TW202220949A

TW202220949A - 製備及純化與環境相容的清潔劑之方法

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Publication number: TW202220949A
Application number: TW110128855A
Authority: TW
Inventors: 尚巴蒂斯特法爾塞; 奧托科斯特納
Original assignee: 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2022-06-01
Also published as: JP2023536195A; WO2022029674A1; CN116057032A; US20240010590A1; EP4192806A1; AR123155A1

Abstract

本發明提供一種製備及純化可使用作為與環境相容之清潔劑的化合物之方法，以及可藉由此類方法獲得之化合物。

Description

製備及純化與環境相容的清潔劑之方法

本發明提供製備和純化可使用作為與環境相容之清潔劑之化合物之方法，以及可藉由此類方法獲得之化合物。

作為治療影響個人健康之許多疾病、病症或症狀之方法，生物製藥藥物之使用越來越重要。生物製藥藥物通常經由從生物體液中純化或經由在宿主細胞(如哺乳動物細胞株)中重組生產而獲得。然而，在此類生物製藥生產過程中，病毒污染為一個重大問題。病毒污染可經由待純化之生物流體或通過使用動物源性產物而引入生物製藥生產過程中。與細菌污染相較，病毒污染難以偵測。然而，如果病毒污染被忽視並且感染性病毒被納入生物製藥藥物之配方中，則會對患者構成重大之健康風險。因此，病毒去活化在生物製藥生產中至關重要。

在許多生物製藥生產過程中，係使用清潔劑使病毒去活化。通常，這些清潔劑在所謂的溶劑/清潔劑(S/D)處理過程中與溶劑組合。清潔劑Triton X-100 (4-(1,1,3,3-四甲基丁基)酚，乙氧基化)已用於產業產物之S/D處理多年。

然而，最近之生態研究顯示Triton X-100及其降解產物可能在水生生物中作為內分泌干擾物，引起環境衝擊問題(請參見「ECHA支持性文件，辨識乙氧基化之4-(1,1,3,3-四甲基丁基)酚為高度關注之物質，因為它們降解為具有內分泌干擾特性之高度關注之物質(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)酚)，它們可能會對於環境造成嚴重影響，引起與CMR和PBT/vPvB同等的關注」，於2012年12月12日採用)。因此，目前需要用於使病毒去活化之替代性、環境相容性清潔劑。WO 2019/086463相關於用於使病毒去活化之此類清潔劑及其生產方法。然而，目前仍需要用於製備和純化這些化合物之增進方法，並且需要具有更高純度之此類化合物。

本發明經由提供本發明之具體實施例而滿足上述需求，解決本領域之上述問題。

據稱Triton-X100之毒性來自其酚部分，該部分能夠停泊在海洋生物體之某些內分泌受體上。一致地，基於內分泌干擾物活性之電腦化預測，對於本發明之非酚類聚氧乙烯醚清潔劑，並無任何預測顯示它們具有內分泌干擾物活性。

本發明人已合成出一種與環境相容之非酚類聚氧乙烯醚清潔劑，其在S/D和單一清潔劑處理過程中可有效地使脂質包膜病毒去活化。因此，本發明人發現與環境相容之非酚類聚氧乙烯醚清潔劑，可用於使脂質包膜病毒去活化。

此外，本發明人開發出一種用於製備和純化本發明清潔劑之增進方法，以及可藉由此類方法獲得之具有增進純度之清潔劑。

因此，本發明提供如下之較佳具體實施例： 1. 一種製備及純化下式(XIX)化合物之方法

(式(XIX))，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基，該方法包含下列步驟 (3) 將下式(XII)化合物

式(XII)，其中m和R如上所定義且X代表鹵素原子或羥基，與式HO(CH ₂CH ₂O) _nH之聚乙二醇(PEG)反應，其中n為n≥2之整數，以產生該式(XIX)化合物和下式(XIII)之副產物

(式(XIII))，其中R如上所定義且n為n≥2之整數；以及 (4) 藉由從中移除未反應之聚乙二醇(PEG)和該副產物而純化出該式(XIX)化合物。 2. 如第1項所述之方法，其在該步驟(3)之前更包含以下步驟(2)： (2) 將下式(XIV)之化合物

(式(XIV))，其中m和R如第1項中所定義，轉化為下式(XII)之化合物

式(XII)，其中m、R和X如第1項中所定義。 3. 如第2項所述之方法，其在該步驟(2)之前更包含以下步驟(1)： (1) 將甲苯進行反應以獲得下式(XIV)之化合物

(式(XIV))，其中m和R如第1項中所定義。 4. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中，該聚乙二醇(PEG)係使用作為反應物以及作為溶劑。 5. 如第3或4項所述之方法，其中在步驟(1)中，甲苯係與二異丁烯或化合物R-X反應，其中R如第1項所定義，X代表鹵素原子。 6. 如第2至5項中任一項所述之方法，其中該步驟(2)中之轉化步驟為自由基反應，使用AIBN(偶氮雙(異丁腈))作為自由基起始劑。 7. 如第1至6項中任一項所述之方法，其中X為氯、碘或溴原子。 8. 如第1至7項任一項所述之方法，其中X為溴原子。 9. 如第2至8項任一項所述之方法，其中在步驟(2)中之轉化係使用N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)作為鹵化試劑。 10. 如前述任一項所述之方法，其中該步驟(4)包含使該式(XIX)化合物在選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑中的溶液，進行一或多次水性洗滌，以從該式(XIX)化合物中移除該未反應之聚乙二醇(PEG)。 11. 如第10項所述之方法，其中該選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑為酯類。 12. 如第11項所述之方法，其中該選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑為乙酸乙酯。 13. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(4)中藉由移除該副產物而純化式(XIX)化合物之步驟，包含將該式(XIX)化合物在包含水和水混溶性有機溶劑之混合物中的溶液，以非極性溶劑洗滌一或多次。 14. 如第13項所述之方法，其中該非極性溶劑包含烷類。 15. 如第14項所述之方法，其中該烷類為己烷、環己烷或庚烷。 16. 如第15項所述之方法，其中該烷類為環己烷。 17. 如前述任一項所述之方法，其中步驟(3)係於不使用該聚乙二醇(PEG)以外之溶劑或稀釋劑之情況下進行。 18. 如前述任一項所述之方法，其中不使用鹵化溶劑。 19. 如前述任一項所述之方法，其不包括在步驟(3)之後使用任何製備級層析法。 20. 如前述任一項所述之方法，其不包括使用任何製備級層析法。 21. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中之反應進行至少10分鐘且不超過1小時。 22. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中之反應進行至少20分鐘且不超過45分鐘。 23. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中之反應進行30分鐘。 24. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中之反應係於55℃至65℃之間的溫度下進行。 25. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中之反應係於60℃的溫度下進行。 26. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中，每莫耳當量(eq.)之該式(XII)化合物係與至少1.0、至少2.0、至少3.0或至少4.0莫耳當量(eq.)之該聚乙二醇(PEG)反應。 27. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中，每莫耳當量(eq.)之該式(XII)化合物係與至少4.5莫耳當量(eq.)之該聚乙二醇(PEG)反應。 28. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟(3)中，每莫耳當量(eq.)之該式(XII)化合物係與至少5.0莫耳當量(eq.)之該聚乙二醇(PEG)反應。 29. 如前述任一項所述之方法，其中該在步驟(3)中使用之聚乙二醇(PEG)之特徵為其在該步驟(3)之反應溫度下為液體。 30. 如前述任一項所述之方法，其中該方法係以產生至少100 g、至少1 kg、至少10 kg、至少100 kg或至少1000 kg之該式(XIX)化合物之規模進行。 31. 如第2至30項中任一項所述之方法，其中步驟(2)所得之式(XII)化合物係由溶劑中沉澱出。 32. 如第31項所述之方法，其中該溶劑為醇類溶劑。 33. 如第31至32項中任一項所述之方法，其中該溶劑為極性溶劑。 34. 如第32至33項中任一項所述之方法，其中該醇類溶劑選自於由異丙醇、乙醇、甲醇和丁醇或其組合組成之群組。 35. 如第32至34項中任一項所述之方法，其中該醇類溶劑為二級醇。 36. 如第32至35項中任一項所述之方法，其中該醇類溶劑為異丙醇。 37. 如第32至33項中任一項所述之方法，其中該溶劑為乙腈。 38. 如第2至37項中任一項所述之方法，其中在步驟(2)和步驟(3)之間進行該式(XII)化合物之至少一次再結晶。 39. 如第38項所述之方法，其中如第31至37項中任一項所使用之溶劑係使用作為步驟2和步驟3之間的再結晶步驟之溶劑。 40. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟3之後進行至少1次、至少2次、至少3次或至少4次水性洗滌。 41. 如前述任一項所述之方法，其中在步驟3之後進行4至6次水性洗滌。 42. 一種純化式(XIX)化合物之方法，

式(XIX)，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基，係自包含該式(XIX)化合物之組成物中純化出，該方法包含將該組成物位於選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑中的溶液，進行一或多次水性洗滌。 43. 如第42項所述之方法，其中該選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之該溶劑為酯類。 44. 如第43項所述之方法，其中該選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑為乙酸乙酯。 45. 如第42至44項中任一項所述之方法，其中該組成物包含聚乙二醇(PEG)。 46. 如第45項所述之方法，其中該式(XIX)化合物之純化包含從該組成物中移除聚乙二醇(PEG)。 47. 如第46項所述之方法，其中該移除聚乙二醇(PEG)包含將該溶液進行一或多次水性洗滌。 48. 如第42至47項中任一項所述之方法，其中該組成物更包含下式(XIII)之化合物：

(式(XIII))，以及其中R如第42項中所定義且n為n≥2之整數。 49. 如第48項所述之方法，其中式(XIX)化合物之純化包含從該組成物中移除式(XIII)化合物。 50. 如第49項所述之方法，其中該式(XIII)化合物之移除包含製備包含該式(XIX)化合物之水溶液，並藉由將該水溶液以非極性溶劑進行一或多次洗滌，而移除該式(XIII)化合物。 51. 如第50項所述之方法，其中該非極性溶劑包含烷類。 52. 如第51項所述之方法，其中該烷類為己烷、環己烷或庚烷。 53. 如第52項所述之方法，其中該烷類為環己烷。 54. 如第1至53項中任一項所述之方法，其中藉由該方法所獲得之式(XIX)化合物之純度，在使用200 nm紫外線偵測之高效液相層析法中測定為至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%，最佳至少95%。 55. 如第1至54項中任一項所述之方法，其中藉由該方法所獲得之式(XIX)化合物之純度，在使用蒸發光散射偵測器(ELSD)偵測之高效液相層析法中測定為至少99%。 56. 如前述任一項所述之方法，更包含辨識出下式(XIII)化合物之步驟：

(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及n為n≥2之整數。 57. 如前述任一項所述之方法，更包含對下式(XIII)之化合物進行定量之步驟：

(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及n為n≥2之整數。 58. 如前述任一項所述之方法，其中A代表包含4至16個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。 59. 如前述任一項所述之方法，其中A代表包含8至10個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。 60. 如前述任一項所述之方法，其中A代表包含9或10個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。 61. 如前述任一項所述之方法，其中R代表具有2至6個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。 62. 如前述任一項所述之方法，其中R代表具有2至6個碳原子之直鏈和2至4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。 63. 如前述任一項所述之方法，其中R代表具有4個碳原子之直鏈和4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。 64. 如前述任一項所述之方法，其中R代表2,4,4-三甲基-戊-2-基。 65. 如前述任一項所述之方法，其中式(XIX)化合物為以下化合物：

其中m等於1，且z為選自以下之整數： z = 1到5。 66. 如前述任一項所述之方法，其中式(XIX)化合物為以下化合物：

其中n為介於4至16之間的整數，較佳其中n等於8、9或10。 67. 一種如下式(XIX)之化合物

(式(XIX))，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基，以及其中該化合物可藉由前述任一項所述之方法獲得。 68. 如第67項所述之化合物，其具有在使用200 nm紫外線偵測之高效液相層析法中測定為至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%，最佳至少95%之純度。 69. 如第67或68項所述之化合物，其具有在使用蒸發光散射偵測器(ELSD)偵測之高效液相層析法中測定為至少99%之純度。 70. 一種使用非極性溶劑萃取和移除下式(XIII)之化合物之用途：

(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及n為n≥2之整數，係自包含該式(XIII)化合物和式(XIX)化合物之組成物中萃取和移除式(XIII)化合物，

式(XIX)，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基。 71. 如第70項所述之用途，其中該非極性溶劑係如第51至53項中任一項所定義。 72. 如第70或71項所述之用途，其中A係如第58至60項中任一項所定義。 73. 如第70至72項中任一項所述之用途，其中R如第61至64項中任一項所定義。 74. 如第70至73項中任一項所述之用途，其中式(XIX)化合物如第65至66項中任一項所定義。

除非下文另有定義，本發明中使用之術語應根據本領域技術人員已知之一般含義來理解。

在此引用之所有文獻、專利案和專利申請案完整併入本文，用於所有目的。定義

「具有脂質包膜之病毒」、「脂質-包膜病毒」和「包膜病毒」等詞在本文中可互換使用，並且具有本領域技術人員已知之含義。例如，脂質包膜病毒可為皰疹病毒科(Herpesviridae)，如偽狂犬病病毒(PRV)、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒或艾斯坦-巴爾病毒(Epstein–Barr virus)；肝炎病毒科(Hepadnaviridae)，如B型肝炎病毒；披膜病毒科(Togaviridae)，例如辛德畢斯病毒(sindbis virus)、德國麻疹病毒或α病毒；沙粒病毒科(Arenaviridae)，如淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒；黃病毒科(Flaviviridae)，例如西尼羅河病毒、牛病毒性下痢病毒(BVDV)、登革熱病毒、C型肝炎病毒或黃熱病病毒；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，如A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、伊薩病毒(isavirus)或索戈託病毒(thogotovirus)；副黏病毒科(Paramyxoviridae)，如仙台病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒或犬瘟熱病毒；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，例如加利福尼亞腦炎病毒或漢他病毒(hantavirus)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，如水泡性口炎病毒或狂犬病毒；絲狀病毒科(Filoviridae)，如伊波拉病毒(Ebola virus)或馬爾堡病毒(Marburg virus)；冠狀病毒科(Coronaviridae)，例如冠狀病毒或嚴重急性呼吸系統症候群(SARS)冠狀病毒或 SARS-CoV-2；博爾納病毒科(Bornaviridae)，例如博爾納病病毒；或動脈病毒科(Arteriviridae)，例如動脈病毒或馬動脈炎病毒；逆轉錄病毒科(Retroviridae)，例如人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類T淋巴細胞病毒1 (HTLV-1)或異嗜性鼠白血病病毒(X-MuLV)；痘病毒科(Poxviridae)，如痘瘡病毒或正痘病毒天花(天花病毒(Variolavirus))。

如本文所用，「使具有脂質包膜之病毒去活化」乙詞係指破壞脂質包膜病毒感染細胞之能力。如本領域技術人員所理解的，脂質包膜病毒感染細胞之能力，即脂質包膜病毒之感染力，通常藉由測定液體中感染性病毒顆粒之數量來評估。因此，本文所用之「使具有脂質包膜之病毒去活化」或「使脂質包膜病毒去活化」等詞係指降低溶液中感染性病毒顆粒之數量。

在本文中，「Log10降低值」或「LRV」等詞與「病毒降低因數」、「降低因數」、「RF」或「R」等詞可互換使用。在一具體實施例中，「Log10降低值」或「LRV」可作為液體中感染性病毒顆粒降低之測量值。如本文所用，「Log10降低值」或「LRV」定義為病毒去活化前之感染性病毒顆粒與病毒去活化後之感染性病毒顆粒之比例對數(以10為底數)。LRV值特異於特定類型之病毒。對於本領域技術人員而言，任何高於零之Log10降低值(LRV)皆有利於增進該方法和製程(例如生物製藥生產方法和製程)之安全性。由本發明之方法達成之Log10降低值(LRV)係以本領域技術人員已知之方法測定。例如，LRV可藉由在液體進行本發明之病毒去活化方法之前和之後，測定該液體中感染性病毒顆粒之數量而確定。

本領域技術人員將了解有許多測量液體中感染性病毒顆粒之方法。例如但不限於，液體中之感染性病毒顆粒濃度可較佳地經由噬斑測定法或經由TCID ₅₀測定法測量，更佳地經由TCID ₅₀測定法來測量。如本文所用，「TCID ₅₀測定法」係指組織培養感染劑量測定法。TCID ₅₀測定法為終點稀釋試驗，其中TCID ₅₀值代表在經接種之細胞培養物中，誘導50%之細胞死亡或產生病理變化所需之病毒濃度。

