， (f)     [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)， (g)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)， (h)    [LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1)， (i)     [MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1)， (j)     [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2)， (k)    [MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1)， (l)     [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2)， (m)   [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1)， (n)    [LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1)， (o)    [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1)， (p)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3)， (q)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1)， (r)     [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR]        (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3)， (s)    [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1)，及 (t)     [LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)， (b)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)， (c)    [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)， (d)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)， (e)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2)， (f)     [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)，及 (g)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
本發明亦提供選自由本文表 4 中 HELM 串描述的反義寡核苷酸的反義寡核苷酸。
共軛物
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其包含共價接附至至少一個結合物部分的本發明之反義寡核苷酸。換言之，本發明提供一種共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸。
術語「反義寡核苷酸結合物」在本文中可與術語「結合物」及「本發明之結合物」互換使用。術語「結合物部分」指可共價接附至本發明之反義寡核苷酸的非核苷酸部分。因此，如本文所用的術語「結合物」指共價接附至非核苷酸部分 (結合物部分) 的本發明之反義寡核苷酸。
寡核苷酸結合物及其合成業經報導於 Manoharan 在 Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.Crooke 編輯，第 16 章, Marcel Dekker, Inc., 2001 中之綜合評論及 Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103。
在一些實施例中，至少一個結合物部分共價接附至反義寡核苷酸之 5' 端。
結合物部分
在一些實施例中，結合物部分 (即非核苷酸部分) 係選自由以下所組成之群組：碳水化合物 (例如 GalNAc)、細胞表面受體配體、原料藥、荷爾蒙、親脂性物質、聚合物、蛋白質、胜肽、毒素 (例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白質 (例如殼體) 或其組合。
在一些實施例中，該結合物部分能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體，諸如人類去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR)。例如，該結合物部分可包含至少一個選自由半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺及 N-異丁醯基半乳糖胺所組成之群組的去唾液酸糖蛋白受體靶向部分。
在一些實施例中，該去唾液酸糖蛋白受體靶向部分為 N-乙醯基半乳糖胺 (GalNAc)。在一些實施例中，結合物部分為 N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc) 結合物部分。因此，本發明之反義寡核苷酸可以與包含至少一個 N-乙醯基半乳糖胺 (GalNAc) 部分的至少一個結合物部分結合，諸如與包含至少一個如下所述之 N-乙醯基半乳糖胺 (GalNAc) 部分的至少一個結合物部分結合。
在一些實施例中，結合物部分為至少二價 (諸如二價、三價或四價) GalNAc。在較佳的實施例中，結合物部分為三價 GalNAc。三價 N-乙醯基半乳糖胺結合物部分適合結合至 ASGPR，參見例如 WO 2014/076196、WO 2014/207232 及 WO 2014/179620。此類結合物用於增強肝臟對寡核苷酸的攝取。如本文所用的術語「三價 GalNAc」指一種殘基，其包含三個 N-乙醯基半乳糖胺部分，亦即較佳三個下式之部分：
在一些實施例中，GalNAc 結合物部分為氨基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)，如下文及圖 8 所描繪。
圖 8 (及上文所示) 之三價 N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc) 在本文中亦稱為「5gn2c6」。
「胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)」亦可稱為「-伸己基-NH-三(N-乙醯基-半乳糖胺)」。
在一些實施例中，結合物部分經由磷酸二酯鍵共價接附至反義寡核苷酸。在一些實施例中，結合物部分經由磷酸二酯鍵共價接附至連接子。在一些實施例中，如圖 8 所描繪之 GalNAc 結合物部分經由磷酸二酯鍵共價接附至反義寡核苷酸。在一些實施例中，如圖 8 所描繪之 GalNAc 結合物部分經由磷酸二酯鍵共價接附至連接子。
連接子
在本發明之反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，結合物部分經由連接子共價接附至反義寡核苷酸。因此，在一些實施例中，結合物包含連接子。在一些實施例中，該結合物包含定位在反義寡核苷酸與結合物部分之間的連接子。
在本發明之反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，結合物部分經由連接子核苷序列共價接附至反義寡核苷酸。連接子核苷序列在本文中可稱為區域 D' 或區域 D''。
在一些實施例中，該連接子核苷序列包含 1 至 10 個經連接之核苷或由 1 至 10 個經連接之核苷組成，諸如 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個經連接之核苷，諸如介於 2 個與 6 個之間的經連接之核苷，諸如介於 2 個與 5 個之間的經連接之核苷，諸如介於 2 個與 4 個之間的經連接之核苷。在一些實施例中，連接子核苷序列之長度為 2 個核苷。在一些實施例中，連接子包含兩個經連接之核苷。在一些實施例中，連接子由兩個經連接之核苷組成。
在一些實施例中，連接子核苷序列包含 DNA 核苷。在一些實施例中，連接子核苷序列由 DNA 核苷組成。換言之，在一些實施例中，連接子核苷序列中所有核苷均為 DNA 核苷。
在一些實施例中，連接子核苷序列之核苷經由磷酸二酯核苷間鍵結連接。在一些實施例中，連接子經由磷酸二酯核苷間鍵結連接至反義寡核苷酸。在一些實施例中，連接子經由磷酸二酯鍵連接至結合物部分。
如本文所用的術語「磷酸二酯核苷間鍵結」及「磷酸二酯鍵」指此項技術中已知的相同化學結構，其中第一化學實體經由中間磷酸酯基團連接至第二化學實體。術語「磷酸二酯核苷間鍵結」特定而言用於一種情況：即其中經連接的第一化學實體及第二化學實體為核苷，諸如本發明之反義寡核苷酸之核苷。如此項技術中已知，磷酸二酯核苷間鍵結為自然產生的核酸諸如基因體 DNA 中之自然產生的核苷間物。術語「磷酸二酯鍵」在本發明之上下文中特定而言用於指結合物部分與本發明之反義寡核苷酸或連接子 (諸如核苷連接子序列) 的共價接附，因為結合物部分不為核苷，所以術語「磷酸二酯核苷間鍵結」係非合適的。磷酸二酯核苷間鍵結/磷酸二酯鍵具有以下結構， 或呈質子化形式， 其中第一化學實體及第二化學實體分別接附於位置 1 及 2 處。在一些實施例中，結合物部分接附於位置 1 處且本發明之反義寡核苷酸附接於位置 2 處。在一些實施例中，結合物部分接附於位置 1 處且連接子接附於位置 2 處。在一些實施例中，連接子接附於位置 1 處且本發明之反義寡核苷酸附接於位置 2 處。
在一些實施例中，該生理不穩定連接子包含 DNA 二核苷酸或由其組成，該 DNA 二核苷酸具有選自由 AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC 或 GG 所組成之群組，其中在兩個 DNA 核苷之間存在磷酸二酯鍵結，並且在二核苷酸之 5' 或 3' 端存在至少又一個磷酸二酯，將核酸分子之寡核苷酸與該二核苷酸連接或將該結合物部分與該二核苷酸連接。例如，連接子可以為 CA 二核苷酸。在一些實施例中，該生理不穩定之連接子包含下列序列之 DNA 三核苷酸或由其組成：AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC 或 GGG，其中在 DNA 核苷之間存在磷酸二酯鍵結，並且可能在三核苷酸之 5' 或 3' 端存在又一個磷酸二酯。包含磷酸二酯的生物可切割連接子在 WO 2014/076195 (在此藉由引用併入) 中更詳細地描述。當與標準品相比時，在具有生物可切割連接子的結合物化合物中，至少約 50% 的結合物部分被從寡核苷酸切割，例如至少約 60% 被切割，例如至少約 70% 被切割，例如至少約 80% 被切割，例如至少約 85% 被切割，例如至少約 90% 被切割，例如至少約 95% 的結合物部分被從寡核苷酸切割。
在一些實施例中，連接子核苷序列為 CA。換言之，在一些實施例中，連接子核苷序列之序列為 CA。在一些實施例中，連接子核苷酸序列為 5'-CA-3'。在一些實施例中，連接子核苷序列為二核苷酸 CA，其中 C 核苷藉由磷酸二酯鍵連接至結合物部分，C 核苷藉由磷酸二酯核苷間鍵結連接至 A 核苷，且 A 核苷藉由磷酸二酯核苷間鍵結連接至本發明之反義寡核苷酸之 5'核苷。
在一些實施例中，連接子為生物可切割連接子。生物可切割連接子包含生理不穩定鍵或由其組成，該生理不穩定鍵在正常情況下或類似於哺乳動物體內遇到的條件下可切割。生理不安定連接子經歷化學轉換 (例如，切斷) 的條件包括化學條件，例如 pH、溫度、氧化或還原條件或作用劑，以及哺乳動物細胞內所常態存在或與之類似的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中的酵素活性，例如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一實施例中，所述生物可切割型連接子易感於 S1 核酸酶切割。在某些實施例中，核酸酶敏感性連接子包含 1 至 5 個核苷，如包含至少兩個連續磷酸二酯鍵結的一或多個 DNA 核苷。在 WO 2014/076195 中更詳細地闡述了包含磷酸二酯的可生物裂解的連接子。
本發明之例示性結合物
術語「結合物」可在本文中用於指本發明之給定反義寡核苷酸結合物中序列 (即核鹼基之順序)、糖部分、核苷間鍵結及結合物部分之組合。對於給定結合物而言，結合物之反義寡核苷酸中的核鹼基、糖部分之類型及各核苷酸之核苷間鍵結經指定。因此，亦在給定結合物中指定糖部分及核苷間鍵結之順序。然而，除非另有說明，否則結合物可包含除指定之序列、糖部分、核苷間鍵結及結合物部分之外的其他元素。
在本文中使用 X_Y 形式之結合物識別號 (CNJ ID NO) 來引用具體結合物，其中 X 及 Y 各自為數字。對於各 CNJ ID NO 而言，X 為對應於結合物之反義寡核苷酸組分之序列的 SEQ ID NO 之編號。例如，指定為 CNJ ID NO 2_1 的結合物具有與 SEQ ID NO 2 相同的核鹼基序列 (及與 CMP ID NO 2_1 相同的核鹼基序列)。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1、14_1、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12、17_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1、30_1、11_2 及 11_3。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物由以下中之任一者組成：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1、14_1、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12、17_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1、30_1、11_2 及 11_3。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1 及 14_1。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物由以下中之任一者組成：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、7_1、7_2、8_1、2_2、9_1、10_1、11_1、4_3、12_1、5_3、13_1 及 14_1。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1 及 5_2。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1 及 5_2。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物由以下中之任一者組成：CNJ ID NO 1_1、2_1、3_1、4_1、4_2、5_1 及 5_2。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)， (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)， (f)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)(SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)， (g)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)， (h)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1, CNJ ID NO 6_1)， (i)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1, CNJ ID NO 7_1)， (j)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2, CNJ ID NO 7_2)， (k)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1, CNJ ID NO 8_1)， (l)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2, CNJ ID NO 2_2)， (m)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1, CNJ ID NO 9_1)， (n)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1, CNJ ID NO 10_1)， (o)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1, CNJ ID NO 11_1)， (p)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3, CNJ ID NO 4_3)， (q)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1, CNJ ID NO 12_1)， (r)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3, CNJ ID NO 5_3)， (s)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1, CNJ ID NO 13_1)， (t)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1, CNJ ID NO 14_1)， (u)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 15, CMP ID NO 15_1, CNJ ID NO 15_1)， (v)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_1, CNJ ID NO 16_1)， (w)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_2, CNJ ID NO 16_2)， (x)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_3, CNJ ID NO 16_3)， (y)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_3, CNJ ID NO 2_3)， (z)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_4, CNJ ID NO 2_4)， (aa)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_5, CNJ ID NO 2_5)， (ab)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_6, CNJ ID NO 2_6)， (ac)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_7, CNJ ID NO 2_7)， (ad)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_8, CNJ ID NO 2_8)， (ae)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_9, CNJ ID NO 2_9)， (af)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_10, CNJ ID NO 2_10)， (ag)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_11, CNJ ID NO 2_11)， (ah)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_12, CNJ ID NO 2_12)， (ai)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 17_1, CNJ ID NO 17_1)， (aj)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 18_1, CNJ ID NO 18_1)， (ak)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 19, CMP ID NO 19_1, CNJ ID NO 19_1)， (al)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_1, CNJ ID NO 20_1)， (am) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_2, CNJ ID NO 20_2)， (an)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_3, CNJ ID NO 20_3)， (ao)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_4, CNJ ID NO 20_4)， (ap)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_5, CNJ ID NO 20_5)， (aq)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_6, CNJ ID NO 20_6)， (ar)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_2, CNJ ID NO 6_2)， (as)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_3, CNJ ID NO 6_3)， (at)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_4, CNJ ID NO 6_4)， (au)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_5, CNJ ID NO 6_5)， (av)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_6, CNJ ID NO 6_6)， (aw) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_7, CNJ ID NO 6_7)， (ax)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_8, CNJ ID NO 6_8)， (ay)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_9, CNJ ID NO 6_9)， (az)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_10, CNJ ID NO 6_10)， (ba)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_11, CNJ ID NO 6_11)， (bb)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_12, CNJ ID NO 6_12)， (bc)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 21, CMP ID NO 21_1, CNJ ID NO 21_1)， (bd)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 22, CMP ID NO 22_1, CNJ ID NO 22_1)， (be)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 23, CMP ID NO 23_1, CNJ ID NO 23_1)， (bf)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 24, CMP ID NO 24_1, CNJ ID NO 24_1)， (bg)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_1, CNJ ID NO 25_1)， (bh)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_2, CNJ ID NO 25_2)， (bi)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 26, CMP ID NO 26_1, CNJ ID NO 26_1)， (bj)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_1, CNJ ID NO 27_1)， (bk)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_2, CNJ ID NO 27_2)， (bl)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 28, CMP ID NO 28_1, CNJ ID NO 28_1)， (bm) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 29, CMP ID NO 29_1, CNJ ID NO 29_1)， (bn)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 30, CMP ID NO 30_1, CNJ ID NO 30_1)， (bo)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 11，CMP ID NO 11_2，CNJ ID NO 11_2)，及 (bp)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_3, CNJ ID NO 11_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
本發明亦提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)， (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)， (f)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)， (g)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)， (h)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1, CNJ ID NO 6_1)， (i)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1, CNJ ID NO 7_1)， (j)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2, CNJ ID NO 7_2)， (k)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1, CNJ ID NO 8_1)， (l)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2, CNJ ID NO 2_2)， (m)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1, CNJ ID NO 9_1)， (n)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1, CNJ ID NO 10_1)， (o)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1, CNJ ID NO 11_1)， (p)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3, CNJ ID NO 4_3)， (q)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1, CNJ ID NO 12_1)， (r)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3, CNJ ID NO 5_3)， (s)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1, CNJ ID NO 13_1)，及 (t)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1, CNJ ID NO 14_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
本發明亦提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)， (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)， (f)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)(SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)，及 (g)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，其係選自由本文表 5 中 HELM 串描繪的反義寡核苷酸結合物。
本發明亦提供一種選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸結合物： (a)   CNJ ID NO 1_1，如圖 1 所描繪； (b)   CNJ ID NO 2_1，如圖 2 所描繪； (c)   CNJ ID NO 3_1，如圖 3 所描繪； (d)   CNJ ID NO 4_1，如圖 4 所描繪； (e)   CNJ ID NO 4_2，如圖 5 所描繪； (f)    CNJ ID NO 5_1，如圖 6 所描繪；及 (g)   CNJ ID NO 5_2，如圖 7 所描繪。
靶向 A1CF 2181-2199
本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物可以結合由 A1CF 前驅 mRNA (SEQ ID NO 45) 的位置 2181 至 2199 定義的區域內的標靶序列。
因此，本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，該反義寡核苷酸結合物包含共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為長度為 12 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 32 內之 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 32。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含與下列序列中之任一者具有至少 80% 同一性的序列或由其組成： AAAAGTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 2)、 AAAAFTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 15)、 AAAAGTTTCTCAFATAGGE (SEQ ID NO 16) 及 AAAAGTTUCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 17)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 2、15、16 及 17 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 2 具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 2 具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 2 組成。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 2 組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由 SEQ ID NO 2 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 2_1、2_2、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12 及 17_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 2_1、2_2、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11 及 2_12。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下或由以下組成：CMP ID NO 2_1 或 CMP ID NO 2_2。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下或由以下組成：CMP ID NO 2_1。
本發明提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)， (b)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2)， (c)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 15_1)， (d)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 16_1)， (e)    [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 16_2)， (f)     [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 16_3)， (g)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_3)， (h)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_4)， (i)     [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_5)， (j)     [LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_6)， (k)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_7)， (l)     [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_8)， (m)   [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_9)， (n)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_10)， (o)    [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_11)， (p)    [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_12)，及 (q)    [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 17_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)，及 (b)    [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物或由下列化合物組成： [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物： [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由下列化合物組成： [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 2_1、2_2、15_1、16_1、16_2、16_3、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11、2_12 及 17_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 2_1、2_2、2_3、2_4、2_5、2_6、2_7、2_8、2_9、2_10、2_11 及 2_12。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下或由以下組成：CNJ ID NO 2_1 或 CNJ ID NO 2_2。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下或由以下組成：CNJ ID NO 2_1。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)， (b)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2, CNJ ID NO 2_2)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 15, CMP ID NO 15_1, CNJ ID NO 15_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_1, CNJ ID NO 16_1)， (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_2, CNJ ID NO 16_2)， (f)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_3, CNJ ID NO 16_3)， (g)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_3, CNJ ID NO 2_3)， (h)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_4, CNJ ID NO 2_4)， (i)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_5, CNJ ID NO 2_5)， (j)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_6, CNJ ID NO 2_6)， (k)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_7, CNJ ID NO 2_7)， (l)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_8, CNJ ID NO 2_8)， (m)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_9, CNJ ID NO 2_9)， (n)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_10, CNJ ID NO 2_10)， (o)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_11, CNJ ID NO 2_11)， (p)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_12, CNJ ID NO 2_12)、及 (q)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 17_1, CNJ ID NO 17_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物係選自以下： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)、及 (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2, CNJ ID NO 2_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物為如下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)。
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 2 所描繪之 CNJ ID NO 2_1。
靶向 A1CF 6951-6970
本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物可以結合由 A1CF 前驅 mRNA (SEQ ID NO 45) 的位置 6951 至 6970 定義的區域內的標靶序列。
因此，本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：GAGAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6970)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，該反義寡核苷酸結合物包含共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為長度為 12 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：GAGAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6970)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 42 內之 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，標靶序列係選自下列序列： GAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 31) (SEQ ID NO 45 之位置 6953 至 6970)、 AGAAAAACCUAUAAUGC (SEQ ID NO 36) (SEQ ID NO 45 之位置 6952 至 6968)、 GAAAAACCUAUAAUGCC (SEQ ID NO 37) (SEQ ID NO 45 之位置 6953 至 6969)、及 GAGAAAAACCUAUAAUGC (SEQ ID NO 41) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6968)。
在一些實施例中，標靶序列係選自 SEQ ID NO 31、36 及 37。
在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 31。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含與下列序列中之任一者具有至少 80% 同一性的序列或由其組成： AGGCATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 1)、 GEATTATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 6)、 GGCATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 7)、 GGEATTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 8)、 AGGCATTATAGGUTTTTE (SEQ ID NO 18)、 AGGCAUTATAGGTTTTTE (SEQ ID NO 19)、 GEATTATAGGTTTTTCTE (SEQ ID NO 20)、 GEATTATAGGTTTTUCTE (SEQ ID NO 21)、 GEATTATAGGTTTUTCTE (SEQ ID NO 22)、 GEATTATAGGTTUTTCTE (SEQ ID NO 23)、 GEATTATAGGTTUTTET (SEQ ID NO 24)、 GEATTATAGGTUTTTET (SEQ ID NO 25)、 GEATTATAGGUTTTTCTE (SEQ ID NO 26)、 GEATTATAGGUTTTTET (SEQ ID NO 27)、 GEATTAUAGGTTTTTET (SEQ ID NO 28)、 GEATUATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 29) 及 GEAUTATAGGTTTTTET (SEQ ID NO 30)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、6、7、8、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、6、7 或 8 中之任一者具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1、6、7 及 8 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1 具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 1 具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 1 組成。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 1 組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由 SEQ ID NO 1 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 1_1、6_1、7_1、7_2、8_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1 及 30_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 1_1、6_1、7_1、7_2 及 8_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 1_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 1_1 組成。
本發明提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)， (b)    [LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1)， (c)    [MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1)， (d)    [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2)， (e)    [MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1)， (f)     [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 17_1)， (g)    [LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 18_1)， (h)    [LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 19, CMP ID NO 19_1)， (i)     [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_1)， (j)     [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_2)， (k)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_3)， (l)     [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_4)， (m)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_5)， (aq)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_6)， (n)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_2)， (o)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_3)， (p)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_4)， (q)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_5)， (r)     [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_6)， (s)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_7)， (t)     [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_8)， (u)    [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_9)， (v)    [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_10)， (w)   [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_11)， (x)    [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_12)， (y)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 21, CMP ID NO 21_1)， (z)    [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 22, CMP ID NO 22_1)， (aa)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 23, CMP ID NO 23_1)， (ab)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 24, CMP ID NO 24_1)， (ac)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_1)， (bh)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_2)， (ad)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 26, CMP ID NO 26_1)， (ae)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_1)， (af)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_2)， (ag)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 28, CMP ID NO 28_1)， (ah)  [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 29, CMP ID NO 29_1)， (ai)   [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 30, CMP ID NO 30_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)， (b)    [LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1)， (c)    [MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1)， (d)    [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2)、及 (e)    [MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物： [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由下列化合物組成： [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 1_1、6_1、7_1、7_2、8_1、18_1、19_1、20_1、20_2、20_3、20_4、20_5、20_6、6_2、6_3、6_4、6_5、6_6、6_7、6_8、6_9、6_10、6_11、6_12、21_1、22_1、23_1、24_1、25_1、25_2、26_1、27_1、27_2、28_1、29_1及 30_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 1_1、6_1、7_1、7_2、8_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 1_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 1_1 組成。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1, CNJ ID NO 6_1)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1, CNJ ID NO 7_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2, CNJ ID NO 7_2)， (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1, CNJ ID NO 8_1)， (f)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 18_1, CNJ ID NO 18_1)， (g)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 19, CMP ID NO 19_1, CNJ ID NO 19_1)， (h)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_1, CNJ ID NO 20_1)， (i)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_2, CNJ ID NO 20_2)， (j)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_3, CNJ ID NO 20_3)， (k)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_4, CNJ ID NO 20_4)， (l)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_5, CNJ ID NO 20_5)， (m)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_6, CNJ ID NO 20_6)， (n)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_2, CNJ ID NO 6_2)， (o)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_3, CNJ ID NO 6_3)， (p)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_4, CNJ ID NO 6_4)， (q)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_5, CNJ ID NO 6_5)， (r)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_6, CNJ ID NO 6_6)， (s)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_7, CNJ ID NO 6_7)， (t)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_8, CNJ ID NO 6_8)， (u)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_9, CNJ ID NO 6_9)， (v)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_10, CNJ ID NO 6_10)， (w)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_11, CNJ ID NO 6_11)， (x)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_12, CNJ ID NO 6_12)， (y)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 21, CMP ID NO 21_1, CNJ ID NO 21_1)， (z)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 22, CMP ID NO 22_1, CNJ ID NO 22_1)， (aa)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 23, CMP ID NO 23_1, CNJ ID NO 23_1)， (ab)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 24, CMP ID NO 24_1, CNJ ID NO 24_1)， (ac)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_1, CNJ ID NO 25_1)， (ad)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_2, CNJ ID NO 25_2)， (ae)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 26, CMP ID NO 26_1, CNJ ID NO 26_1)， (af)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_1, CNJ ID NO 27_1)， (ag)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_2, CNJ ID NO 27_2)， (ah)  [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 28, CMP ID NO 28_1, CNJ ID NO 28_1)， (ai)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 29, CMP ID NO 29_1, CNJ ID NO 29_1)，及 (aj)   [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 30, CMP ID NO 30_1, CNJ ID NO 30_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物係選自以下： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1, CNJ ID NO 6_1)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1, CNJ ID NO 7_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2, CNJ ID NO 7_2)、及 (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1, CNJ ID NO 8_1).
