TW202128733A

TW202128733A - 使用肝特異性基因療法載體之遺傳性血管性水腫的治療

Info

Publication number: TW202128733A
Application number: TW109139830A
Authority: TW
Inventors: 彼得克羅希
Original assignee: 美商拜奧馬林製藥公司
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2021-08-01
Also published as: CO2022005641A2; BR112022009279A2; WO2021097157A1; IL292717A; KR20220098210A; CL2022001260A1; AU2020384294A1; US20230340078A1; EP4058475A1; JP2023503850A; CA3161154A1; CN114829391A; MX2022005869A

Abstract

本文提供用於治療缺少C1酯酶抑制劑之組合物及方法，其藉由在患有HAE之個體中使C1酯酶抑制劑的水準正常化。

Description

使用肝特異性基因療法載體之遺傳性血管性水腫的治療

本文提供重組型腺相關病毒(rAAV)載體及病毒顆粒，其藉由在個體的肝臟中實現長期表現C1酯酶抑制劑(C1EI，或C1-INH)以用於治療遺傳性血管性水腫。

遺傳性血管性水腫(HAE)係由C1EI基因（其被稱為SERPING1）中的突變所引起。大多數患者(85%)的C1EI水準低（稱為第I型HAE），而少數(15%)之功能異常的突變C1EI水準正常或升高（稱為第II型HAE）。還有第三種類型HAE（第III型HAE）之患者的C1EI蛋白正常但在其他基因中發生突變，諸如引起HAE的因子XII基因。第I及II型HAE的特徵為缺乏功能性血漿C1酯酶抑制劑，會因為未經調控的補體路徑活化及/或接觸活化路徑而造成發炎性危症。所述危症會出現蕁麻疹及/或血管性水腫的症狀，諸如皮膚及/或黏膜腫脹（皮下水腫或黏膜下水腫），包括呼吸道及胃腸道。喉部腫脹會導致致命的窒息。嚴重腫脹的反復發作會影響手臂、腿、臉部、腸道及呼吸道，若它們阻塞呼吸則會令人疼痛、容面受損且有時甚至危及生命。若不加以治療，該病況有25%的死亡率。據估計，HAE在全球50,000至100,000個人中會影響1個人。

較小的外科手術或牙科手術處置或創傷、感染、壓力及藥物的使用（尤其是血管收縮素轉換酶(ACE)及雌激素之抑制劑）可引發危機HAE危症。急性危症通常是以C1EI蛋白、新鮮冷凍血漿、血漿衍生的C1EI蛋白、艾卡拉肽(ecallantide)（激肽釋放素酶抑制劑）及/或艾替班特(icatibant)（緩激肽B2受體拮抗劑）治療。常規的預防療法包括血漿衍生的C1EI蛋白、減弱的雄激素（諸如達那唑(danazol)）、抗纖維蛋白溶解劑及孕酮，儘管其每一種都有副作用。孕婦的治療存在問題，因為在懷孕期間禁用雄激素及抗纖維蛋白溶解劑。

C1EI為絲胺酸蛋白酶抑制劑，其直接或間接抑制若干與HAE發作相關聯之蛋白酶。其為若干補體蛋白酶（諸如C1r及C1s及接觸蛋白酶，包括因子XIIa及激肽釋放素酶）之主要抑制劑，以及纖維蛋白溶解蛋白酶（諸如血纖維蛋白溶解酶及因子XIa）之次要抑制劑。在患有HAE之患者中，因為功能性C1-INH的水準不足，接觸路徑不受抑制地活化會造成高分子量的激肽原被激肽釋放素酶不受調控地裂解，導致過量的游離緩激肽（其為一種有效的血管活性肽，可增加微血管通透性及水腫）生成。參見(例如) Riedl M. “Recombinant human C1 esterase inhibitor in the management of hereditary angioedema.” Clin Drug Investig. 2015;35(7):407–417。

本文所述之實施例係有關於載體構築體、重組複製缺陷型AAV顆粒、細胞及醫藥組合物，以用於遞送功能性人類C1酯酶抑制劑(C1EI)至有需要之個體，尤其患有遺傳性血管性水腫或是缺少功能性C1EI之個體。本文所述之實施例亦有關於這類AAV顆粒或這類載體構築體之遞送一編碼人類C1EI之基因至患者(人類個體)肝細胞的用途，所述患者係經診斷患有遺傳性血管性水腫或缺少功能性C1EI。

在一態樣中，本文所述之實施例係提供一種包含有編碼功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)之核酸序列的載體構築體。在一或多個實施例中，該功能性C1EI包含與SEQ ID NO: 2（人類C1EI，或“hC1EI”）之胺基酸23-500至少90%、95%或98%一致之胺基酸序列。在例示實施例中，編碼功能性C1EI之核酸序列為野生型序列，其中SEQ ID NO: 1為一實例，或為密碼子最佳化的，或為變異體。替代之密碼子最佳化的人類C1EI編碼序列係安排在SEQ ID NO: 10-13、59或60。在例示實施例中，編碼功能性C1EI之核酸序列係包含與SEQ ID NO: 1或10-13或59-60之至少100、200、300、400或500個連續鹼基至少90%的同源性，且其編碼與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少95%一致之功能性人類C1酯酶抑制劑(hC1EI)。在一些實施例中，hC1EI的編碼序列為表現在人類中密碼子最佳化的。在一實施例中，該密碼子最佳化的hC1EI核酸係包含降低之CpG二核苷酸含量。在一實施例中，該CpG二核苷酸含量低於25。

在一或多個實施例中，編碼C1EI之核酸序列係可操作地連接至一或多個異源表現控制元件。較佳地，該編碼hC1EI之轉殖基因的表現係受肝特異性表現控制元件所控制。因此，在這類實施例中，在本文所述之載體構築體中，編碼C1EI之核酸序列係可操作地連接至一異源肝特異性轉錄調節區。在一些實施例中，在本文所述之載體構築體中，該表現控制元件包含以下之一或多者：啟動子及/或增強子；視情況存在之內含子；以及聚腺苷酸(polyA)信號。這類元件係進一步描述於本文中。

肝特異性轉錄調節區可包含一或多個肝特異性表現控制元件。在一或多個實施例中，肝特異性轉錄調節區為包含有人類α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子、肝控制區(HCR)增強子、及/或脂蛋白元E (ApoE)增強子之合成啟動子序列。在一些實施例中，肝特異性轉錄調節區包含(a)與SEQ ID NO: 16至少90%一致之縮短ApoE增強子序列；(b)與SEQ ID NO: 3至少90%一致之α抗胰蛋白酶(hAAT)近端啟動子序列；(c)選自由以下組成之群的一或多種增強子：(i)與SEQ ID NO: 4至少90%一致之ApoE/HCR增強子，(ii) AAT啟動子遠端X區，及(iii) AAT啟動子遠端區。在一例示實施例中，肝特異性轉錄調節區之序列包含與SEQ ID NO: 5至少80%、85%、90%或95%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，肝特異性轉錄調節區包含(a)與SEQ ID NO: 17至少90%一致之α-微球蛋白增強子序列，及/或(b)與SEQ ID NO: 3至少90%一致之α抗胰蛋白酶(AAT)近端啟動子。

在一些實施例中，載體構築體包含一或多個內含子。在一些實施例中，內含子亦增強編碼C1EI之核酸的表現，且視情況增強在肝臟中的表現。在一或多個實施例中，內含子為複合hAAT/血球蛋白內含子序列。在一例示實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 6至少80%、85%、90%或95%一致之核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 61至少80%、85%、90%或95%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼C1EI之核苷酸序列包含內含子。

在一些實施例中，載體構築體包含聚腺苷酸信號，視情況包含牛生長激素(bGH) poly(A)信號(例如，SEQ ID NO: 19)或較佳地包含人類生長激素(hGH) poly(A)信號(例如，SEQ ID NO: 7)。