如本文所用，「界面活性劑」乙詞係指降低兩種液體之間或液體與固體之間的表面張力之化合物。界面活性劑可使用作為清潔劑、潤濕劑、乳化劑、發泡劑和分散劑。

就本發明而言，如「加入(adding to)」、「加至(add to)」或「被加入(added to)」等詞與第一次和第二次提及之溶劑、清潔劑及/或液體相結合，包含以下情況：將第一次提及之溶劑、清潔劑及/或液體加入到第二次提及之溶劑、清潔劑及/或液體中。然而，這些術語也意在涵蓋將第二次提及之溶劑、清潔劑及/或液體加入到第一次提及之溶劑、清潔劑及/或液體中之情況。因此，如「加入(adding to)」、「加至(add to)」或「被加入(added to)」等詞並不意味著要指定第一次提到之溶劑、清潔劑及/或液體加入到第二次提到之溶劑、清潔劑及/或液體中，反之亦然。

如本領域技術人員已知，「清潔劑」乙詞根據其在本領域已知之一般含義使用，並且特別包括可使脂質膜呈可通透之界面活性劑。例如，已發現清潔劑Triton X-100和去氧膽酸鹽可藉由與蛋白質之疏水片段結合來溶解雙性膜蛋白(請參見Simons等人，1973)。清潔劑根據其電荷分為三大類。陰離子清潔劑包含陰離子，即帶負電荷之親水性基團。示範性陰離子清潔劑為十四烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基聚氧乙醚硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、溴化十六基三甲銨(cetrimide)和十六烷基三甲基溴化銨。陽離子清潔劑包含陽離子，即帶正電荷之親水性基團。示範性陽離子清潔劑為苯扎氯銨、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)和氯化苯索寧(benzethonium chloride，BZT)。如本文所用，術語「非離子清潔劑」係指不具正電荷或負電荷之清潔劑。示範性之非離子清潔劑為山梨糖醇酐酯(山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、山梨糖醇酐單硬脂酸酯、山梨糖醇酐三硬脂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、山梨糖醇酐三油酸酯)、聚山梨糖醇酯(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯(Polysorbate 20)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇單油酸酯(Tween 80/聚山梨糖醇酯80))、泊洛沙姆(poloxamers)(泊洛沙姆407、泊洛沙姆188)和克雷莫佛(cremophor)。本發明之清潔劑如較佳具體實施例中具體所述者。

如本文所用，「非酚類」乙詞與「不含酚」乙詞可互換使用。本發明之非酚類清潔劑係指不含任何酚官能團之清潔劑。

「芳族」乙詞具有本領域技術人員已知之含義。不是芳族的清潔劑係指不含任何芳環之清潔劑。

如本文所用，「與環境相容」乙詞具有本領域技術人員已知之含義。在本發明之較佳具體實施例中，關於清潔劑，「與環境相容」乙詞表示該清潔劑不會作為內分泌干擾物。內分泌干擾物為外源性物質，會改變內分泌系統之功能，因而對完整之生物體或其後代或(亞)群體造成不利之健康影響。技術人員會知道各種辨識內分泌干擾物之方法。有關內分泌干擾物及其評估之更多資訊可見於例如ECHA之「辨識乙氧基化之4-(1,1,3,3-四甲基丁基)酚為高度關注之物質，因為它們降解為具有內分泌干擾特性之高度關注之物質(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)酚)，它們可能會對於環境造成嚴重影響，引起與CMR和PBT/vPvB同等的關注」，於2012年12月12日採用之支持文件，於此全文併入並用於所有目的；或見於國際衛生組織之國際化學品安全計劃公開之「內分泌干擾物之最新科學之全球評估」(WHO/PCS/EDC/02.2)中，於此全文併入並用於所有目的。

如本文所用，「生物醫藥產物」乙詞為本領域已知，並且係指一種產物，其活性物質為生物物質，例如，由哺乳動物細胞或微生物製造之生物物質。如本文所用，本發明方法中使用之生物醫藥產物不限於最終製造之產物，但較佳亦包括製造過程之任何階段之中間產物。

如本文所用，「生物製藥藥物」乙詞具有本領域技術人員已知之含義。生物製藥藥物包括重組生物製藥藥物和從其他來源(如人類血漿)獲得之生物製藥藥物。

如本文所用，「深度過濾器」乙詞具有本領域已知之含義。特別為，此種過濾器(例如梯度-密度之深度過濾器)可在該過濾材料的深度內達成過濾。此類過濾器之常見類別為包含黏合纖維(或以其他方式固定)之隨機基質，以形成複雜、曲折之流動通道迷宮者。這些過濾器中之顆粒分離通常是由於纖維基質之捕捉或吸附所致。深度過濾器可由多種材料組成，包括但不限於纖維素或聚丙烯纖維之纖維床、纖維墊、織造或非織造織物，或合成纖維例如尼龍或人造絲，例如Miracloth® (Calbiochem，La Jolla，加利福尼亞州)，以及助濾劑或「基質」，例如紙、塑膠、金屬、玻璃、玻璃纖維、尼龍、聚烯烴、碳、陶瓷、矽藻土、纖維素或矽藻土(diatomite)(微小藻類(矽藻)之骨骼殘骸，其在高於海平面之海洋沉積物中發現)。

本文所用「純化生物製藥藥物」乙詞具有本領域技術人員已知之含義，係指將生物製藥藥物與本發明混合物中可能包含之其他物質分離。在本發明之一較佳具體實施例中，「純化生物製藥藥物」乙詞係指將生物製藥藥物與本發明之清潔劑分離。

「層析法」乙詞根據本領域已知之含義使用。其包括將感興趣之分析物(例如目標分子，如生物製藥藥物)與混合物中存在之其他分子分離之任何層析技術。通常，由於混合物中各分子在動相影響下遷移通過靜相介質之速率不同，或在結合和沖提過程中，感興趣之分析物係與其他分子分離。

「層析樹脂」和「層析介質」等詞在本文中可互換使用，係指將感興趣之分析物(例如目標分子，如生物製藥藥物)與存在於混合物中之其他分子分離之任何相種類(例如，固相)。通常，由於混合物中各分子在動相影響下遷移通過靜相介質之速率不同，或在結合和沖提過程中，感興趣之分析物係與其他分子分離。各種類型之層析介質實例包含，例如，陽離子交換樹脂、陽離子交換膜、親和樹脂、陰離子交換樹脂、陰離子交換膜、疏水性交互作用樹脂和離子交換單塊。

如本文所用，「藥物配方」乙詞具有本領域技術人員已知之含義，並且指適合投予患者之任何配方。可根據本領域已知之方法製備藥物配方。例如，對於存在於配方中之任何生物製藥藥物，技術人員將能夠選擇和加入較佳之額外成分，包括緩衝劑、穩定劑、界面活性劑、抗氧化劑、螯合劑及/或防腐劑等。

如本文所用，「溶劑/清潔劑混合物」具有本領域技術人員已知之含義。在較佳之具體實施例中，根據本發明使用之溶劑/清潔劑混合物包含至少一種除水之外的溶劑和至少一種清潔劑。根據本發明使用之溶劑較佳為有機溶劑，最佳為磷酸三正丁酯。混合物中包含的不同溶劑及/或清潔劑之數量沒有特別限制。例如，溶劑/清潔劑混合物可由磷酸三正丁酯、聚山梨醇酯80和本發明之聚氧乙烯醚清潔劑組成。

應當理解，當在本發明中用於指示數值範圍時，「介於」乙詞包含各範圍之指示下限和上限。例如，當溫度指示介於0℃至10℃之間時，這包含 0℃和10℃之溫度。類似地，當變量x指示為介於4至16之間的整數時，包含整數4和16。

如本文所用，術語如「包含(comprising)」或「包含(comprises)」每次出現時可任擇地替換為「由……組成(consisting of)」或「由……組成(consists of)」。具體實施例

本發明相關於聚氧乙烯和聚氧丙烯醚清潔劑及其製備和純化方法，以及相關於這些清潔劑用於使病毒去活化之方法和用途。

Triton-X100之毒性活性來自其酚部分，其能夠停靠在海洋生物之某些內分泌受體上。藉由在芳環和PEG鏈之間插入亞甲基，Triton-X100之酚官能基不再存在於式XIX之新結構中。此外，一旦PEG鏈在釋放到環境中後斷裂，所暴露出之苯甲醇很容易氧化成相對應之苯甲酸。這種代謝物與酚衍生物具有完全不同之極性和幾何結構，這將降低與內分泌受體之結合。

基於上述考量，本發明人合成了非酚類聚氧乙烯醚並測試其抗病毒活性(請參見實施例1至9)。

因此，在一態樣中，本發明提供下式(XIX)之非酚類聚氧乙烯醚：

式(XIX) 其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基。

本發明亦提供下式(XIX)之非酚類聚氧乙烯醚：

式(XIX) 其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基，任擇地具條件為排除具有以下結構式之29-[4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九噁烷二十九烷-1-醇。

在式(XIX)中，R代表具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個、最佳4個碳原子，以及一或多個、較佳2至6個、最佳4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。

較佳地，R代表具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個、且最佳4個碳原子之直鏈，以及2個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基；具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個且最佳4個碳原子之直鏈和4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基；或具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個且最佳4個碳原子之直鏈和6個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。

最佳地，R代表2,4,4-三甲基-戊-2-基。

在式(XIX)中，A代表聚氧乙烯殘基，較佳為包含2至20個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基，更佳為包含4至16個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基，尤佳為包含8至12個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基，最佳為包含9或10個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。

式(XIX)化合物之較佳具體實施例為其中R代表具有2至6個碳原子之直鏈和2至4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基；m=1，且A代表包含8至12個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基之化合物。

式(XIX)化合物之一特定較佳具體實施例為以下化合物：

其中m等於1，z為選自以下之整數： z = 1到5。

式(XIX)之化合物之另一特定較佳具體實施例為以下化合物：

4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物其中n為介於4至16之間的整數，較佳地其中n等於8、9或10。

聚氧乙烯醚為本領域技術人員已知並具有以下如式A之結構：

(式A)；其中n等於或大於1。

本領域技術人員將清楚，聚氧丙烯醚可具有與本發明之聚氧乙烯醚非常相似的性質，且可以相對應之方式製備和純化。因此，根據本發明之所有其他具體實施例，例如在本發明之所有方法中，該聚氧乙烯醚可被聚氧丙烯醚代替。

聚氧丙烯醚亦為本領域技術人員已知且具有以下如式B之結構：

(式B)；其中n為n≥2之整數。

因此，在另一態樣中，本發明提供下式(XIX)之非酚類聚氧丙烯醚：

較佳地，R代表具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個且最佳4個碳原子之直鏈，以及2個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基；具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個且最佳4個碳原子之直鏈，以及4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基；或具有2至12個、較佳2至8個、更佳2至6個且最佳4個碳原子之直鏈，以及6個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。

最佳地，R代表2,4,4-三甲基-戊-2-基。

在本發明之式(XIX)之又一態樣中，A代表一聚氧丙烯殘基，較佳為包含2至20個氧丙烯單元之聚氧丙烯殘基，更佳為包含4至16個氧丙烯單元之聚氧丙烯殘基，尤佳為包含8至12個氧丙烯單元之聚氧丙烯殘基，最佳為包含9或10個氧丙烯單元之聚氧丙烯殘基。

式(XIX)化合物之較佳具體實施例為其中R代表具有2至6個碳原子之直鏈和2至4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基；m=1，且A代表包含8至12個氧丙烯單元之聚氧丙烯殘基之化合物。

如本文所指出，本發明之「聚氧乙烯醚」較佳為本領域中一般含義之聚氧乙烯醚。或者，本發明之聚氧乙烯醚也可以為聚氧醚，其中聚氧醚分子總數之一部分，較佳為大部分，為聚氧乙烯醚分子，但其中聚氧醚分子總數之另一部分，較佳為少部分，為包含氧乙烯與氧丙烯單元之混合聚合物，及/或包含氧丙烯單元之聚合物。在這種情況下，「聚氧醚分子總數之大部分為聚氧乙烯醚分子」乙詞係指聚氧醚分子總數之至少50%為聚氧乙烯醚分子。較佳地，聚氧醚分子總數之至少60%為聚氧乙烯醚分子。更佳地，聚氧醚分子總數之至少70%為聚氧乙烯醚分子。尤佳地，聚氧醚分子總數之至少80%為聚氧乙烯醚分子。又更佳地，聚氧醚分子總數之至少90%為聚氧乙烯醚分子。最佳地，聚氧醚分子總數之至少95%為聚氧乙烯醚分子。又或者，本發明之聚氧乙烯醚也可以為混合聚氧醚，包含大部分(例如至少60%，較佳至少70%，更佳至少80%，尤佳至少90%，以及最佳至少95%)之氧乙烯單元和少部分之氧丙烯單元。

本發明之清潔劑為非酚類。

根據本發明，式(XIX)之化合物可如較佳具體實施例中所示製備和純化。

因此，本發明包含製備和純化下式(XIX)之化合物的方法

(式(XIII))，其中R如上所定義且n為n≥2之整數；以及 (4) 藉由從中移除未反應之聚乙二醇(PEG)和該副產物而純化出該式(XIX)化合物。

在該步驟(3)之前可更包含以下步驟(2)： (2) 將下式(XIV)之化合物，

(式(XIV))，其中m和R如請求項1中所定義，轉化為下式(XII)之化合物

式(XII)，其中m、R和X如請求項1中所定義。

此外，該方法在該步驟(2)之前更可包含下列步驟(1)： (1) 使甲苯反應以獲得下式(XIV)之化合物

(式(XIV))，其中m和R如請求項1中所定義。

本發明之較佳方法為對如下所示之流程2之修改。本發明之該方法提供的優點為合成僅需三步驟，無需層析純化，因而降低所需溶劑之體積，避免使用昂貴的化學物(如Tf ₂O、Pd催化劑)、有毒的化學物(如辛基酚、Zn(CN) ₂、DMF、MsCl)和危險的化學物(例如LiAlH ₄)，並適合大規模實施。

在Friedel-Craft烷基化中常用之酸，例如硫酸，可使用作為步驟(1)反應之催化劑。催化劑較佳為全氟烷基磺酸，更佳為七氟-1-丙磺酸、三氟甲磺酸(triflic acid)或九氟-1-丁磺酸。

可用於步驟(2)之轉化的鹵化試劑可選自於本領域已知之鹵化試劑。較佳之試劑包括 - N-鹵代琥珀醯亞胺，例如N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)、 - 溴、 - 合適之溴錯合物試劑，例如溴-1,4-二噁烷錯合物、 - 合適之三溴化物錯合物試劑，例如四丁基三溴化銨、三甲基苯基三溴化銨、芐基三甲基三溴化銨、溴化吡啶鎓過溴化物、4-二甲基胺基溴化吡啶鎓過溴化物、1-丁基-3-甲基咪唑鎓三溴化物和1,8-二吖雙環[5.4.0]-7-十一烯氫三溴化物、 - 二溴異三聚氰酸、 - 三溴異三聚氰酸、 - 1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷、 - N-溴酞醯亞胺，以及 - 次溴酸鹽。

最佳之鹵化試劑為N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)。

可用於步驟(2)之轉化的自由基起始劑可適當地選自於本領域已知之物理性和化學性自由基起始劑。它們包括，例如，光、AIBN(偶氮雙(異丁腈)、過氧化苯甲醯、二-第三-丁基過氧化物、過氧化甲基乙酮、過氧化丙酮、過氧化二硫酸鹽或其衍生物之一。最佳為AIBN(偶氮雙(異丁腈))。

可用於步驟(2)之轉化的較佳溶劑為環己烷和乙腈。庚烷、乙酸乙酯、CCl4和苯亦可使用作為步驟(2)之轉化的溶劑。

在本發明之一較佳具體實施例中，將步驟(2)中得到之式(XII)化合物從溶劑中沉澱出。較佳地，該溶劑為極性溶劑。在一較佳具體實施例中，溶劑較佳選自於由異丙醇、乙醇、甲醇和丁醇或其組合組成之群組的醇類溶劑。更佳地，該醇類溶劑為二級醇，例如異丙醇。在另一較佳具體實施例中，溶劑為乙腈。水會增加溶劑之極性。因此，根據本發明使用之極性溶劑也可以包含水。因此，根據本發明使用之極性溶劑可為例如包含(i)水和(ii)如上所示之醇類及/或乙腈之溶劑混合物。

醇類溶劑可能與式(XII)之鹵化中間產物反應，而形成醚類副產物。一級醇傾向於發生此種反應，而二級醇如異丙醇則不太容易形成這種副產物，因此較有利。非醇類溶劑如乙腈也可用於避免此種醚類副產物，因此也較有利。