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])(SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1).
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])(SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1).
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 1 所描繪之 CNJ ID NO 1_1。
靶向 A1CF 16970-16989
本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物可以結合由 A1CF 前驅 mRNA (SEQ ID NO 45) 的位置 16970 至 16989 定義的區域內的標靶序列。
因此，本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，該反義寡核苷酸結合物包含共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為長度為 12 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 43 內之 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，該標靶序列為 AAGUAAAAUUAACAUGUCC (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16988) 或 GUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 45 之位置 16972 至 16989)。
在一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 33。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含與下列序列中之任一者具有至少 80% 同一性的序列或由其組成： GGACATGTTAATTTTACTT (SEQ ID NO 3)、 TGGACAUGTTAATTTTAE (SEQ ID NO 9)、及 GGACATGUTAATTTTACTT (SEQ ID NO 10)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 3、9 及 10 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 3 具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 3 具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 3 組成。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 3 組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由 SEQ ID NO 3 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 3_1、9_1 及 10_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 3_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 3_1 組成。
本發明提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)， (b)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1)，及 (c)    [LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物： [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由下列化合物組成： [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 3_1、9_1 或 10_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 3_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 3_1 組成。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC])(SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1, CNJ ID NO 9_1)，及 (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1, CNJ ID NO 10_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)(SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)。
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 3 所描繪之 CNJ ID NO 3_1。
靶向 A1CF 26358-26377
本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物可以結合由 A1CF 前驅 mRNA (SEQ ID NO 45) 的位置 26358 至 26377 定義的區域內的標靶序列。
因此，本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，該反義寡核苷酸結合物包含共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為長度為 12 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 39 內之 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，該標靶序列為 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 40) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 GTTTTAAGATTGTGGTGTTT (SEQ ID NO 11) 具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 11 具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 11 組成。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 11 組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列由 SEQ ID NO 11 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 11_1、11_2 或 11_3。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 11_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 11_1 組成。
本發明提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1)， (b)    [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 11，CMP ID NO 11_2)，及 (c)    [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物： [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由下列化合物組成： [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 11_1、11_2 或 11_3。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 11_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 11_1 組成。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1, CNJ ID NO 11_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 11，CMP ID NO 11_2，CNJ ID NO 11_2)，及 (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_3, CNJ ID NO 11_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1, CNJ ID NO 11_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1, CNJ ID NO 11_1)。
靶向 A1CF 38053-38071
本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物可以結合由 A1CF 前驅 mRNA (SEQ ID NO 45) 的位置 38053 至 38071 定義的區域內的標靶序列。
因此，本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，該反義寡核苷酸結合物包含共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為長度為 12 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 34 內之 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，該標靶序列為 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 TGAACTTGTTATATACETG (SEQ ID NO 4) 具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 4 具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含 SEQ ID NO 4 或由其组成。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 4 組成。在一些實施例中，反義之序列由 SEQ ID NO 4 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成：CMP ID NO 4_1、4_2 或 4_3。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 4_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 4_1 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 4_2。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 4_2 組成。
本發明提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)， (b)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4，CMP ID NO 4_2)，及 (c)    [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下： [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下組成： [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下： [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下組成： [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 4_1、4_2 或 4_3。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 4_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 4_1 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 4_2。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 4_2 組成。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)、及 (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3, CNJ ID NO 4_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)。
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 4 所描繪之 CNJ ID NO 4_1。
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 5 所描繪之 CNJ ID NO 4_2。
靶向 A1CF 78973-78990
本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物可以結合由 A1CF 前驅 mRNA (SEQ ID NO 45) 的位置 78973 至 78990 定義的區域內的標靶序列。
因此，本發明提供一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：AGACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78990)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
本發明亦提供一種反義寡核苷酸結合物，該反義寡核苷酸結合物包含共價接附至至少一個結合物部分的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為長度為 12 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列能夠結合至 A1CF mRNA 中之標靶序列，其中標靶序列為下列序列內之至少 17 個連續核苷酸之序列：AGACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78990)，且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
在本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物之一些實施例中，標靶序列為 SEQ ID NO 44 內之 17、18、19 或 20 個連續核苷酸之序列。
在一些實施例中，該標靶序列為: AGACACACAAAACUCUA (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78989)、或 GACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 40) (SEQ ID NO 45 之位置 78974 至 78990)。
在一些實施例中，該標靶序列為 AGACACACAAAACUCUA (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78989)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含與下列序列中之任一者具有至少 80% 同一性的序列或由其組成： TAGAGTTTTGTGTGTET (SEQ ID NO 5)、 TAGAGTTTUGTGTGTET (SEQ ID NO 12)、 TAGAGTTTTGTGUGTET (SEQ ID NO 13)、及 ATAGAFTTTTGTGTGTE (SEQ ID NO 14)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 5、12、13 及 14 中之任一者具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 5 具有至少 80% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO 5 具有至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 同一性的序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之序列及/或連續核苷酸序列中之序列包含 SEQ ID NO 5 或由其组成。在一些實施例中，連續核苷酸序列中之序列由 SEQ ID NO 5 組成。在一些實施例中，反義之序列由 SEQ ID NO 5 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下中之任一者或由其組成 CMP ID NO 5_1、5_2、12_1、5_3、13_1 或 14_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 5_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 5_1 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 CMP ID NO 5_2。在一些實施例中，反義寡核苷酸由 CMP ID NO 5_2 組成。
本發明提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自以下的化合物或由該化合物組成： (a)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)， (b)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)， (c)    [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1)， (d)    [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3)， (e)    [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1)，及 (f)     [LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物： [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由下列化合物組成： [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含下列化合物： [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由下列化合物組成： [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含以下中之任一者或由其組成：CNJ ID NO 5_1、5_2、12_1、5_3、13_1 或 14_1。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 5_1。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 5_1 組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物包含 CNJ ID NO 5_2。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物由 CNJ ID NO 5_2 組成。
本發明提供一種選自以下的反義寡核苷酸結合物： (a)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)， (b)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)， (c)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1, CNJ ID NO 12_1)， (d)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3, CNJ ID NO 5_3)， (e)    [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1, CNJ ID NO 13_1)，及 (f)     [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1, CNJ ID NO 14_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由以下組成： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)。
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 6 所描繪之 CNJ ID NO 5_1。
本發明提供一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 7 所描繪之 CNJ ID NO 5_2。
醫藥上可接受之鹽
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物呈醫藥上可接受之鹽的形式。
如本文所用，術語「鹽」符合其通常已知之含義，即陰離子及陽離子之離子組合體。
術語「醫藥上可接受之鹽」指代保有生物學有效性及游離鹼或游離酸之特性，且並非在生物學上或在其他方面有不利之處的鹽。該鹽是以無機酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、特別是鹽酸，以及以有機酸形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苄甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯半胱胺酸等。此外，此等鹽可由無機鹼或有機鹼添加至游離酸中來製備。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於一級胺、二級胺、和三級胺的鹽、取代胺，包括天然存在的取代胺、環胺和鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺樹脂。本發明之化合物亦可以兩性離子之形式存在。特別優選地，式 (I) 化合物之醫藥上可接受之鹽是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的鹽。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸的形式是一種醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物的呈醫藥上可接受之鹽的形式。
在一些實施例中，醫藥上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物呈鈉鹽的形式。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸呈鈉鹽的形式。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物呈鈉鹽的形式。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物呈鉀鹽的形式。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸呈鉀鹽的形式。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸結合物呈鉀鹽的形式。
反義寡核苷酸之遞送
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物係被包覆於基於脂質的遞送載體中，共價連接至或被包覆於樹枝狀聚合物中，或者結合至適體。這可能是為了將本發明之反義寡核苷酸遞送至標靶細胞及/或改善反義寡核苷酸之藥物動力學。基於脂質的遞送載體之實例包括水包油乳液、微胞、脂質體及脂質奈米顆粒。
在一些實施例中，反義寡核苷酸被包覆於基於脂質的遞送載體中。在一些實施例中，反義寡核苷酸共價連接至樹枝狀聚合物。在一些實施例中，反義寡核苷酸被包覆於樹枝狀聚合物中。在一些實施例中，反義寡核苷酸與適體結合。
在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物被包覆於基於脂質的遞送載體中。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物共價連接至樹枝狀聚合物。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物被包覆於樹枝狀聚合物中。在一些實施例中，反義寡核苷酸結合物與適體結合。
醫藥組成物
本發明提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含水性稀釋劑或溶劑。在一些實施例中，水性稀釋劑或溶劑為磷酸鹽緩衝食鹽水。在一些實施例中，水性稀釋劑或溶劑係無菌的。
本發明提供一種包含本發明之反義寡核苷酸及醫藥上可接受之鹽的醫藥組成物。在一些實施例中，該鹽包含金屬陽離子。在某些實施例中，醫藥上可接受之鹽選自由鈉鹽、鉀鹽及銨鹽所組成之群組。
本發明亦提供一種本發明之反義寡核苷酸或其結合物之醫藥溶液，其中該醫藥溶液包含本發明之反義寡核苷酸或其結合物及醫藥上可接受之溶劑，諸如食鹽水。
本發明亦提供固體粉末形式諸如凍乾粉末形式的本發明之反義寡核苷酸或其結合物。
降低 A1CF 表現的方法
本發明提供一種於活體外降低標靶細胞中 A1CF 表現的方法，該方法包含向標靶細胞投予有效量的本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物。
本發明提供一種於活體內降低標靶細胞中 A1CF 表現的方法，該方法包含向標靶細胞投予有效量的本發明之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物。
在一些實施例中，標靶細胞為動物細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或猴子細胞。最佳地，標靶細胞為人類細胞。
在一些實施例中，標靶細胞為肝細胞。
在一些實施例中，以 HBV 感染標靶細胞。在一些實施例中，以 HBV 感染標靶細胞。在一些實施例中，標靶細胞可包含 HBV cccDNA。在一些實施例中，標靶細胞包含 A1CF 前驅 mRNA (諸如 SEQ ID NO 45)、成熟 mRNA (諸如 SEQ ID NO 47 至 54 中之任一者) 及 HBV cccDNA。
在一些實施例中，標靶細胞為 HBV 感染之原代人類肝細胞，其來源於 HBV 感染之個體或來源於具有人源化肝臟之 HBV 感染之小鼠 (PhoenixBio，PXB 小鼠)。
在本發明之 活體內方法的一些實施例中，標靶細胞為患有 HBV 感染諸如慢性 HBV 感染的個體之一部分。在本發明之 活體外方法的一些實施例中，標靶細胞來源於患有 HBV 感染諸如慢性 HBV 感染的個體。