載體構築體較佳地為重組型AAV載體構築體。在一些實施例中，載體構築體包含(a)以下一或二者：(i) AAV 5'反向末端重複序列(ITR)及(ii) AAV3’ ITR；(b)啟動子及/或增強子，例如肝特異性轉錄調節區；以及(c)編碼功能活性人類C1酯酶抑制蛋白之核酸序列，或其片段。在一些實施例中，載體構築體包含(a) AAV 5'反向末端重複(ITR)序列(例如，SEQ ID NO: 54)；(b)啟動子及/或增強子，例如肝特異性轉錄調節區；(c)編碼功能活性人類C1酯酶抑制蛋白之核酸序列；及(d) AAV 3' ITR (例如，SEQ ID NO: 55)。該AAV 5' ITR及/或AAV 3' ITR可來自異源AAV假型（其可能或可能不如本技術領域已知般修飾）。在一些實施例中，5’ ITR及3’ ITR序列係衍生自AAV2。在一或多個實施例中，該載體構築體為大小約3 kb至約5 kb、或大小約2.7 kb至約4 kb之AAV載體基因組。在一或多個實施例中，該該載體構築體為大小約2.7 kb至約3.3 kb、或大小約3.7 kb至約4.1 kb之AAV載體基因組，例如SEQ ID NO: 57及58。

在例示實施例中，該載體構築體包含與SEQ ID NO: 9、20-36或57-58中之任一者至少80%、85%、90%或95%一致之核苷酸序列。

在另一態樣中，本文提供重組型腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含AAV衣殼及如本文實施例中之一或多者中所述之載體構築體。在一些實施例中，該用於遞送C1EI-編碼基因（「rAAV.SERPIN G1」或「AAV-SERPIN G1」）之重組型AAV (rAAV)顆粒具有肝趨性。在這類實施例中，rAAV包含具有肝趨性之AAV衣殼（例如，與SEQ ID NO: 46至少90%一致之AAV5衣殼）、或猴AAV衣殼、視情況存在之狒狒衍生型AAV衣殼或其展現肝趨性之變異體。在一或多個實施例中，(例如)當在活體外以IVIG中和來評估時，該AAV衣殼為先前存在體液性免疫與AAV5相似之衣殼，或與AAV5相比體液性免疫降低的衣殼。

在另一態樣中，本文提供用於產生用作為基因遞送載體之AAV顆粒之方法，該方法包含以下步驟：(1)提供包含有一或多種核酸構築體之昆蟲細胞，該等核酸構築體包含：(a)本文所述之載體構築體，其包含本文所述之由兩個AAV ITR核苷酸序列側接的核酸；(b)編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，該一或多種AAV Rep蛋白可操作地連接至能夠驅使Rep蛋白在昆蟲細胞中表現的啟動子；(c)編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，該一或多種AAV衣殼蛋白可操作地連接至能夠驅使衣殼蛋白在昆蟲細胞中表現的啟動子；其中(b)及(c)係位於相同的表現卡匣中或在兩個不同的表現卡匣中；以及(d)視情況存在之編碼VP2/3中含有的AAP及MAAP之基因；(2)在有助於表現Rep及衣殼蛋白之條件下培養(1)中定義之昆蟲細胞；且視情況(3)回收AAV顆粒。

在又一態樣中，本文提供醫藥組合物，其包含本文所述之載體構築體或本文所述之rAAV顆粒，及無菌的醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。

在另一態樣中，本文提供遞送C1EI基因至哺乳動物個體之方法。這類方法包含在哺乳動物個體中表現C1EI之方法，包含向該個體投與一包含有本文所述之載體構築體、本文所述之rAAV顆粒、或本文所述之醫藥組合物的組合物，藉以在該個體中表現經編碼的C1EI蛋白。較佳地，在這類方法中，該哺乳動物為人類且該C1EI為如本文所述之功能性人類C1EI。這類方法包括在哺乳動物肝臟中表現C1EI之方法，其係藉由投與有效增加該哺乳動物肝臟中之C1EI表现水準之一定量之載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組合物。這類方法亦包括增加哺乳動物血液中之功能性C1EI水準的方法，其係藉由投與有效增加該哺乳動物血液中之功能性C1EI水準之一定量之載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組合物。這類方法亦包括治療哺乳動物中之功能性C1EI缺乏的方法，其係藉由投與有效增加該哺乳動物血液中之功能性C1EI水準之一定量之載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組合物。在一些實施例中，該載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組合物的量係有效增加血液中之功能性C1EI水準至約0.4 IU/ml或1 IU/ml或更高，或增加C1EI水準至約16 mg/dL或更高。

這類方法亦包括治療哺乳動物中之遺傳性血管性水腫、或治療或預防其症狀的方法，包含投與治療有效量之載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組合物。在一或多個實施例中，這類方法降低哺乳動物中之黏膜下或皮下水腫、急性HAE發作的頻率或嚴重性，或投與治療急性HAE發作的按需治療量。

在本文所述方法之任一者中，rAAV顆粒係以約1 x 10¹² 至約1 x 10¹⁴ vg/kg或1 x 10¹⁵ vg/kg，或替代以約2 x 10¹² 至約6 x 10¹³ vg/kg，或替代以約6 x 10¹³ vg/kg至約1 x 10¹⁵ vg/kg之劑量遞送。

在水性懸浮液中。在本文所述方法之任一者中，載體構築體、rAAV顆粒或醫藥組合物之投與可進一步包含投與防治性或治療性皮質類固醇治療，及/或可進一步包括投與第二治療劑以治療HAE。在本文所述方法之任一者中，在如上述向患者投與AAV顆粒之前，可針對能夠阻斷細胞轉導或以其他方式降低治療方案之總效率之抗AAV衣殼抗體的存在評估預期患者。

熟習此項技術者在閱讀本說明書時將顯而易知其他實施例。

本文提供編碼功能活性治療C1EI蛋白之核酸或載體構築體、AAV載體基因組、及包含有這類載體構築體之複製缺陷型rAAV顆粒、以及包含有這類載體構築體、載體基因組及AAV顆粒之醫藥組合物。本發明之組合物及方法可提供改良的AAV病毒生產良率及/或簡化的純化及/或增強的表現，尤其是增強的肝特異性表現。本文亦提供製造該載體構築體、AAV載體基因組、及包含有這類載體構築體之複製缺陷型rAAV顆粒的方法。本文進一步提供治療功能性C1EI缺乏、或遺傳性血管性水腫之方法。定義：

除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。參見(例如) Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)；Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。出於本發明之目的，以下術語定義如下。

如本文所用，在基因遞送之上下文中，術語「載體」或「基因遞送載體」可指作為基因遞送載劑且包含封裝在(例如)外膜或衣殼內之核酸（亦即，包含有本文所述之載體構築體中之任一者的載體基因組）的顆粒。基因遞送載體可為病毒基因遞送載體或非病毒基因遞送載體。替代性地，在一些情況下，術語「載體」可用於僅指代載體基因組或載體構築體。適用於本文中之病毒載體可為小病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒或單純疱疹病毒。小病毒可為腺病毒相關病毒(AAV)。