極性溶劑為本領域已知。介電常數高於15.0之溶劑通常被認為是極性。此種極性溶劑實例為異丙醇、乙醇、甲醇和丁醇，以及乙腈。如本文所用，本文所指之介電常數值係指在20℃之參考溫度下測量之介電常數。

應了解到，本領域技術人員可適當地選擇步驟(3)中可使用之聚乙二醇(PEG)。此種聚乙二醇(PEG)沒有特別限制。較佳地，聚乙二醇(PEG)之特徵在於其在該步驟(3)之反應溫度下為液體。可用於步驟(3)之較佳聚乙二醇(PEG)包含平均分子量在150至1000道耳吞之間之PEG。更佳地，可用於步驟(3)之聚乙二醇(PEG)選自於由PEG200、PEG400、PEG600、PEG800和PEG1000組成之群組。最佳地，該聚乙二醇(PEG)為PEG400。

式(XIII)化合物為步驟(3)中PEG化反應之副產物。在步驟(4)中，式(XIX)化合物係藉由從中移除該式(XIII)副產物而純化。基於對於本發明提供之式(XIX)和式(XIII)化合物之背景知識，以及基於這兩種化合物之間的差異，可理解本領域技術人員將能夠藉由適當之方法步驟移除式(XIII)副產物。例如，由於式(XIII)副產物具雙功能性，其比式(XIX)化合物更大且極性更小。因此，在步驟(4)中，式(XIX)化合物可藉由使用基於尺寸及/或基於極性之純化方法，從中移除該副產物而純化。在一較佳具體實施例中，在步驟(4)中藉由從中移除該副產物而純化該式(XIX)化合物之步驟，包含藉由將式(XIX)化合物位於包含水和水混溶性有機溶劑之混合物中的溶液，以非極性溶劑洗滌一或多次，而自該式(XIX)化合物中移除該副產物。

如本文所用之水混溶性有機溶劑為本領域已知，且尤其包含以下溶劑：乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇胺、二亞乙基三胺、二甲基甲醯胺、二甲氧基乙烷、二甲基亞碸、1,4-二噁烷、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘油、甲醇、甲基二乙醇胺、甲基異氰化物、N-甲基-2-吡咯烷酮、1-丙醇、1,3-丙二醇、1,5-戊二醇、2-丙醇(異丙醇)、丙酸、丙二醇、吡啶、四氫呋喃和三乙二醇。

較佳地，該式(XIX)之化合物位於包含水和水混溶性有機溶劑之混合物中的溶液為該式(XIX)之化合物位於醇和水之混合物中的溶液。更佳地，該式(XIX)化合物溶液為該式(XIX)化合物在乙醇和水之混合物中的溶液。應當理解，本領域技術人員可容易地確定此種混合物之合適混合比例。乙醇和水之混合物的示範性混合比例介於50:1(v/v)至10:1(v/v)之間，較佳為20:1(v/v)。

非極性溶劑為本領域已知。介電常數小於15.0之溶劑通常被認為是非極性。較佳地，用於該洗滌之非極性溶劑之介電常數小於5.0，更佳小於2.5。此類之更佳溶劑實例為己烷、環己烷和庚烷。如本文所用，本文所指之介電常數值係指在20℃之參考溫度下測量之介電常數。

本發明亦提供一種純化式(XIX)化合物之方法，

式(XIX)，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基，係自包含該式(XIX)化合物之組成物中純化出，該方法包含將位於選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑中之該組成物溶液，進行一或多次水性洗滌。

較佳地，該組成物更包含下式(XIII)化合物：

(式(XIII))，其中R如請求項37中所定義且n為n≥2之整數。較佳地，式(XIX)化合物之純化包含從該組成物中移除式(XIII)化合物。更佳地，式(XIII)化合物之移除包含製備包含該式(XIX)化合物之水溶液，並將該水溶液以非-極性溶劑進行一或多次洗滌而移除該式(XIII)化合物。非極性溶劑如上所定義，且可用於本發明之水溶液包含水，且較佳為該式(XIX)化合物位於包含水和水混溶性有機溶劑之混合物中的溶液。該式(XIX)化合物位於包含水和水混溶性有機溶劑之混合物中的較佳溶液如上述所定義。

在本發明方法之一較佳具體實施例中，這些方法包含辨識及/或定量具下式(XIII)之化合物之步驟：

(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，且n為n≥2之整數。此種辨識可藉由本領域已知之用於化學化合物之結構辨識之任何合適的方法進行，包括例如 ¹H-NMR測量。其他NMR測量如 ¹³C-NMR或2D NMR也可用於辨識。此外，HRMS(高解析度質譜)亦可用於辨識。該式(XIII)化合物之定量可經由本領域已知之用於定量化學化合物之任何合適方法進行，包括例如使用UV偵測之高效液相層析法和使用蒸發光散射偵測器(ELSD)偵測之高效液相層析法。

一般而言，根據本發明，使用UV偵測之高效液相層析法較佳使用200 nm之UV偵測進行。更佳地，根據本發明，使用UV偵測之高效液相層析法較佳使用實施例3之HPLC方法1和2中指示之方法設定進行，更佳使用實施例3之HPLC方法2中指示之方法設定。

較佳地，根據本發明，使用蒸發光散射偵測器(ELSD)偵測之高效液相層析法係使用實施例3之HPLC方法2中指示之方法設定進行。

用於實施例3之HPLC方法2之設定如下： HPLC：Agilent 1260 管柱：Zorbax 300SB-C3，5 μm，2.1 x 150 mm (V= 0.520 mL) 沖提液：水(A)、乙腈 (B) 梯度沖提：35%B (0分鐘) --＞ 35%B (4分鐘) --＞ 97%B (20分鐘) --＞ 97%B (25分鐘) 駐留時間(post time)：8分鐘流速：0.5 mL/分鐘管柱溫度：25℃ 注射體積：5 μL 偵測：波長為200 nm之UV，或ELSD

用於製備和純化本發明清潔劑之本發明較佳方法尤其提供以下優點： l 無需層析純化，有機溶劑之總用量大幅降低。 l 不需要二氯甲烷等危險溶劑。 l 此外，純化程序可在短時間內完成；總合成成本被最小化。 l 第3步驟不需要溶劑：該流程易於執行，且可使後處理過程中存在之不同溶劑之數量最小化。 l 總產率與其他方法相當，但該過程比同類方法更有效率，因為它實施的成本更低、執行速度更快且浪費更少。 l 可藉由數種方式有效降低雙功能性副產物之量，例如：藉由使用非極性溶劑如己烷或環己烷萃取產物，及/或在步驟(3)期間使用高(例如至少4、至少4.5或至少5)莫耳當量之PEG。 l 由於上述原因，本發明之較佳方法可輕易地以工業規模實施，因而允許使用標準設備生產公斤量級之純產物。

或者，本發明之聚氧乙烯醚清潔劑可以如乙氧基化反應合成。乙氧基化為基於醇類進行之工業製程，以生成醇類乙氧化物(又名聚氧乙烯醚)。反應藉由使環氧乙烷在高溫(例如，約180℃)和高壓(例如，在1至2巴之壓力)下通過醇類，以鹼(例如氫氧化鉀，KOH)作為催化劑而進行。該製程為高度放熱。

該反應導致形成具有廣重複單元長度多分散性之產物(上述方程式中之n值為平均聚合物長度)。

雖然本發明之化合物可為聚氧乙烯醚(=以環氧乙烷氣體進行乙氧基化反應)，但也可以使用環氧丙烷以工業規模進行類似之反應(=丙氧基化)。唯一之區別為PEG鏈中之甲基取代反應：

乙氧基化和丙氧基化也可以在同一製程中組合並產生混合產物，例如包含氧乙烯和氧丙烯單元之混合聚合物聚氧醚。

在實驗室規模上，聚氧乙烯醚清潔劑可首先由醇之羥基形成良好之離去基(例如Cl、Br、I、OMs或OTf)，之後將此受質與單去質子化之聚乙二醇反應而生產。或者，一個良好之離去基(例如Cl、Br、I、OMs或OTf)可位於聚乙二醇鏈上，該鏈在第二步驟中與去質子化之醇類反應。

合成聚氧乙烯醚之示範性方法詳細描述於例如美國專利號1,970,578和Di Serio等人(2005)之文獻，其經由引用整體併入本文，用於所有目的。

式(XIX)之化合物亦可經由已知之合成方法合成，例如在Vogel‘s Textbook of Practical Organic Chemistry (5th Edition，1989，A.I. Vogel，A.R. Tatchell，B.S. Furnis，A.J. Hannaford，P.W.G. Smith)中描述者。例如，4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物可藉由以下來製備：將包含有對應於式(XIX)之基團R的取代基之酚，轉化為相對應之苯甲酸或高苯甲酸(homobenzoic acid)，將該酸基還原為醇基，並使該醇反應以形成聚乙二醇醚(也稱為聚氧乙烯醚；POE醚) 。在本文中，環氧乙烷或合適之聚乙二醇可作為引入聚乙二醇醚官能團之基礎(流程1；有效進行個別轉化之實驗程序之代表性實例可見於例如Bioorganic & Medicinal Chemistry，16(9)，4883-4907，2008；Journal of Medicinal Chemistry，48(10)，3586-3604，2005；Journal of Physical Chemistry B，107(31)，7896-7902；2003；Journal of Nanoparticle Research，15(11)，2025/1-2025/12，12 pp.，2013；以及PCT Int. Appl.，2005016240，24 Feb 2005)。

或者，式(XIX)化合物可藉由甲苯之烷基化，之後將芐基甲基進行官能基化並進一步反應形成聚乙二醇醚(流程2；有效進行個別轉化之實驗程序之代表性實施例可見於例如Russian Journal of Applied Chemistry，82(6)，1029-1032，2009；Journal of Organic Chemistry，79(1)，223-229，2014；以及Chemistry - A European Journal，23(60)，15133-15142，2017))。亦設計苯甲醇之直接烷基化，以獲得適用於引入聚乙二醇醚官能基之中間產物(流程3；相對應之轉化實驗流程代表性實例可見於Russian Journal of Organic Chemistry，51(11)，1545-1550，2015)。

上述具有式(XIX)結構之聚氧乙烯醚可用於本發明之使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中。

如上所述，且如本領域之技術人員將瞭解的，聚氧乙烯醚之合成通常產生具有廣聚氧乙烯重複單元長度多分散性之產物。因此，當聚氧乙烯重複單元數目用於指稱本發明之聚氧乙烯醚時，該數目指的是平均聚氧乙烯重複單元之長度，四捨五入到最接近之整數。平均聚氧乙烯重複單元長度係指樣本中所有聚氧乙烯醚之分子之聚氧乙烯重複單元之平均數量，四捨五入到最接近之整數。這同樣適用於聚氧丙烯醚。例如，若在本發明使用之配方中，聚氧乙烯或聚氧丙烯重複單元之數量為n=10，這意味著，所有聚氧乙烯醚或聚氧丙烯醚分子之聚氧乙烯或聚氧丙烯重複單元之平均數量，四捨五入至最接近之整數為10。

本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，使用之聚氧乙烯醚或聚氧丙烯醚清潔劑，具有聚氧乙烯或聚氧丙烯重複單元數之平均數量為2至100、2至50、2至20、或4至16、或9或10。較佳地，聚氧乙烯或聚氧丙烯重複單元之平均數量為4至16，更佳為9或10，最佳為10。

本領域技術人員將了解，在本發明之聚氧乙烯/聚氧丙烯醚清潔劑中，甲基可連接到聚氧乙烯/聚氧丙烯部分之末端羥基上(即末端羥基可被阻斷)。此種末端羥基之阻斷可促進合成。這對於不經由乙氧基化或丙氧基化製備之化合物，例如根據以上流程1或流程2製備之化合物，特別有用。具有甲基阻斷之聚氧乙烯/聚氧丙烯部分之結構通常稱為mPEG衍生物，如以下示範性結構所示：

聚乙二醇(PEG) 甲氧基聚乙二醇(mPEG)

本領域技術人員將了解，聚氧丙烯醚之合成通常也產生具有廣聚氧丙烯重複單元長度多分散性之產物。因此，當本發明中指出聚氧丙烯醚之聚氧丙烯重複單元之數目時，該數目係指平均聚氧丙烯重複單元長度。如上針對聚氧乙烯醚所述，平均聚氧丙烯重複單元長度係指樣本中所有聚氧丙烯醚分子之聚氧丙烯重複單元之平均數量。

根據本發明使用之聚氧丙烯醚清潔劑具有聚氧丙烯重複單元平均數為2至100、2至50、2至20、或5至15、或9或10。較佳地，該聚氧丙烯重複單元之平均數為5至15，更佳為9或10，最佳為10。

本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法，包含將本發明之清潔劑加到液體中，以製備該清潔劑和該液體之混合物之步驟，以及將該混合物靜置以去活化該病毒之步驟。如上所述，本文所用之「使具有脂質包膜之病毒去活化」乙詞係指降低溶液中感染性病毒顆粒之濃度。在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，較佳該方法達成至少一種病毒之1 Log10降低值(LRV)為至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至少7、或至少8，最佳至少一種病毒達到至少4 Log10降低值(LRV)。當然，對於本領域技術人員顯而易見的，至少一種病毒之任何Log10降低值(LRV)都為有益，因為其提高例如生物製藥生產製程之安全性。本發明所指之LRV為包膜病毒之LRV。

應當理解，雖然本發明之方法通常用於使脂質包膜病毒去活化，但本發明之清潔劑亦可使無包膜病毒去活化，例如若此類無包膜病毒在其複製週期之某個階段獲得脂質包膜即可。因此，「使具有脂質包膜之病毒去活化」乙詞並不意味著在本發明之方法中，除了具有脂質包膜的病毒之外，排除無包膜病毒也可以被去活化之可能性。

在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，將本發明之清潔劑加入到液體中，以製備該清潔劑和該液體之混合物，並將該混合物靜置以使該病毒去活化。應當理解，本發明方法之該液體可為任何一種液體或數種液體之混合物，包括溶液、懸浮液或數種懸浮液及/或溶液之混合物。例如，但不限於，本發明之液體可為血液或可以包含血液或血液成分，可為血漿或可包含血漿或血漿成分，可為血清或可包含血清或血清成分，可為細胞培養基或可含有細胞培養基，可為緩衝液或可含有緩衝液。該液體也可以為製程之中間產物，例如製備生物製藥藥物之製程中間產物。

本發明之液體可能含有具有脂質包膜之病毒，或者可能懷疑含有具有脂質包膜之病毒(例如，如果其為血液或含有血液或血液成分、血漿或含有血漿或血漿成分、血清或含有血清或血清成分，或者如果其含有在細胞培養中產生之生物製藥藥物)。在本發明之所有其他具體實施例之本發明較佳具體實施例中，本發明之該液體含有具有脂質包膜之病毒。在本發明液體中的該具有脂質包膜之病毒來源沒有特別限制。例如，病毒可源自用於製備本發明液體之人類血液、人類血漿或人類血清，或源自可用於製備本發明液體之細胞培養基。特別地，如果病毒源自用於製備本發明液體之細胞培養基，則該病毒可源自該細胞培養基之動物衍生成分，例如牛血清白蛋白。

在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，在液體中加入清潔劑以製備該清潔劑和該液體之混合物。該清潔劑為本發明之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚。

在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，在液體中加入清潔劑以製備該清潔劑和該液體之混合物。在本發明之一具體實施例中，將聚氧乙烯或聚氧丙烯醚清潔劑加入到液體中，以產生最終濃度約0.03% (w/w)至10% (w/w)，較佳約0.05% (w/w) 至10% (w/w)，更佳0.1% (w/w)至10% (w/w)，尤佳約0.5% (w/w)至5% (w/w)，最佳約0.5% (w/w)至2% (w/w)之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚清潔劑於該液體中。

在本發明之用於使具有脂質包膜的病毒去活化之方法之較佳具體實施例中，該方法中使用之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚適合用於使該具有脂質包膜之病毒去活化。本文所用之去活化係指破壞脂質包膜病毒感染細胞之能力。本領域技術人員將了解，脂質包膜病毒感染細胞之能力，即脂質包膜病毒之感染力，通常經由測定溶液中感染性病毒顆粒之數量來評估。本文描述用於測定溶液中感染性病毒顆粒數量之示範性方法。