在該方法的一些實施例中，與對照相比，A1CF 表現降低至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100%。在一些實施例中，對照是未暴露於反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物的細胞。在一些實施例中，A1CF 表現為由標靶細胞表現的 A1CF mRNA 之量。
治療方法、預防方法及醫療用途
本發明提供一種治療疾病的方法，該方法包含向患有該疾病的個體投予治療有效量的本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物。
本發明提供一種治療疾病的方法，該方法包含向患有該疾病的個體投予治療有效量的本發明之反義寡核苷酸。本發明提供一種治療疾病的方法，該方法包含向患有該疾病的個體投予治療有效量的本發明之反義寡核苷酸結合物。本發明提供一種治療疾病的方法，該方法包含向患有該疾病的個體投予治療有效量的本發明之醫藥組成物。
本發明提供一種預防疾病的方法，該方法包含向罹患該疾病的個體投予預防有效量的本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物。
本發明提供一種預防疾病的方法，該方法包含向罹患該疾病的個體投予預防有效量的本發明之反義寡核苷酸。本發明提供一種預防疾病的方法，該方法包含向罹患該疾病的個體投予預防有效量的本發明之反義寡核苷酸結合物。本發明提供一種預防疾病的方法，該方法包含向罹患該疾病的個體投予預防有效量的本發明之醫藥組成物。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物，其用於治療個體中之疾病。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸，其用於治療個體中之疾病。本發明亦提供本發明之反義寡核苷酸結合物，其用於治療個體中之疾病。本發明亦提供本發明之醫藥組成物，其用於治療個體中之疾病。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物，其用於預防個體中之疾病。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸，其用於預防個體中之疾病。本發明提供本發明之反義寡核苷酸結合物，其用於預防個體中之疾病。本發明提供本發明之醫藥組成物，其用於預防個體中之疾病。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物用於製備治療個體中之疾病的藥物之用途。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸用於製備治療個體中之疾病的藥物之用途。本發明提供本發明之反義寡核苷酸結合物用於製備治療個體中之疾病的藥物之用途。本發明提供本發明之醫藥組成物用於製備治療個體中之疾病的藥物之用途。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物用於製備預防個體中之疾病的藥物之用途。
本發明提供本發明之反義寡核苷酸用於製備預防個體中之疾病的藥物之用途。本發明提供本發明之反義寡核苷酸用於製備預防個體中之疾病的藥物之用途。本發明提供本發明之醫藥組成物用於製備預防個體中之疾病的藥物之用途。
如本文所用的術語「治療」指治療既有疾病 (例如本文所提及之疾病或病症)，或防範疾病，即預防。因此應知，本文中所稱之治療，於一些實施例中，係預防性的。預防可以理解為防止 HBV 感染轉為慢性 HBV 感染或防止慢性 HBV 感染引起的嚴重肝病例如肝硬化及肝細胞癌。
在本文中，術語「預防」、「防止」或「阻止」涉及預防性治療，亦即，其目的為預防而非治癒疾病的措施或程序。預防意指獲得期望的藥理學及/或生理學效果，該效果在完全或部分地防止疾病或其症狀方面是預防性的。據此，本文中，「預防 HBV 感染」包括防止 HBV 感染在個體中發生，以及防止 HBV 感染症狀的發生。在本發明中，特別考慮了預防來自 HBV 感染之母親的兒童之 HBV 感染。還考慮預防急性 HBV 感染轉變為慢性 HBV 感染。
本發明提供用作藥物的如本發明之反義寡核苷酸、本發明之反義寡核苷酸結合物、或本發明之醫藥組成物。本發明提供用於療法中的如本發明之反義寡核苷酸、本發明之反義寡核苷酸結合物、或本發明之醫藥組成物。本發明提供用於製備藥物的如本發明之反義寡核苷酸、本發明之反義寡核苷酸結合物、或本發明之醫藥組成物。
疾病
在一些實施例中，該疾病為 HBV 感染。在一些實施例中，HBV 感染為慢性 HBV 感染。
術語「B 型肝炎病毒感染 (hepatitis B virus infection)」或「HBV 感染 (HBV infection)」在本領域中是眾所周知的，並且是指由 B 型肝炎病毒 (HBV) 引起並影響肝臟的傳染病。HBV 感染可以是急性或慢性感染。慢性 B 型肝炎病毒 (CHB) 感染係一種全球性疾病負擔，影響全球 2.48 億人。每年約有 686,000 人死於 HBV 相關的終末期肝病及肝細胞癌 (HCC) (GBD 2013; Schweitzer 等人, 2015)。世衛組織預計，如果不擴大干預，在未來 40 至 50 年內，CHB 感染人數將保持在當下之高水平，2015 年至 2030 年期間將有 2,000 萬人死亡 (WHO 2016)。CHB 感染不是具有單一臨床表現的同種疾病。經感染之個體在其一生中經歷與 CHB 相關之肝病之多個階段；該等疾病階段也是標準照護 (SOC) 治療的基礎。當下之指南建議僅基於以下三個標準治療選定之 CHB 感染個體：血清 ALT 含量、HBV DNA 含量及肝病嚴重程度 (EASL, 2017)。該建議係因為以下事實：SOC 亦即核苷 (酸) 類似物 (NA) 及聚乙二醇化干擾素-α (PEG-IFN) 不具治癒療效且必須長期投予，因而增加了其安全風險。由於其各種副作用，PEG-IFN 只能投予至 CHB 之一個小子集。NA 有效抑制 HBV DNA 複製；然而，其等對其他病毒標記之影響非常有限/沒有影響。HBV 感染之兩個標誌，B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) 及共價閉合環狀 DNA (cccDNA) 為針對 HBV 治癒之新型藥物的主要標靶。在 CHB 個體之血漿中，HBsAg 次病毒 (空) 顆粒之數量為 HBV 病毒粒子之 103 至 105 倍 (Ganem & Prince, 2014)；據信其過量有助於疾病之免疫發病機制，包括個體無法產生中和抗 HB 抗體，該抗體為在急性 HBV 消退後觀察到的血清學標記物。
在一些實施例中，疾病與 HBV 感染關聯。在一些實施例中，疾病為肝病。在一些實施例中，疾病為肝硬化。在一些實施例中，疾病為肝細胞癌。
個體
對於本發明之目的，「個體」或「患者」可以為脊椎動物。在本發明之語境中，術語「個體」包括人類及其他動物，特別是哺乳動物及其他生物。因此，本文提供的手段及方法適用於人類療法及獸醫應用兩者。據此，本文中之個體可以為動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豚鼠、雪貂、貓、狗、雞、羊、牛科物種、馬、駱駝或靈長類動物。較佳地，個體為哺乳動物。更佳地，個體為人類。在一些實施例中，個體患有本文提及之疾病，諸如 HBV 感染。在一些實施例中，個體易患該疾病。
投予
本發明之反義寡核苷酸、本發明之反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物可局部 (諸如向皮膚、吸入、眼部或耳部) 或腸內 (諸如口服或透過胃腸道) 或腸胃外 (諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內) 投予。
在較佳的實施例中，本發明之寡核苷酸、本發明之反義寡核苷酸結合物或本發明之醫藥組成物藉由腸胃外途徑投予，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注、鞘內或顱內 (例如腦內或腦室內) 投予。在一實施例中，本發明之反義寡核苷酸經腦內或腦室內投予。在另一實施例中，本發明之反義寡核苷酸經鞘內投予。
本發明亦提供如所述之本發明之反義寡核苷酸或本發明之醫藥組成物用於製備藥物之用途，其中該藥物呈鞘內投予之劑型。
本發明亦提供如所述之本發明之反義寡核苷酸或本發明之醫藥組成物用於製備藥物之用途，其中該藥物呈腦室內投予之劑型。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸、反義寡核苷酸結合物或醫藥組成物用以與另一治療劑進行組合治療。
序列表
隨本申請呈送的序列表藉由引用方式併入本文。如果序列表與說明書或圖式不一致，則說明書 (包括圖式) 中揭露之資訊應視為正確。
HELM 符號
本發明之反義寡核苷酸 (化合物) 及本發明之反義寡核苷酸結合物 (結合物) 在本文中使用大分子分層編輯語言 (HELM) 符號進行描述。
HELM 為一種設計用於描繪大分子之結構的符號格式。HELM 符號之完整細節可見於 www.pistoiaalliance.org/helm-tools/，Zhang 等人 J. Chem. Inf.Model.2012, 52, 2796-2806 (其最初描述了 HELM 符號) 以及 Milton 等人 J. Chem Inf.Model.2017, 57, 1233-1239 (其描述 HELM 2.0 版本) 中。
簡而言之，大分子經描繪為「HELM 串」，其經劃分成部分。第一部分列出包含於大分子中的分子。第二部分列出大分子內分子之間的連接。一個或多個貨幣符號 $ 標記 HELM 串之一部分之結束。
本發明之化合物由 HELM 串表示，該串由定義寡核苷酸的單個第一部分組成。
本發明之結合物由 HELM 串表示，該串由兩個部分組成：第一部分，其定義寡核苷酸 (包括 5' CA 二核苷酸連接子) 及結合物部分；以及第二部分，其定義寡核苷酸與結合物部分之間的連接。第三、第四及第五部分 (其可在 HELM 串中用於更複雜的大分子) 不用於本文的 HELM 串。
HELM 串之第一部分中列出的各分子均被給予識別符 (例如，「RNA1」表示核酸，「PEPTIDE1」表示胺基酸序列，「CHEM1」表示化學結構)，且由緊跟在識別符之後的大括弧 { } 中之符號來定義分子之結構。用於定義本發明之化合物及結合物的 HELM 串之第一部分中的大括弧 {} 中各分子之結構的 HELM 符號為如下： [LR](G) 為 β-D-氧-LNA 鳥嘌呤核苷， [LR](T) 為 β-D-氧-LNA 胸腺嘧啶核苷， [LR](A) 為 β-D-氧-LNA 腺嘌呤核苷， [LR]([5meC]) 為 β-D-氧-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR](G) 為 DNA 鳥嘌呤核苷， [dR](T) 為 DNA 胸腺嘧啶核苷， [dR](A) 為 DNA 腺嘌呤核苷， [dR]([C]) 為 DNA 胞嘧啶核苷, [mR](G) 為 2'-O-甲基 RNA 鳥嘌呤核苷， [mR](U) 為 2'-O-甲基 RNA 尿嘧啶核苷， [mR](A) 為 2'-O-甲基 RNA 腺嘌呤核苷， [mR]([C]) 為 2'-O-甲基 RNA 胞嘧啶核苷， [sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 為二硫代磷酸酯核苷間鍵結， [MOE](G) 為 2’-MOE RNA 鳥嘌呤核苷， [MOE](T) 為 2'- MOE RNA 胸腺嘧啶核苷， [MOE](A) 為 2'- MOE thyl RNA 腺嘌呤核苷， [MOE]([5meC]) 為 2'- MOE RNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR]([PPG]) 為 DNA 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核苷， [P] 為磷酸二酯核苷間鍵結, .用於標示核苷，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
如上所述，在本發明之上下文中，第二部分僅用於表示本發明之結合物的 HELM 串中。第二部分列出第一部分中列出的分子之間的連接。藉由列出分子之識別符來定義各對經連接之分子，且隨後定義該等分子之間的接附點 (即分子之間存在共價鍵的點)。
在表示本發明之結合物的 HELM 串中，存在單一連接 (在結合物部分與寡核苷酸之間)。此單一連接在本文的所有 HELM 串中表示如下： CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1。
這表明結合物部分 (CHEM1) 藉由 CHEM1 (其如圖 8 所描述為整個結合物部分) 之第一單體之 R2 接附點 (由「1:R2」表示) 與 RNA1 之第一單體之 R1 接附點 (由「1:R1」表示) 之間的共價鍵接附至寡核苷酸 (RNA1)。
HELM 符號之實例
例如，CMP ID NO 1_1 由下列 HELM 串 (如表 4 所描繪) 表示： RNA1{[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
此 HELM 串由單個部分組成，列出 CMP ID NO 1_1 之寡核苷酸。初始「RNA1」表示分子為核酸 (寡核苷酸)。寡核苷酸之結構係在 RNA1 之後的大括弧 {} 中使用 HELM 符號來表示。「$$$$」標記該部分之結尾及整個 HELM 串之結尾。「V2.0」表示使用 HELM 2.0 版本。
作為另一實例，CNJ ID NO 1_1 由下列 HELM 串 (如表 5 所描繪) 表示： CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
此 HELM 串由兩個部分組成。第一部分列出結合物部分 (其具有識別符 CHEM1) 及寡核苷酸 (識別符 RNA1)，兩者為組成 CNJ ID NO 1_1 之反義寡核苷酸結合物的兩個分子。結合物部分定義於緊跟在 CHEM1 之後的大括弧 {} 中，且寡核苷酸 (包括 CA 二核苷酸連接子) 定義於 RNA1 之後的大括弧 {} 中。「$」標記第一部分之結尾。第二部分定義 CHEM1 及 RNA1 如何相互連接。「CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1」表示結合物部分 (1:R2) 之 R2 接附點接附至寡核苷酸之第一單體之 R1 接附點 (在這種情況下，為磷酸酯基團 [P])。「$$$」標記第二部分之結尾及整個 HELM 串之結尾。「V2.0」同樣表示使用 HELM 2.0 版本。
經簡化之 HELM 符號
本文亦使用經簡化之 HELM 符號以比典型 HELM 串更易讀之格式來描繪本發明之化合物及結合物。在此經簡化之符號中，省略第二部分 (列出分子之間的連接)。在本文描繪本發明的結合物的每個 HELM 串中，結合物部分與寡核苷酸之間的連接為結合物部分與所描繪的寡核苷酸之 5' 核苷之間的磷酸二酯鍵。在經簡化之 HELM 符號中，亦省略「CHEM1」及「RNA1」識別符及相關的大括弧 {}、部分結尾 $ 及 HELM 版本號。
例如，CMP ID NO 1_1 在本文中以經簡化之 HELM 符號表示如下： [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])
例如，CNJ ID NO 1_1 在本文中以經簡化之 HELM 符號表示如下： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])
在本文所有經簡化之 HELM 串中，[5gn2c6]P. 表示如圖 8 中所描繪之結合物部分，其藉由磷酸二酯鍵接附至由 HELM 串之其餘部分表示的寡核苷酸。
應當理解，經簡化之 HELM 串表示與對應的完整 HELM 串相同的分子。因此，針對給定化合物或結合物的經簡化 HELM 串可與針對該化合物或結合物的完整 HELM 串互換 (如本文表 4 及 5 中所描繪)。
上述說明書中所提及之所有出版物皆以引用方式併入本文中。本發明之所闡述方法及系統之各種修改及變化為熟習此項技術者所明瞭，其並不背離本發明之範圍及精神。儘管已結合具體較佳實施例闡述了本發明，但應理解，所主張之本發明不應過度地限於該等具體實施例。實際上，熟習分子生物學、生物化學、細胞生物學、病毒學或相關領域者所明瞭之對於用於實施本發明之所闡述模式之各種修改皆意欲屬下列申請專利範圍的範圍內。
實例
實例 1- 反義寡核苷酸序列、化合物及結合物
合成 68 種靶向 A1CF mRNA 的反義寡核苷酸 (化合物)。亦合成該等 68 種反義寡核苷酸之結合物形式，其中胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺) 結合物部分 (如圖 8 所描繪) 經由 CA 二核苷酸連接子共價接附至各反義寡核苷酸之 5' 端。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。本發明之反義寡核苷酸及結合物可藉由此項技術中已知的任何此類方法合成。以下就可採用的合成方式加以說明。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。
在 Mermade 192 上，以 1 μmol 刻度，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，以氨水於 60℃ 處理 5 至 16 小時，將寡核苷酸自固相支持物上裂解。藉由逆相 HPLC (RP-HPLC)、離子交換層析或藉由固相萃取來進行寡核苷酸之純化，之後以 UPLC 進行特性分析，再用 ESI-MS 進一步確認分子質量。
寡核苷酸的延長：
使用 5’-O-DMT-保護之醯胺在乙腈中的 0.1 M 溶液以及 DCI (4,5–二氰基咪唑) 的乙腈 (0.25 M) 溶液做為活化劑，進行 β-氰基乙基-亞磷醯胺 (DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf) 或 LNA-T) 之偶合。於最終循環時，可使用具有所需修飾的亞磷醯胺，所需修飾例如用以連附結合基團的 C6 連接子，或結合基團本身。為導入硫代磷酸酯鍵結，使用氫化黃原素 (0.01 莫耳於乙腈/吡啶 9:1) 執行硫醇化處理。可利用 0.02 莫耳的碘於 THF/吡啶/水 7:2:1 導入磷酸二酯鍵結。其餘試劑為通常用於寡核苷酸合成者。
可於固相合成的最後循環使用經商購取得的 C6 胺基連接子亞磷醯胺來進行後固相合成接合，在脫保護及自撐體裂解後，便可分離出胺基連結脫保護寡核苷酸。接著使用標準合成方法，透過官能基團的活化來導入結合物。
以 RP-HPLC 純化：
使用製備型 RP-HPLC 在 Phenomenex Jupiter® C18 10 µm 150x10 mm 管柱上對粗產化合物進行純化。使用 0.1 莫耳 pH 為 8 的乙酸銨及乙腈為緩衝液，流速為 5 mL/min。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。
縮寫：DCI：      4,5-二氰基咪唑 DCM：   二氯甲烷 DMF：    二甲基甲醯胺 DMT：    4,4’-二甲氧三苯甲基 THF：     四氫呋喃 Bz：        苯甲醯基 Ibu：       異丁醯基 RP-HPLC：  逆相高效液相層析
序列、化合物與結合物表
下面的表 3 顯示反義寡核苷酸 (ASO) 之序列以及其中之糖部分及核苷間鍵結之模式，且參考 A1CF mRNA 中之對應標靶序列。表 3 中使用的代碼為如下： 核鹼基之代碼：A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，E = 5-甲基胞嘧啶，F = 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤，G = 鳥嘌呤，T = 胸腺嘧啶，U = 尿嘧啶 糖之代碼：D = DNA，L = LNA，M = 2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)，O = 2'-O-甲基-RNA 核苷間鍵結之代碼：S = 硫代磷酸酯，2 = 二硫代磷酸酯
下面的表 4 表示使用 HELM 串的化合物。同樣，下面的表 5 表示使用 HELM 串的結合物。有關如何讀取 HELM 串的細節，參見 www.pistoiaalliance.org/helm-tools/及 Zhang 等人 J. Chem. Inf.Model.2012, 52, 2796-2806。
HELM 註解鍵： RNA1 為化合物或結合物之寡核苷酸部分之識別符；寡核苷酸定義於第一「RNA1」例子之後的大括弧 {} 中；各結合物串中的第二「RNA1」例子定義寡核苷酸與結合物部分之間的連接之位置， CHEM1 為結合物之結合物部分之識別符；結合物部分定義於第一「CHEM1」例子之後的大括弧 {} 中；各結合物串中的第二「CHEM1」例子定義寡核苷酸與結合物部分之間的連接之位置， 一個或多個 $ 標記 HELM 串之一部分之結尾；HELM 串之第一部分定義寡核苷酸序列 (包括糖部分及核苷間鍵結)；第二部分 (僅存在於結合物 HELM 串中) 定義寡核苷酸與結合物部分之間的連接之位置， 「V2.0」表示使用 HELM 2.0 版本， [LR](G) 為 β-D-氧-LNA 鳥嘌呤核苷， [LR](T) 為 β-D-氧-LNA 胸腺嘧啶核苷， [LR](A) 為 β-D-氧-LNA 腺嘌呤核苷， [LR]([5meC]) 為 β-D-氧-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR](G) 為 DNA 鳥嘌呤核苷， [dR](T) 為 DNA 胸腺嘧啶核苷， [dR](A) 為 DNA 腺嘌呤核苷， [dR]([C]) 為 DNA 胞嘧啶核苷, [mR](G) 為 2'-O-甲基 RNA 鳥嘌呤核苷， [mR](U) 為 2'-O-甲基 RNA 尿嘧啶核苷， [mR](A) 為 2'-O-甲基 RNA 腺嘌呤核苷， [mR]([C]) 為 2'-O-甲基 RNA 胞嘧啶核苷， [sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 為二硫代磷酸酯核苷間鍵結， [MOE](G) 為 2’-MOE RNA 鳥嘌呤核苷， [MOE](T) 為 2'- MOE RNA 胸腺嘧啶核苷， [MOE](A) 為 2'- MOE thyl RNA 腺嘌呤核苷， [MOE]([5meC]) 為 2'- MOE RNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR]([PPG]) 為 DNA 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核苷， [P] 為磷酸二酯核苷間鍵結， .用於標示核苷，且 [5gn2c6] 為胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺) 部分，如圖 8 所示。
表 5 中列出的本發明之結合物中之各結合物均由對應於所示 CMP ID NO 的 ASO 組成，該 ASO 在其 5' 端經由二核苷酸 (CA) 連接子共價接附至如圖 8 所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺) 部分，其中二核苷酸連接子之核苷為 DNA 核苷，該等核苷經由磷酸二酯核苷間鍵結彼此連接、連接至 ASO 以及連接至結合物。
表 3- 序列及對應標靶序列
ASO SEQ ID NO ASO 核鹼基序列 ASO 糖序列 ASO 核苷間鍵結 標靶 SEQ ID NO A1CF 基因中之位置 (SEQ ID NO 45)
1 AGGCATTATAGGTTTTTE LLDDLDDDDDDDDDDLLL SSSSSSSSSSSSSSSSS 31 6953-6970
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLDOLDDDDDDDDDDDOLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
3 GGACATGTTAATTTTACTT LLODDDLDDDDDDDDDDLL SSSSSSSSSSSSSSSSS2 33 16970-16988
4 TGAACTTGTTATATACETG LLLDDDDDDDDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSS22 34 38053-38071
4 TGAACTTGTTATATACETG LLLODDDDDDDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 34 38053-38071
5 TAGAGTTTTGTGTGTET LLDDLDDDDDDDDDDMM 22SSSSSSSSSSSSSS 35 78973-78989
5 TAGAGTTTTGTGTGTET LLDDLDDDDDDDDDDMM 2SSSSSSSSSSSSSSS 35 78973-78989
6 GEATTATAGGTTTTTET LLDDDDDDDDDDDLLLL SSSSSSSSSSSSSSSS 36 6952-6968
7 GGCATTATAGGTTTTTE MLDLDDDDDDDDDLMMM SSSSSSSSSSSSSSSS 37 6953-6969
7 GGCATTATAGGTTTTTE LLDLDDDDODDDDDLLL SSSSSSSSSSSSSSSS 37 6953-6969
8 GGEATTATAGGTTTTTE MMMLDDDDODDDDLLLM SSS2SSSSSSSSS222 37 6953-6969
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLDOLDDDDDDDDDDDDLL 22SSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
9 TGGACAUGTTAATTTTAE LLDLDDODDLDDDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 38 16972-16989
10 GGACATGUTAATTTTACTT LLDDDDLODODDDDDDDLL 22SSSSSSSSSSSSSSS2 33 16970-16988
11 GTTTTAAGATTGTGGTGTTT LLLDDODDDDDDDDDDDLLL SSSSSSSSSSSSSSSSSS2 39 26358-26377
4 TGAACTTGTTATATACETG LLLDDDDDDDDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 34 38053-38071
12 TAGAGTTTUGTGTGTET LLDDLDDDODDDDDDMM 22SSSSSSSSSSSSSS 35 78973-78989
5 TAGAGTTTTGTGTGTET MMMMLDDDDDDDDDDLM SSSS2SSSSSSSSSS2 35 78973-78989
13 TAGAGTTTTGTGUGTET MMMMLDDDDDDDODDLM SSSS2SSSSSSSSSS2 35 78973-78989
14 ATAGAFTTTTGTGTGTE LLLLDDDDDDDDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 40 78974-78990
15 AAAAFTTTCTCAGATAGGE LLLDDDDDDDDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
16 AAAAGTTTCTCAFATAGGE LLLDDDDDDDDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
16 AAAAGTTTCTCAFATAGGE MLLDDDDDDDDDDDDDLLM S2SSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
16 AAAAGTTTCTCAFATAGGE MLLDDDDDDDDDDDDDLLM S2SSSSSSSSSSSSSS22 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLDOLDDDDDDDDDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLDOLDDDDDDDDDDDOLL 22SSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLLDDDDDDDDODDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LMMDDDDDDDDODDDDLLM 2SSSSSSSSSSSSSSS22 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLLDDDDDDDODDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE MMLDDDDDDDODDDDDLLM SS2SSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE MLLDDDDDDDDODDDDLLM SSSSSSSSSSSSSSSSSS 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE LLLDDDDDODDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE MLLDDDDDODDDDDDDLLM SSSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