如本文所用，術語「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為僅在某些功能由共感染輔助病毒提供之細胞中生長之單股DNA小病毒。當前有許多種已表徵之AAV血清型。AAV之總體資訊及綜述可見於例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, 第1卷, 第169-228頁；及Berns, 1990, Virology, 第1743-1764頁, Raven Press, (New York)；Gao等人, 2011, Methods Mol. Biol. 807: 93-118; Ojala等人, 2018, Mol. Ther. 26(1): 304-19中。然而，完全預期此等相同原理將適用於額外AAV血清型，因為熟知各種血清型在結構上及功能上相當密切相關，甚至在基因層面上亦如此。（參見(例如) Blacklowe, 1988, Parvoviruses and Human Disease之第165-174頁, J. R. Pattison編; 及Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)）。例如，全部AAV血清型明顯展現藉由同源rep基因介導之非常類似的複製特性；且全部攜有三種相關衣殼蛋白。相關性程度進一步藉由揭示血清型之間沿基因組長度之廣泛交叉雜交的異雙螺旋分析；及在末端對應於「反向末端重複序列」(ITR)之類似自黏接鏈段之存在來表明。

如本文所用，「AAV載體構築體」係指單股或雙股核酸，其具有以下至少一者：(i) AAV 5'反向末端重複(ITR)序列及(ii)側接蛋白編碼序列（在一實施例中為功能性治療蛋白編碼序列，例如C1EI）之AAV 3' ITR，該蛋白編碼序列可操作地連接至與該蛋白編碼序列異源及/或與該AAV病毒基因組異源之轉錄調節元件（亦稱「表現控制元件」），即一或多個啟動子及/或增強子，及視情況存在之聚腺苷酸化序列及/或一或多個插入該蛋白編碼序列之外顯子之間的內含子。單股AAV載體係指存在於AAV病毒顆粒之基因組中且可為本文所揭示之核酸序列之有義鏈或反義鏈之核酸。這類單股核酸之尺寸係以鹼基提供。雙股AAV載體係指用於表現或轉移AAV載體核酸之存在於質體(例如pUC19)之DNA或雙股病毒(例如桿狀病毒)之基因組中的核酸。這類雙股核酸之尺寸係以鹼基對(bp)提供。

呈單股形式之本文所提供之AAV載體構築體之長度小於約7.0 kb、或長度小於6.5 kb、或長度小於6.4 kb、或長度小於6.3 kb、或長度小於6.2 kb、或長度小於6.0 kb、或長度小於5.8 kb、或長度小於5.6 kb、或長度小於5.5 kb、或長度小於5.4 kb、或長度小於5.3 kb、或長度小於5.2 kb、或長度小於5.0 kb、或長度小於4.8 kb、或長度小於4.6 kb、或長度小於4.5 kb、或長度小於4.4 kb、或長度小於4.3 kb、或長度小於4.2 kb、或長度小於4.1 kb、或長度小於4.0 kb、或長度小於3.9 kb、或長度小於3.8 kb、或長度小於3.7 kb、或長度小於3.6 kb、或長度小於3.5 kb、或長度小於3.4 kb、或長度小於3.3 kb、或長度小於3.2 kb、或長度小於3.1 kb、或長度小於3.0 kb。呈單股形式之本文所提供之AAV載體構築體之長度在約5.0 kb至約6.5 kb範圍內、或長度在約4.8 kb至約5.2 kb範圍內、或長度為4.8 kb至5.3 kb、或長度在約4.9 kb至約5.5 kb範圍內、或長度為約4.8 kb至約6.0 kb、或長度為約5.0 kb至6.2 kb、或長度為約5.1 kb至約6.3 kb、或長度為約5.2 kb至約6.4 kb、或長度為約5.5 kb至約6.5 kb、或長度在約4.0 kb至約5.0 kb範圍內、或長度在約3.8 kb至約4.8 kb範圍內、或長度為3.6 kb至4.6 kb、或長度在約3.4 kb至約4.4 kb範圍內、或長度在約3.2 kb至約4.2 kb範圍內、或長度在約3.0 kb至4.0 kb範圍內、或長度在約3.5 kb至約4.0 kb範圍內、或長度在約3.0 kb至約3.5 kb範圍內。

儘管已有文獻報導AAV顆粒具有＞ 5.0kb之AAV基因組，在許多這種情況下，編碼基因之5'或3'端似乎被截斷（參見Hirsch等人,Molec. Ther. 18:6-8, 2010及Ghosh等人,Biotech. Genet. Engin. Rev. 24:165- 178, 2007）。然而已顯示，重疊的同源重組發生在AAV感染細胞中之具有5'端截斷與3'端截斷的核酸之間，以產生編碼大蛋白質之「完整」核酸，進而重構功能性全長基因。

過大的AAV載體係於5’端處隨機截斷且缺乏5' AAV ITR。因為AAV為單鏈DNA病毒且包裝有義鏈或反義鏈，所以在過大AAV載體中之有義鏈缺乏5' AAV ITR且可能缺乏目標蛋白編碼基因之5’端之部分，且過大的AAV載體中之反義鏈缺乏3' ITR且可能缺乏目標蛋白編碼基因之3’端之部分。功能性轉殖基因係於過大AAV載體感染的細胞中、藉由在目標細胞內黏著有義及反義截斷基因組來產生。因此，在某些實施例中，AAV C1EI及/或病毒顆粒包含至少一ITR。

如本文所用之術語「反向末端重複序列(ITR)」係指在AAV基因組之5'及3'端發現的技術辨識區，該等區域以順式充當DNA複製起點及充當病毒基因組之封裝信號。AAV ITR連同AAV rep編碼區提供自插入兩個側接ITR之間的核苷酸序列之有效切除及救援(rescue)，且將所述核苷酸序列嵌入至宿主細胞基因組中。某些AAV相關ITR之序列係由Yan等人,J. Virol. (2005) 第79卷, 第364-379頁所揭示，該文獻以全文引用之方式併入本文中。可用於本文中之ITR序列可為保留功能性能力之全長野生型AAV ITR或其片段，或可為能夠以順式充當複製來源之全長野生型AAV ITR之序列變異體。適用於本文所提供之實施例之重組型AAV C1EI載體中之AAV ITR可來源於任何已知AAV血清型，且在某些較佳實施例中，來源於AAV2或AAV5血清型。

術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況存在之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。

「轉錄調節元件」係指參與基因轉錄調節之基因之核苷酸序列，包括啟動子加上反應元件、活化子及增強子序列（用於結合轉錄因子以輔助RNA聚合酶結合及促進表現）及操縱子或靜止子序列（抑制因子蛋白與其結合以阻斷RNA聚合酶附接及預防表現）。術語「肝特異性轉錄調節元件」或「肝特異性轉錄調節區」係指特異性地在肝臟組織中產生偏好的基因表現之調節元件或區。肝特異性調節元件之實例包括(但不限於)小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子(mTTR)、內源性人類因子VIII啟動子(F8)、人類脂蛋白元E肝控制區及其活性片段、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)及其活性片段、人類α-1-微球蛋白啟動子及其片段增強子序列、人類凝血酶原啟動子及其活性片段、人類白蛋白最小啟動子及小鼠白蛋白啟動子。亦涵蓋來源於肝特異性轉錄因子結合位點之增強子，諸如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6及Enh1。

如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述調節元件與基因或其編碼區之間的連接。一般而言，基因表現在一或多個調節元件控制下，例如不限於組成性或誘導性啟動子、組織特異性調節元件及增強子。基因或編碼區係稱為「可操作地連接至」或「以操作方式連結至」調節元件或與調節元件「可操作地相關」，意謂基因或編碼區受調節元件的控制或影響。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。