在一具體實施例中，在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，將包括本發明之非酚類清潔劑和溶劑之清潔劑加入液體中之步驟，係以製備用於使該病毒去活化之溶劑/清潔劑混合物之方式進行。較佳地，該溶劑為有機溶劑，更佳地，該溶劑為磷酸三正丁酯。應當理解，清潔劑之濃度以及溶劑之類型和濃度可由技術人員適當地選擇，例如考慮到液體中存在之潛在病毒、所需之LRV、可能存在於液體中之生物製藥藥物之性質，以及可能存在於液體中之生物製藥藥物之製造過程之特徵(例如，在何種溫度下進行去活化)。通常，在本發明之靜置過程中，有機溶劑和單一清潔劑之最終濃度為約0.01% (w/w)至約5% (w/w)之有機溶劑和約0.05% (w/w))至約10% (w/w)之清潔劑，較佳約0.1% (w/w)至約5% (w/w)之有機溶劑和約0.1%(w/w)至約10% (w/w)之清潔劑，更佳約0.1% (w/w)至約1% (w/w)之有機溶劑和約0.5% (w/w)至約5% (w/w)之清潔劑，最佳約0.1% (w/w)至約0.5% (w/w)之有機溶劑和約0.5% (w/w)至約2% (w/w)之清潔劑。

在另一具體實施例中，在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，在液體中加入包括本發明之非酚類清潔劑(以及任選之溶劑)之清潔劑之步驟，係以在液體中加入其他清潔劑之方法進行。較佳地，該其他清潔劑為聚氧乙烯(80)山梨糖醇酐單油酸酯(也稱為例如聚山梨醇酯80或TWEEN 80)。較佳地，該溶劑為有機溶劑，更佳地，該溶劑為磷酸三正丁酯。應當理解，本發明之清潔劑濃度、其他清潔劑之類型和濃度，以及溶劑之類型和濃度，可由技術人員適當地選擇，例如考慮到液體中存在之潛在病毒、所需之LRV、液體中可能存在之生物製藥藥物特性，以及可能存在於液體中之生物製藥藥物之製造過程之特徵(例如，在何種溫度下進行去活化)。通常，有機溶劑之最終濃度為約0.01% (w/w)至約5% (w/w)，本發明清潔劑之最終濃度為約0.05% (w/w)至約10% (w/w)，其他清潔劑之最終濃度為約0.01% (w/w)至約5% (w/w)。較佳地，有機溶劑之最終濃度為約0.1%(w/w)至約5%(w/w)，本發明之清潔劑最終濃度為約0.1%(w/w)至約10% (w/w)，其他清潔劑之最終濃度為約0.1% (w/w)至約5% (w/w)。更佳地，有機溶劑之最終濃度為約0.1% (w/w)至約1% (w/w)，本發明清潔劑之最終濃度為約0.5% (w/w)至約5% (w/w)，以及其他清潔劑之最終濃度為約0.1% (w/w)至約1% (w/w)。最佳地，有機溶劑之最終濃度為約0.1% (w/w)至約0.5% (w/w)，本發明清潔劑之最終濃度為約0.5% (w/w)至約2% (w/w)，其他清潔劑之最終濃度為約0.1% (w/w) 至約0.5% (w/w)。

在本發明之另一具體實施例中，僅使用一種清潔劑。例如，在本發明方法之一具體實施例中，在步驟a)中，除了本發明之清潔劑之外不加入其他清潔劑。在本發明方法之另一具體實施例中，在該方法中，除了本發明之清潔劑之外不加入其他清潔劑。在本發明之另一具體實施例中，使用本發明清潔劑於使具有脂質包膜之病毒去活化之方法之用途中，除了本發明之清潔劑之外不使用其他清潔劑。這些具體實施例的優點之一為單一清潔劑可在隨後之(方法)步驟中更容易地移除。例如，與標準溶劑/清潔劑(S/D)處理中使用之三種成分(通常包含兩種清潔劑和一種溶劑，特別是有機溶劑)相比，單一清潔劑可更容易地移除。因此，在本發明之另一具體實施例中，包含本發明清潔劑之組成物不包含除該清潔劑之外之任何其他清潔劑。

在該使病毒去活化之方法的另一具體實施例中，不使用有機溶劑。例如，在本發明使病毒去活化方法之一具體實施例中，在步驟a)中不加入有機溶劑。在本發明之另一具體實施例中，使用本發明清潔劑於使具有脂質包膜之病毒去活化之方法的用途中，不使用有機溶劑。在本發明之另一具體實施例中，包含本發明清潔劑之組成物不包含任何有機溶劑。

如上所述，本發明使具有脂質包膜之病毒去活化的方法，在生物製藥生產過程中特別有用，其中必須確保最終產物中不存在活性(即感染性)病毒，以確保患者安全。因此，在一具體實施例中，在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，將本發明清潔劑加入包含生物醫藥產物或生物製藥藥物，較佳為生物製藥藥物之液體中。在本發明之一較佳具體實施例中，該生物製藥藥物不為病毒疫苗。本發明之生物製藥藥物沒有特別限制。它們包含重組性生物製藥藥物和其他來源之生物製藥藥物，例如從人類血漿中獲得之生物製藥藥物。本發明之生物製藥藥物包含但不限於血液因子、免疫球蛋白、替代用酵素、疫苗、基因治療載體、生長因子及其受體。在一較佳具體實施例中，該生物製藥藥物為治療性蛋白質。較佳之血液因子包含凝血因子I(纖維蛋白原)、凝血因子II(凝血酶原)、組織因子、凝血因子V、凝血因子VII和凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、von Willebrand因子(VWF)、前激肽釋放素、高分子量激肽原(HMWK)、纖維接合素、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纖維蛋白溶酶原、α 2-抗纖溶酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶、纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1 (PAI1)和纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-2 (PAI2)。凝血因子VIII為特佳之血液因子，尤佳為重組性凝血因子VIII。可根據本發明使用之血液因子意在包括功能性多肽變異體和編碼血液因子或編碼此類功能性變異體多肽之多核苷酸。較佳之免疫球蛋白包括來自人類血漿之免疫球蛋白、單株抗體和重組抗體。本發明之生物製藥藥物較佳為相對應之人類或重組人類蛋白質或其功能變異體。

如上所述，本發明之生物製藥藥物亦可為基因治療載體，包括病毒基因治療載體。本領域技術人員將了解，本發明用於使具有脂質包膜之病毒去活化之方法一般不會使無包膜之病毒去活化。因此，在本發明之生物製藥藥物為病毒基因治療載體之較佳具體實施例中，這種病毒基因治療載體係以無包膜病毒為基礎。在一較佳之具體實施例中，這種病毒基因治療載體係以腺相關病毒(AAV)為基礎。

根據本發明之所有其他具體實施例，本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法可包含，在靜置該混合物以使該病毒去活化之步驟後，純化該生物製藥藥物之步驟。較佳地，該純化包含將該生物製藥藥物與該清潔劑分離。技術人員會瞭解將生物製藥藥物與清潔劑分離之各種方法。此類方法可由本領域技術人員在考慮生物製藥藥物之特性、其獲得來源(例如重組性或來自其他來源，例如來自人類血漿)和所需之生物製藥應用(例如是否將經由皮下或靜脈等方式投藥)後而選擇。例如，可使用層析法，例如陰離子交換層析法或陽離子交換層析法，將生物製藥藥物與清潔劑分離。在一具體實施例中，自該一或多種清潔劑中純化出之步驟包含大於一種之層析純化。

根據本發明之所有其他具體實施例，本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法可包含過濾該混合物之步驟，較佳使用深度過濾器。該過濾步驟可在於液體中加入清潔劑以製備該清潔劑和該液體之混合物之步驟前進行。或者，該過濾步驟可在於液體中加入清潔劑以製備該清潔劑和該液體之混合物之步驟，與靜置該混合物以使該病毒去活化之步驟之間進行。

在本發明所有其他具體實施例之另一具體實施例中，在使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中，靜置該混合物以使該病毒去活化之步驟可以將該混合物靜置至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少4小時、至少12小時或至少24小時之方式進行。

在本發明所有其他具體實施例之另一具體實施例中，在靜置該混合物以使該病毒去活化之步驟中，該混合物靜置於低溫下，例如溫度介於0℃至15℃之間、0℃至10℃之間、介於0℃至8℃之間、介於0℃至6℃之間、介於0℃至4℃之間，或介於0℃至2℃之間，較佳介於0℃至10℃之間。在本發明所有其他具體實施例之替代具體實施例中，在靜置該混合物以使該病毒去活化之步驟中，將該混合物靜置於室溫或接近室溫下，例如溫度介於16℃至25℃之間、介於18℃至24℃之間，或介於20℃至23℃之間。

應當理解，本發明方法之步驟的實施方式沒有特別限制。特別地，該方法步驟可以分批方式進行。或者，該方法步驟也可以半連續或連續之方式進行。

如上所述，本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法特別適用於生物製藥生產製程中。因此，本發明亦相關於一種製備生物製藥藥物之方法，該方法包含本發明及其任一具體實施例之使具有脂質包膜之病毒去活化之方法的方法步驟。較佳地，本發明之製備生物製藥藥物之方法包含製備包含該生物製藥藥物之藥物配方之步驟，該步驟在本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法之步驟後進行。此種藥物配方可根據已知之藥物配方製備標準來製備。例如，配方可以可適當地儲存和投藥之方式製備，例如藉由使用醫藥上可接受之成分例如載體、賦形劑或穩定劑。此類醫藥上可接受之成分在向患者投予該藥物配方時使用之量為無毒性。

本發明人驚訝地發現，本發明之清潔劑對於使具有脂質包膜之病毒去活化特別有用。因此，本發明亦相關於使用本發明揭示之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚清潔劑於使具有脂質包膜之病毒去活化之任一方法中之用途。較佳地，使該病毒去活化之方法為使用溶劑/清潔劑處理之方法，其中該溶劑/清潔劑處理包含使用本發明之清潔劑。在另一具體實施例中，使該病毒去活化為在包含生物製藥藥物之液體中使病毒去活化。

由於本發明人驚訝地發現本發明之非酚類清潔劑對於使具有脂質包膜之病毒去活化特別有用，因此本發明亦相關於本發明之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚清潔劑，並相關於一種包含本發明之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚清潔劑之組成物。在另一具體實施例中，包含本發明之聚氧乙烯或聚氧丙烯醚清潔劑之組成物額外包含生物製藥藥物及/或有機溶劑及/或其他清潔劑。

本發明提供非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚。如上所述，這些聚氧乙烯或聚氧丙烯醚可用於本發明使具有脂質包膜之病毒去活化之方法中。然而，本發明之此類非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚，以及所有其他非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚，也可用於各種其他目的，例如。對於通常使用Triton X-100者。例如，本發明之非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚可用於實驗室中。在實驗室中，它們可用於例如裂解細胞以萃取蛋白質或胞器，或通透化活細胞之膜；通透化未經固定(或經輕微固定)之真核細胞膜；與兩性離子清潔劑(如CHAPS)一起溶解處於天然狀態之膜蛋白；作為DNA萃取中裂解緩衝液之一部分(通常在鹼性裂解緩衝液中之5%溶液中)；降低免疫染色過程中水溶液之表面張力(通常在TBS或PBS緩衝液中的濃度為0.1-0.5%)；在微生物學中限制小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)之菌落擴張；使動物衍生組織脫細胞；或在凝膠中使蛋白質復性(renature)之前，從SDS-PAGE凝膠中移除SDS。在另一具體實施例中，本發明之非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚可用於電子工業，例如作為板條(slats)之潤濕劑，以改進和加速某些程序和操作。在另一具體實施例中，本發明之非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚可具有醫學用途，例如可使用作為殺精劑Nonoxynol 9之替代品，或作為藥物賦形劑，或作為流感疫苗(Fluzone)之成分。在進一步具體實施例中，本發明之非酚類聚氧乙烯或聚氧丙烯醚可用於數種類型之清潔化合物，範圍從重型工業產物到溫和之清潔劑；它們可與蒸餾水和異丙醇一起作為自製黑膠唱片(vinyl record)清潔液之成分；它們可用於清潔鑽石刀片；它們可用於乳化聚合化之配方中；它們可用於輪胎中；它們可用於清洗劑和清潔劑；它們可在工業中作為生產聚合物或膠水之起始化學品；它們可用於家用或工業清潔劑、油漆或塗料、紙漿或紙張、油田、紡織品、農用化學品、金屬加工液；可用於軟複合材料之碳材料之分散；或者它們可用於金屬之電鍍。

在下文中，本發明將藉由實施例來說明，但不限於此。 實施例

如上所述，最近的生態研究引起對於在生物製藥生產過程中使用Triton X-100之環境問題的關注。基於結構性考量，本發明人已找出可作為Triton X-100之可用替代品之候選清潔劑，其不會造成負面環境影響。具體而言，本發明人驚訝地找出非酚類聚氧乙烯醚作為Triton X-100之合適替代品，用於在生物製藥生產過程中藉由溶劑/清潔劑(S/D)處理而使脂質包膜病毒去活化。在接下來之實驗中，合成出4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物，並在各個測試項目上測試4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物和其他聚氧乙烯醚用於S/D處理以及單一清潔劑處理之適用性。

實施例 1 ： 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物 I 之合成 ( 方法 1)

中間產物 III之合成：

將酚 II(170.3g，800 mmol)放入配備有內部溫度計和攪拌棒之3頸2L燒瓶中。將無水CH ₂Cl ₂(1000 mL)加入燒瓶並開始攪拌。起始材料溶解後，將溶液冷卻至0℃。完全溶解後，在10分鐘內加入NEt ₃(225 mL，1.6 mol)。在0℃下將Tf ₂O(256 g，907 mmol)之CH ₂Cl ₂(180 mL)溶液加入到反應混合物中，歷時120分鐘，並將反應在室溫下攪拌整夜。加入飽和NaHCO ₃水溶液(400 mL)並萃取反應混合物。有機相以水(2×400 mL)和濃鹽水(500 mL)重複洗滌。之後真空濃縮該有機相。於殘餘物中加入甲苯(300 mL)，並將粗產物濃縮，以產生314 g之粗黑色液體。將該殘餘物裝入SiO ₂塞頂部，並以石油醚/EtOAc(0至2%)沖提。濃縮純分液，產生269.5 g(產率：99.6%)之透明無色油狀物。R _f= 0.74(石油醚/EtOAc 5%)。

中間產物 IV之合成：

將三氟甲磺酸鹽 III(269 g，795 mmol)溶解在無水且除氣之DMF (1.3 L)中，並依次加入Zn(CN) ₂(95.3 g，795 mmol)和Pd(PPh ₃) ₄(25 g，21.5 mmol)。將反應混合物加熱至80℃、3小時，之後在真空下移除DMF。於殘餘物中加入甲苯(300 mL)並將粗產物濃縮，以產生432 g黑色殘餘物。將該粗產物裝入SiO ₂塞頂部，並以石油醚/EtOAc(0至10%)沖提。濃縮純分液，產生128.1 g(產率：74.8%)澄清之無色油狀物。R _f=0.23(石油醚/EtOAc 2%)。

中間產物 V之合成：

將腈 IV(127.6 g，592.5 mmol)溶解於MeOH (500 mL)中，加入4M NaOH水溶液(750 mL)，並將混合物進行回流並在該溫度(80℃)下保持整夜。將額外之NaOH 10M水溶液(150mL)加入到溫熱之混合物中，並將溶液進一步加熱20小時。冷卻至環境溫度後，將反應容器之內容物轉移到大燒杯中並在冰浴中冷卻。在30分鐘內加入4M HCl水溶液(1.1 L)，此時pH值如pH試紙所示呈酸性，並且沉澱出白色固體。過濾出沉澱物，並以水(500 mL)沖洗。將濕餅狀物轉移到2L燒瓶中並在真空下乾燥3天，以產生127.5 g(產率：91.9%)之白色粉末。R _f= 0.42 (石油醚/EtOAc 2:1)。

中間產物 VI之合成：

將羧酸 V(127 g，542 mmol)懸浮在無水mTHF (1.2 L)中並冷卻至-10℃。在60分鐘內加入LiAlH ₄之THF溶液(1 M，575 mL，575 mmol)，之後將反應緩慢升溫至環境溫度，並進一步攪拌整夜。將反應容器之內容物轉移到一個大燒杯中，過量之氫化物小心地以冰(15 g)淬滅。在20分鐘內加入3M HCl水溶液(500 mL)，此時pH值如pH試紙所示為酸性。將EtOAc(300 mL)加入粗混合物中，並劇烈攪拌兩相。水相以EtOAc(300 mL和500 mL)逆萃取兩次。合併之有機相連續以飽和NaHCO ₃水溶液(300 mL)、水(300 mL)和濃鹽水(500 mL)洗滌。之後真空濃縮該有機相。於殘餘物中加入甲苯(300 mL)並將粗產物濃縮，以產生123.3 g澄清之淡黃色油狀物。將該殘餘物裝入SiO ₂塞頂部並以石油醚/EtOAc(0至15%)沖提。濃縮純分液，產生85.3 g(產率：71.4%)之非晶形白色固體。R _f= 0.37(石油醚/EtOAc 4:1)。