2 AAAAGTTTCTCAGATAGGE MLLDDDDDDDDDDDDOLLM S2SSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
17 AAAAGTTUCTCAGATAGGE MMLDDDDODDDDDDDDLLM SSSSSSSSSSSSSSSSS2 32 2181-2199
18 AGGCATTATAGGUTTTTE LLDDLDDDDDDDODDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 31 6953-6970
19 AGGCAUTATAGGTTTTTE LLDDLODDDDDDDDDLLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 31 6953-6970
20 GEATTATAGGTTTTTCTE LLDDDDDDDDDLDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
20 GEATTATAGGTTTTTCTE LLODDDDDDDDLDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
20 GEATTATAGGTTTTTCTE LLDDDDDODDDLDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
20 GEATTATAGGTTTTTCTE LLDDDDDDODDLDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
20 GEATTATAGGTTTTTCTE LLDDDDDDDDDLDDDDLM 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
20 GEATTATAGGTTTTTCTE LLDDDDDDDODLDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLLDDDDDDDDDDLDLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLLDDDDODDDDDLDLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLLDDDDDODDDDLDLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLODDDDDDDDDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLDDDDDODDDDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLDDDDDDODDDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET LLDDDDDDDODDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET MLDDDDDDDDDDDLLLM S2SSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET MLDDDDDDDDDDDLLMM S2SSSSSSSSSSSS2S 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET MLDDDDDDDDDDDLLLM S2SSSSSSSSSSSS22 36 6952-6968
6 GEATTATAGGTTTTTET MLDDDDDDDDDDDLLMM S2SSSSSSSSSSS22S 36 6952-6968
21 GEATTATAGGTTTTUCTE LLDDDDDDDDDLDDODLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
22 GEATTATAGGTTTUTCTE LLDDDDDDDDDLDODDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
23 GEATTATAGGTTUTTCTE LLDDDDDDDDDLODDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
24 GEATTATAGGTTUTTET LLDDDDDDDDDDOLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
25 GEATTATAGGTUTTTET LLLDDDDDDDDODLDLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
25 GEATTATAGGTUTTTET LLDDDDDDDDDODLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
26 GEATTATAGGUTTTTCTE LLDDDDDDDDOLDDDDLL 2SSSSSSSSSSSSSSS2 41 6951-6968
27 GEATTATAGGUTTTTET LLLDDDDDDDODDLDLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
27 GEATTATAGGUTTTTET LLDDDDDDDDODDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
28 GEATTAUAGGTTTTTET LLDDDDODDDDDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
29 GEATUATAGGTTTTTET LLDDODDDDDDDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
30 GEAUTATAGGTTTTTET LLDODDDDDDDDDLLLL 2SSSSSSSSSSSSSS2 36 6952-6968
11 GTTTTAAGATTGTGGTGTTT LLLDDDDODDDDDDDDDLLL SSSSSSSSSSSSSSSSSSS 39 26358-26377
11 GTTTTAAGATTGTGGTGTTT LLLDDDDODDDDDDDDDLLL SSSSSSSSSSSSSSSSSS2 39 26358-26377
表 4- 化合物 (CMP) 結構
SEQ ID NO CMP ID NO HELM 串 (5' 至 3')
1 1_1 RNA1{[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_1 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
3 3_1 RNA1{[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
4 4_1 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G)}$$$$V2.0
4 4_2 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G)}$$$$V2.0
5 5_1 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$$$$V2.0
5 5_2 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$$$$V2.0
6 6_1 RNA1{[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)}$$$$V2.0
7 7_1 RNA1{[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
7 7_2 RNA1{[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
8 8_1 RNA1{[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_2 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
9 9_1 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
10 10_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
11 11_1 RNA1{[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
4 4_3 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G)}$$$$V2.0
12 12_1 RNA1{[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$$$$V2.0
5 5_3 RNA1{[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T)}$$$$V2.0
13 13_1 RNA1{[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T)}$$$$V2.0
14 14_1 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
15 15_1 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
16 16_1 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
16 16_2 RNA1{[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
16 16_3 RNA1{[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_3 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_4 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_5 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_6 RNA1{[LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_7 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_8 RNA1{[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_9 RNA1{[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_10 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_11 RNA1{[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
2 2_12 RNA1{[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
17 17_1 RNA1{[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
18 18_1 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
19 19_1 RNA1{[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
20 20_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
20 20_2 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
20 20_3 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
20 20_4 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
20 20_5 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])}$$$$V2.0
20 20_6 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
6 6_2 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_3 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_4 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_5 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_6 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_7 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_8 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
6 6_9 RNA1{[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T)}$$$$V2.0
6 6_10 RNA1{[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$$$$V2.0
6 6_11 RNA1{[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T)}$$$$V2.0
6 6_12 RNA1{[MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$$$$V2.0
21 21_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
22 22_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
23 23_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
24 24_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
25 25_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
25 25_2 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
26 26_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$$$$V2.0
27 27_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
27 27_2 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
28 28_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
29 29_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
30 30_1 RNA1{[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
11 11_2 RNA1{[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)}$$$$V2.0
11 11_3 RNA1{[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$$$$V2.0
表 5- 結合物 (CNJ) 結構
SEQ ID NO CMP ID NO CNJ ID NO HELM 串 (5' 至 3')
6 6_1 6_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
1 1_1 1_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
7 7_1 7_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
7 7_2 7_2 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
2 2_2 2_2 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
2 2_1 2_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
3 3_1 3_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
9 9_1 9_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
8 8_1 8_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
4 4_1 4_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
4 4_2 4_2 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
12 12_1 12_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
5 5_3 5_3 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
5 5_1 5_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
13 13_1 13_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
14 14_1 14_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
10 10_1 10_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
11 11_1 11_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
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24 24_1 24_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
25 25_1 25_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
25 25_2 25_2 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
26 26_1 26_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
27 27_1 27_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
27 27_2 27_2 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
28 28_1 28_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
29 29_1 29_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
30 30_1 30_1 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
11 11_2 11_2 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
11 11_3 11_3 CHEM1{[5gn2c6]}|RNA1{P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)}$CHEM1,RNA1,1:R2-1:R1$$$V2.0
實例 2-A1CF mRNA 敲低
使用反義寡核苷酸 (ASO) 在 HepaRG 細胞 (一種肝細胞株) 中抑制 A1CF mRNA 表現。使用定量 PCR 確定對 A1CF mRNA 之量的影響。
表 6- 用於 A1CF 敲低的材料
材料 來源 種類編號 /ID
HepaRG 細胞 羅氏 RNCB RNCB ID：CL007104 標本：CLHO00141
HepaRG 生長培養基： - William's E 培養基 - 添加劑 - 1x Glutamax    - Sigma - Biopredic - Gibco    - 4128 - ADD710c - 35050-38
HepaRG diff 培養基： - William's E 培養基 - 帶青黴素/鏈黴素之 +Diff 培養基補充劑 - DMSO, 1% (v/v) GlutaMAX-I    - Sigma - Biopredics    - 4128 - ADD720
PBS Gibco #14190-094
胰蛋白酶-EDTA Sigma #T4049
96-孔 Nunc 盤 (Nunclon delta) (96 孔細胞培養盤) Thermo Scientific 167008
帶條碼之 96 孔寡核苷酸盤 Eppendorf 0030609204
Buffer RLT (細胞裂解緩衝液) Qiagen 79216
70% 乙醇 於 RICC 製備 -
RNeasy 96 盤 (過濾盤) Qiagen 74182
S-block (接收盤) Qiagen 19585
緩衝液 RW1 (第一洗滌緩衝液) Qiagen 74182
緩衝液 RPE (第二及第三洗滌緩衝液) Qiagen 74182
96 孔 PCR 盤 (洗脫盤) Thermo Scientific AB0900
無 RNase 的水 Qiagen 74182
封盤機 HJ Bioanalytik -
Airpore 膠帶 (密封膠帶) Qiagen 19571
RNA 稀釋盤 Thermo Scientific #AB0900
qScript™ XLT 一步式 RT-qPCR ToughMix®，低 ROX™ (測定緩衝液) Quanta Bioscience 95134-500
A1CF (目標基因 qPCR 測定 - 探針 1FAM，比率 2) IDT Hs.PT.58.26619649
POLR2A (內源性對照 qPCR 測定HEX，比率 2) IDT Hs.PT.39a.19639531
MicroAmp 光學 384 孔盤 (qPCR 盤) Applied Biosystems 4309849
MicroAmp 光學黏合膜 Applied Biosystems 4311971
Viia7 或 Quantstudio 7 (qPCR 機) Thermo Scientific -
HepaRG 細胞培養
將 HepaRG 細胞在含 5% CO 2的加濕環境中於 37℃ 在完全 HepaRG 生長培養基中培養，該培養基由 William's E 培養基 (Sigma)、生長培養基補充劑 (Biopredics，Cat# ADD710)、1% (v/v) GlutaMAX-I 組成。
為啟動分化，將 HepaRG 細胞在完全 HepaRG 生長培養基中在 T175 燒瓶中生長兩週 (在 1:5 分裂後)，直至該等細胞完全融合。隨後將培養基更換為含有 0.9% (v/v) DMSO 的 50% 完全 HepaRG 生長培養基 + 50% HepaRG diff 培養基，培養 3 天，並隨後更換為完全 HepaRG 生長培養基 + 1.8% (v/v) DMSO。細胞需要在分化培養基 (含 0.9-1.8% DMSO) 中分化 2 至 3 週，每週更新培養基 2 至 3 次。經分化之 HepaRG 細胞 (dHepaRG) 顯示由單層膽管樣細胞包圍的肝細胞樣細胞島。
在完全 HepaRG diff 培養基中，將經分化之 HepaRG 細胞以每孔 80,000 個細胞接種至膠原蛋白 I 塗覆之 96 孔盤中。在 ASO 處理前平盤培養後大約 4 至 6 天，令細胞在 96 孔盤中恢復其分化表型。一般而言，一個 T175 培養瓶之經分化之 HepaRG 細胞含有足夠的細胞用於以 80,000 個細胞/孔接種的 (2 至 4 個) 96 孔盤。
將細胞培養盤與 ASO 一起孵育 5 天，並隨後採集並針對 RNA 萃取進行處理。
RNA 萃取
藉由移液從培養孔去除細胞培養基，然後使用下列方案從細胞純化 RNA： 1.向微孔盤之各孔加入 125 µL 緩衝液 RLT。來回劇烈搖動 10 秒。 2.向各微孔盤加入 1 體積 (125 μL) 之 70% 乙醇並混合均勻。 3.將 RNeasy® 96 盤放在 S-Block 之頂部，並將來自步驟 2 的樣品施加至 RNeasy 96 盤之孔中。 3.用 airpore 膠帶密封該盤並於室溫以 6000 rpm (約 5300 x g) 離心 5 分鐘。丟棄流過物。 4.向 RNeasy® 96 盤之各孔加入 800 µL 之緩衝液 RW1。用 airpore 膠帶密封該盤並以 6000 rpm 離心 5 分鐘。丟棄流過物並用乾淨的 S-Block 替換。 5.向 RNeasy® 96 盤之各孔加入 800 µL 之緩衝液 RPE。用 airpore 膠帶密封該盤並於室溫以 6000 rpm 離心 5 分鐘。丟棄流過物。 6.向 RNeasy® 96 盤之各孔加入另外 800 µL 之緩衝液 RPE。用 airpore 膠帶密封該盤並於室溫以 6000 rpm 離心 5 分鐘。丟棄流過物並用乾淨的 S-Block 替換。 7.用 airpore 膠帶密封該盤並以 6000 rpm 將 RNeasy® 96 盤離心額外的 10 分鐘。 8.為洗脫 RNA，向各孔加入 100 μL 之無 RNase 的水。加入水之後立即將 PCR 96 孔盤放在 S-Block 上，並將過濾盤放回 PCR 盤之頂部。於室溫孵育 2 分鐘。隨後用 airpore 膠帶密封該盤並於室溫以 6000 rpm 離心 5 分鐘。丟棄過濾盤並密封 PCR 盤。
將經純化之 RNA 儲存於 - 80℃ 直至使用。
qPCR 測定
將經純化之 RNA 於 90℃ 熱休克 40 秒以熔化 RNA:ASO 雙股螺旋，直接移至冰中並在使用前旋轉沉降。
將 qPCR 標準曲線作為性能對照包括在內。將來自兩個 PBS 孔的經純化之 RNA 在無 RNase 的水中稀釋 5 倍，並藉由在無 RNase 的水中連續稀釋從該材料產生稀釋系列。