在一實施例中，所述載體構築體包含編碼功能活性C1EI蛋白之核酸。C1EI編碼序列可為野生型、密碼子最佳化的或變異體。

如本文所用，野生型SERPIN G1 (C1EI-編碼基因)具有以下核酸序列： ATGGCCTCCAGGCTGACCCTGCTGACCCTCCTGCTGCTGCTGCTGGCTGGGGATAGAGCCTCCTCAAATCCAAATGCTACCAGCTCCAGCTCCCAGGATCCAGAGAGTTTGCAAGACAGAGGCGAAGGGAAGGTCGCAACAACAGTTATCTCCAAGATGCTATTCGTTGAACCCATCCTGGAGGTTTCCAGCTTGCCGACAACCAACTCAACAACCAATTCAGCCACCAAAATAACAGCTAATACCACTGATGAACCCACCACACAACCCACCACAGAGCCCACCACCCAACCCACCATCCAACCCACCCAACCAACTACCCAGCTCCCAACAGATTCTCCTACCCAGCCCACTACTGGGTCCTTCTGCCCAGGACCTGTTACTCTCTGCTCTGACTTGGAGAGTCATTCAACAGAGGCCGTGTTGGGGGATGCTTTGGTAGATTTCTCCCTGAAGCTCTACCACGCCTTCTCAGCAATGAAGAAGGTGGAGACCAACATGGCCTTTTCCCCATTCAGCATCGCCAGCCTCCTTACCCAGGTCCTGCTCGGGGCTGGGGAGAACACCAAAACAAACCTGGAGAGCATCCTCTCTTACCCCAAGGACTTCACCTGTGTCCACCAGGCCCTGAAGGGCTTCACGACCAAAGGTGTCACCTCAGTCTCTCAGATCTTCCACAGCCCAGACCTGGCCATAAGGGACACCTTTGTGAATGCCTCTCGGACCCTGTACAGCAGCAGCCCCAGAGTCCTAAGCAACAACAGTGACGCCAACTTGGAGCTCATCAACACCTGGGTGGCCAAGAACACCAACAACAAGATCAGCCGGCTGCTAGACAGTCTGCCCTCCGATACCCGCCTTGTCCTCCTCAATGCTATCTACCTGAGTGCCAAGTGGAAGACAACATTTGATCCCAAGAAAACCAGAATGGAACCCTTTCACTTCAAAAACTCAGTTATAAAAGTGCCCATGATGAATAGCAAGAAGTACCCTGTGGCCCATTTCATTGACCAAACTTTGAAAGCCAAGGTGGGGCAGCTGCAGCTCTCCCACAATCTGAGTTTGGTGATCCTGGTACCCCAGAACCTGAAACATCGTCTTGAAGACATGGAACAGGCTCTCAGCCCTTCTGTTTTCAAGGCCATCATGGAGAAACTGGAGATGTCCAAGTTCCAGCCCACTCTCCTAACACTACCCCGCATCAAAGTGACGACCAGCCAGGATATGCTCTCAATCATGGAGAAATTGGAATTCTTCGATTTTTCTTATGACCTTAACCTGTGTGGGCTGACAGAGGACCCAGATCTTCAGGTTTCTGCGATGCAGCACCAGACAGTGCTGGAACTGACAGAGACTGGGGTGGAGGCGGCTGCAGCCTCCGCCATCTCTGTGGCCCGCACCCTGCTGGTCTTTGAAGTGCAGCAGCCCTTCCTCTTCGTGCTCTGGGACCAGCAGCACAAGTTCCCTGTCTTCATGGGGCGAGTATATGACCCCAGGGCCTGA (SEQ ID NO:1)。

如本文所用，野生型C1-INH (C1EI蛋白)具有以下胺基酸序列： MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (SEQ ID NO: 2)。

本文所述之載體構築體可包含一不同於野生型但仍編碼與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少90%、95%或98%一致之功能性C1酯酶抑制劑胺基酸序列的核苷酸序列。根據此態樣，該核苷酸序列可包含一個具有與SEQ ID NO: 1或10-12之至少100個連續鹼基至少80%、85%或90%之同源性的部分，只要該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少90%、95%或98%一致之功能性人類C1酯酶抑制劑。在例示實施例中，該核苷酸序列可包含一個具有與SEQ ID NO: 1或10-12之至少100、200、300、400或500個連續鹼基至少90%之同源性的部分，只要該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少90%一致之功能性人類C1酯酶抑制劑。在例示實施例中，該核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 1或10-12之核苷酸序列實質同源性並編碼功能性C1EI。術語實質同源性可參考同源性百分比(%)（例如，至少80%、85%、90%或95%同源）進一步定義。此在本文中其他處進一步詳細地討論。

術語「分離」在關於本發明之核酸分子使用時通常係指自至少一種與其天然來源通常相關的污染核酸鑑別且分離的核酸序列。經分離之核酸可以與自然界中發現的形式或環境不同的形式或環境存在。因此，經分離之核酸分子與在天然細胞中存在的核酸分子有所區別。

如本文所用，術語「變異體」係指具有與參考聚核苷酸(或多肽)實質上類似的序列之聚核苷酸(或多肽)。熟習此項技術者已知在聚核苷酸、蛋白質或多肽中引入核苷酸及胺基酸變化之程序（參見例如Sambrook等人(1989)）。在聚核苷酸之情況中，與參考聚核苷酸相比，變異體可在5'端、3'端及/或一或多個內部位點處具有一或多個核苷酸之刪除、取代、添加。變異體與參考聚核苷酸之間之序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術（例如聚合酶鏈反應(PCR)及雜交技術）偵測。變異體聚核苷酸亦包括合成衍生之聚核苷酸，諸如(例如)藉由使用定點突變誘發產生之聚核苷酸。一般而言，如藉由熟練的技術人員已知之序列比對程式所判定，包括(但不限於) DNA之聚核苷酸的變異體可與參考聚核苷酸具有至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多的序列一致性。在多肽之情況下，與參考多肽相比，變異體可具有一或多個胺基酸之刪除、取代、添加。變異體與參考多肽之間之序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術（例如西方墨點法）偵測。一般而言，如熟習此項技術者已知的序列比對程式所判定，多肽的變異體可與參考多肽具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多的序列一致性。

術語「一致性」、「同源性」及其語法變化形式係意謂兩個或更多個參考實體在其為「比對」序列時相同。因此，藉助於實例，在兩個多肽序列一致時，其至少在參考區或部分內具有相同胺基酸序列。在兩個多核苷酸序列一致時，其至少在參考區或部分內具有相同聚核苷酸序列。一致性可在序列之界定區域(區或結構域)內。一致性之「區域」或「區」係指相同的兩個或更多個參考實體之部分。因此，在兩個蛋白質或核酸序列在一或多個序列區域或區內一致時，其在該區內共用一致性。「比對」序列係指多個聚核苷酸或蛋白質(胺基酸)序列，其與參考序列相比通常含有對缺失或額外鹼基或胺基酸(間隙)的校正。「實質同源性」意謂分子在結構上或在功能上保守，以使得其具有或經預測具有至少部分的參考分子或與其共用同源性之參考分子之相關/對應區或部分之一或多種結構或功能(例如，生物功能或活性)的結構或功能。

「核酸序列一致性或同源性百分比(%)」的定義為候選序列中之核苷酸的百分比，該等候選序列中之核苷酸在比對各別序列且必要時引入間隙以實現最大序列一致性百分比後係與參考序列一致。出於判定核酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如，使用公開可獲得之電腦軟體，諸如ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可判定用於量測比對之適當參數，包括用以實現所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。

關於本文中所鑑別之C1EI胺基酸序列，「胺基酸序列一致性或同源性百分比(%)」的定義為候選序列中之胺基酸殘基的百分比，該等候選序列中之胺基酸殘基在比對序列且必要時引入間隙以實現最大序列一致性百分比後，係與C1EI多肽序列中之胺基酸殘基一致，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於判定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如，使用公開可獲得之電腦軟體，諸如ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可判定用於量測比對之適當參數，包括用於實現所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。

「密碼子最佳化(codon optimization/codon optimized)」係指核苷酸序列中所產生之變化，以使得其與非密碼子最佳化序列相比更可能以相對較高程度表現。其不改變各密碼子編碼之胺基酸。