中間產物 VII之合成：

將苯甲醇 VI(84.8 g，385 mmol)溶解在無水CH ₂Cl ₂(1L)中，並在冰/水浴中冷卻。加入NEt ₃(110 mL，770 mmol)，之後緩慢加入MsCl (45 mL，577 mmol)之無水CH ₂Cl ₂溶液(25 mL)，歷時60分鐘。反應緩慢升溫至環境溫度並進一步攪拌整夜。加入飽和NaHCO ₃水溶液(420 mL)並劇烈攪拌反應混合物。有機相以水(2×500 mL)和濃鹽水(300 mL)重複洗滌。之後真空濃縮有機相。於殘餘物中加入甲苯(200 mL)和CH ₂Cl ₂(100 mL)，濃縮粗產物，得到90 g(產率：78.4%)橙色半固體。R _f= 0.71(石油醚/EtOAc 4:1)。

I之合成

將PEG400 (360 g，900 mmol)溶解在無水THF (1 L)中，並在環境溫度下、在15分鐘內分批加入tBuOK (90 g，802 mmol)，並將混合物在環境溫度下攪拌60分鐘，並以冰浴冷卻。同時，將甲磺酸鹽 VII(89.5 g，300 mmol)懸浮於THF (300 mL)中，並在20分鐘內將乳橙色溶液加入到冷卻之去質子化PEG400溶液中。將反應緩慢升溫至環境溫度，並進一步攪拌整夜。加入冰(500 g)以及1M HCl水溶液(820 mL)。真空移除THF並加入EtOAc(1L)。攪拌各相並以水(2×500 mL)連續洗滌有機相。每一水相以EtOAc(300 mL)逆萃取。以水(500 ml)洗滌合併之有機相並真空濃縮。於殘餘物中加入甲苯(250 mL)並將粗產物濃縮，以產生125.2 g澄清淡黃色油狀物。將該殘餘物裝入SiO ₂塞頂部並以CH ₂Cl ₂/MeOH (0至8%)沖提。濃縮純分液，產生107.5 g(產率：59.5%)淺棕色透明油狀物。R _f= 0.37-0.22 (CH ₂Cl ₂/MeOH 20:1)。MS (ESI): m/z =[M+H] ⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac] ^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.33 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (br s, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。

實施例 2a ： 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物 I 之合成 ( 方法 2)

在圓底燒瓶中將甲苯 (35 mL，328 mmol) 和濃H ₂SO ₄(10 mL)冷卻至0 ℃。甲苯 (27 mL，256 mmol) 和二異丁烯之混合物(為2,4,4-三甲基-1-戊烯 + 2,4,4-三甲基-2-戊烯之3:1之混合物，10 mL，64 mmol)緩慢加入反應混合物中，歷時2小時。將反應在0℃下進一步攪拌2小時。加入水(100 mL)。相分離後，有機相用以飽和NaHCO ₃水溶液(100 mL)洗滌，經MgSO ₄除水並濃縮，得到14 g之澄清無色油狀物。將油狀物置於100 mL圓底燒瓶中，並在短路徑蒸餾裝置(1·10 ^-1mbar)上蒸餾。收集在62至70℃之間蒸餾出之分液(8.1 克，產率 61.9%)。R _f= 0.65(石油醚40-60 100%)。

對位-取代之甲苯 X(500 mg，2.45 mmol)溶解在乙腈(ACN) (5 mL) 中。加入N-溴代琥珀醯亞胺(NBS) (460 mg，2.57 mmol)，溶解後，將Duran 25 mL圓底燒瓶置於距鹵素燈(300 W) 15 cm處。照射60分鐘後(反應溫度 = 45℃)，移除溶劑。加入石油醚40-60 (25 mL)並沉澱出固體。液相以水(2×20 mL)洗滌，以MgSO ₄除水並濃縮，得到540 mg之粗黃色油狀物(產率：77.9%)。R _f= 0.43(石油醚40-60 100%)。

在環境溫度下將PEG400 (2.25 g，5.61 mmol)溶解在無水THF(5mL)中。在1分鐘內分批加入tBuOK(420 mg，3.74 mmol)，並將混合物攪拌90分鐘，之後在冰/水浴中冷卻至0℃。同時，將苯甲基溴中間產物 XI(530 mg，1.87 mmol)懸浮在THF(2 mL)中，並將溶液加入冷卻之去質子化之PEG400溶液中。將反應緩慢升溫至環境溫度並進一步攪拌整夜。將HCl (1 M，20 mL)以及EtOAc(50mL)和水(20mL)加入到反應混合物中。將溶液轉移到分離漏斗中並劇烈萃取。相分離後，有機相以水(5×15mL)連續洗滌，最後以MgSO ₄除水，得到0.8 g粗油狀殘餘物。將該殘餘物裝入SiO ₂管柱頂部並以CH ₂Cl ₂/MeOH (0至8%)沖提。濃縮純分液產生588 mg之透明淡黃色油狀物(產率：52.2%)。R _f= 0.37-0.22 (CH ₂Cl ₂/MeOH 20:1)。

實施例 2b ： 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物 I 之合成 ( 方法 2 之變異物 )

步驟1：

該步驟如下進行：

在圓底燒瓶中將甲苯 (750 mL，7.04 mol)和濃硫酸(20 mL，0.375 mol)冷卻至0℃。甲苯(250 mL，2.35 mol)和二異丁烯之混合物(為2,4,4-三甲基-1-戊烯 + 2,4,4-三甲基-2-戊烯之3:1混合物，200 mL，1.28 mol)緩慢加入反應混合物中，歷時90分鐘。將反應在0℃下進一步攪拌並溫熱至環境溫度整夜。加入冰(400 g)並將混合物轉移到分離漏斗中。相分離後，有機相連續以飽和NaHCO ₃水溶液(300 mL)和水(2×250 mL)洗滌。濃縮有機相，得到199.1 g透明無色油狀物。將該油狀物置於500 mL圓底燒瓶中並在短路徑蒸餾裝置(20 mbar)上蒸餾。收集在138 ℃至161℃之間蒸餾出的分液(134.1 g，產率51.4%)。R _f= 0.65(石油醚40-60 100%)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.28 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.10 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.38 (s, 6H), 0.75 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 147.3, 134.7, 128.6 (2C), 126.1 (2C), 57.1, 38.4, 32.5, 31.9 (3C), 31.7 (2C), 21.0。

或者，該步驟如下進行：

在環境溫度下於圓底燒瓶中攪拌甲苯 (400 mL，3.83 mol)和九氟-1-丁烷磺酸(4 mL，24 mmol)。甲苯(200 mL，1.92 mol)和二異丁烯之混合物(為2,4,4-三甲基-1-戊烯 + 2,4,4-三甲基-2-戊烯之3:1混合物，100 mL，0.64 mol)緩慢加入反應混合物中，歷時60分鐘。將反應在環境溫度下進一步攪拌整夜。加入飽和NaHCO ₃水溶液(200 mL)並將混合物攪拌20分鐘。將混合物轉移至分離漏斗並棄去水相。有機相以水(3×300 mL)連續洗滌。濃縮有機相，得到132.5 g透明無色油狀物。將該油狀物置於500 mL圓底燒瓶中，並在短路徑蒸餾裝置(26-16毫巴)上蒸餾。收集在115℃至135℃之間蒸餾出的分液(80.5 g，產率 62%)。R _f= 0.65(石油醚40-60 100%)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.28 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.10 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.38 (s, 6H), 0.75 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 147.3, 134.7, 128.6 (2C), 126.1 (2C), 57.1, 38.4, 32.5, 31.9 (3C), 31.7 (2C), 21.0。

步驟2：

此步驟如下進行：

對位取代之甲苯 X(63.6 g，311 mmol)溶解在乙腈(ACN) (650 mL) 中。加入N-溴代琥珀醯亞胺(NBS) (58.2 g，327 mmol)，溶解後，將Duran 2L圓底燒瓶放置在距鹵素燈(300 W) 5至25 cm處，同時攪拌(350 rpm)。照射6小時後(反應溫度 = 高達46℃)，真空移除溶劑。加入石油醚40-60 (450 mL)並沉澱出深色固體。濃縮液相得到深棕色殘餘物(75 g)。將該殘餘物裝入SiO ₂塞頂部並以石油醚40-60(100%)沖提。濃縮純分液，產生43.8 g之橙色透明油狀物(產率：49.7%)。R _f= 0.43(石油醚 40-60 100%)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.34 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 4.50 (s, 2H), 1.74 (s, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.72 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 150.9, 134.8, 128.6 (2C), 126.7 (2C), 57.0, 38.7, 33.9, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。

或者，此步驟如下進行：

對位取代之甲苯 X(85.2 g，417 mmol)溶解在三氟甲苯(830 mL) 中。其他溶劑如酯或烷類(EtOAc和己烷)也有效。加入N-溴代琥珀醯亞胺(NBS) (74.2 g，417 mmol)以及AIBN (偶氮二異丁腈) (3.4 g，21 mmol)，同時攪拌(450 rpm)。將混合物加熱至80℃、5小時。真空移除溶劑。加入石油醚40-60 (350 mL)，沉澱出白色固體。濃縮液相，產生澄清之橙色殘餘物(108 g)。將該殘餘物裝入SiO ₂塞頂部，並以石油醚40-60 (100%)沖提。濃縮純分液，得到64.1 g澄清之幾乎無色之油狀物(產率：54.3%)，結晶形成無色針狀物，顯示產物純度高。R _f= 0.43 (石油醚40-60 100%)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.34 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 4.50 (s, 2H), 1.74 (s, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.72 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 150.9, 134.8, 128.6 (2C), 126.7 (2C), 57.0, 38.7, 33.9, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。預期使用 AIBN(偶氮雙(異丁腈))作為自由基起始劑將有助於在該反應步驟中獲得高純度之產物。

步驟3：

此步驟如下進行：

在環境溫度下將PEG400 (184.1 g，460 mmol)溶解於無水THF (550 mL)中。在15分鐘內分批加入tBuOK(27.2 g，245 mmol)並將混合物攪拌90分鐘。同時，將苯甲基溴中間產物 XI(43.5 g，153 mmol)懸浮在THF(300 mL)中，並將溶液加入冷卻之去質子化之PEG400溶液中。將反應在環境溫度下攪拌整夜。將HCl(1 M，270 mL)加入到反應混合物中。移除揮發物並加入EtOAc(600 mL)。將溶液轉移到分離漏斗中並劇烈萃取。相分離後，水相進一步以EtOAc(300 mL)萃取。合併之有機相以水/濃鹽水(1:1，3×300 mL)連續洗滌，最後濃縮產生90.4 g粗橙色油狀殘餘物。將該殘餘物裝入SiO ₂管柱頂部並以CH ₂Cl ₂/MeOH (0至8%)沖提。濃縮純分液，產生82.2 g澄清之淺棕色油狀物(產率：89.0%)。R _f= 0.37-0.22 (CH ₂Cl ₂/MeOH 20:1)。MS (ESI): m/z =[M+H] ⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac] ^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.33 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (br s, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。

或者，此步驟如下進行：

在環境溫度下將PEG400(475 g，1.19 mol)溶解在TBME(甲基-第三-丁基醚)(1.0 L)中。在20分鐘內分批加入tBuOK(43.2 g，385 mmol)，並將混合物攪拌90分鐘。同時，將苯甲基溴中間產物 XI(84 g，297 mmol)懸浮在TBME(250 mL)中，並且在環境溫度下將溶液加入去質子化之PEG400溶液中。將反應在環境溫度下攪拌3小時。將冰(200 g)和HCl (1 M，400 mL)加入到反應混合物中。將溶液轉移到分離漏斗中，加入EtOAc (1 L)和水(500 mL)並劇烈萃取。相分離後，有機相以水/濃鹽水(1:1，3×500 mL)連續洗滌，最後濃縮產生165 g粗橙色油狀殘餘物。將該殘餘物裝入SiO ₂管柱頂部，並以CH ₂Cl ₂/MeOH (0至10%)沖提。濃縮純分液產生151.7 g之澄清淺棕色油狀物(產率：84.9%)。R _f= 0.37-0.22 (CH ₂Cl ₂/MeOH 20:1). MS (ESI): m/z =[M+H] ⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac] ^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.33 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (br s, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。預期使用TBME(甲基第三-丁基醚)作為溶劑，3 小時之中度反應時間(預計可使反應副產物最少化)，較大之生產規模和起始材料(即苯甲基溴中間產物 XI)之純度，對於在此反應步驟中觀察到之高產率都有貢獻。

實施例 3 - 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物 I 之改進合成和改進純化

1 材料

所有合成均使用市售試劑和溶劑(Merck，Karl Roth，TCI，WVR)進行，無需進一步純化。

2 合成與分析方法：

¹H和 ¹³C-NMR光譜係於Bruker AV600光譜儀上，使用標準脈衝程序在室溫下記錄。化學位移 (δ) 以百萬分之幾 (ppm) 為單位引用，並參考適當之殘留溶劑信號。耦合常數( J)報告為最接近之0.1 Hz。LC-質譜(m/z)係於Shimadzu LC-MS 2020上進行，HRMS(高解析度質譜)分析係於Waters之MicroMass TOF光譜儀(ESI+)上進行。使用矽膠(Merck Kieselgel 60，0.040 - 0.063 mm)進行快速層析法。薄層層析(TLC)使用TLC Silica Gel 60 F24(來自Merck之鋁片)進行。分析式HPLC層析圖在配備有DAD及/或ELSD偵測器之Agilent System中運行。在DSC儀器(來自TA Instruments之DSC 2000)或顯微鏡Reichert Thermovar上測量熔點。FT-IR (ATR)係於配備有ATR BioATR cell II 之 Bruker tensor 27光譜儀上測量，使用純樣本(針對液體和油狀物化合物)或使用二氯甲烷溶解之溶液樣本(針對固體樣本)，在揮發物完全揮發後測量。分子長度之計算使用軟體Chem3D V15.1進行。

3. 合成流程

3.1 1- 甲基 -4-(2,4,4- 三甲基戊 -2- 基 ) 苯 (XV) 之合成 ( 步驟 (1))

在環境溫度和攪拌下，將甲苯(V = 600 mL，4倍體積)裝入反應容器中，並加入一部分九氟-1-丁磺酸(V = 4.8 mL)。將溶液冷卻至0℃，並使用滴液漏斗將預混於甲苯(V = 300 mL)中之二異丁烯(V = 150 mL)混合物緩慢加入該反應混合物中，歷時40至100分鐘，同時於冰/水浴中冷卻該反應混合物。之後將該反應混合物在環境溫度下攪拌120分鐘，之後再加入一部分飽和NaHCO ₃水溶液(V = 300 mL)以淬滅反應。將反應混合物攪拌60分鐘，並將燒瓶之內容物轉移到分離漏斗中。相分離後移除水相，有機相以水(2×V＝500 mL)洗滌。在真空中充分濃縮有機相，得到淺棕色油狀殘餘物之粗產物(195.5 g，大量產率)。R _f= 0.65(石油醚40-60 100%)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ = 7.28 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.10 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.38 (s, 6H), 0.75 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ = 147.3, 134.7, 128.6 (2C), 126.1 (2C), 57.1, 38.4, 32.5, 31.9 (3C), 31.7 (2C), 21.0。IR (cm ^-1): 2953, 2906, 2867, 1513, 1469, 1364, 1251, 1020, 815, 649, 489。

此外，發現比九氟-1-丁磺酸更便宜且更易於處理(黏性更小且更易於溶解)之三氟甲磺酸，可有利地用於代替九氟-1-丁磺酸。

3.2 1-( 溴甲基 )-4-(2,4,4- 三甲基戊 -2- 基 ) 苯 (XVI) 之合成 ( 步驟 (2))