使用以下方案實施 qPCR 測定： 1.對 384 孔 qPCR 盤之各孔準備以下預混物。 1 次反應 (10 uL) ：XLT 一步式混合物 5 uL GOI taqman 探針 (FAM) 0.5 uL 對照 taqman 探針 (VIC) 0.5 uL 由於 XLT 緩衝液係粘性的，因此在使用前徹底混合預混物。 2.在 384 盤中每孔加入 6 uL 預混物。 3.從 RNA 稀釋盤每孔加入 4 uL 之經稀釋之 RNA。密封 384 孔盤並震盪。在震盪橡膠與 384 盤之間使用盤或其他塑膠，以避免孔上出現深色橡膠。以最大速度將 qPCR 盤旋轉沉降 3 分鐘。 4.在 ViiA7 或 Quantstudio 7 qPCR 儀器上運行下列程式： 於 50℃ 持續 15 分鐘 於 95℃ 持續 3 分鐘 隨後為以下之 40 個循環： 於 95℃ 持續 5 秒 於 60℃ 持續 45 秒 針對所有步驟將溫度變化率設定為 1.9℃/sec，95 至 60 除外，即 1.6℃/sec
qPCR 資料分析
在 Quantstudio 7 軟體中捕捉 qPCR 資料並進行原始資料質量控制。 1.藉由 ΔΔ Ct 方法計算數量 (數量 = 2^(-Ct)*1000000000) 2.將數量標準化為在同一孔中運行的管家基因測定的計算數量。相對標靶數量 = 數量_標靶 / 數量_管家 3.藉由用同一盤上的所有經 PBS 處理之孔之均值相除，計算每個孔的 RNA 敲低。標準化標靶數量 = (相對標靶數量 / [均值] 相對標靶數量]_pbs_孔) * 100 4.對於濃度反應實驗，針對每種化合物，由 RNA 敲低值擬合一條曲線 (步驟 3 至 4)。使用 4 參數 S 形劑量反應模型擬合曲線。
最終資料顯示於下面的 表 7中，作為未處理 (PBS) 孔之百分比。
表 7-A1CF 敲低之結果ND = 未確定
SEQ ID NO CMP ID NO EC50 (μM) A1CF A1CF mRNA 剩餘 (%)
1 μM ASO 5 μM ASO
1 1_1 0.10358 19.72 1.69
2 2_1 0.17106 17.28 3.02
3 3_1 0.18750 36.91 7.20
4 4_1 0.21593 19.97 3.36
4 4_2 0.15548 21.60 2.11
5 5_1 0.20544 24.45 1.01
5 5_1 0.21824 30.57 2.39
6 6_1 0.09931 20.16 1.13
7 7_1 0.06919 30.59 2.28
7 7_2 0.06142 17.24 1.24
8 8_1 0.12850 4.42 0.55
2 2_2 0.20129 16.90 3.03
9 9_1 0.23145 30.34 9.36
10 10_1 0.18685 10.75 1.54
11 11_1 0.11215 28.79 4.51
4 4_3 0.15581 35.34 6.42
12 12_1 0.20495 25.92 2.41
5 5_3 0.23966 24.41 1.21
13 13_1 0.17192 30.21 1.25
14 14_1 0.23067 28.61 1.43
15 15_1 ND 14.63 1.47
16 16_1 ND 14.12 1.67
16 16_2 ND 22.00 3.05
16 16_3 ND 14.74 1.80
2 2_3 ND 25.70 3.24
2 2_4 ND 13.73 3.45
2 2_5 ND 15.90 1.67
2 2_6 ND 17.33 5.55
2 2_7 ND 12.88 1.63
2 2_8 ND 17.26 3.09
2 2_9 ND 25.20 4.10
2 2_10 ND 13.01 1.44
2 2_11 ND 20.78 3.64
2 2_12 ND 19.59 2.45
17 17_1 ND 23.10 3.99
18 18_1 ND 7.79 0.61
19 19_1 ND 11.77 0.86
20 20_1 ND 7.51 0.58
20 20_2 ND 8.79 0.48
20 20_3 ND 12.00 1.04
20 20_4 ND 14.23 2.41
20 20_5 ND 9.97 0.60
20 20_6 ND 16.13 3.22
6 6_2 ND 8.50 0.32
6 6_3 ND 12.05 0.70
6 6_4 ND 10.41 0.77
6 6_5 ND 5.11 0.14
6 6_6 ND 6.61 0.27
6 6_7 ND 8.99 0.65
6 6_8 ND 9.80 0.58
6 6_9 ND 9.07 0.33
6 6_10 ND 15.85 0.63
6 6_11 ND 5.04 0.19
6 6_12 ND 5.01 0.23
21 21_1 ND 6.93 0.51
22 22_1 ND 12.64 1.29
23 23_1 ND 7.82 0.54
24 24_1 ND 17.03 0.72
25 25_1 ND 11.31 0.52
25 25_2 ND 8.60 0.31
26 26_1 ND 12.49 1.03
27 27_1 ND 12.92 0.71
27 27_2 ND 9.07 0.49
28 28_1 ND 10.91 0.77
29 29_1 ND 15.88 2.34
30 30_1 ND 15.57 0.71
11 11_2 ND 43.11 10.36
11 11_3 ND 19.91 3.57
實例 3-ASO 於原代人類肝細胞中的效力及抗病毒功效
用靶向 A1CF mRNA 的 ASO 處理原代人類肝細胞 (PHH)。隨後使用 qPCR 來定量這些處理對 A1CF mRNA 表現、pgRNA 表現、HBV DNA 至上清液中之分泌及總細胞內 HBV DNA 的影響。還使用自動化西方墨點法來定量對 A1CF 蛋白含量的影響。
原代人類肝細胞 (PHH) 細胞培養
將從人源化小鼠 (uPA/SCID 小鼠) 採集的新鮮原代人類肝細胞 (PHH) 以 96 孔形式從 PhoenixBio Co.，Ltd (日本) 獲得且在改良肝細胞選殖生長培養基 (dHCGM) 中培養。dHCGM 為一種 DMEM 培養基，其含有 100 U/ml 青黴素、100 μg/ml 鏈黴素、20 mM Hepes、44 mM NaHCO3、15 μg/ml L-脯胺酸、0.25 μg/ml 胰島素、50 nM 地塞米松、5 ng/ml EGF、 0.1 mM Asc-2P、2% DMSO 及 10% FBS (Ishida 等人，2015)。將細胞於具有 5% CO2 之加濕環境中於 37℃ 培養。
在 4% PEG 之存在下用源自 HepG2.2.15 細胞培養基的 HBV GtD 感染 PHH 達 16 至 20 小時。次日去除病毒接種物，用 PBS 洗滌細胞 3 次，然後加入新鮮培養基。為實現 cccDNA 建立，在 HBV 感染後第 4 天開始以化合物處理（三重複），最終濃度為 25uM，每孔總體積為 120 ul。第 11 天及第 18 天重複相同的處理。在第 7、14 及 21 天更換培養基。對於 cccDNA 讀出，從感染後第 7 天開始直至採集當天，將細胞維持在補充有 10 nM 恩替卡韋 (entecavir) (ETV) 的培養基中。所有其他讀出均在不加入 ETV 的情況下進行。
第 25 天，採集上清液並於 -80℃ 儲存。利用 1xDPBS (Gibco，#14190250) 以 150 ul/孔洗滌細胞一次。對於 RNA 讀出，加入 200 ul/孔 MagNA Pure 96 外部裂解緩衝液 (Roche，#06374913001) 並將盤於 -80℃ 冷凍。對於 cccDNA 及細胞內 DNA 讀出，用 80 ul/孔 cccDNA SDS 裂解緩衝液 (50mM Tris pH8、5mM EDTA、無核酸酶的水中的 1% SDS) 來裂解細胞，隨後於 -80℃ 冰箱中冷凍至少 2 小時。對於蛋白讀出，用補充有完全蛋白酶抑制劑混合錠劑 (Sigma，#11697498001；每 25 ml 1 錠) 及 1 mM 苯甲基磺醯氟 (Roche，#10837091001) 的 100 ul/孔 RIPA 緩衝液 (ThermoFischer，#89901) 來裂解細胞，並於 -80℃ 冷凍。
A1CF mRNA 劑 pgRNA 定量 —RNA 萃取及 RT-qPCR
使用 MagNA Pure 機器人及 MagNA Pure 96 細胞 RNA 大體積套組 (Roche，#05467535001)，使用「細胞 RNA LV」方案根據製造商之方案從細胞萃取總 RNA，最終洗脫體積為 100 μl。使用 QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems)、TaqMan RNA-to-CT 一步式套組 (Applied Biosystems，#4392938) 及人類 GusB 內源性對照，藉由 qPCR 以技術性二重複方式對 A1CF mRNA 及 pgRNA 表現量定量。在 QuantStudio Cycler 上以 48℃ 運行 qPCR 15 分鐘，隨後於 95℃ 運行 10 分鐘，隨後於 95℃持續 15 秒以及於 60℃ 持續 1 分鐘進行 40 個循環，反應體積為 10 μl。使用比較週期閾值 2-ΔΔCt 方法分析 mRNA 表現，該方法針對參考基因 GusB 及感染 HBV 的未處理細胞進行標準化。在 GraphPad 中單獨使用各 Ct 值進行倍數變化計算 (未計算 dCT 計算之技術性 Ct 值之平均值)。隨後使用 Excel 藉由計算技術性二重複之值之平均值來計算各生物樣品之平均倍數變化。隨後由各生物學重複品之倍數變化，使用 excel 計算百分比、最終平均值、SD 及 N。用於 GusB mRNA、A1CF mRNA 及 pgRNA 定量的 TaqMan 引子列於下面的 表 8中。
表 8- 用於 GusB mRNA 、 A1CF mRNA 及 pgRNA 定量的引子
標靶 來源
A1CF ThermoFisher – 測定 ID：Hs00205840_m1
pgRNA ThermoFisher – 定制測定： 探針 FAM GAGGCAGGTCCCCTAGAAGA (SEQ ID NO 54) 正向 GGAGTGTGGATTCGCACTCCT (SEQ ID NO 55) 反向 AGATTGAGATCTTCTGCGAC (SEQ ID NO 56)
GusB ThermoFisher – 測定 ID：Hs00939627_m1
PHH 細胞中的相對 A1CF mRNA 及 pgRNA 表現量以相較於對照的百分比顯示於 表 9中，亦即，數值越低表示抑制越大。
表 9-PHH 細胞中的 A1CF mRNA 及 pgRNA 表現量
SEQ ID NO CNJ ID NO A1CF mRNA (%) pgRNA (%)
均值 SD N 均值 SD N
6 6_1 0.071 0.037 3 37.08 8.05 2
1 1_1 0.120 0.011 3 13.99 1.29 3
7 7_1 0.093 0.031 3 2.76 1.34 3
7 7_2 0.092 0.037 3 3.08 0.00 2
8 8_1 0.652 0.002 2 2.89 N/A 1
2 2_2 1.742 1.199 3 48.60 17.18 3
2 2_1 3.359 2.148 3 19.29 2.10 3
3 3_1 0.980 0.180 3 16.09 5.70 3
9 9_1 5.181 0.767 3 134.75 7.55 3
10 10_1 3.157 0.288 3 4.13 2.08 3
11 11_1 0.772 0.248 3 27.11 10.30 3
4 4_3 0.127 0.056 3 81.44 23.89 3
4 4_1 0.230 0.084 3 69.02 9.96 3
4 4_2 0.243 0.095 3 99.31 11.96 3
12 12_1 0.367 0.329 3 31.60 27.10 3
5 5_3 0.396 0.002 2 36.08 4.36 2
5 5_1 0.434 0.059 3 46.90 7.28 3
13 13_1 0.700 0.059 3 28.71 5.74 3
14 14_1 0.274 0.016 3 42.78 3.72 3
分泌型 HBV DNA 定量 — 上清液 DNA 萃取及 qPCR
使用「Viral NA Plasma ext lys SV 4.0」方案，以 MagNA Pure 96 DNA 及病毒 NA 小體積套組 (Roche，#06543588001) 從 MagNA Pure 機器人上的 25 uL 上清液萃取 DNA。
為進行 HBV DNA 之定量，使用 TaqMan 基因表現預混液（TaqMan Gene Expression Master Mix）及以下循環條件，以正向引子 CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO 57) (最終濃度 200 nM)、反向引子 AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO 58) (最終濃度 200 nM) 及探針 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ (SEQ ID NO 59) (最終濃度 100 nM) (IDT DNA) 擴增覆蓋核心區域的 99 個核苷酸片段：於 50℃持續 2 分鐘，於 95℃ 持續 10 分鐘，且於 95℃ 持續 15 秒以及於 60℃ 持續 1 分鐘 進行 40 個循環。所有 qPCR 反應均使用 QuantStudio 12K Flex 即時 PCR 系統 (Life Technologies) 進行。
使用針對感染 HBV 的未處理細胞標準化的比較循環閾值 2-ΔCt 方法來計算相對表現量。在 GraphPad 中單獨使用各 Ct 值進行倍數變化計算 (未計算 dCT 計算之技術性 Ct 值之平均值)。隨後使用 Excel 藉由計算技術性二重複之值之平均值來計算各生物樣品之平均倍數變化。隨後由各生物學重複品之倍數變化，使用 excel 計算百分比、最終平均值、SD 及 N。
用於分泌型 HBV DNA 定量的 TaqMan 引子列於下面的 表 10中。
表 10- 用於上清液 HBV 定量的引子
標靶 來源
HBV 核心 正向引子 CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO 57) 反向引子 AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO 58) 探針 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ (SEQ ID NO 59)
PHH 細胞中的分泌型 HBV DNA 含量以相較於對照的百分比顯示於 表 11中，亦即，數值越低表示抑制越大。
表 11- 相對分泌型 HBV DNA 含量
SEQ ID NO CNJ ID NO 分泌型 HBV DNA (%)
均值 SD N
6 6_1 32.51 4.29 3
1 1_1 5.63 0.68 3
7 7_1 3.93 0.87 3
7 7_2 8.85 1.35 3
8 8_1 2.85 0.26 3
2 2_2 109.32 17.39 3
2 2_1 58.94 33.92 3
3 3_1 21.07 5.33 3
9 9_1 178.96 17.77 3
10 10_1 9.18 3.00 3
11 11_1 18.80 4.46 3
4 4_3 89.06 10.62 3
4 4_1 93.54 6.33 3
4 4_3 111.12 10.90 3
12 12_1 46.26 6.30 3
5 5_3 51.21 18.24 3
5 5_1 83.29 8.91 3
13 13_1 33.11 5.83 3
14 14_1 69.61 3.28 3
細胞內總 HBV 定量 — 細胞 DNA 萃取及 qPCR
使用 ZR-96 Genomic DNA Clean & Concentrator-5 套組 (Zymo Research，#D4067) 來萃取細胞內 DNA。首先，向各經解凍之裂解物加入 1 uL 之蛋白酶 K (Ambion，#AM2546；20 mg/mL)，並將盤密封，且於 56℃ 孵育 30 分鐘。孵育之後，將裂解物與 240 ul ChIP DNA 結合緩衝液混合，並加載至安裝在收集盤上的 Zymo-Spin i-96-XL 盤上。隨後將盤以 3500xg 旋轉 5 分鐘，丟棄流過物，並向各孔加入 200 uL 之 DNA 洗滌緩衝液。隨後將盤再次以 3500xg 旋轉 5 分鐘，丟棄流過物。重複洗滌步驟一次，隨後將 Zymo-Spin I-96-XL 盤安裝在洗脫盤上，並向各孔中的基質直接加入 40 uL 之 DNA 洗脫緩衝液。將盤於室溫孵育 5 分鐘，隨後以 3500x g 旋轉 5 分鐘以洗脫 DNA。將 DNA 於 -20℃ 儲存或直接將其用於細胞內總 HBV DNA qPCR 中。在運行總 HBV DNA qPCR 之前，將 DNA 樣品用水進行 1:10 稀釋。使用 QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems)、TaqMan Fast Advanced 預混物 (Applied Biosystems，#4444557) 及人類 HBB 內源性對照，藉由 qPCR 以技術二重複方式對細胞內總 HBV DNA 表現量進行定量。以針對快速加熱塊的標準設定在 QuantStudio Cycler 上運行 qPCR (於 95℃ 持續 20 秒，隨後於 95℃持續 1 秒以及於 60℃ 持續 20 秒進行 40 個循環，反應體積為 10 ul)。
對於 HBB Ct 值，將閾值設定為 0.18。使用比較週期閾值 2-ΔΔCt 方法分析 DNA 表現量，該方法針對參考基因 HBB 及感染 HBV 的未處理細胞進行標準化。在 GraphPad 中單獨使用各 Ct 值進行倍數變化計算 (未計算 dCT 計算之技術性 Ct 值之平均值)。隨後使用 Excel 藉由計算技術性二重複之值之平均值來計算各生物樣品之平均倍數變化。隨後由各生物學重複品之倍數變化，使用 excel 計算百分比、最終平均值、SD 及 N。用於 HBB 及 總 HBV DNA 定量的 TaqMan 引子列於下面的 表 12中。
表 12- 用於總 HBV DNA 及 HBB 定量的引子
標靶 來源
總 HBV DNA ThermoFisher – 測定 ID：Pa03453406_s1
HBB ThermoFisher – 測定 ID：HBB Hs00758889_s1
PHH 細胞中的細胞內總 HBV DNA 表現量以相較於對照的百分比顯示於 表 13中，亦即，數值越低表示抑制越大。
表 13- 細胞內總 HBV DNA
SEQ ID NO CNJ ID NO 細胞內總 HBV DNA (%)
均值 SD N
6 6_1 41.35 10.57 3
1 1_1 23.06 4.47 3
7 7_1 43.05 2.98 3
7 7_2 36.80 11.16 3
8 8_1 29.64 12.58 3
2 2_2 69.93 14.26 3
2 2_1 35.34 5.33 3
3 3_1 33.07 5.72 3
9 9_1 96.81 13.27 3
10 10_1 80.67 27.70 3
11 11_1 24.26 7.21 3
4 4_3 125.87 7.51 3
4 4_1 104.62 15.89 3
4 4_3 92.86 36.32 3
12 12_1 106.90 31.03 3
5 5_3 99.44 8.86 3
5 5_1 92.29 15.87 3
13 13_1 57.43 3.65 3
14 14_1 94.93 19.91 3
A1CF 蛋白含量定量 — 自動化西方墨點法
根據製造商之說明，使用具有 12-230 kDa Jess 或 Wes 分離模組、8 x 25 毛細管柱 (Protein Simple，#SM-W004) 的 JESS 系統 (proteinsimple) 對 RIPA 蛋白裂解物中之 A1CF 含量定量。將蛋白裂解物解凍並藉由移液充分混合，隨後將 1.5 ul 之 5x 螢光樣品緩衝液與 5 ul 蛋白溶胞產物混合。將樣品於 95℃ 加熱 5 分鐘並冷卻至 4℃，隨後將樣品旋轉沉降以進行加載。初級抗體混合物由無乳抗體稀釋劑 (Protein Simple，# 043-524) 中的抗 A1CF (abcam, #ab231614) 之 1:25 稀釋液及抗 ACTB (Sigma，#A1978-200 ul) 之 1:50 稀釋液組成。二級抗體混合物由抗兔二級抗體 (Protein Simple，#042-206) 中以 20x 抗小鼠 NIR 抗體 (Protein Simple，#043-821、1:20) 之 1:20 稀釋液組成。以 60 分鐘之初級抗體孵育時間使用化學發光及螢光讀出加載並運行。藉由針對各樣品將 A1CF 帶標準化為 ACTB 帶，及隨後將經處理對照標準化為未處理對照，計算相對 A1CF 表現。
對於所有經 A1CF ASO 處理之樣品，A1CF 蛋白含量均低於偵測極限，因此無法計算抑制 %。
上清液中的 HBsAg 及 HBeAg 含量
對 PHH 細胞之上清液中的 HBsAg 及 HBeAg 含量藉由以下進行偵測：用 1xDPBS 以 1:50 稀釋上清液，及隨後根據製造商之說明使用化學發光免疫測定 (CLIA) 套組 (DiaSino® #DS1877032012V4、#DS1877012012V4) 對抗原定量。在 Envision (Perkin Elmer) 上偵測發光，並使用 Excel 減去背景值並基於設定為 100% 的無藥物對照計算抑制百分比。
PHH 細胞之上清液中的相對 HBsAg 及 HBeAg 表現量以對照之剩餘 % 顯示於表 14 中，亦即，數值越低抑制作用越大。
表 14-PHH 細胞之上清液中的 HBsAg 及 HBeAg 含量BDL = 低於偵測極限
CNJ ID NO HBsAg (%) HBeAg (%)
均值 SD N 均值 SD N
6_1 37.71 4.30 3 35.29 2.63 3
1_1 7.57 2.07 3 5.21 3.52 3
7_1 0.46 0.16 3 2.56 2.44 3
7_2 0.45 0.49 3 4.45 4.71 3
8_1 0.46 0.89 3 0.60 2.84 3
2_2 69.79 2.50 3 52.43 2.37 3
2_1 28.10 13.29 3 14.40 7.73 3
3_1 17.22 14.53 3 7.17 4.42 3
9_1 108.38 3.92 3 92.16 4.13 3
10_1 *BDL 0.23 3 2.24 1.18 3
11_1 10.35 4.02 3 6.39 3.60 3
4_3 81.75 4.59 3 57.57 2.58 3
4_1 82.90 6.38 3 56.86 4.76 3
4_3 81.25 2.70 3 60.92 9.81 3
12_1 68.26 7.47 3 32.68 2.90 3
5_3 66.47 1.39 3 20.03 5.48 3
5_1 59.41 9.64 3 28.97 4.75 3
13_1 43.45 12.21 3 11.50 2.79 3
14_1 68.55 32.06 3 45.19 19.70 3
實例 4- 活體外 安全性測定
使用 活體外測定 (亦即，凋亡蛋白酶活化測定、肝毒性測定、腎毒性測定及免疫毒性測定) 來評定 ASO 之安全性。這些測定之結果以綜合安全性評分錶示。
凋亡蛋白酶活化測定
HepG2 細胞係於大約70% 匯合在補充有以 10% 熱去活化之胎牛血清、具有 GlutaMax (Gibco #41090) 的 MEM 培養基中培養。用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (Gibco #25200056) 分離細胞，並以 1 x 10 4個細胞/孔之密度接種於黑色透明 96 孔盤 (Corning #3904, NY, USA) 中。使用溶解在 Opti-MEM (Gibco #31985) 中的 100 nM 寡核苷酸，用 Lipofectamine 2000 (Life Technologies #11668019) 瞬時轉染接種後 24 小時的 HepG2 細胞。使用 Caspase-Glo® 3/7 測定 (Promega Corporation, Madison WI, USA) 確定 Caspase-3/7 活性。將重構之 Caspase-Glo® 3/7 試劑添加到轉染後 24 小時的細胞中，孵育 60 分鐘，將細胞裂解物轉移到不透明的 96 孔平盤 (Corning #3600, NY, USA) 中，然後根據製造商的說明，在 Enspire 多模式平盤分析儀 (Perkin Elmer) 上測定發光。
資料分析：各測定盤含有一個毒性 SSO 對照及兩個安全 SSO 對照；在將資料計算為載體對照的百分比 [%V] 的同時，亦計算實際的測定窗口。這基於安全及毒性對照 SSO，這實現確定與測定窗口相關的凋亡蛋白酶 3/7 蛋白酶活性之變化 [% AW]
肝毒性測定
將經冷凍保存之人類肝細胞 (BioIVT -F00995，Lot QQE) 或小鼠肝細胞 (KalyCell) 解凍，並且小鼠肝細胞以 25.000 個細胞/孔及人類肝細胞以 40.000 個細胞/孔的密度接種在膠原蛋白包被之 96 孔盤 (Becton Dickinson AG，Allschwil，瑞士) 上。在 ASO 處理之前，令細胞附著至盤達 4 小時。
將寡核苷酸溶解於 PBS 中，並在細胞培養基中製備 10x 儲備溶液。在沒有任何輔助/轉染的情況 (裸條件) 下，以對於小鼠肝細胞的最大濃度 30 µM 以及對於人類肝細胞的最大濃度 100 µM，向細胞加入 ASO。在進行細胞毒性 (LDH 及 ATP) 測定之前，將 ASO 留在細胞上 3 天 [參見參考文獻 1 及 2]。
腎毒性測定
從 Evercyte GmbH, Vienna, Austria 購得 RPTEC/TERT1 細胞。將細胞在補充有激素的 DMEM/F12 培養基中進行常規培養，生長因子包括 [2] 中所述的 10 ng/ml 重組人類 EGF，外加 2% FBS。將細胞以 18.000 個細胞/孔之密度接種在膠原蛋白塗覆之 96 孔盤中並培養 3 天。在開始用寡核苷酸處理的前一天，將培養基換為不含 FBS 的培養基並將細胞再孵育 24 小時。將 ASO 溶解於 PBS 中，並在不含 FBS 的培養基中製備 10x 儲備溶液。向細胞以 100 M 之最終濃度方式加入 ASO（三重複）。在孵育 3 天及 6 天後，在新鮮培養基中用化合物重複處理細胞兩次。在化合物處理 6 天之後採集細胞培養物上清液以對 EGF 消耗 (即留在培養基中的 EGF) 定量。在總共 9 天之化合物處理後測定細胞內 ATP 含量 [參見參考文獻 3]。
凋亡蛋白酶活化、肝毒性及腎毒性測定之讀出
LDH 測定-藉由根據製造商之方案使用細胞毒性偵測套組 (Roche 11644793001，Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim，德國) 及 EnSpire 多模式讀盤儀 (Perkin Elmer Schweiz AG, Schwerzenbach, Switzerland) 測量釋放至培養基中的 LDH 之量來測定細胞毒性量。各樣品以三重複方式進行測試。
培養基中之酶活性表示為經載體處理之細胞之上清液中總 LDH 活性之百分比。最後將資料歸一化至由各盤上的陰性及陽性對照 ASO 組成的測定窗口，以顯示測試項目之 % 測定窗口。
細胞內 ATP 含量-根據製造商之方案，使用 CellTiter-Glo® 發光細胞活力測定 (G9242，Promega Corporation，Madison WI，USA) 來測定細胞 ATP 含量。使用 Envision 讀盤儀 (Perkin Elmer Schweiz AG, Schwerzenbach, Switzerland) 來記錄發光。使用完全相同的試劑及處理條件由利用 ATP 生成的標準曲線計算 ATP 濃度。各樣品以三重複方式進行測試。ATP 含量之變化計算為 % 安全對照或 % 測定窗口，其由安全及毒性 ASO 對照生成。
EGF 測定-為分析可溶性 EGF，將冷凍細胞上清液在冰上解凍，在 PBS 中按 1:100 稀釋，並根據製造商之說明使用人類 EGF DuoSet ELISA (R&D #DY236-05) 及 DuoSet 輔助試劑套組 2 (R&D #DY008) 藉由 ELISA 進行分析。資料經報告為三重複孔之平均 EGF 濃度及標準偏差，並於載體 (PBS) 對照上經歸一化。當 100 µM 下的經歸一化之 EGF 值低於毒性對照之 5% 時，化合物係安全的。
免疫毒性測定 [ 參見參考文獻 4]
將來自三個獨立的健康供體的靜脈血液收集在噴有抗凝劑之真空採血管 (Sanquin Diagnostiek BV，msterdam NL) 中，並於室溫保存。由於單股寡核苷酸 (LNA) 之物理化學特性及針對補體級聯的完整性，必須使用水蛭素作為血液抗凝劑。收集後 3 小時內，向含有 5 μl 之待測項目的 96 孔盤之 U 型底部孔以三重複方式加入 195 μl 之新鮮全血。於最終濃度 50µM 分析測試項目。藉由將含有 PBS、穩定溶液及 TLR 激活劑 (R848、CpG 及 polyDC、InvivoGen) 的對照包括在內，評定血液細胞對先天免疫刺激的反應及內源性活化量。亦將用於補體刺激的內部對照 (補體活化劑，TECO medical 及 Zymosan，Sigma) 包括在內。