如本文所用，「內含子」廣泛定義為可藉由RNA剪接而移除之核苷酸序列。「RNA剪接」意謂自前mRNA切除內含子以形成成熟mRNA。內含子可謂於基因之編碼區上游、下游或之內。可藉由此項技術中已知之任何方法完成將內含子插入核苷酸序列中。插入內含子之位置的唯一限制為考慮AAV病毒顆粒(約5 kbp)之封裝限制。

在某些實施例中，重組型AAV載體構築體包含：(a)核酸，其包含AAV2 5'反向末端重複序列(ITR)（其可能或可能不如本技術領域已知般修飾），(b)肝特異性轉錄調節區，(c)功能性C1EI蛋白編碼區，(d)視情況存在之一或多個內含子，(e)聚腺苷酸化序列，及(f) AAV2 3' ITR（其可能或可能不如本技術領域已知般修飾）。

本文所提供之其他實施例係針對編碼功能性C1EI多肽之載體構築體，其中該等構築體在一或多個不同定向上包含一或多個上述構築體之個別元件及其組合。本文所提供之另一實施例係針對呈相反定向之上述構築體。在另一實施例中，提供包含本文中所述之AAV C1EI載體之重組型AAV病毒顆粒及其用於治療個體之HAE或功能性C1EI缺乏之用途。在一實施例中，所述個體為青少年個體。

「AAV病毒粒子」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」或「AAV病毒」係指由至少一種如本文所述之AAV衣殼蛋白及衣殼化AAV載體構築體構成之病毒顆粒。若所述顆粒包含異源聚核苷酸(亦即，除野生型AAV基因組外之聚核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因)，則通常稱作「重組型AAV載體顆粒」或僅稱作「AAV載體」。AAV載體顆粒之產生必定包括AAV載體基因組之產生，因此載體基因組係含在於AAV載體顆粒內。應理解，提及囊封在載體顆粒內之多核苷酸AAV載體構築體及其複制物係指AAV載體基因組。

如本文所用之「治療性AAV病毒」係指AAV病毒粒子、AAV病毒顆粒、AAV載體顆粒或AAV病毒，其包含編碼治療蛋白（諸如本文所述之C1EI）之異源聚核苷酸。如本文所用之「AAV載體構築體」或「AAV載體基因組」係指包含一或多種藉由至少一AAV末端重複序列(ITR)側接且可操作地連接至一或多種表現控制元件之所關注的聚核苷酸(亦稱轉殖基因)之載體構築體。當感染性病毒顆粒存在於經編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中時，這類AAV載體構築體可複製及封裝至感染性病毒顆粒中。

如本文所用之「治療蛋白」係指具有替代或補償內源蛋白之活性損失或降低之生物活性的多肽。例如，功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)為遺傳性血管性水腫(HAE)之治療蛋白。

如本文所用之「遺傳性血管性水腫(HAE)」係指一種遺傳性代謝性疾病，其特徵是由於補體路徑及/或接觸活化路徑的活化，皮下及/或黏膜下水腫（腫脹）反復發作或症狀，特別是皮膚、胃腸道及呼吸道的。嚴重腫脹的反復發作會影響手臂、腿、臉部、腸道及呼吸道，若它們阻塞呼吸則會令人疼痛、容面受損且有時甚至危及生命。若不加以治療，該病況有25%的死亡率。

第I型HAE及第II型HAE係因缺乏功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)所引起。第I型HAE的特徵是C1EI的表现水準低。第II型HAE的特徵是非功能性 C1EI的表现水準正常或升高。第III型HAE的特徵是功能性C1EI水準正常但在其他基因中有突變，諸如因子XII。

如本文所用之「C1酯酶抑制劑(C1EI)缺乏」或「功能性C1EI的缺乏」係指因功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)蛋白的缺乏所引起的遺傳病症。這包括第I型及第II型HAE。因為功能性C1EI的水準不足，補體及/或接觸活化路徑不受抑制的活化會造成高分子量的激肽原被激肽釋放素酶不受調控地裂解，導致過量的游離緩激肽（其為一種有效的血管活性肽，可增加微血管通透性及水腫）生成。

如本文所用之「對HAE治療有效」或「HAE療法」係指患有HAE之個體之任何治療性干預，其改善HAE症狀或降低急性HAE發作的頻率、持續時間或嚴重性，或降低需要用來治療急性HAE發作之按需治療量（例如，人類C1EI蛋白、激肽釋放素酶抑制劑、緩激肽拮抗劑等），或降低施予用來治療急性HAE發作之按需治療的頻率。如本文所用之「HAE基因療法」係指患有HAE之個體之任何治療性介入，其涉及藉由將表現功能性C1EI蛋白的一或多個核酸分子遞送至個體之細胞中而替代或恢復或增加C1EI活性。在某些實施例中，HAE基因療法係指涉及表現人類C1EI之包含有載體構築體之腺相關病毒(AAV)顆粒之基因療法。

如本文所用之「治療(treat/treatment)」係指治療性治療，其係指出於減少或消除彼等病徵及症狀之目的，向展現出病理(即HAE)病徵及症狀之個體所施予的治療。該等病徵或症狀可為生物化學、細胞、組織學、功能、主觀或客觀的。「治療(treat/treatment)」或「治療有效的」係指降低或改善與C1EI缺乏或HAE相關聯之疾病(或其相關症狀)的進展、嚴重程度及/或持續時間，例如，皮下水腫及/或黏膜下水腫的頻率或嚴重性，或不正常升高的緩激肽水準。治療可在水腫之前或之後出現。在治療讓血液中功能性C1EI恢復正常水準（例如，約16 mg/dL (約1 IU/ml)至約32 mg/dL），或正常C1EI水準恢復到約40%或更高期望能改善HAE症狀時，症狀會減輕。參見(例如) Zuraw等人, Allergy 2015; 70: 1319–1328，其表明有正常C1EI水準約40%時可看到具有臨床意義的效果。治療較佳地為穩定的治療，其將功能性C1EI恢復到臨床顯著時間長度內的治療有效水準。

如本文所用之「改善」係指減少疾病之症狀之嚴重程度、進展或持續時間之作用。

如本文所用之「穩定治療(stably treating/stable treatment)」係指使用向個體投與之治療性載體構築體、AAV顆粒或細胞，其中該個體穩定地表現由該載體構築體、AAV顆粒或細胞表現之治療蛋白。穩定表現之治療蛋白意謂蛋白質在臨床上顯著的時間長度內表現。如本文所用之「臨床上顯著的時間長度」意謂以治療有效程度表現的時間長度，其對個體之生活品質具有重大影響。在某些實施例中，無需靜脈內或皮下投與替代療法展示對生活品質的重大影響。在某些實施例中，臨床上顯著的時間長度為表現至少六個月、至少八個月、至少一年、至少兩年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年、至少十年或個體一生。較佳地，治療有效表現持續至少一年。

如本文所用，術語「有效量」係指足以實現有益或所需生物及/或臨床結果的量。

如本文所用，「個體」係指為治療、觀測或實驗之目標之動物。「動物」包括冷血及溫血脊椎動物及無脊椎動物，諸如魚、甲殼類動物、爬行動物及尤其哺乳動物。如本文所用之術語「禽類」包括(但不限於)雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞及雉雞。如本文所用，「哺乳動物」係指屬於哺乳綱之個體，且包括(但不限於)人類、家養動物及農耕動物、動物園動物、競技用動物及寵物動物。哺乳動物之非限制性實例包括小鼠；大鼠；兔；天竺鼠；狗；貓；綿羊；山羊；奶牛；馬；靈長類動物，諸如猴、黑猩猩及猿及尤其人類。在一些實施例中，哺乳動物為人類。然而，在一些實施例中，哺乳動物不是人類。