將對位取代之甲苯 XV(195 g，954 mmol) 溶解在環己烷(1560 mL，8倍體積)中，並在攪拌下加入NBS (170 g，954 mmol)和AIBN (0.8 g，4.8 mmol)。將混合物加熱至70℃直至反應完成，並冷卻至環境溫度。濾出固體，濾餅以cHex (100 mL)洗滌。將濾液轉移到分離漏斗中並以水(2×500 mL)洗滌有機相。真空濃縮有機相，得到褐色透明油狀粗殘餘物。將IPA(2 mL/g 殘餘物)加入到粗產物中，並將溶液冷卻至-20℃。在-20℃下、1小時後，加入一些晶種(10至50 mg)。燒瓶在-20℃下靜置整夜。濾出固體，以冷IPA(50 mL)洗滌，得到灰白色固體和相對應之母液。將此固體重新溶解在IPA(2 mL/g固體)和水(0.2 mL/g固體)中，使用旋轉蒸發儀之水浴(45℃，5分鐘)。將溶液冷卻至+2至8℃。在+2至8℃、1小時後，加入少量晶種(10至50 mg)，並將燒瓶在+2至8℃靜置整夜，並進一步冷卻至-20℃、4小時。如有必要，重複結晶步驟。濾出沉澱物，以冷IPA(50 mL)沖洗，得到無色針狀物。將固體在真空烘箱中乾燥(30℃，＜15毫巴，24小時，之後為20℃，＜15毫巴，24小時)，以產生50至80g(2步驟，20-30%之產率)。R _f= 0.43 (石油醚40-60 100%)。m.p. (DSC) = 53℃。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ = 7.34 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 4.50 (s, 2H), 1.73 (s, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.72 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ = 150.9, 134.8, 128.7 (2C), 126.7 (2C), 57.0, 38.7, 33.9, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。IR (cm ^-1): 2953, 2899, 2868, 1511, 1470, 1366, 1252, 1230, 1204, 1095, 830, 648, 628, 606, 573, 454。

此外，亦發現通常可使用乙腈取代環己烷作為該步驟之溶劑。乙腈可有利地作為合成溶劑和結晶溶劑。此外，使用乙腈可降低下節中描述之二溴化副產物之形成。

3.3 用於比較之副產物 XVII 之合成

將對位取代之苯甲基溴 XVI(502 mg，1.77 mmol)溶解在環己烷(6 mL)中。在攪拌(400 rpm)之同時加入NBS(474 mg，417 mmol)以及AIBN(16 mg，0.09 mmol)。將混合物加熱至80℃、4小時。將反應混合物冷卻至環境溫度並加入20 mL環己烷。將燒瓶之內容物轉移到分離漏斗中，有機相依次以水(2×5 mL)和濃鹽水(5 mL)洗滌。真空移除溶劑，產生淡黃色殘餘物(720 mg)。將該殘餘物裝入SiO ₂管柱之頂部並以己烷(100%)沖提。濃縮純分液，產生358 mg(產率：56%)之透明無色黏性油狀物。R _f= 0.47(己烷)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ = 7.47 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 6.65 (s, 1H), 1.74 (s, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.72 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ = 152.6, 139.1, 126.5 (2C), 126.1 (2C), 57.0, 41.3, 38.9, 32.5, 31.9 (3C), 31.5 (2C)。IR (cm ^-1): 2955, 2898, 2871, 1607, 1469, 1411, 1365, 1251, 1143, 1095, 1017, 836, 746, 667。

3.4 由 XVI 合成 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物 ( 步驟 (3))

(4- 第三- 辛基苯甲醇聚乙氧化物)

將反應燒瓶裝滿PEG400 (700 g，1.77 mol)並加熱至60℃，之後在攪拌下分批加入tBuOK (47.5 g，423 mmol)。加入後，將反應混合物在60℃加熱30分鐘。將一部分固體結晶苯甲基溴中間產物 XVI(100 g)加至去質子化之PEG中。30分鐘後，使反應混合物冷卻至環境溫度，並加入水(1.5 L)。使用1M HCl水溶液將溶液之pH值設定至6至7。任擇地，如果最終產物需要近乎無色：將次氯酸鈉(5%活性氯溶液，10至15 mL)逐滴加入到反應容器中。將容器之內容物轉移到分離漏斗中。將水(0.5 L)和EtOAc(2 L)加入到漏斗中並劇烈振搖各相。相分離後移除水相。加入水/濃鹽水(20:1)(1 L)並劇烈搖動各相，在相分離後移除水相。重複2次。之後減壓濃縮EtOAc相，以產生約200 g淡黃色透明產物。將殘餘物溶於EtOH (2 L)中，並轉移到分離漏斗中。加入cHex (3 L) 以及水 (100 mL)。劇烈搖動各相，移除cHex相。加入新鮮之cHex (1 L)，劇烈搖動各相，並移除cHex相。減壓濃縮EtOH相並將產物進一步乾燥整夜，以產生約160至170g之淡黃色透明產物(產率75至80%)。MS (ESI): m/z =[M+H] ⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac] ^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ= 7.33 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (brs, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ= 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C)。IR (cm ^-1): 2957, 2865, 1465, 1350, 1249, 1097, 948, 816, 670, 632。IR (cm- ¹): 2957, 2865, 1465, 1350, 1249, 1097, 948, 816, 670, 632。HRMS (ESI ⁺) (m/z): C ₃₃H ₆₁O ₁₀(n=9) 之[M+H] ⁺計算值：617.4265；觀測值：617.4269。

3.5 用於比較之雙功能副產物 XVIII 之合成

在環境溫度下將PEG400 (5.01 g，12.5 mmol)溶解在THF(20 mL)中。加入一部分之tBuOK(3.25 g，28.8 mmol)並將混合物攪拌30分鐘。在環境溫度下將一部分苯甲基溴 XVI加入到去質子化之PEG400溶液中，並將反應在環境溫度下攪拌整夜。於反應混合物中加入水(120 g)和HCl(1 M，10 mL)。將溶液轉移到分離漏斗中，加入EtOAc(120mL)並劇烈萃取。相分離後，有機相以水(2×100 mL)連續洗滌，最後以MgSO ₄除水後濃縮，得到10.8 g黃色油狀粗殘留物。將該殘餘物裝入SiO ₂管柱頂部並以CH ₂Cl ₂/MeOH (0至15%)沖提。濃縮純分液，產生9.13 g澄清之淡黃色油狀物(產率：91%)。R _f= 0.21-0.78 (CH ₂Cl ₂/MeOH 20:1)。 ¹H-NMR (600 MHz, CDCl ₃): δ = 7.33 (d, J= 8.2 Hz, 4H), 7.23 (d, J= 8.2 Hz, 4H), 4.53 (s, 4H), 3.80-3.49 (m, 36H), 1.73 (s, 4H), 1.35 (s, 12H), 0.71 (s, 18H)。 ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl ₃): δ = 149.8 (2C), 135.2 (2C), 127.5 (4C), 126.3 (4C), 73.2, 70.8, 70.8 (m), 69.4, 57.1 (2C), 38.6 (2C), 32.5 (2C), 31.9 (6C), 31.7 (4C). IR (cm ^-1): 2951, 2861, 1465, 1363, 1249, 1099, 817, 670, 633。HRMS (ESI ⁺) (m/z): C ₄₈H ₈₂NaO ₁₀(n=9)之[M+Na] ⁺計算值：841.5806；觀測值：841.5797。

最終產物純度分析之分析方法：

HPLC 方法 1 ：

此方法使用以下設定： HPLC：Agilent 1260 管柱：Zorbax Rx-C8，5 μm，4.6 x 250 mm (V = 4.155 mL) 沖提液：水(A)、乙腈(B) 梯度沖提：70%B(0分鐘)--＞ 70%B(4分鐘)--＞ 97%B(20分鐘)-＞ 97%B(40分鐘) 駐留時間：12分鐘流速：1.0毫升/分鐘管柱溫度：25℃ 注射體積：5 μL 波長：200 nm 粗產物在200 nm下之光譜圖和最終產物在200 nm下之光譜圖如圖7所示。

HPLC 方法 2:

此方法使用以下設定： HPLC：Agilent 1260 管柱：Zorbax 300SB-C3，5 μm，2.1 x 150 mm (V= 0.520 mL) 沖提液：水(A)、乙腈(B) 梯度沖提：35%B (0分鐘) --＞ 35%B (4分鐘) --＞ 97%B (20分鐘) --＞ 97%B (25分鐘) 駐留時間：8分鐘流速：0.5毫升/分鐘管柱溫度：25℃ 注射體積：5 μL 波長：200 nm和ELSD

最終產物之光譜如圖8所示。根據ELSD之純度＞99% 根據200 nm之純度 = 95%

HPLC 方法 3 ：

此方法使用以下設定： HPLC：Agilent 1260 管柱：Acclaim Surfactant Plus，4.6 x 150 mm，3 μm，175 Å，V = 2.493 mL 沖提液：水(A)、乙腈(B) 梯度沖提：20%B(0分鐘)--＞ 20%B(7分鐘)--＞ 90%B(27分鐘)--＞ 90%B(40分鐘)-＞ 20%B(40.1分鐘) --＞ 20%B (50分鐘) 駐留時間：0分鐘流速：0.5毫升/分鐘管柱溫度：30℃ 注射體積：5 μL 波長：225 nm ELSD偵測最終產物之光譜如圖9所示。

結論：

值得注意的是，該方法使用少量溶劑(例如，甲苯、cHex、IPA、EtOAc和EtOH)，所有這些都為無害，並且在濃縮後可以回收。與較低量之PEG相較，在該方法中使用較高當量數(eq.)之PEG，例如5莫耳當量(eq.)之PEG，為較有利，因為它們可經由降低雙功能副產物 XVIII之量來增加產物之純度，若省略次氯酸鈉之加入，則最終產物將呈橙色，但分析結果相同。

上述3步驟、無層析合成過程使用不貴的起始材料，具有穩健且簡單之後處理，並允許在標準有機實驗室中進行生產，以提供純度＞ 99%之數百克批次。其可以工業規模製備和純化本發明之清潔劑。

實施例 4 ：使用 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物使含靜脈內免疫球蛋白之液體中的 PRV 去活化

材料與方法

如WO 2019/086463之實施例1進行實驗。然而，針對S/D處理，係測試包含實施例2a中生產之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物之S/D混合物，並與包含Triton X-100之S/D混合物進行比較。如WO 2019/086463之實施例1所述製備包含Triton X-100之S/D混合物之組成物。如下製備包含4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物之S/D混合物之組成物。

S/D成分聚山梨醇酯80 (PS80，Crillet 4 HP，Tween 80) 和磷酸三正丁酯(TnBP)與實施例2a中製備之清潔劑4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物，係依以下比例混合(請見表1)：

S/D試劑	S/D試劑混合量 [g]
4-TOBAPE	10.61±0.11
PS80	3.23±0.03
TnBP	2.93±0.03
S/D試劑結果	16.77

表 1 ：4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物(簡稱「4-TOBAPE」) S/D試劑混合物之各成分量

將混合物攪拌至少15分鐘。S/D試劑混合物儲存於室溫下以備一年內使用。在使用之前，將S/D試劑混合物再次攪拌至少15分鐘以確保均勻性。

將各S/D試劑混合物加入到含有IVIG之液體中，以得到最終濃度為0.05% w/w之各聚氧乙烯醚清潔劑。

僅測試PRV病毒之去活化。

結果

當使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、PS80和TnBP之混合物對含有IVIG之液體進行S/D處理時，PRV在1-2分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)大約4 (圖1A)。在重複實驗中獲得類似的結果(圖1B)。

這些實驗顯示，以4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物代替Triton X-100 對含生物製藥藥物之液體進行S/D處理，可有效地使脂質包膜病毒去活化，即使在低濃度清潔劑下亦如此。

實施例 5 ：使用 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物使含人類血清白蛋白之液體中的 X-MuLV 去活化

材料與方法

如WO 2019/086463之實施例3進行實驗。然而，對於S/D處理，係測試包含4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物之S/D混合物，並與包含Triton X-100之S/D混合物進行比較。如WO 2019/086463之實施例3所述製備包含Triton X-100之S/D混合物之組成物。如下製備包含4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物之S/D混合物之組成物。

S/D成分聚山梨醇酯80 (PS80，Crillet 4 HP，Tween 80)和磷酸三正丁酯(TnBP)與清潔劑4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物，係依以下比例混合(請見表2)：

S/D試劑	S/D試劑混合量 [g]
4-TOBAPE	10.5±0.1
PS80	3.2±0.03
TnBP	2.9±0.03
S/D試劑結果	16.6

表 2 ：4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物(簡稱「4-TOBAPE」) S/D試劑混合物之各成分量

將混合物攪拌至少15分鐘。S/D試劑混合物在室溫下儲存以備一年內使用。在使用之前，將S/D試劑混合物再次攪拌至少15分鐘以確保均勻性。

將各S/D試劑混合物加入到含HSA之液體中，以得到最終濃度為0.1%之各聚氧乙烯醚清潔劑。

僅測試X-MuLV病毒之去活化。

結果

當使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、PS80和TnBP之混合物在1℃ ± 1℃下，對含有HSA之液體進行S/D處理時，X-MuLV在10分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)大於2 (圖2A)。在重複實驗中獲得類似的結果(圖2B)。

額外實驗完全按照本實施例之材料和方法一節之描述進行，惟不同之處在19℃ ± 1℃而非 1℃ ± 1℃下，對含HSA之液體進行S/D處理。當使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、PS80和TnBP之混合物在19℃ ± 1℃下，對含有HSA之液體進行S/D處理時，X-MuLV在10分鐘內被去活化，病毒降低因子(RF)大於2(圖3A)，在30分鐘內之RF值大約4。在重複實驗中獲得類似的結果(圖3B)。

這些實驗顯示，以4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物代替Triton X-100對含生物製藥藥物之液體進行S/D處理，可有效地使脂質包膜病毒去活化，在室溫或約室溫，以及低溫如1℃ ± 1℃下，即使在低濃度清潔劑下亦如此。

實施例 6 ：使用 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物、 Triton X-100 之還原形式或 Brij C10 使含 HSA 之緩衝液中的 BVDV 去活化

測試4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、Triton X-100還原劑或Brij C10用於單一清潔劑處理，以使含有人類血清白蛋白(HSA) (作為治療性抗體之模型蛋白)之緩衝液中的脂質包膜病毒牛病毒性下痢病毒(BVDV)去活化之適用性，並與Triton X-100進行比較。為此，將低濃度之各清潔劑加入含有HSA之緩衝液中，之後在混合物中加入病毒。靜置不同時間段後，測定病毒之殘餘感染性。各清潔劑在低濃度下使用，以便能夠評估使病毒去活化之動力學，即病毒去活化之效率(由RF表示)隨時間之變化。如本領域技術人員所了解的，在諸如生物製藥生產之商業生產過程中，本發明之清潔劑可以顯著較高之濃度使用，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之RF。

材料

含有HSA之緩衝液

含有人類血清白蛋白(HSA)之緩衝液係使用作為治療性抗體之模型。病毒

病毒株	來源	傳播於	滴定於
細胞株	來源	細胞株	來源
BVDVNadl	ATCC ¹VR-1422	MDBK	ATCC ¹CRL-22	BT	ATCC ¹CRL-1390

¹ATCC ：美國典型培養物保存中心，大學大道10801 號，馬納薩斯州，VA20110 ，美國 表 3 ：實驗中使用的病毒儲存液。

病毒儲存液在使用前進行鑑定。該鑑定包含經由至少10次獨立滴定測定病毒效價，並指定可接受之病毒效價範圍作為陽性對照組、測定病毒儲存液之蛋白含量、PCR檢測病毒種類以及與其他病毒和黴漿菌之污染，以及使用不允許大病毒聚集體通過之過濾器測試病毒的聚集情況。僅使用通過PCR辨識/污染測試且沒有顯著聚集之病毒儲存液(即病毒儲存液和經過濾儲存液之間之感染性效價差異小於1.0 log)。

清潔劑

在使用各清潔劑或其1:10稀釋液(即1 g ± 2%之各清潔劑加上9 g ± 2%之蒸餾水)之前，攪拌至少15分鐘以確保均勻性。

方法

在不利於病毒去活化之條件下，即在較短之靜置時間和相對較低之溫度下，評估單一清潔劑處理之病毒去活化能力和穩健性。本領域技術人員將了解，在諸如生物製藥生產之商業生產過程中，可使用更長之靜置時間和更高之溫度，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之LRV。此外，如上所述，使用低濃度之各清潔劑。如本領域技術人員所清楚知道的，在諸如生物製藥生產之商業生產過程中，可使用更高濃度之各清潔劑，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之LRV。