於 37℃ 以 5% CO2 孵育之後，藉由於 1800 g 離心 5 分鐘來分離細胞及血漿。45 分鐘後收集用於補體分析的血漿樣品，在穩定溶液中按 1:1 稀釋，並於 -70℃ 分裝冷凍直至分析。根據製造商之說明 (Human Complement Plus EIA 套組：  C3a 種類編號 A015，C5a 種類編號 A025，來自 Quidel TECOmedical AG, Sissach, Switzerland)，使用不同人類測定套組，藉由單獨的三明治 ELISA 測定分析物濃度。使用 Softmax Pro 軟體 v.5.2 在 Versamax 微孔盤 ELISA 讀取儀 (Bucher Biotec，Basel，Switzerland) 上分析各盤。
在經 6 小時收集的冷凍血漿樣品中，藉由多重 ELISA，使用人類可溶性蛋白 Flex 測定 (BD CBA 人類可溶性蛋白測定) 及 FCAP 陣列分析軟體來進行細胞激素濃度之測定。
對各濃度取三重複值之平均值，且針對各供體計算刺激指數 (SI，相對於陰性對照參照物 ASO)。使用針對 3 個供體之平均刺激指數對測試項目之免疫毒性潛力進行排名：SI 低於 2 的 ASO 視為具有低免疫毒性潛力。SI 介於 2 與 5 之間的測試項目 ASO 視為具有中等免疫毒性風險，而大於 5 的 SI 將 ASO 定性為具有高免疫毒性潛力。
最終安全性評分計算
在各種安全測定中評估的寡核苷酸的選擇標準是基於獲得的訊號的幅度和頻率。在個體 活體外安全性測定中獲得的訊號導致評分 (0 = 安全，0.5 = 臨界毒性，1 = 輕度毒性，2 = 中等毒性，且 3 = 重度毒性)，並總結為對於各序列的累積評分，實現化合物之客觀排名。訊號強度為針對 活體內毒性的風險測度，其基於使用活體內相關參考分子的測定之驗證。 參考文獻 1.    Sewing S. 等人 (2016) Establishment of a Predictive In Vitro Assay for Assessment of the Hepatotoxic Potential of Oligonucleotide Drugs. PLoS ONE 11(7): e0159431 2.    WO2017/067970 A1 活體外毒性篩查測定 (IN VITRO TOXICITY SCREENING ASSAY) PCT/EP2016/075060 Sabine Sewing, Adrian B. Roth, Annie Moisan, Cristina Bertinetti-Lapatki, Franziska Boess 3.    Moisan A.等人 (2017) Inhibition of EGF Uptake by Nephrotoxic Antisense Drugs In Vitro and Implications for Preclinical Safety Profiling. Molecular Therapy: Nucleic Acids 6, 89-105 4.    Sewing S. 等人 (2018) Assessing single-stranded oligonucleotide drug-induced effects in vitro reveals key risk factors for thrombocytopenia.PLoS ONE 12(11): e0187574
表 15- 活體外 安全性結果ND = 未確定
反義寡核苷酸 凋亡蛋白酶活化 肝毒性 免疫毒性 50 μM 腎毒性 總評分
CMP ID NO CNJ ID NO HepG2 100 nM 小鼠 30 μM 人類 100 μM 補體 細胞激素 人類 PTEC 100 μM
%AW 得分 LDH %AW ATP %AW 得分 LDH %AW ATP %AW 得分 得分 得分 ATP %AW EGF %AW 得分
1_1 1_1 5 0 39 0 1 17 5 0 0 0 95 -1 0 1
7_2 7_2 6 0 25 -5 0.5 15 15 0 0 1 91 1 0 1.5
2_1 2_1 10 0 24 10 0.5 6 17 0 0 1 107 0 0 1.5
4_3 4_3 12 0 17 1 0 11 29 1 0 1 108 2 0 2
5_1 5_1 4 0 21 -11 0.5 24 6 0.5 0 1 111 2 0 2
4_1 4_1 -1 0 20 -2 0 10 30 1 0 1 87 3 0 2
13_1 13_1 -7 0 14 2 0 8 9 0 0 2 94 3 0 2
3_1 3_1 9 0 33 8 1 24 15 0.5 0 0 97 12 1 2.5
4_2 4_2 -1 0 22 -2 0.5 12 27 1 0 1 99 0 0 2.5
6_1 6_1 -4 0 32 -5 1 29 29 1 0 1 92 -2 0 3
10_1 10_1 1 0 0 28 1 7 19 0 0 0 73 23 2 3
14_1 14_1 14 0 20 7 0 18 20 0.5 0 2 110 7 0.5 3
7_2 7_2 22 0.5 28 7 1 23 23 0.5 0 1 93 9 0.5 3.5
12_1 12_1 7 0 21 -6 0.5 24 28 1 0 2 107 1 0 3.5
5_3 5_3 -7 0 33 -2 1 5 22 0.5 1 1 97 3 0 3.5
8_1 8_1 -1 0 27 1 1 11 -2 0 1 2 103 -1 0 4
11_1 11_1 12 0 3 9 0 8 37 1 1 2 101 10 1 5
2_2 2_2 9 0 24 5 0.5 0 13 0 2 2 97 5 0.5 5
9_1 9_1 -6 0 15 8 0 22 39 1 2 2 101 11 1 6
5_2 5_2 8 0 21 -5 0.5 14 8 0 0 0 110 2 0 0.5
15_1 15_1 10 0 9 -8 0 15 56 2 ND ND 111 6 0.5 2.5
16_1 16_1 14 0 20 -5 0.5 16 39 1 ND ND 107 6 0.5 2.0
16_2 16_2 11 0 14 11 0 9 32 1 0 0 108 5 0.5 1.5
16_3 16_3 10 0 5 3 0 10 38 1 ND ND 108 3 0 1.0
2_3 2_3 7 0 11 -2 0 14 38 1 ND ND 106 5 0 1.0
2_4 2_4 4 0 12 -1 0 16 48 2 ND ND 105 4 0 2.0
2_5 2_5 8 0 20 8 0.5 11 39 1 ND ND 106 6 0.5 2.0
2_6 2_6 -6 0 8 7 0 5 47 2 ND ND 109 5 0 2.0
2_7 2_7 10 0 20 -12 0.5 21 40 1 ND ND 116 2 0 1.5
2_8 2_8 7 0 21 -13 0.5 15 38 1 ND ND 117 3 0 1.5
2_9 2_9 18 0 22 2 0.5 17 24 0.5 0 0 101 3 0 1.0
2_10 2_10 17 0 23 7 0.5 12 30 1 ND ND 106 4 0 1.5
2_11 2_11 13 0 22 -11 0.5 27 38 1 ND ND 109 2 0 1.5
2_12 2_12 19 0 25 -5 1 11 33 1 ND ND 115 3 0 2.0
17_1 17_1 7 0 16 4 0 16 26 1 0 0 109 2 0 1.0
18_1 18_1 14 0 23 6 0.5 12 21 0.5 0 0 114 3 0 1.0
19_1 19_1 11 0 16 -12 0 12 32 1 0 0 113 3 0 1.0
20_1 20_1 -7 0 22 -7 0.5 6 42 2 ND ND 101 4 0 2.5
20_2 20_2 -8 0 20 -14 0 -2 38 1 ND ND 102 3 0 1.0
20_3 20_3 -7 0 18 -5 0 -3 26 1 1 1 100 2 0 3.0
20_4 20_4 -4 0 0 -7 0 0 33 1 1 0 107 2 0 2.0
20_5 20_5 -8 0 17 -9 0 -3 41 2 ND ND 102 2 0 2.0
20_6 20_6 -4 0 16 -5 0 5 40 1 ND ND 104 2 0 1.0
6_2 6_2 -6 0 18 -6 0 3 52 2 ND ND 105 4 0 2.0
6_3 6_3 -3 0 8 -7 0 7 -26 0 0 0 115 2 0 0.0
6_4 6_4 -1 0 22 12 0.5 5 41 2 ND ND 108 4 0 2.5
6_5 6_5 -3 0 ND ND ND 9 40 1 ND ND 92 4 0 ND
6_6 6_6 -4 0 -1 13 1 9 45 2 ND ND 95 7 0.5 2.5
6_7 6_7 5 0 33 14 1 7 40 2 ND ND 103 3 0 3.0
6_8 6_8 -3 0 15 6 0 5 32 1 0 1 108 2 0 2.0
6_9 6_9 -5 0 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0 ND
6_10 6_10 -3 0 15 9 0 15 43 2 ND ND 104 3 0 2.0
6_11 6_11 -2 0 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0 ND
6_12 6_12 -5 0 8 16 0 19 51 2 ND ND 109 3 0 2.0
21_1 21_1 -7 0 17 -16 0 -6 -19 0 0 1 103 2 0 2.0
22_1 22_1 -6 0 14 -8 0 -2 -4 0 0 0 102 2 0 0.0
23_1 23_1 -6 0 19 -10 0 -11 13 0 0 0 102 2 0 0.0
24_1 24_1 4 0 22 -19 0.5 -11 12 0 0 0 87 6 0.5 1.0
25_1 25_1 -7 0 9 -16 0 -10 7 0 0 0 95 4 0 0.0
25_2 25_2 -3 0 24 -23 0.5 -16 7 0 0 0 86 5 0.5 1.0
26_1 26_1 -3 0 27 -16 1 -13 10 0 0 1 92 5 0 2.0
27_1 27_1 -5 0 23 -12 0.5 -9 31 1 ND ND 110 3 0 1.5
27_2 27_2 -5 0 28 -9 1 7 42 2 ND ND 102 2 0 3.0
28_1 28_1 2 0 28 -2 1 4 40 2 ND ND 100 3 0 3.0
29_1 29_1 -5 0 19 -1 0 4 39 1 ND ND 94 5 0 1.0
30_1 30_1 -4 0 19 2 0 5 30 1 0 0 100 4 0 1.0
11_2 11_2 19 0 13 -3 0 14 44 2 ND ND 101 3 0 2.0
11_3 11_3 24 0.5 20 -3 0 15 35 1 ND ND 100 3 0 1.0
實例 5- 大鼠之 4 週皮下探索性毒性研究 ( 活體內 安全性 )
研究設計
進行該研究作為針對主要標靶器官毒性之初步篩查，並就潛在的安全性責任對寡核苷酸進行排名。在該研究中，在第 1、8、15 及 22 天每週一次，以各寡核苷酸 (CNJ ID NO 1_1、CNJ ID NO 2_1、CNJ ID NO 3_1、CNJ ID NO 4_2 及 CNJ ID NO 5_1) 之 0 (載體對照)、15 或 45 mg/kg/次投予，對四隻雄性大鼠 (Wistar Han IGS Crl:WI，研究開始時大約 8 周大) 皮下投予。在禁食過夜後最後一次給藥後三天 (第 25 天)，藉由腹膜內注射 150 mg/kg 戊巴比妥 (pentobarbital) 麻醉動物，然後斷頭或雙側氣胸。所有動物之器官及組織均在原位進行檢查、取出並檢查異常。由福爾馬林固定、石蠟包埋之器官 (即肝臟、腎臟、脾臟、腋窩淋巴結、肺、心臟、迴腸、胃及注射部位) 製備系列切片。切片用蘇木精-曙紅染色。毒性之評定基於死亡率、活體觀測、體重、食物消耗、脾臟重量、臨床及解剖病理學。
結果
在大鼠研究中測試的所有寡核苷酸均減少了體重增加及食物消耗。在肝臟、腎臟、脾臟、腋窩淋巴結、肺及注射部位中觀察到所有寡核苷酸與測試項目相關之組織病理學結果，表示有免疫刺激作用。主要在腎臟及肝臟中觀察到很可能繼發於寡核苷酸積累的組織病理學變化。對於 CNJ ID NO 1_1、CNJ ID NO 4_2 及 CNJ ID NO 5_1，在低劑量及高劑量量下觀察到與肝細胞單細胞壞死相關的增加之肝酶。用 CNJ ID NO 3_1 處理產生相同的發現，但限於 1/4 動物中的高劑量量。在高劑量下僅針對 CNJ ID NO 4_2 及 CNJ ID NO 5_1，觀察到腎臟之不良組織病理學發現，即腎小管退化/再生。用任何化合物在心臟、迴腸及胃中均未觀察到與測試項目相關的發現。
CNJ ID NO 2_1 耐受性良好，且除了非不利的免疫刺激變化外，沒有產生任何不良反應。
實例 6- 感染 HBV 之小鼠之 84 天抗病毒功效研究
此實例描述使用具有人源化肝臟的感染 HBV 之小鼠 (PhoenixBio，PXB 小鼠) 在活體內測試選定寡核苷酸之抗病毒功效。
材料與方法
化合物調配
所有化合物均在無菌食鹽水中調配。
小鼠
針對本研究的動物之使用得到 PhoenixBio 之動物倫理委員會的批准 (決議號：2743)。小鼠研究 PBCA-00130 包括七十隻具有人源化肝臟的 PXB-mice® (PhoenixBio Co.; Ltd.) [Uchida 等人 Usefulness of humanized cDNA-uPA/SCID mice for the study of hepatitis B virus and hepatitis C virus virology.J Gen Virol. 2017 年 5 月；98(5):1040-1047]，該等小鼠在第一次給藥前如先前描述感染 HBV 基因型 C 達 69 天。在開始化合物投予的前一天，對所有候選動物秤重，並將具有健康外表且滿足關於年齡、體重、血清病毒血症的所有標準的動物分配至研究。為了最大限度減少群組之間的差異，基於針對體重及血液 h-Alb 濃度的算術均值以及針對血清 HBV DNA 濃度的幾何均值使群組組成隨機化。
基於以下給藥方案給小鼠皮下注射劑量調配物，並在給藥後第 84 天犧牲。各群組由 8 只感染 HBV 之 PXB 小鼠組成。
給藥方案：
組 測試化合物 劑量
量 (mg/kg) Conc.(mg/mL) 體積 (mL/kg) 頻率
1 媒劑 0 0 10 每週，12 次，第 0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77 天
2 CNJ ID NO 2_1 10 1 10 每週，9 次，第 0、7、14、21、28、35、42、49、56 天
3 CNJ ID NO 3_1 10 1 10 每週，12 次，第 0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77 天
血液收集及血清分離
對於血清製劑，每隻動物每個時間點抽取 75 µl 血液。將兩微升之血液用於血液人類白蛋白定量。剩餘 73 μl 於室溫放置至少 5 分鐘凝固後，並隨後以 13200×g、4℃ 離心 3 分鐘，以得到血清。
最終犧牲
在犧牲時，即給藥後第 84 天，以異氟烷麻醉對小鼠進行麻醉，並經由心臟從各動物收集至少 300 μL 之血液，將其收集至注射器中，在此之後藉由心臟穿刺及放血犧牲該等動物。在犧牲時收集全血後，進行屍檢。採集所有動物之全肝並吸乾。去除膽囊，且幾個小的肝臟組織切片經直接切割及快速冷凍用於肝內讀出。
Hirt 肝臟萃取
使用 FastPrep-24 5G 樣品製備系統 (M.P. Biomedicals)，將小塊肝臟組織以 1 ml 之 cccDNA 萃取緩衝液 (50 mM Tris-HCl，pH 7.5；150 mM NaCl；10 mM EDTA；1% SDS) 在 MagNA Lyser Green Bead 管 (Roche,03358941001) 中以 6000 rpm 於室溫均質化 20 秒。將樣品旋轉沉降，並將裂解物轉移至具有 250 µl 5M NaCl (Gibco，#24740-011) 的新鮮管。於 4℃ 將所樣品旋轉過夜，隨後旋轉沉降並將上清液轉移至新管。以 1 mL UltraPure 緩衝液飽和苯酚 (Life Technologies，#15513-039) 萃取 DNA 三次，隨後以 1 mL UltraPure 苯酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1) (Life Technologies，#15593-031) 萃取 DNA 一次。隨後將水相與 2.2 體積之 EtOH 混合，於 -80℃ 沉澱過夜。將 DNA 沉澱並用 70% EtOH 洗滌三次，隨後風乾並重新懸浮在 pH 為 8 的 50 µl 10 mM Tris-HCl 中。
人類 β 球蛋白 (HBB) qPCR
隨後使用經 Hirt 萃取之 DNA 之 1:50 稀釋液藉由 qPCR 來測定 HBB 拷貝數。為此，每次反應混合 5 ul TaqMan Fast Advanced 預混物 (Applied Biosystems，# 4444557)、0.5 uL 20x Taqman 測定 (HBB Hs00758889_s1，VIC)、0.5 uL H2O 及 4 µl 經稀釋之 DNA。亦製備了基因體 DNA 標準品並將其包括在 qPCR 中以允許進行拷貝數計算。將 QuantStudio 12KFlex Cycler 於 95 ℃ 運行 20 秒，隨後於 95 ℃ 持續 1 秒以及於 60 ℃ 持續 20 秒進行 40 個循環。
南方墨點法
藉由以下完成南方墨點法：將每樣品限定數量之 HBB 拷貝 (525'000 個拷貝) 加載到 0.95% 瓊脂糖凝膠上並在 50 V 下運行 3.5 小時。此後，將凝膠在 0.2 M HCl 中於室溫孵育 10 分鐘，在變性緩衝液 (0.5M NaOH，1.5M NaCl) 於室溫孵育 30 分鐘，在中和緩衝液 (0.5M Tris-HCl pH 7.5，1.5M NaCl) 中於室溫孵育 30 分鐘，並最後在 UltraPure 20X SSC 緩衝液 (Life Technologies，#15557-036) 中於室溫孵育 30 分鐘。利用 Whatman Nytran SuPerCharge (SPC) TurboBlotter 套組 (Sigma，#WHA10416328) 過夜完成轉染至 Hybond-XL 膜 (GE Healthcare，#RPN2020S)。將膜在 1800 x 100µJ/cm2 下進行 UV 交聯一次並乾燥。隨後將膜在 DIG Easy Hyb 緩衝液 (Roche，#11603558001) 中於 37℃ 預雜交 1 小時。以 HBV 特異性質體為模板，使用 PCR DIG 探針合成套組 (Merk，11636090910) 製備經 DIG 標記之 HBV 特異性探針，加熱至 100℃ 達 5 分鐘，且隨後快速冷卻並在新鮮的 37° 溫熱雜交緩衝液中，在該膜上孵育過夜。用 SSC 洗滌緩衝液 I (2xSSC，0.1% SDS) 於室溫洗滌 2×5 分鐘，並 用 SSC 洗滌緩衝液 II (0.5xSSC，0.1% SDS) 於 65℃ 洗滌 2×15 分鐘。隨後根據製造商之說明使用 DIG Wash and Block 緩衝液組 (Roche, #11585762001)，並在 Fusion Fx (VILBER) 中利用 CDP-Star 及 NitroBlock 溶液偵測發光強度。將在第 84 天犧牲前死亡的小鼠排除在分析之外。將兩隻患有小鼠淋巴瘤的載體小鼠排除在分析之外，因為經加載之 HBB 拷貝數太少。使用 Image Studio Lite 5.2 版本軟體 (LI-COR Biosciences) 對 cccDNA 帶之發光強度定量。與載體群組相比，針對各治療群組，cccDNA 之剩餘百分比計算如下： 剩餘 % cccDNA = (經處理之小鼠之強度平均值 * 100) / 載體小鼠之強度平均值。
測量血清 HBsAg 濃度
藉由 SRL, Inc. (Tokyo, Japan) 基於由 Fujirebio 開發的化學發光酶免疫測定 (CLEIA) (LUMIPULSE HBsAg-HQ，LUMIPULSE® PrestoⅡ) 來測定血清 HBsAg 濃度。稀釋係數為 60，且該測定之測量範圍介於 0.005 與 150 IU/mL 之間。將在第 84 天犧牲前死亡的小鼠排除在分析之外。將第 0 天血清 HBsAg 含量異常的小鼠排除在分析之外。
測量血清 HBeAg 濃度
藉由 SRL, Inc. 基於由 Fujirebio 開發的化學發光酶免疫測定 (CLEIA) (LUMIPULSE HBeAg，LUMIPULSE® PrestoⅡ) 來測定血清 HBeAg 濃度。稀釋係數為 60，且該測定之測量範圍介於 0.1 與 1590 C.O.I. 之間。將在第 84 天犧牲前死亡的小鼠排除在分析之外。將第 0 天血清 HBeAg 含量異常的小鼠排除在分析之外。
測量血清 HBcrAg 濃度
藉由 SRL, Inc. 使用由 Fujirebio Inc. 開發的化學發光酶免疫測定 (CLEIA) (LUMIPULSE HBcrAg，LUMIPULSE F) 來測定血清 HBcrAg 濃度。該測定之最低定量極限為 3.0 logU/mL。在本研究中，稀釋係數為 300。將在第 84 天犧牲前死亡的小鼠排除在分析之外。
測量血清中的循環 HBV RNA
將血清按 1:12.5 稀釋，並根據製造商之說明，利用在 cobas® 6800/8800 系統上運行的定量 cobas® HBV RNA 研究測試來偵測 HBV RNA 含量。相對於非 HBV RNA 定量標準 (RNA-QS) 對病毒載量 (拷貝/mL) 定量，該定量標準在樣品處理期間引入各標本中。此外，該測試利用三個外部對照：高效價陽性、低效價陽性及陰性對照。將在第 84 天犧牲前死亡的小鼠排除在分析之外。
測量血液中之人類白蛋白 (hAlb)
於食鹽水中稀釋兩微升之血液。使用臨床化學分析儀 BioMajestyTM 系列 JCA-BM6050 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)，利用乳膠凝集免疫濁度測定法 LZ 測試「Eiken」U-ALB (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)，以單位 mg/mL 來測量血液 h-Alb 濃度。將在第 84 天犧牲前死亡的小鼠排除在分析之外。
測量肝內 pgRNA 、肝內 A1CF mRNA 及肝內 HBV RNA
樣品處理
在 1400 µl MagNaPure LC RNA 分離組織緩衝液 (Roche，#03604721001) 中使用 2 mL MagNA Lyser Green Bead (Roche，#03358941001) 以 6000 rpm 將組織切片裂解並均質 20 秒。隨後將均質物於室溫孵育 30 分鐘，並藉由離心去除不溶性碎片。
藉由 qPCR 進行 A1CF 、 pgRNA 及 HBV RNA 轉錄本之 RNA 分離及定量
使用 MagNA Pure 機器人及 MagNA Pure 96 細胞 RNA 大體積套組 (Roche，#05467535001)，使用「細胞 RNA LV」方案，根據製造商之方案從組織均質物萃取總 RNA。將 350 µl 之組織均質物載入機器人中，且最終洗脫液體積為 50 ul。
對經分離之 RNA 樣品 (藉由 NanoDrop) 進行 RNA 濃度及質量檢查，且在稀釋盤 (Thermo scientific - #AB0900) 中將該等樣品全部標準化至 7.5 ng/ul 之濃度。混合 RNA，密封該盤並將 RNA 於 90℃ 熱休克 40 秒以熔化 RNA:LNA 雙股螺旋，並隨後將其置於冰上。由食鹽水樣品製成標準曲線，作為 RNA 之 8 點 2 倍稀釋系列。
製備一步式 qPCR 混合物並經移液送入 384 孔 qPCR 盤 (MicroAmp 光學 384 孔盤 - Applied Biosystems 4309849)。按反應 (10 µl)，將 5 µL qScript™ XLT 一步式 RT-qPCR ToughMix®、Low ROX™ (Quanta Bioscience cat 95134-500)、0.25 uL 測定混合物 (見下文) 及 0.75 uL 水混合。向 384 孔盤加入 6 uL 之這種混合物，並在頂部加入 4 µL 經稀釋之 RNA。快速旋轉之後，在 ViiA 7(Thermo) 上運行以下 qPCR 程式：於 50℃ 運行 15 分鐘，隨後於 95℃ 運行 3:30 分鐘，然後於 95℃ 持續 5 秒以及於 60℃ 持續 45 秒進行 40 個循環。
所使用之測定為：
人 A1CF 廠商
A1CF_Hs00205840_m1 Thermo
人類管家基因   
GAPDH_Hs.PT.39a.22214836 IDT
TBP_Hs.PT.58v39858774 IDT
GUSB_Hs.PT.58v27737538 IDT
PGK1_Taqman_Hs9999906_m1 Thermo
HPRT1_Hs.PT.58v45621572 IDT
病毒讀出   
pgRNA_Taqman_pgRNA_AILJKX5 Thermo
HBV-RNA_taqman_Pa03453406_s1 Thermo
在 QuantStudio 中分析 qPCR 結果。使用標準曲線計算各轉錄物之表現。將人類 A1CF 表現歸一化為上示四種管家基因之幾何均值。結果顯示為食鹽水群組之平均值百分比。
藉由雜交 ELISA 測量寡核苷酸暴露量
使用雙探針雜交 ELISA 測定系統來測量寡核苷酸暴露量 (即組織中存在的分子量)。簡而言之，在含有生物素結合的捕捉探針及地高辛結合的偵測探針的緩衝液中，將 ASO 標準品 (未結合分子) 或組織樣品均質物 (上述用於 qPCR 的樣品之等分樣品) 稀釋，結合至卵白素塗覆的測定盤，並透過使用地高辛-鹼性磷酸酶二級抗體及吸光度讀出進行定量。
所使用之方案如下。在 5x SSCT 緩衝液 (750 mM NaCl 及 75 mM 檸檬酸鈉，含有 0.05% (v/v) Tween-20) 中稀釋樣品。在每個板上執行匹配樣品基質和稀釋因子的合適的標準品。
將樣品及標準品加入至期望設定下的稀釋盤 (針對 CNJ ID NO 2_1：具有圓底的聚丙烯 96 孔盤，Thermo - 針對 CNJ ID NO 3_1：Eppendorf twin.tec PCR 盤 96 LoBind，半裙邊(semi-skirted) - 種類編號：0030129504) 並製作稀釋系列。向第一孔加入 250 μL 樣品/標準品加上捕捉偵測溶液，並將 125 μL 捕捉偵測溶液加入其餘孔中。所使用之捕捉偵測溶液為：
寡核苷酸 ( 結合的 ) 5'-[5gn2c6]-CAAAAAGTTTCTCAGATAGGC-3' (CNJ ID NO 2_1) 5'-[5gn2c6]-CAGGACATGTTAATTTTACTT-3' (CNJ ID NO 3_1)
化合物 ( 未結合的 ) 5'-CAAAAAGTTTCTCAGATAGGC-3' (CMP ID NO 2_1) 5'-CAGGACATGTTAATTTTACTT-3' (CMP ID NO 3_1)
捕捉探針 5'-BIO-GCCTATCTGAG-3' (SEQ ID NO 60) 5'-BIO-AAGTAAAAT-3'
檢測探針 5'-AACTTTT-DIG-3' 5'-ATGTCC-DIG-3'
5x SSCT 緩衝液中之探針濃度 (nM) 10 100
藉由依序轉移 125 μL 液體，製備 (未結合的分析物的) 標準品及樣品之兩倍稀釋系列。保留 2 至 4 個孔作為空白 (僅捕捉偵測溶液)。為獲得最佳結果，建議至少 6 個孔之兩倍樣品稀釋系列。
將針對 CNJ ID NO 2_1 定量之稀釋盤於室溫放置 30 分鐘。
將針對 CNJ ID NO 3_1 定量之稀釋盤於 90℃ 孵育 5 分鐘 (使用熱循環儀)，並隨後於室溫靜止 30 分鐘。
對於這兩種寡核苷酸，程序為：
將 100 μL 之液體從稀釋盤轉染至卵白素盤 (Roche 種類編號 11989685001)。將板在室溫下溫和攪拌 (板搖床) 孵育 1 小時。
吸孔並用 300 μL 之 2 x SSCT 緩衝液 (300 mM NaCl 及 30 mM 檸檬酸鈉，含有 0.05% (v/v) Tween-20) 洗滌三次。