一般而言，「醫藥學上可接受之載劑」為對細胞非毒性或非過度有害的載劑。例示性的醫藥學上可接受之載劑包括無菌、無熱原質水及無菌、無熱原質磷酸鹽緩衝鹽水。醫藥學上可接受之載劑包括生理學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。

在另一實施例中，提供產生包含本文所提供之AAV載體構築體中之任一者之重組型腺相關病毒(AAV)顆粒之方法。該方法包含以下步驟：培養已經本文所提供之AAV載體構築體中之任一者（與各種AAV cap及rep基因相關）轉染之細胞且自經轉染細胞的上清液中回收重組型治療性AAV顆粒。

適用於本文所提供之重組型AAV產生之細胞為易患桿狀病毒感染之任何細胞類型，包括諸如High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38之昆蟲細胞。在另一實施例中，可使用諸如HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5之哺乳動物細胞。

在另一實施例中，本文提供有效量之載體核酸、載體構築體或AAV顆粒之用以製備用於治療患有HAE或C1EI缺乏之個體的藥劑的用途。在一實施例中，該患有HAE之個體為人類。在一實施例中，該藥劑係以靜脈(IV)給藥。在另一實施例中，投與該藥劑會導致該個體的血流中有C1EI蛋白表現，其足以增加該個體血液中之功能性C1EI蛋白水準，以改善HAE症狀。在某些實施例中，該藥劑也用於與防治性及/或治療性皮質類固醇共同投與，以預防及/或治療任何與投與AAV-C1EI病毒相關的肝毒性。該防治性或治療性皮質類固醇治療可包含每天至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60毫克或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，該防治性或治療性皮質類固醇可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更久之連續時段投與。

在另一實施例中，本文提供之HAE療法視情況進一步包括投與（例如，同時投與）其他用以治療HAE的治療劑，例如，達那唑(danazol)、司坦唑醇(stanozolol)、氧雄龍(oxandrolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、替勃龍(tibolone)、羥甲烯龍(oxymetholone)。在一實施例中，本文提供之HAE療法包含輔助性投與以下一或多者：用於急性HAE發作之C1EI蛋白、視情況存在之重組型或血漿衍生型、激肽釋放素酶抑制劑、緩激肽拮抗劑。載體構築體及 AAV 載體

本發明之重組載體構築體本身可用作基因療法，或可用以藉由本文所述方法產生rAAV顆粒，包含向適宜宿主細胞提供該重組載體構築體以及Rep及Cap基因。本文所述之載體構築體包含編碼功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)之核酸序列。該重組載體構築體可包含編碼可操作地連接至異源表現控制元件（例如，啟動子及/或增強子；視情況存在之內含子；視情況存在之聚腺苷酸(polyA)信號）之功能性人類C1EI的核酸。該異源表現控制元件可為(例如)本文所述之異源肝特異性轉錄調節區。

當用以產生rAAV顆粒時，該重組載體構築體可包含(a)以下一或二者：(i) AAV 5'反向末端重複序列(ITR)及(ii) AAV3’ ITR；(b)異源肝特異性轉錄調節區；以及(c)編碼功能性人類C1EI之核酸，視情況其中AAV ITR為AAV2 ITR。較佳地，編碼功能性C1EI之核酸可操作地連接至肝特異性表現控制元件。載體構築體可包括額外的表現控制元件，例如：啟動子及/或增強子；內含子；視情況存在之來自相同基因的外顯子作為內含子；及聚腺苷酸(polyA)信號。這類元件係進一步描述於本文中。較佳地，rAAV顆粒亦包含具有肝趨性之AAV衣殼，視情況為AAV5型衣殼。

在一或多個實施例中，該功能性C1EI包含與SEQ ID NO: 2（人類C1EI，或“hC1EI”）之胺基酸23-500至少90%、95%或98%一致之胺基酸序列。在例示實施例中，該編碼功能性C1EI之核酸序列為野生型SERPIN G1序列，其中SEQ ID NO: 1為一實例，或為密碼子最佳化的，或為變異體。

在一或多個實施例中，該編碼C1EI之核酸序列係可操作地連接至一或多個異源表現控制元件。較佳地，該表現控制元件為肝特異性表現控制元件。肝特異性控制元件之實例包括(但不限於)小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子(mTTR)、內源性人類因子VIII啟動子(F8)、人類脂蛋白元E肝控制區及其活性片段、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)及其活性片段、人類α-1-微球蛋白啟動子及其片段、人類凝血酶原啟動子及其活性片段、人類白蛋白最小啟動子及小鼠白蛋白啟動子。亦涵蓋來源於肝特異性轉錄因子結合位點之增強子，諸如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6及Enh1。

在一些實施例中，載體構築體中包含編碼可操作地連接至異源肝特異性轉錄調節區之功能性C1EI的核酸序列。該載體構築體可包含其他調節元件。在一些實施例中，於本文所述之載體構築體中，該表現控制元件包括以下一或多者：啟動子及/或增強子；視情況存在之內含子；及聚腺苷酸(polyA)信號。

該肝特異性轉錄調節區可包含一或多個肝特異性表現控制元件。在一或多個實施例中，該肝特異性轉錄調節區為包含有人類α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子、肝控制區(HCR)增強子、及/或脂蛋白元E (ApoE)增強子之合成啟動子序列。

在一些實施例中，載體構築體包含以下至少一或二者：AAV之5'反向末端重複序列(ITR)及3' AAV ITR、啟動子、編碼功能性C1EI之核酸、及視情況存在之轉錄後調節元件，其中啟動子、編碼C1EI之核酸及轉錄後調節元件係位於5' AAV ITR之下游及3' AAV ITR之上游。例如，出於治療目的，該載體構築體可用於在個體中產生高水準的C1EI。

在某些實施例中，重組型AAV載體構築體包含核酸，其包含(a) AAV2 5'反向末端重複序列(ITR) （其可能或可能不如本技術領域已知般修飾），(b)肝特異性轉錄調節區，(c)功能性C1EI蛋白編碼區，(d)視情況存在之一或多個內含子，(e)聚腺苷酸化序列，及(f) AAV2 3' ITR（其可能或可能不如本技術領域已知般修飾）。

在一些實施例中，肝特異性轉錄調節區包含縮短之ApoE增強子序列(SEQ ID NO: 16)或與該序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列；186個鹼基之人類α抗胰蛋白酶(hAAT)近端啟動子，包括42個鹼基之5'非轉譯區(UTR) (SEQ ID NO: 15)或與其至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列；選自由以下組成之群的一或多個增強子：(i) 34個鹼基之人類ApoE/HCR增強子(SEQ ID NO: 4)或與其至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列，(ii) 32個鹼基之人類AAT啟動子遠端X區或與其至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列，及(iii) 80個額外鹼基之人類AAT近端啟動子之遠端元件或與其至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列；及編碼人類C1EI之核酸。在另一實施例中，肝特異性轉錄調節區包含α-微球蛋白增強子序列(SEQ ID NO: 17)或與其至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列，以及186個鹼基之人類α抗胰蛋白酶(AAT)近端啟動子(SEQ ID NO: 15)或與其至少80%、85%、90%、95%或98%一致之核苷酸序列。

本文所提供之其他實施例係針對編碼功能性C1EI多肽之載體構築體，其中該等構築體在一或多個不同方向上包含一或多個上述構築體之個別元件及其組合。本文所提供之另一實施例係針對呈相反方向之上述構築體。在另一實施例中，提供包含有本文所述之載體構築體之重組型AAV顆粒以及其用於治療個體之HAE或C1EI缺乏之用途。在一實施例中，該個體為青少年個體。