由於蛋白質濃度對病毒去活化沒有顯著影響(另請見Dichtelmüller等人，2009年)，關於蛋白質含量之穩健性並未研究。

以下所有步驟均在第二級生物安全櫃中進行。使用與低溫恆溫器相連之雙壁容器，在攪拌下，於+14℃ ± 1℃之溫度下靜置該起始材料以進行靜置步驟。

將含有HSA之緩衝液轉移到已測定空重之螺旋蓋燒瓶中。測定含有 HSA之緩衝液(在密閉燒瓶中)之重量，以計算待加入之單一清潔劑之量。每克含有HSA之緩衝液加入所需量之清潔劑([mg])或各1:10稀釋液之量，以產生以下最終濃度之各清潔劑：0.1% ± 0.01% (w/w)或0.03% ± 0.01% (w/w)。在攪拌下於1分鐘內使用注射器加入清潔劑，並以回稱該注射器來確定實際加入量。在完成清潔劑加入後，將含有HSA之緩衝液進一步攪拌至少10分鐘。含有HSA之緩衝液與清潔劑混合，通過0.2 µm Supor注射器膜過濾器(或等效裝置)過濾，並使用連接到低溫恆溫器之雙壁容器在14℃ ± 1℃之目標溫度下收集濾液。冷卻濾液容器。若過濾器堵塞，則使用新鮮之過濾器繼續過濾含有HSA之緩衝液。過濾後，測量溫度(目標：14℃ ± 1℃)和體積。

使用連接到低溫恆溫器之雙壁容器，在攪拌下將含有HSA和各清潔劑之過濾緩衝液調節至14℃ ± 1℃。在攪拌下保持此溫度範圍直到含有HSA與清潔劑之緩衝液靜置結束並連續記錄。測定體積之含有HSA和清潔劑之緩衝液以1:31之比例加入，例如48毫升含有HSA之緩衝液加入1.6毫升病毒儲存液。將含有HSA之加入病毒之緩衝液，在14℃ ± 1℃、持續攪拌下進一步靜置59 ± 1分鐘。在靜置期間，病毒滴定樣本在1至2分鐘、5 ± 1分鐘、29 ± 1分鐘和59 ± 1分鐘時採集。為了防止在樣本抽取後清潔劑進一步使病毒去活化，樣本立即用各冷(+2℃至+8℃)細胞培養基稀釋(即1份體積樣本加19份體積細胞培養基)。

加入病毒之組和維持對照組在同一天進行：如上所述過濾含有HSA之緩衝液，但沒有預先加入清潔劑。之後在攪拌下將濾液調節至14℃ ± 1℃，如上所述。含有HSA之緩衝液以1:31之比例加入，並在14℃ ± 1℃下進一步靜置 59 ± 1分鐘，如上所述。在加入病毒後1至2分鐘內，採集用於病毒滴定之樣本(加入病毒對照組)。靜置 59 ± 1分鐘後，採集用於病毒滴定之樣本(即維持對照組樣本)(HC)。

如WO 2019/086463之實施例1進行樣本之滴定和病毒清除能力之計算。

結果

當使用 0.1% ± 0.01% Triton X-100、Brij C10、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在 14℃ ± 1℃下對含有HSA之緩衝液進行單一清潔劑處理時，BVDV在5分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)為大約5(圖4A)。當使用0.03% ± 0.01% Triton X-100、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在14℃ ± 1℃下對含有HSA之緩衝液進行單一清潔劑處理時，BVDV在5分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)超過3，在29分鐘內超過4(圖4B)。

這些實驗顯示，使用Triton X-100、Brij C10、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，對含生物製藥藥物之液體進行單一清潔劑處理，能有效地使脂質包膜病毒去活化，即使在低濃度清潔劑下。

實施例 7 ：使用 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物或 Triton X-100 還原形式使含 IVIG 之液體中的 BVDV 去活化

測試4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式用於單一清潔劑處理，以使包含靜脈內免疫球蛋白(IVIG)之液體中的脂質包膜病毒牛病毒性下痢病毒(BVDV)去活化之適用性，並與Triton X-100進行比較。為此，將病毒加入到包含IVIG之液體中。之後將包含IVIG之含病毒液體與低濃度之Triton X-100還原形式、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100靜置不同之時間段，並測定病毒之剩餘感染性。Triton X-100還原形式、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100以低濃度使用，以評估病毒去活化之動力學，即病毒去活化效率(由RF表示)隨時間之變化。如本領域技術人員清楚所了解，在諸如生物製藥生產之商業生產過程中，包括Triton X-100還原形式或4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物之本發明清潔劑可以顯著更高之濃度使用，這將加速病毒去活化之動力學，亦預期可增加可達成之LRV。

材料

包含 IVIG 之液體

將含有IVIG之液體(含IVIG之液體)在乾冰上冷凍並在≤-60℃下儲存，直至自收集之日起一年內使用。病毒

¹ATCC ：美國典型培養物保存中心，大學大道10801 號，馬納薩斯州，VA20110 ，美國 表 4：實驗中使用之病毒儲存液。

清潔劑

方法

在不利於病毒去活化之條件下，即在較短之靜置時間和相對較低之溫度下，評估單一清潔劑處理之病毒去活化能力和穩健性。本領域技術人員將了解，在諸如生物製藥生產之商業生產過程中，可使用更長之靜置時間和更高之溫度，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之LRV。此外，如上所述，使用低濃度之各清潔劑。如本領域技術人員所清楚的，在諸如生物製藥生產之商業生產過程中，可使用更高濃度之各清潔劑，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之LRV。

由於蛋白質濃度對病毒去活化沒有顯著影響(亦請見Dichtelmüller等人，2009年)，關於蛋白質含量之穩健性並未研究。

將含有IVIG之液體解凍，所有進一步之步驟都在第二級生物安全櫃中進行。使用與低溫恆溫器相連之雙壁容器，含有IVIG之液體在攪拌下、於+17℃ ± 1℃之溫度下靜置。之後將含有IVIG之液體通過0.2 µm深度過濾器過濾，該過濾器之有效過濾面積為25 cm ²(Cuno VR06或等效物)，該過濾器與Sartorius (SM16249)不鏽鋼過濾器維持器相連，使用加壓氮氣，在 0.9 bar之目標壓力下(極限：0.5 bar至1.5 bar)。為了改善性能(conditioning)，過濾材料以55 L/m ²Hyflo Supercel懸浮液進行預塗層(5.0 g ± 0.05 g每公升Hyflo Supercel；電導率調整到3.5 mS/cm(指定範圍：2.5 至6.0 mS/cm)，使用3 M NaCl)(壓力≤ 0.5 bar)，之後過濾液體。在過濾過程中，過濾器維持器被冷卻，並使用連接到低溫恆溫器之雙壁容器，在+17℃ ± 1℃之目標溫度下收集濾液。冷卻濾液容器。若過濾器被堵塞，則使用新鮮之預處理過濾器來繼續過濾剩餘之液體。過濾後測量體積。

測量含IVIG液體之體積後，在攪拌下以冷(+2℃至+8℃)稀釋緩衝液(目標電導率為3.5 mS/cm(範圍：2.5 mS/cm至6.0 mS/cm))調整體積，直至計算之目標吸光度為28.9 AU _280-320/cm(範圍：14.5至72.3 AU _280-320/cm)為止。考量到之後的1:31病毒尖峰，這導致在過濾後與清潔劑一起靜置之目標吸光度計算值為28 AU _280-320/cm(範圍：14至70 AU _280-320/cm)。

使用連接到低溫恆溫器之雙壁容器，在攪拌下再次將經過濾和蛋白質經調整之含有IVIG之液體調整至+17℃ ± 1℃。在攪拌下保持該溫度範圍直到該經過濾之含有IVIG之液體與清潔劑之靜置結束並連續記錄。將測定體積之經過濾含有IVIG之液體轉移到已確定空重之螺旋蓋燒瓶中，以1:31之比例加入病毒，例如將30 mL含IVIG之液體加入1 mL病毒儲存液。加入病毒之含IVIG液體在17℃ ± 1℃之持續攪拌下進一步靜置。在加入病毒後1至2分鐘內，採集用於病毒滴定之樣本(加入病毒對照組SC，以及維持對照組HC)。

取出後，維持對照組(HC)與加入病毒之含有IVIG之液體，在加入清潔劑後保持在相同之溫度，即+17℃ ± 1℃，即，將其儲存在與裝有IVIG液體之容器相同之冷卻循環中，直到清潔劑處理結束。在置入該維持對照組樣本之前測定冷卻液體之溫度，並在清潔劑處理後、該維持對照組取出滴定之前一段短時間內再次測定。

測定加入病毒之含有IVIG之液體的重量，以計算要加入之清潔劑之量。如有必要，已稱重之材料在攪拌下重新調整至+17℃ ± 1℃。每克含有IVIG之液體加入所需量之清潔劑([mg])或各1:10稀釋液之量，以產生以下最終濃度之各清潔劑：0.1% ± 0.01% (w/w)或0.03% ± 0.01% (w/w)。在攪拌下於1分鐘內使用注射器加入清潔劑，並以回稱該注射器來確定實際加入量。在+17℃ ± 1℃、持續攪拌下，將加入病毒之含有IVIG之液體與各清潔劑進一步靜置59 ± 1分鐘。在靜置期間，在1至2分鐘、10 ± 1分鐘、30 ± 1分鐘和59 ± 1分鐘時採集1 mL病毒滴定樣本。為了防止在樣本抽取後S/D試劑進一步使病毒去活化，樣本立即以1:20(即1份體積樣本加19份體積細胞培養基)之各冷(+2℃至+8℃)細胞培養基稀釋。

結果

當使用0.1% ± 0.01% Triton X-100、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在17℃ ± 1℃下對含IVIG之液體進行單一清潔劑處理時，BVDV在10分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)約為5 (圖5A)。當使用0.03% ± 0.01% Triton X-100、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或 Triton X-100 還原形式，在17℃ ± 1℃下對含IVIG之液體進行單一清潔劑處理時，BVDV在10分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)超過3，且在30分鐘內超過4 (圖5B)。

這些實驗證實，使用Triton X-100、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式對含生物製藥藥物之液體進行單一清潔劑處理，可有效地使脂質包膜之病毒去活化，即使在低濃度之清潔劑下。

實施例 8 ：使用 4- 第三 - 辛基苯甲醇聚乙氧化物或 Triton X-100 還原形式使含 FVIII 之液體中的 BVDV 去活化

測試4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式用於單一清潔劑處理，以使包含血漿衍生因子VIII (pdFVIII)之液體中的脂質包膜病毒牛病毒性下痢病毒(BVDV)去活化之適用性，並與Triton X-100進行比較。為此，將病毒加入到包含pdFVIII之液體中。之後將包含pdFVIII之含病毒液體與低濃度之Triton X-100還原形式、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100靜置不同之時間段，並測定病毒之剩餘感染性。Triton X-100還原形式、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100以低濃度使用，以評估病毒去活化之動力學，即病毒去活化效率(由RF表示)隨時間之變化。如本領域技術人員所了解，在諸如生物製藥生產之工業生產過程中，包括Triton X-100還原形式或4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物之本發明清潔劑可以顯著更高之濃度使用，這將加速病毒去活化之動力學，亦預期可增加可達成之LRV。

材料

包含 pdFVIII 之液體

將含有pdFVIII之液體(含pdFVIII之液體)在乾冰上冷凍並在≤-60℃下儲存，直至在收集之日起一年內使用。病毒

¹ATCC ：美國典型培養物保存中心，大學大道10801 號，馬納薩斯州，VA20110 ，美國 表 5：實驗中使用之病毒儲存液。

病毒儲存液在使用前進行鑑定。該鑑定包含經由至少10次獨立滴定測定病毒效價，並指定可接受之病毒效價範圍作為陽性對照組、測定病毒儲存液之蛋白含量、以PCR檢測病毒種類以及與其他病毒和黴漿菌之污染，以及使用不允許大病毒聚集體通過之過濾器測試病毒的聚集情況。僅使用通過PCR辨識/污染測試且沒有顯著聚集之病毒儲存液(即病毒儲存液和經過濾儲存液之間之感染性效價差異小於1.0 log)。

清潔劑

方法

在不利於病毒去活化之條件下，即在較短之靜置時間下，評估單一清潔劑處理之病毒去活化能力和穩健性。本領域技術人員將清楚，在諸如生物製藥生產之工業生產過程中，可使用更長之靜置時間，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之LRV。此外，如上所述，使用低濃度之各清潔劑。如本領域技術人員所清楚知道的，在諸如生物製藥生產之工業生產過程中，可使用更高濃度之各清潔劑，這將加速病毒去活化之動力學並可增加可達成之LRV。

將含有pdFVIII之液體解凍，所有進一步之步驟都在第二級生物安全櫃中進行。為了移除可能之總聚集體，將含有pdFVIII之液體通過0.45 µm膜過濾器(例如Sartorius SartoScale Sartobran或等效裝置)過濾。將含有pdFVIII之液體轉移到已測定空重之螺旋蓋燒瓶中，並在攪拌下調節至23℃ ± 1℃之目標溫度，使用連接到低溫恆溫器之雙壁容器。已測定體積之含有pdFVIII之液體以1:31之比例加入，例如48 mL含有pdFVIII之液體加入1.6 mL病毒儲存液。隨後，分別採集用於病毒滴定(加入病毒對照組，SC)和用於維持對照組(HC)之樣本。

取出後，維持對照組(HC)與加入病毒之含有pdFVIII之液體，在加入清潔劑後保持在相同之溫度，即+23℃ ± 1℃，即，將其儲存在與裝有pdFVIII液體之容器相同之冷卻循環中，直到清潔劑處理結束。在置入該維持對照組樣本之前測定冷卻液體之溫度，並在清潔劑處理後、該維持對照組取出滴定之前一段短時間內再次測定。

測定加入病毒之含有pdFVIII之液體的重量，以計算要加入之清潔劑之量。已稱重之材料使用連接到低溫恆溫器的雙壁容器，在攪拌下調整至+23℃ ± 1℃。保持該溫度範圍直到加入病毒的含有pdFVIII之液體與清潔劑的靜置結束並連續記錄。每克含有pdFVIII之液體加入所需量之清潔劑([mg])或各1:10稀釋液之量，以產生以下最終濃度之各清潔劑：0.1% ± 0.01% (w/w)。在攪拌下、於1分鐘內使用注射器加入清潔劑，並以回稱該注射器來確定實際加入量。在+23℃ ± 1℃、持續攪拌下，將加入病毒之含有pdFVIII之液體進一步靜置59 ± 1分鐘。在靜置期間，在1至2分鐘、5 ± 1分鐘、30 ± 1分鐘和59 ± 1分鐘時採集1 mL樣本用於病毒滴定。為了防止在樣本抽取後清潔劑進一步使病毒去活化，樣本立即以1:20(即1份體積樣本加19份體積細胞培養基)之各冷(+2℃至+8℃)細胞培養基稀釋。

結果

當使用0.1% ± 0.01% Triton X-100、4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在23℃ ± 1℃下對含pdFVIII之液體進行單一清潔劑處理時，BVDV在5分鐘內被去活化，病毒降低因數(RF)約為5 (圖6)。