向各孔加入按 1:4000 稀釋於 PBST (加入 0.05% tween-20) (同一天製備) 中的 100 μL 抗 DIG-AP (Roche Applied Science，種類編號 11 093 274 910)，並在溫和攪拌下於室溫孵育 1 小時。
吸孔並用 300 μL 2 x SSCT 緩衝液洗滌 3 次。
向各孔加入 100 μL 基質 (AP) 溶液 (新鮮製備，Blue Phos 基質，KPL 產品代碼 50-88-00)。處理 AP 基質 A 時佩戴防護眼鏡。
在溫和攪拌下孵育 30 分鐘之後，以 615 nm 用分光光度法測量色彩之強度。對於手動 ELISA 程序，將盤直接轉移至讀取器，並從 t=0 至 t=45 每 5 分鐘讀取一次，每次讀取前進行搖動。
原始資料從讀取器 (Gen5 2.0 軟體) 匯出為 excel 格式，並在 excel 中進行進一步分析。使用 GraphPad Prism 6 軟體及邏輯 4PL 迴歸模型生成標準曲線 (對數濃度與吸光度)。資料點報告為來自分析中接受的所有孔的技術重複品之均值 (高於 5 倍背景訊號及低於訊號飽和度)。
結果
在第 84 天 PXB 小鼠之肝臟中藉由南方墨點法獲得的 cccDNA 表現量
剩餘 cccDNA 在表 16 中顯示為載體小鼠 %。測量 cccDNA 帶強度，並歸一化至載體小鼠。
表 16-PXB 小鼠之肝臟中的 cccDNA 含量
組 N 剩餘 % cccDNA 之均值 SEM
媒劑 3 100.00 23.37
CNJ ID NO 2_1 3 64.88 16.80
CNJ ID NO 3_1 5 64.48 13.97
PXB 小鼠之血清中的 HBsAg
第 0 天及第 84 天的 HBsAg 含量在表 17 中顯示為作為基線的第 0 天的 %。
表 17-PXB 小鼠之血清中的相對 HBsAg
研究日 剩餘血清 HBsAg 之 %
食鹽水 CNJ ID NO 2_1 CNJ ID NO 3_1
均值 SEM N 均值 SEM N 均值 SEM N
0 100 0 4 100 0 3 100 0 4
84 136.59 19.79 4 88.26 1.37 3 71.38 8.92 4
PXB 小鼠之血清中的 HBeAg
第 0 天及第 84 天的 HBeAg 含量在表 18 中顯示為作為基線的第 0 天的 %。
表 18-PXB 小鼠之血清中的相對 HBeAg
研究日 剩餘血清 HBeAg 之 %
食鹽水 CNJ ID NO 2_1 CNJ ID NO 3_1
均值 SEM N 均值 SEM N 均值 SEM N
0 100 0 5 100 0 3 100 0 4
84 109.32 12.33 5 63.10 10.48 3 44.10 6.15 4
第 84 天血清中之 HBcrAg
第 84 天的 HBcrAg 含量在表 19 中顯示為 logU/mL。
表 19-PXB 小鼠之血清中的 HBcrAg
組 N HBcrAg 之均值，單位為 LogU/mL SEM
媒劑 5 8.3 0.04
CNJ ID NO 2_1 3 8.067 0.03
CNJ ID NO 3_1 5 7.96 0.05
第 84 天血清中之循環 HBV RNA
第 84 天的剩餘循環 HBV RNA 在表 20 中顯示為剩餘與載體之 %。
表 20-PXB 小鼠之血清中的相對循環 HBV RNA 含量
組 N 剩餘 circHBV RNA 之 % SEM
媒劑 5 100 33.69
CNJ ID NO 2_1 3 38.86 14.66
CNJ ID NO 3_1 5 61.55 16.58
第 84 天的 pgRNA 含量
第 84 天的相對 pgRNA 含量在表 21 中顯示為剩餘與載體之 %。
表 21-PXB 小鼠之肝臟中的相對 pgRNA
組 N 剩餘 pgRNA 之 % SEM
媒劑 5 100 18.07
CNJ ID NO 2_1 3 79.9 8.19
CNJ ID NO 3_1 5 75.4 4.91
第 84 天的肝內 HBV RNA 含量
第 84 天的相對 pgRNA 含量在表 22 中顯示為剩餘與載體之 %。
表 22-PXB 小鼠之肝臟中的相對 HBV RNA
組 N 剩餘肝內 HBV RNA 之 % SEM
媒劑 5 100 13.66
CNJ ID NO 2_1 3 73.7 7.16
CNJ ID NO 3_1 5 77.0 5.91
第 84 天的肝內人類 A1CF mRNA 含量
第 84 天的 A1CF mRNA 表現量在表 23 中顯示為剩餘與載體之 %。
表 23-PXB 小鼠之肝臟中的相對人類 A1CF mRNA
組 N 剩餘 A1CF mRNA 之 % SEM
媒劑 5 100 6.76
CNJ ID NO 2_1 3 32.2 3.06
CNJ ID NO 3_1 5 13.1 2.14
第 84 天的肝臟化合物暴露量
第 84 天化合物暴露之絕對量在表 24 中顯示為剩餘與載體之 %。
表 24-PXB 小鼠之肝臟中的化合物暴露量
組 N 化合物暴露量 (nmol/g) SEM
媒劑 5 0.00 0.00
CNJ ID NO 2_1 3 0.30 0.04
CNJ ID NO 3_1 5 2.80 0.39
PXB 小鼠之血液中的人類白蛋白
第 0 天及第 84 天的人類白蛋白 (hAlb) 含量在表 25 中顯示為作為基線的第 0 天的 %。儘管從第 0 天至第 84 天，所有群組中人類白蛋白均略有下降，但透過研究維持的總人類白蛋白含量表明肝臟人源化率為 ＞70%。
表 25-PXB 小鼠之血液中的人類白蛋白
研究日 剩餘人類白蛋白之 %
食鹽水 CNJ ID NO 2_1 CNJ ID NO 3_1
均值 SEM N 均值 SEM N 均值 SEM N
0 100 0 5 100 0 3 100 0 5
84 64.66 3.03 5 70.97 3.37 3 66.64 2.12 5
組織病理學評估 ( 活體內安全性資料 )
評估用寡核苷酸處理的感染 HBV 之小鼠之肝臟，以評定寡核苷酸之 活體內安全性。
在屍檢時從所有動物獲得左腎臟之一半及來自肝臟左側葉的約 5 毫米厚之切片，用 10% 中性緩衝之福爾馬林固定至少 24 小時至 48 小時，並處理為經石蠟包埋之腎臟及肝臟塊。從兩個器官製備系列切片，且用蘇木精-曙紅來對切片染色。
對第 84 天犧牲的所有動物 (即總共 24 個動物) 進行組織病理學評估。個體動物 (包括對照動物) 顯示肝臟及腎臟中存在淋巴瘤。
對於本研究中測試的三種寡核苷酸 (CNJ ID NO 1_1、CNJ ID NO 2_1 及 CNJ ID NO 3_1) 中之任一種而言，腎臟或肝臟中不存在明顯的寡核苷酸相關組織病理學變化。
圖 1顯示 CNJ ID NO 1_1 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 1 及 CMP ID NO 1_1)。 圖 2顯示 CNJ ID NO 2_1 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 2 及 CMP ID NO 2_1)。 圖 3顯示 CNJ ID NO 3_1 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 3 及 CMP ID NO 3_1)。 圖 4顯示 CNJ ID NO 4_1 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 4 及 CMP ID NO 4_1)。 圖 5顯示 CNJ ID NO 4_2 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 4 及 CMP ID NO 4_2)。 圖 6顯示 CNJ ID NO 5_1 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 5 及 CMP ID NO 5_1)。 圖 7顯示 CNJ ID NO 5_2 之化學結構 (對應於 SEQ ID NO 5 及 CMP ID NO 5_2)。 圖 8顯示胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺) (HELM 標註 [5gn2c6]) 之化學結構，其為表 5 中所示之反義寡核苷酸結合物中之每一者中之 GalNAc 部分。波浪線指示 GalNAc 部分藉由其接附至連接子或至反義寡核苷酸的共價鍵。 化學圖式顯示反義寡核苷酸的質子化形式，且應當理解在硫代磷酸酯核苷間鍵結中硫原子上的每個氫可獨立存在或不存在。應當理解，質子之存在將取決於分子環境之酸性。在鹽形式中，一個或多個氫可例如以陽離子 (諸如金屬陽離子，諸如鈉陽離子或鉀陽離子) 取代。質子化硫代磷酸酯是以互變異構的形式存在。
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Claims (44)

  1. 一種長度為 12 至 30 個核苷酸之反義寡核苷酸，其包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列能夠與在脂蛋白元 B mRNA 編輯酶催化次單元 1 (APOBEC1) 互補因子(A1CF) mRNA 中的標靶序列結合，其中該標靶序列為在下列序列中之任一者內的至少 17 個連續核苷酸之序列： GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)、 GAGAAAAACCUAUAAUGCCU (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 45 之位置 6951 至 6970)、 AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989)、 AAACACCACAAUCUUAAAAC (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 45 之位置 26358 至 26377)、 CAGGUAUAUAACAAGUUCA (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 45 之位置 38053 至 38071) 及 AGACACACAAAACUCUAU (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 45 之位置 78973 至 78990)， 且其中該反義寡核苷酸能夠降低 A1CF 表現。
  2. 如請求項 1 之反義寡核苷酸，其中該標靶序列為 GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199) 或 AAGUAAAAUUAACAUGUCC (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16988)。
  3. 如請求項 1 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠降低在經 B 型肝炎病毒 (HBV) 感染的細胞中的 A1CF 表現。
  4. 如請求項 3 之反義寡核苷酸，其中與對照相比，該反義寡核苷酸能夠降低該細胞中的總細胞內 HBV DNA。
  5. 如請求項 3 之反義寡核苷酸，其中與對照相比，該反義寡核苷酸能夠降低由該細胞所分泌的 HBV DNA 之量。
  6. 如請求項 3 之反義寡核苷酸，其中與對照相比，該反義寡核苷酸能夠降低該細胞中的共價閉合環狀 DNA (cccDNA) 之量。
  7. 如請求項 3 之反義寡核苷酸，其中與對照相比，該反義寡核苷酸能夠降低該細胞中的前基因體 RNA (pgRNA) 之量。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠募集 RNase H。
  9. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為單股反義寡核苷酸。
  10. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與該標靶序列至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% 互補。
  11. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸的長度為 17、18、19 或 20 個核苷酸。
  12. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列的長度為 17、18、19 或 20 個核苷酸。
  13. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸由該連續核苷酸序列所組成。
  14. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸之序列及/或該連續核苷酸序列之序列包含以下或由以下所組成：與 AAAAGTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 2) 或 GGACATGTTAATTTTACTT (SEQ ID NO 3) 具有至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100% 同一性的序列。
  15. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含一個或多個經糖修飾的核苷。
  16. 如請求項 15 之反義寡核苷酸，其中該一個或多個經糖修飾的核苷係獨立地選自由以下所組成之群組：2'-O-甲基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE-RNA) 及 LNA 核苷。
  17. 如請求項 15 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸中不包含經糖修飾的核苷的每個核苷酸包含 DNA 核苷。
  18. 如請求項 1 至 7 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含一個或多個經修飾的核苷間鍵結。
  19. 如請求項 18 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸中的所有核苷間鍵結為經修飾的核苷間鍵結。
  20. 如請求項 18 之反義寡核苷酸，其中每個經修飾的核苷間鍵結係獨立地選自由以下所組成之群組：硫代磷酸酯核苷間鍵結及二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
  21. 一種反義寡核苷酸，其包含選自下列的化合物或由選自下列的化合物所組成： (a) [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1)， (b) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)， (c) [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A) [sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)， (d) [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1)， (e) [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR] (C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2)， (f) [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G) [sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1)， (g) [LR](T)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G) [sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2)， (h) [LR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP]. [LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1)， (i) [MOE](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)[sP]. [MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1)， (j) [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T) [sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2)， (k) [MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](A) [PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] (T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1)， (l) [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2)， (m) [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C) [sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1)， (n) [LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR] (A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1)， (o) [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1)， (p) [LR](T)[PS2].[LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3)， (q) [LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G) [sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1)， (r) [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP]. [LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3)， (s) [MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP]. [LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1)， (t) [LR](A)[PS2].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A) [sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1)， (u) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] ([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 15, CMP ID NO 15_1)， (v) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_1)， (w) [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_2)， (x) [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_3)， (y) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_3)， (z) [LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_4)， (aa) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_5)， (ab) [LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_6)， (ac) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_7)， (ad) [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP]. [mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_8)， (ae) [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_9)， (af) [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_10)， (ag) [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_11)， (ah) [MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_12)， (ai) [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 17_1)， (aj) [LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR] (A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A) [sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 18_1)， (ak) [LR](A)[PS2].[LR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR] (A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A) [sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 19, CMP ID NO 19_1)， (al) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_1)， (am) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_2)， (an) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_3)， (ao) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_4)， (ap) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_5)， (aq) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_6)， (ar) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_2)， (as) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_3)， (at) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_4)， (au) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_5)， (av) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_6)， (aw) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_7)， (ax) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_8)， (ay) [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_9)， (az) [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_10)， (ba) [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_11)， (bb) [MOE](G)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_12)， (bc) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 21, CMP ID NO 21_1)， (bd) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 22, CMP ID NO 22_1)， (be) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 23, CMP ID NO 23_1)， (bf) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 24, CMP ID NO 24_1)， (bg) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_1)， (bh) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_2)， (bi) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 26, CMP ID NO 26_1)， (bj) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_1)， (bk) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) [sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_2)， (bl) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP]. [LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 28, CMP ID NO 28_1)， (bm) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP]. [LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 29, CMP ID NO 29_1)， (bn) [LR](G)[PS2].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP]. [LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 30, CMP ID NO 30_1)， (bo) [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 11，CMP ID NO 11_2)，及 (bp) [LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
  22. 一種反義寡核苷酸結合物，其包含共價接附至至少一個結合物部分的如請求項 1 至 21 中任一項之反義寡核苷酸。
  23. 如請求項 22 之反義寡核苷酸結合物，其中該結合物部分為 N-乙醯基半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine) (GalNAc) 結合物部分。
  24. 如請求項 23 之反義寡核苷酸結合物，其中該 GalNAc 結合物部分為如圖 8 中所繪示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)。