呈單股形式之本文所提供之AAV載體構築體之長度小於約7.0 kb、或長度小於6.5 kb、或長度小於6.4 kb、或長度小於6.3 kb、或長度小於6.2 kb、或長度小於6.0 kb、或長度小於5.8 kb、或長度小於5.6 kb、或長度小於5.5 kb、或長度小於5.4 kb、或長度小於5.3 kb、或長度小於5.2 kb、或長度小於5.0 kb、或長度小於4.8 kb、或長度小於4.6 kb、或長度小於4.5 kb、或長度小於4.4 kb、或長度小於4.3 kb、或長度小於4.2 kb、或長度小於4.1 kb、或長度小於4.0 kb、或長度小於3.9 kb、或長度小於3.8 kb、或長度小於3.7 kb、或長度小於3.6 kb、或長度小於3.5 kb、或長度小於3.4 kb、或長度小於3.3 kb、或長度小於3.2 kb、或長度小於3.1 kb、或長度小於3.0 kb。呈單股形式之本文所提供之AAV載體構築體之長度在約5.0 kb至約6.5 kb範圍內、或長度在約4.8 kb至約5.2 kb範圍內、或長度為4.8 kb至5.3 kb、或長度在約4.9 kb至約5.5 kb範圍內、或長度為約4.8 kb至約6.0 kb、或長度為約5.0 kb至6.2 kb、或長度為約5.1 kb至約6.3 kb、或長度為約5.2 kb至約6.4 kb、或長度為約5.5 kb至約6.5 kb、或長度在約4.0 kb至約5.0 kb範圍內、或長度在約3.8 kb至約4.8 kb範圍內、或長度為3.6 kb至4.6 kb、或長度在約3.4 kb至約4.4 kb範圍內、或長度在約3.2 kb至約4.2 kb範圍內、或長度在約3.0 kb至4.0 kb範圍內、或長度在約3.5 kb至約4.0 kb範圍內、或長度在約3.0 kb至約3.5 kb範圍內。本文提供之本文所提供之AAV載體構築體之長度亦可在2.7 kb至約3.3 kb範圍內、或長度在約3.7kb至約4.1 kb、或長度在約2.7 kb至約4 kb、或長度在約2.7 kb至約4.1 kb，例如SEQ ID NO: 57 (HAE23)及58 (HAE24)。於本發明之該等載體構築體中，大小範圍較小的載體構築體提供較高的表现水準。

在由過大的重組型載體構築體產生AAV載體時，該等AAV載體可能缺少一部份的重組型載體構築體5'或3’端。因為AAV為單股DNA病毒，且封裝有義鏈或反義鏈之一，在過大AAV載體中之有義鏈缺少5' AAV ITR且可能缺少部分的目標蛋白編碼基因的5'端，而在過大AAV載體中之反義鏈缺少3' ITR且可能缺少部分的目標蛋白編碼基因的3'端。功能性轉殖基因係在過大AAV載體感染的細胞中藉由在目標細胞內黏合有義鏈及反義鏈的截短基因組而產生。因此，在某些實施例中，本發明之rAAV顆粒可包含重組型載體構築體，其包含至少一ITR，及編碼功能性C1EI之核苷酸序列的實質部分，所述功能性C1EI諸如為具有SEQ ID NO: 10-13、59或60之大於該核苷酸序列長度50%、60%、70%、80%或90%之任一片段。例如，該重組型載體構築體可包含至少一ITR，一肝特異性轉錄調節區、及編碼功能性C1EI之核苷酸序列的實質部分。本發明之rAAV顆粒亦可包含SEQ NO: 8、9、20-36、57及58中之任一者之實質部分，例如具有SEQ NO: 8、9、20-36、57及58中之任一者中所提出的核肝酸序列長度之大於50%、60%、70%、80%或90%且包含該肝特異性轉錄調節區的片段。

可使用此項技術中眾所周知的的任何適宜基因工程化技術來完成載體構築體的生成，該等技術包括(但不限於)限制性核酸內切酶消化、接合、轉型、質體純化及DNA定序之標準技術，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))中所述。

載體構築體可合併來自任何已知生物體之基因組的序列。序列可以其天然形式併入或可以任何方式修飾以獲得所要需活性。例如，序列可包含插入、刪除或取代。

當出現在已被編碼並表現rep及cap基因產物之聚核苷酸轉染之宿主細胞中，AAV載體構築體可被複製及封裝到感染性AAV顆粒（較佳地為複製缺陷型AAV顆粒）內。

本文所述載體構築體或AAV顆粒亦可在具有與人類HAE相關聯的特徵（包括血漿C1EI水準下降）之缺乏C1EI的小鼠模型中產生有益效果。從表現型上來看，這些小鼠的皮膚及內部器官的血管通透性增加。轉錄調節元件或區 啟動子或增強子

各種啟動子可與包含有本文所揭露之載體構築體中之所關注蛋白質(人類C1EI)之編碼區的核酸可操作地連接。在一些實施例中，啟動子可驅使所關注蛋白質在經來源於病毒載體之病毒感染之細胞（諸如靶細胞）中表現。啟動子可為天然存在的或非天然存在的。在一些實施例中，啟動子為合成啟動子。在一實施例中，合成啟動子包含自然界中不存在且經設計以調節可操作地連接之基因之活性的序列。在另一實施例中，合成啟動子包含天然啟動子之片段以形成自然界中不存在的DNA序列之新區段。合成啟動子通常包含調節元件、啟動子、增強子、內含子、剪接供體及受體，其經設計以產生增強之組織特異性表現。啟動子之實例包括(但不限於)病毒啟動子、植物啟動子及哺乳動物啟動子。在另一實施例中，啟動子為肝特異性啟動子。肝特異性啟動子之具體實例包括LP1、HLP、HCR-hAAT、ApoE-hAAT、LSP、TBG及TTR。這些啟動子在以下參考文獻有更詳細地描述：LP1 (具有人類AAT啟動子(255 bp)之人類ApoE HCR核心序列(192 bp))：Nathwani A.等人，Blood. 2006 April 1; 107(7): 2653-2661；雜交肝特異性啟動子(HLP)（具有經修飾的人類α-1-抗胰蛋白酶(αAT)啟動子(217 bp)之人類脂蛋白元E (ApoE)肝控制區(HCR)片段(34 bp)）：McIntosh J.等人，Blood. 2013 Apr 25; 121(17): 3335–3344；HCR-hAAT（ApoE-HCR (319 bp)，具有ApoE增強子(1-4x154 bp)及人類AAT啟動子(408 bp)且包括內含子(1.4 kbp)及3’UTR (1.7 kbp)）：Miao CH等人，Mol Ther. 2000;1: 522-532；ApoE-hAAT：Okuyama T等人，Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996)；LSP: Wang L等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 March 30; 96(7): 3906-3910，甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子：Yan等人, Gene 506:289-294 (2012)；及甲狀腺素轉運蛋白(TTR)啟動子：Costa等人, Mol. Cell. Biol. 8:81-90 (1988)。

例如，De Simone等人(EMBO Journal 第6卷第9冊第2759-2766頁, 1987)描述了許多衍生自人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子的啟動子。例如，其定出人類AAT啟動子從-1200至+44內之肝特異性活性所需之順式及反式作用元件的特徵。於HLP中之人類AAT啟動子係由遠端的X元件(32 bp)及近端的A與B元件(185 bp)所組成。Frain等人(MOL CELL BIO, Mar. 1990, 第10卷, 第3冊, 第991-999頁)描述了許多衍生自人類白蛋白啟動子的啟動子。例如，其定出人類白蛋白啟動子從-1022至-1內之啟動子及增強子元件的特徵。