實施例 9 ：毒理學測試

基於電腦數據，並未發現任何證據顯示本發明之清潔劑具有作為內分泌干擾物之活性。

產業可利用性：

本發明之方法和產物可用於產業上，例如用於產業製造過程中，進行與環境相容性之脂質包膜病毒之去活化。例如，可藉由本發明之方法獲得之清潔劑，可用於生物製藥之產業生產。因此，本發明具產業可利用性。 參考文獻Dichtelmüller et al. (2009): Robustness of solvent/detergent treatment of plasma derivatives: a data collection from Plasma Protein Therapeutics Association member companies. Transfusion 49(9): 1931-1943. Di Serio et al. (2005): Comparison of Different Reactor Types Used in the Manufacture of Ethoxylated, Propoxylated Products. Ind. Eng. Chem. Res. 44(25): 9482-9489. ECHA, Support document for identification of 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, ethoxylated as substances of very high concern because, due to their degradation to a substance of very high concern (4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol) with endocrine disrupting properties, they cause probable serious effects to the environment which give rise to an equivalent level of concern to those of CMRs and PBTs/vPvBs, adopted on 12 December 2012 Brochure 「Global Assessment of the State-of-the-Science of Endocrine Disruptors」 (WHO/PCS/EDC/02.2), published by the International Programme on Chemical Safety of the World Health Organization (2002) Simons et al. (1973): Solubilization of the membrane proteins from Semliki Forest virus with Triton X100. J Mol Biol. 80(1):119-133. US patent no. 1,970,578 International Patent Publication No. WO 2019/086463 Vogel‘s Textbook of Practical Organic Chemistry ((5th Edition, 1989, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith) Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16(9), 4883-4907; 2008: Effects of modifications of the linker in a series of phenylpropanoic acid derivatives: Synthesis, evaluation as PPARα/γ dual agonists, and X-ray crystallographic studies; Casimiro-Garcia, Agustin; Bigge, Christopher F.; Davis, Jo Ann; Padalino, Teresa; Pulaski, James; Ohren, Jeffrey F.; McConnell, Patrick; Kane, Christopher D.; Royer, Lori J.; Stevens, Kimberly A.; Auerbach, Bruce J.; Collard, Wendy T.; McGregor, Christine; Fakhoury, Stephen A.; Schaum, Robert P.; Zhou, Hairong. DOI:10.1016/j.bmc.2008.03. Chemistry - A European Journal, 23(60), 15133-15142; 2017: Solid Phase Stepwise Synthesis of Polyethylene Glycols; Khanal, Ashok; Fang, Shiyue.DOI:10.1002/chem.201703004 Journal of Medicinal Chemistry, 48(10), 3586-3604; 2005: Synthesis and Structure-Activity Relationships of Novel Selective Factor Xa Inhibitors with a Tetrahydroisoquinoline Ring; Ueno, Hiroshi; Yokota, Katsuyuki; Hoshi, Jun-Ichi; Yasue, Katsutaka; Hayashi, Mikio; Hase, Yasunori; Uchida, Itsuo; Aisaka, Kazuo; Katoh, Susumu; Cho, Hidetsura. DOI:10.1021/jm058160e Journal of Nanoparticle Research, 15(11), 2025/1-2025/12, 12 pp.; 2013: Magnetic nanoparticles conjugated to chiral imidazolidinone as recoverable catalyst; Mondini, Sara; Puglisi, Alessandra; Benaglia, Maurizio; Ramella, Daniela; Drago, Carmelo; Ferretti, Anna M.; Ponti, Alessandro. DOI:10.1007/s11051-013-2025-3 Journal of Organic Chemistry, 79(1), 223-229; 2014: A Scalable Procedure for Light-Induced Benzylic Brominations in Continuous Flow; Cantillo, David; de Frutos, Oscar; Rincon, Juan A.; Mateos, Carlos; Kappe, C. Oliver. DOI:10.1021/jo402409k Journal of Physical Chemistry B, 107(31), 7896-7902; 2003: Anellated hemicyanine dyes with large symmetrical solvatochromism of absorption and fluorescence; Huebener, Gerd; Lambacher, Armin; Fromherz, Peter. DOI:10.1021/jp0345809 PCT Int. Appl., 2005016240, 24 Feb 2005: Preparation of aryl carbamate oligomers for hydrolyzable prodrugs and prodrugs comprising same; Ekwuribe, Nnochiri N.; Odenbaugh, Amy L. WO 2004-US15004, May 6, 2004 Russian Journal of Applied Chemistry, 82(6), 1029-1032; 2009: Relative activity of alkenyl-gem-dichlorocyclopropanes in the reactions of hydrogenation and alkylation; Brusentsova, E. A.; Zlotskii, S. S.; Kutepov, B. I.; Khazipova, A. N. DOI:10.1134/S1070427209060196 Russian Journal of Organic Chemistry, 51(11), 1545-1550; 2015: Alkylation of aromatic compounds with 1-bromoadamantane in the presence of metal complex catalysts; Khusnutdinov, R. I.; Shchadneva, N. A.; Khisamova, L. F.

無

圖 1 ：低濃度之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物在17℃ ± 1℃下，對含有IVIG之液體進行S/D處理時之病毒去活化效率。使用三成分混合物得到最終濃度為0.04%-0.06%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、0.01%-0.02%聚山梨酯80、0.01%-0.02% TnBP(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由病毒降低因數(RF)指示，針對PRV進行二次(分別為A和B)。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物進行S/D處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100(4-第三-辛基酚聚乙氧化物，「TX-100」)進行S/D處理之病毒去活化進行比較。請注意，在(A)中，兩種清潔劑都顯示出相同之去活化動力學。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。

圖 2 ：低濃度之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物在1℃ ± 1℃下，對含有人類血清蛋白(HAS)之液體進行S/D處理之病毒去活化效率。使用三成分混合物得到最終濃度為0.08% – 0.1%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、0.02% – 0.03%聚山梨酯80、0.02% – 0.03% TnBP(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由病毒降低因數(RF)指示，針對X-MuLV進行二次(分別為A和B)。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物進行S/D處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100 (「TX-100」)進行S/D處理之病毒去活化進行比較。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。

圖 3 ：低濃度之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物在19℃ ± 1℃下，對含有HSA之液體進行S/D處理之病毒去活化效率。使用三成分混合物得到最終濃度為0.08% – 0.1%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物、0.02% – 0.03%聚山梨酯80、0.02% – 0.03%之TnBP(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由病毒降低因數(RF)指示，針對X-MuLV進行二次(分別為A和B)。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物進行S/D處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100 (「TX-100」)進行S/D處理之病毒去活化進行比較。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。

圖 4 ：(A) 低濃度4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(即4-第三-辛基環己醇聚乙氧化物)或Brij C10(即正-十六醇聚乙氧化物)，在14℃ ± 1℃下對含有HSA之緩衝液進行清潔劑處理時之病毒去活化效率。使用單一清潔劑處理後，得到最終濃度為0.09% – 0.11%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式或Brij C10(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由平均病毒降低因數(RF)指示，針對BVDV進行兩次。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(「TX-100 red.」)或Brij C10之單一清潔劑處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100(「 TX-100」)之單一清潔劑處理之病毒去活化進行比較。請注意，4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物和Triton X-100還原形式具有與Triton X-100相同之去活化動力學。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。(B) 低濃度之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在14℃ ± 1℃下對含有HSA之緩衝液進行清潔劑處理時之病毒去活化效率。使用單一清潔劑處理後，最終濃度為0.02%-0.04%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(與相同濃度之 Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化係由平均病毒降低因數(RF)指示，針對BVDV進行兩次。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(「TX-100 red.」)之單一清潔劑處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100(「TX-100」)之單一清潔劑處理之病毒去活化進行比較。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。

圖 5 ：(A) 低濃度4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在17℃ ± 1℃下對含有IVIG之液體進行清潔劑處理時之病毒去活化效率。使用單一清潔劑處理得到最終濃度為0.09% – 0.11%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由平均病毒降低因數(RF)指示，針對BVDV進行兩次。使用 4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(「TX-100 red.」)之單一清潔劑處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100(「 TX-100」)之單一清潔劑處理之病毒去活化進行比較。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。(B)低濃度之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在17℃ ± 1℃下對含有IVIG之液體進行清潔劑處理時之病毒去活化效率。使用單一清潔劑處理後，最終濃度為0.02%-0.04%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由平均病毒降低因數(RF)指示，針對BVDV進行兩次。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(「TX-100 red.」)之單一清潔劑處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100(「TX-100」)之單一清潔劑處理之病毒去活化進行比較。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。

圖 6 ：低濃度之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式，在23℃ ± 1℃下對含有凝血因子-VIII之液體進行清潔劑處理時之病毒去活化效率。使用單一清潔劑處理得到最終濃度為0.09% – 0.11%之4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(與相同濃度之Triton X-100並列比較)。病毒隨時間之去活化情況係由平均病毒降低因數(RF)指示，針對BVDV進行兩次。使用4-第三-辛基苯甲醇聚乙氧化物或Triton X-100還原形式(「TX-100 red.」)之單一清潔劑處理之病毒去活化，係與使用Triton X-100(「TX-100」)之單一清潔劑處理之病毒去活化進行比較。實心符號表示具有剩餘感染性之數值，非實心符號表示低於偵測極限之降低因數。

圖 7 ：使用如實施例3中所述之HPLC方法1得到之產物光譜。

圖 8 ：使用如實施例3中所述之HPLC方法2得到之產物光譜。

圖 9 ：使用如實施例3中所述之HPLC方法3得到之產物光譜。

無

Claims

一種製備及純化下式(XIX)化合物之方法
(式(XIX))，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表聚氧乙烯殘基，該方法包含下列步驟 (3) 將下式(XII)化合物
式(XII)，其中m和R如上所定義且X代表鹵素原子或羥基，與式HO(CH ₂CH ₂O) _nH之聚乙二醇(PEG)反應，其中n為n≥2之整數，以產生該式(XIX)化合物和下式(XIII)之副產物
(式(XIII))，其中R如上所定義且n為n≥2之整數；以及 (4) 藉由從中移除未反應之聚乙二醇(PEG)和該副產物而純化出該式(XIX)化合物。
如請求項1之方法，其在該步驟(3)之前更包含以下步驟(2)： (2) 將下式(XIV)之化合物
(式(XIV))，其中m和R如請求項1中所定義，轉化為下式(XII)之化合物
式(XII)，其中m、R和X如請求項1中所定義。
如請求項2之方法，其在該步驟(2)之前更包含以下步驟(1)： (1) 將甲苯進行反應以獲得下式(XIV)之化合物
(式(XIV))，其中m和R如請求項1中所定義。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中，該聚乙二醇(PEG)係使用作為反應物以及作為溶劑。
如請求項3或4之方法，其中在步驟(1)中，甲苯係與二異丁烯或化合物R-X反應，其中R如請求項1所定義，X代表鹵素原子。
如請求項2至5中任一項之方法，其中該步驟(2)中之轉化步驟為自由基反應，使用AIBN(偶氮雙(異丁腈))作為自由基起始劑。
如請求項1至6中任一項之方法，其中X為氯、碘或溴原子。
如請求項1至7中任一項之方法，其中X為溴原子。
如請求項2至8中任一項之方法，其中在步驟(2)中之轉化係使用N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)作為鹵化試劑。
如前述請求項中任一項之方法，其中該步驟(4)包含將該式(XIX)化合物在選自於烷類、醚類和酯類及其混合物的溶劑中之溶液，進行一或多次水性洗滌，以從該式(XIX)化合物中移除該未反應之聚乙二醇(PEG)。
如請求項10之方法，其中該選自於烷類、醚類及酯類及其混合物之溶劑為酯類。
如請求項11之方法，其中該選自於烷類、醚類及酯類及其混合物之溶劑為乙酸乙酯。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(4)中藉由移除該副產物而純化式(XIX)化合物之步驟，包含將該式(XIX)化合物在包含水和水混溶性有機溶劑之混合物中的溶液，以非極性溶劑洗滌一或多次。
如請求項13之方法，其中該非極性溶劑包含烷類。
如請求項14之方法，其中該烷類為己烷、環己烷或庚烷。
如請求項15之方法，其中該烷類為環己烷。
如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(3)係於不使用該聚乙二醇(PEG)以外之溶劑或稀釋劑之情況下進行。
如前述請求項中任一項之方法，其中不使用鹵化溶劑。
如前述請求項中任一項之方法，其不包括在步驟(3)之後使用任何製備級層析法。
如前述請求項中任一項之方法，其不包括使用任何製備級層析法。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中之反應進行至少10分鐘且不超過1小時。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中之反應進行至少20分鐘且不超過45分鐘。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中之反應進行30分鐘。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中之反應係於55℃至65℃之間的溫度下進行。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中之反應係於60℃的溫度下進行。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中，每莫耳當量(eq.)之該式(XII)化合物係與至少1.0、至少2.0、至少3.0或至少4.0莫耳當量(eq.)之該聚乙二醇(PEG)反應。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中，每莫耳當量(eq.)之該式(XII)化合物係與至少4.5莫耳當量(eq.)之該聚乙二醇(PEG)反應。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中，每莫耳當量(eq.)之該式(XII)化合物係與至少5.0莫耳當量(eq.)之該聚乙二醇(PEG)反應。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(3)中使用之聚乙二醇(PEG)的特徵為其在該步驟(3)之反應溫度下為液體。
如前述請求項中任一項之方法，其中該方法係以產生至少100 g、至少1 kg、至少10 kg、至少100 kg或至少1000 kg之該式(XIX)化合物之規模進行。
如請求項2至30中任一項之方法，其中步驟(2)所得之式(XII)化合物係由溶劑中沉澱出。
如請求項31之方法，其中該溶劑為醇類溶劑。
如請求項31至32中任一項之方法，其中該溶劑為極性溶劑。
如請求項32至33中任一項之方法，其中該醇類溶劑選自於由異丙醇、乙醇、甲醇及丁醇或其組合組成之群組。
如請求項32至34中任一項之方法，其中該醇類溶劑為二級醇。
如請求項32至35中任一項之方法，其中該醇類溶劑為異丙醇。
如請求項32至33中任一項之方法，其中該溶劑為乙腈。
如請求項2至37中任一項之方法，其中在步驟(2)和步驟(3)之間進行該式(XII)化合物之至少一次再結晶。
如請求項38之方法，其中如請求項31至37中任一項所使用之溶劑係使用作為步驟2和步驟3之間的再結晶步驟之溶劑。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟3之後進行至少1次、至少2次、至少3次或至少4次水性洗滌。
如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟3之後進行4至6次水性洗滌。
一種純化式(XIX)化合物之方法，
式(XIX)，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表聚氧乙烯殘基，係自包含該式(XIX)化合物之組成物中純化出，該方法包含將位於選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑中之該組成物溶液，進行一或多次水性洗滌。
如請求項42之方法，其中該選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之該溶劑為酯類。
如請求項43之方法，其中該選自於烷類、醚類和酯類及其混合物之溶劑為乙酸乙酯。
如請求項42至44中任一項之方法，其中該組成物包含聚乙二醇(PEG)。
如請求項45之方法，其中該式(XIX)化合物之純化包含從該組成物中移除聚乙二醇(PEG)。
如請求項46之方法，其中該移除聚乙二醇(PEG)包含將該溶液進行一或多次水性洗滌。
如請求項42至47中任一項之方法，其中該組成物更包含下式(XIII)之化合物：
(式(XIII))，以及其中R如請求項42中所定義且n為n≥2之整數。
如請求項48之方法，其中式(XIX)化合物之純化包含從該組成物中移除式(XIII)化合物。
如請求項49之方法，其中該式(XIII)化合物之移除包含製備包含該式(XIX)化合物之水溶液，並藉由將該水溶液以非極性溶劑進行一或多次洗滌而移除該式(XIII)化合物。
如請求項50之方法，其中該非極性溶劑包含烷類。
如請求項51之方法，其中烷類為己烷、環己烷或庚烷。
如請求項52之方法，其中烷類為環己烷。
如請求項1至53中任一項之方法，其中藉由該方法所獲得之式(XIX)化合物之純度，在使用200 nm紫外線偵測之高效液相層析法中測定為至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%，最佳至少95%。
如請求項1至54中任一項之方法，其中藉由該方法所獲得之式(XIX)化合物之純度，在使用蒸發光散射偵測器(ELSD)偵測之高效液相層析法中測定為至少99%。
如前述請求項中任一項之方法，更包含辨識出下式(XIII)化合物之步驟：
(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及n為n≥2之整數。
如前述請求項中任一項之方法，更包含對下式(XIII)之化合物進行定量之步驟：
(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及n為n≥2之整數。
如前述請求項中任一項之方法，其中A代表包含4至16個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。
如前述請求項中任一項之方法，其中A代表包含8至10個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。
如前述請求項中任一項之方法，其中A代表包含9或10個氧乙烯單元之聚氧乙烯殘基。
如前述請求項中任一項之方法，其中R代表具有2至6個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。
如前述請求項中任一項之方法，其中R代表具有2至6個碳原子之直鏈和2至4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。
如前述請求項中任一項之方法，其中R代表具有4個碳原子之直鏈和4個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基。
如前述請求項中任一項之方法，其中R代表2,4,4-三甲基-戊-2-基。
如前述請求項中任一項之方法，其中式(XIX)化合物為以下化合物：
其中m等於1，且z為選自以下之整數： z = 1到5。
如前述請求項中任一項之方法，其中式(XIX)化合物為以下化合物：
其中n為介於4至16之間的整數，較佳其中n等於8、9或10。
一種如下式(XIX)之化合物
(式(XIX))，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表聚氧乙烯殘基，以及其中該化合物可藉由前述請求項中任一項所述之方法獲得。
如請求項67之化合物，其具有在使用200 nm紫外線偵測之高效液相層析法中測定為至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%，最佳至少95%之純度。
如請求項67或68之化合物，其具有在使用蒸發光散射偵測器(ELSD)偵測之高效液相層析法中測定為至少99%之純度。
一種非極性溶劑用於萃取及移除下式(XIII)之化合物之用途：
(式(XIII))，其中R代表具有2至12個碳原子之直鏈及一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及n為n≥2之整數，係自包含該式(XIII)化合物和式(XIX)化合物之組成物中萃取和移除式(XIII)化合物，
式(XIX)，其中m=1，R代表具有2至12個碳原子之直鏈和一或多個甲基作為該直鏈上之取代基之烴基，以及A代表一聚氧乙烯殘基。
如請求項70之用途，其中該非極性溶劑係如請求項51至53中任一項所定義。
如請求項70或71之用途，其中A係如請求項58至60中任一項所定義。
如請求項70至72中任一項之用途，其中R如請求項61至64中任一項所定義。
如請求項70至73中任一項之用途，其中式(XIX)化合物如請求項65至66中任一項所定義。