  25. 一種反義寡核苷酸結合物，其係選自下列中： (a) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A) [sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 1, CMP ID NO 1_1, CNJ ID NO 1_1)， (b) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)， (c) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR] (A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T) [sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] (T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)， (d) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A) [sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR] (T)[PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_1, CNJ ID NO 4_1)， (e) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP]. [LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[PS2]. [LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_2, CNJ ID NO 4_2)， (f) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2]. [dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T) [sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_1, CNJ ID NO 5_1)， (g) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T) [sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_2, CNJ ID NO 5_2)， (h) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_1, CNJ ID NO 6_1)， (i) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR](G)[sP]. [dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [LR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_1, CNJ ID NO 7_1)， (j) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[dR] (C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T) [sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 7, CMP ID NO 7_2, CNJ ID NO 7_2)， (k) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP]. [MOE]([5meC])[sP].[LR](A)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 8, CMP ID NO 8_1, CNJ ID NO 8_1)， (l) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2]. [dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_2, CNJ ID NO 2_2)， (m) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP]. [dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 9, CMP ID NO 9_1, CNJ ID NO 9_1)， (n) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2]. [dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[mR] (U)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2]. [LR](T) (SEQ ID NO 10, CMP ID NO 10_1, CNJ ID NO 10_1)， (o) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR] (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_1, CNJ ID NO 11_1)， (p) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](G)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A) [sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T) [PS2].[LR](G) (SEQ ID NO 4, CMP ID NO 4_3, CNJ ID NO 4_3)， (q) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](T)[PS2].[LR](A)[PS2]. [dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T) [sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 12, CMP ID NO 12_1, CNJ ID NO 12_1)， (r) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP]. [MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 5, CMP ID NO 5_3, CNJ ID NO 5_3)， (s) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP]. [MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[LR](G)[PS2].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 13, CMP ID NO 13_1, CNJ ID NO 13_1)， (t) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](T)[sP]. [LR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 14, CMP ID NO 14_1, CNJ ID NO 14_1)， (u) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G) [PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 15, CMP ID NO 15_1, CNJ ID NO 15_1)， (v) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [LR]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_1, CNJ ID NO 16_1)， (w) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_2, CNJ ID NO 16_2)， (x) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR]([PPG]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 16, CMP ID NO 16_3, CNJ ID NO 16_3)， (y) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_3, CNJ ID NO 2_3)， (z) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[PS2]. [dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_4, CNJ ID NO 2_4)， (aa) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_5, CNJ ID NO 2_5)， (ab) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[MOE](A)[sP]. [MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[PS2].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_6, CNJ ID NO 2_6)， (ac) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_7, CNJ ID NO 2_7)， (ad) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP]. [LR](A)[PS2].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_8, CNJ ID NO 2_8)， (ae) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[sP]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_9, CNJ ID NO 2_9)， (af) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_10, CNJ ID NO 2_10)， (ag) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_11, CNJ ID NO 2_11)， (ah) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[LR](A)[PS2]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_12, CNJ ID NO 2_12)， (ai) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP]. [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR](G)[sP].[LR](G)[PS2]. [MOE]([5meC]) (SEQ ID NO 17, CMP ID NO 17_1, CNJ ID NO 17_1)， (aj) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U) [sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 18, CMP ID NO 18_1, CNJ ID NO 18_1)， (ak) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](G)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 19, CMP ID NO 19_1, CNJ ID NO 19_1)， (al) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_1, CNJ ID NO 20_1)， (am) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_2, CNJ ID NO 20_2)， (an) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_3, CNJ ID NO 20_3)， (ao) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_4, CNJ ID NO 20_4)， (ap) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE] ([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_5, CNJ ID NO 20_5)， (aq) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[mR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 20, CMP ID NO 20_6, CNJ ID NO 20_6)， (ar) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_2, CNJ ID NO 6_2)， (as) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_3, CNJ ID NO 6_3)， (at) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_4, CNJ ID NO 6_4)， (au) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_5, CNJ ID NO 6_5)， (av) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. 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[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_9, CNJ ID NO 6_9)， (az) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC]) [PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_10, CNJ ID NO 6_10)， (ba) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC]) [PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR]([5meC])[PS2].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_11, CNJ ID NO 6_11)， (bb) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[MOE](G)[sP].[LR]([5meC]) [PS2].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T)[PS2].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T) (SEQ ID NO 6, CMP ID NO 6_12, CNJ ID NO 6_12)， (bc) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 21, CMP ID NO 21_1, CNJ ID NO 21_1)， (bd) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 22, CMP ID NO 22_1, CNJ ID NO 22_1)， (be) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 23, CMP ID NO 23_1, CNJ ID NO 23_1)， (bf) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 24, CMP ID NO 24_1, CNJ ID NO 24_1)， (bg) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_1, CNJ ID NO 25_1)， (bh) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 25, CMP ID NO 25_2, CNJ ID NO 25_2)， (bi) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 26, CMP ID NO 26_1, CNJ ID NO 26_1)， (bj) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_1, CNJ ID NO 27_1)， (bk) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 27, CMP ID NO 27_2, CNJ ID NO 27_2)， (bl) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 28, CMP ID NO 28_1, CNJ ID NO 28_1)， (bm) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 29, CMP ID NO 29_1, CNJ ID NO 29_1)， (bn) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) [sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 30, CMP ID NO 30_1, CNJ ID NO 30_1)， (bo) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR] (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T) (SEQ ID NO 11，CMP ID NO 11_2，CNJ ID NO 11_2)，及 (bp) [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR] (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G) [sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP]. [dR](G)[sP].[dR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 11, CMP ID NO 11_3, CNJ ID NO 11_3)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
  26. 一種反義寡核苷酸結合物，其係選自如圖 2 中所繪示的 CNJ ID NO 2_1 及如圖 3 中所繪示的 CNJ ID NO 3_1。
  27. 如請求項 1 至 7 及 21 至 26 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該標靶序列為在該序列 GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199) 內的至少 17 個連續核苷酸之序列。
  28. 如請求項 27 之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該標靶序列為 GCCUAUCUGAGAAACUUUU (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 45 之位置 2181 至 2199)。
  29. 如請求項 27 之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該反義寡核苷酸之序列及/或該連續核苷酸序列之序列包含以下或由以下所組成：與 AAAAGTTTCTCAGATAGGE (SEQ ID NO 2) 具有至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100% 同一性的序列。
  30. 一種反義寡核苷酸，其包含下列化合物或由下列化合物所組成： [LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP]. [dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A) [sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR]([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
  31. 一種反義寡核苷酸結合物，其中該反義寡核苷酸結合物為下列者： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](A)[PS2].[LR](A)[sP].[dR](A) [sP].[mR](A)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](G)[sP].[LR](G)[PS2].[LR] ([5meC]) (SEQ ID NO 2, CMP ID NO 2_1, CNJ ID NO 2_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
  32. 一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 2 中所繪示的 CNJ ID NO 2_1。
  33. 如請求項 1 至 7 及 21 至 26 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該標靶序列為在 AAGUAAAAUUAACAUGUCCA (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16989) 內的至少 17 個連續核苷酸之序列。
  34. 如請求項 33 之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該標靶序列為 AAGUAAAAUUAACAUGUCC (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 45 之位置 16970 至 16988)。
  35. 如請求項 33 之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該反義寡核苷酸之序列及/或該連續核苷酸序列之序列包含以下或由以下所組成：與 GGACATGTTAATTTTACTT (SEQ ID NO 3) 具有至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或 100% 同一性的序列。
  36. 一種反義寡核苷酸，其包含下列化合物或由下列化合物所組成： [LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP]. [dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR] (A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP]. [dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結，且 [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結。
  37. 一種反義寡核苷酸結合物，其中該反義寡核苷酸結合物為下列者： [5gn2c6]P.[dR](C)P.[dR](A)P.[LR](G)[sP].[LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR] (T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[PS2].[LR](T) (SEQ ID NO 3, CMP ID NO 3_1, CNJ ID NO 3_1)， 其中 (A) 為包含腺嘌呤核鹼基的核苷， (C) 為包含胞嘧啶核鹼基的核苷， ([5meC]) 為包含 5-甲基胞嘧啶核鹼基的核苷， ([PPG]) 為包含 7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤核鹼基的核苷， (G) 為包含鳥嘌呤核鹼基的核苷， (U) 為包含尿嘧啶核鹼基的核苷， (T) 為包含胸腺嘧啶核鹼基的核苷， [LR] 表示下一個核苷為 β-D-氧-LNA 核苷， [dR] 表示下一個核苷為 DNA 核苷， [mR] 表示下一個核苷為 2'-O-甲基 RNA 核苷， [MOE] 表示下一個核苷為 2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE RNA) 核苷， [sP] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的硫代磷酸酯核苷間鍵結， [PS2] 表示前一個核苷與下一個核苷之間的二硫代磷酸酯核苷間鍵結， P 表示前一個核苷或部分與下一個核苷之間的磷酸二酯核苷間鍵結，且 [5gn2c6] 為如圖 8 中所示的胺基己基結合的三(N-乙醯基-半乳糖胺)部分。
  38. 一種反義寡核苷酸結合物，其為如圖 3 中所繪示的 CNJ ID NO 3_1。
  39. 如請求項 1 至 7、21 至 26、30 至 32 及 36 至 38 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該反義寡核苷酸或該反義寡核苷酸結合物係為醫藥上可接受之鹽之形式。
  40. 如請求項 1 至 7、21 至 26、30 至 32 及 36 至 38 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，其中該反義寡核苷酸或該反義寡核苷酸結合物係被包覆於基於脂質的遞送載體中、共價連接至或被包覆於樹枝狀聚合物中、或結合至適體。
  41. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 40 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物，以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
  42. 一種降低標靶細胞中的 A1CF 表現之活體外 (in vitro) 或離體 (ex vivo) 方法，該方法包含向該標靶細胞投予有效量之如請求項 1 至 40 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或如請求項 41 之醫藥組成物。
  43. 一種如請求項 1 至 40 中任一項之反義寡核苷酸或反義寡核苷酸結合物或如請求項 41 之醫藥組成物用於製備藥物之用途，該藥物用於治療或預防個體的疾病。
  44. 如請求項 43 之用途，其中該疾病為 HBV 感染。
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