Dang等人(J BIOL CHEM, 第270冊, 第38卷, 9月22日發行, 第22577–22585頁, 1995)描述了人類脂蛋白元E基因(774 bp)的肝控制區(HCR)。Shachter等人(J. Lipid Res. 1993. 第34冊:第1699-1707頁)定出了ApoE HCR (154 bp)中的肝特異性增強子的特性。這些HCR片段可與其他轉錄調節元件（諸如人類AAT啟動子或其片段）結合在一起。Chow等人(J Biol Chem. 1991年10月5日; 266(28):18927-33)定出了人類凝血酶原增強子從-940至-860 (80 bp)的特性。Rouet等人(第267卷, 第29冊, 10月15日發行, 第20765-20773頁, 1992; Nucleic Acids Res. 1995年2月11日; 23(3): 395–404; 及Biochemical Journal, 9月15日, 1998, 334 (3) 577-584)定出了人類α-1-微球蛋白/雙庫寧(bikunin)增強子序列的特性。美國專利第7,323,324號亦描述了人類AAT啟動子、人類α-1-微球蛋白/雙庫寧增強子、人類白蛋白啟動子及人類凝血酶原增強子。

在一些實施例中，啟動子包含人類α1抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子複合體。在一些實施例中，啟動子包含hAAT啟動子之至少一部分。hAAT啟動子之部分可包含與SEQ ID NO: 3具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核酸序列。

在一些實施例中，啟動子包含肝特異性增強子。在一些實施例中，啟動子包含肝特異性脂蛋白元E (ApoE)/肝控制區(HCR)增強子。在一些實施例中，啟動子包含ApoE/HCR增強子之至少一部分。例如，ApoE/HCR增強子可包含與SEQ ID NO: 4具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核酸序列。

在一些實施例中，啟動子為包含有hAAT啟動子之至少一部分、ApoE/HCR增強子之至少一部分之合成啟動子。在一些實施例中，啟動子可包括與SEQ ID NO: 5具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核酸序列。

在一些實施例中，啟動子包含上述經鑑別之增強子中之一或多者之多個複本。在一些實施例中，啟動子構築體在一或多個不同定向上係包含一或多個上文所述之個別增強子元件及其組合。

在一些實施例中，啟動子係與編碼一或多種所關注蛋白質之聚核苷酸可操作地連接。在一些實施例中，啟動子係與編碼C1EI蛋白之聚核苷酸可操作地連接。

啟動子之尺寸可變化。由於AAV之有限封裝能力，較佳使用尺寸小但同時允許在宿主細胞中產生高水準之所關注蛋白質的啟動子。例如，在一些實施例中，啟動子為至多約1.5 kb、至多約1.4 kb、至多約1.35 kb、至多約1.3 kb、至多約1.25 kb、至多約1.2 kb、至多約1.15 kb、至多約1.1 kb、至多約1.05 kb、至多約1 kb、至多約800個鹼基對、至多約600個鹼基對、至多約400個鹼基對、至多約200個鹼基對或至多約100個鹼基對。其他調節元件

各種額外調節元件可用於載體構築體中，例如進一步增加所關注蛋白質在宿主細胞、聚腺苷酸化信號、核糖體結合序列及/或共同剪接受體或剪接供體位點中之表现水準的強化子。在一些實施例中，調節元件可有助於將重組型DNA分子維持在宿主細胞之染色體外及/或改進載體效能（例如，骨架/基質附接區(S/MAR)）。這類調節元件在此項技術中是眾所周知的。

本文所揭示之載體構築體可包括調節元件，諸如轉錄起始區及/或轉錄終止區。轉錄終止區之實例包括(但不限於)聚腺苷酸化信號序列。聚腺苷酸化信號序列之實例包括(但不限於)人類生長激素(hGH) poly(A),、牛生長激素(bGH) poly(A)、SV40後poly(A)、兔β-球蛋白(rBG) poly(A)、胸苷激酶(TK) poly(A)序列及其任何變異體。在一些實施例中，轉錄終止區位於轉錄後調節元件之下游。在一些實施例中，轉錄終止區為聚腺苷酸化信號序列。在一些實施例中，轉錄終止區為hGH poly(A)序列(SEQ ID NO:7)。

在一些實施例中，載體構築體可包括額外的轉錄及轉譯起始序列，及/或額外的轉錄及轉譯終止子，其為此項技術中已知的。所關注蛋白質及編碼該所關注蛋白質之核酸

如本文所用，「所關注蛋白質」為任何功能性C1EI蛋白，包括其天然存在的及非天然存在的變異體。在一些實施例中，可將編碼一或多種所關注之C1EI蛋白的聚核苷酸插入本文所揭示之病毒載體中，其中該聚核苷酸係與啟動子可操作地連接。在一些情況下，啟動子可驅使所關注蛋白質在宿主細胞(例如，人類肝細胞)中表現。

在一第一態樣中，本發明提供包含有編碼功能性野生型C1EI蛋白(例如，SEQ ID NO:2)之核苷酸序列。該核苷酸序列可與SEQ ID NO: 1之野生型核苷酸序列同源。

如本文所述，編碼C1EI蛋白之核苷酸序列可經修飾以改進蛋白質之表現效率。可用於改進本文中之基因之轉錄及/或轉譯的方法不受特別限制。例如，核苷酸序列可經修飾以更好地反映宿主密碼子使用以在宿主(例如，哺乳動物)中增加基因表現(例如，蛋白質產生)。作為修飾之另一非限制性實例，所關注蛋白質之核苷酸序列中之剪接供體及/或剪接受體中之一或多者係經修飾以降低外來剪接之可能性。作為修飾之另一非限制性實例，可將一或多個內含子插入所關注蛋白質之核苷酸序列內或鄰近處以最佳化AAV載體封裝並增強表現。

核酸分子係編碼與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少90%一致之功能性C1EI蛋白，且較佳地至少與野生型胺基酸序列至少95%或98%一致。若核酸編碼包含有針對野生型胺基酸中之任一者具有變化之序列的蛋白質，則該蛋白質仍應為功能蛋白。熟習此項技術者應瞭解，在不會對蛋白質的功能產生不利影響之情況下，可對該蛋白質之一些胺基酸做輕微變化。

在某些實施例中，核酸分子具有與SEQ ID NO: 1或10-12，或與SEQ ID NO: 1或10-12之至少100、200、300、400或500個連續核苷酸，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%的同源性或至少98%的同源性。在一實施例中，核酸分子編碼功能性C1EI蛋白，換言之，其編碼在表現時具有野生型C1EI之功能的C1EI。在某些實施例中，核酸分子在適宜系統（例如，宿主細胞）中表現時，以相對較高的水準產生功能性C1EI蛋白。由於所產生之C1EI具功能性，其將具有與野生型C1EI之至少一部分相同之構形。在某些實施例中，如本文所述之所產生之功能性C1EI蛋白係有效治療罹患C1EI缺乏及/或HAE之個體。

在另一實施例中，與編碼對應非密碼子最佳化序列之天然存在的核苷酸序列相比，編碼功能性C1EI之核苷酸序列係具有對於人類細胞而言改良的密碼子使用偏好。編碼功能性C1EI之核苷酸序列對於人類細胞之密碼子使用的適應性可以密碼子適應指數(CAI)表示。密碼子適應指數在本文中的定義為基因之密碼子使用相對適應性朝向高度表現之人類基因之密碼子使用的量測值。各密碼子之相對適應性為各密碼子之使用與相同胺基酸之最富足的密碼子之使用的比率。CAI的定義為此等相對適應性值之幾何平均值。已排除非同義密碼子及終止密碼子（視基因密碼而定）。CAI值在0至1範圍內，其中較高值表明較高比例之最富足的密碼子（參見Sharp及Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295；亦參見：Kim等人, Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede等人, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635）。在某些實施例中，編碼所關注蛋白質之核酸分子的CAI為至少0.75、0.80、0.85、0.90、0.95或0.99。

SEQ ID NO: 10-12之核苷酸序列為基於野生型人類C1EI核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)之序列的密碼子最佳化人類C1EI核酸序列。

可(例如)使用DNA2.0密碼子最佳化演算法執行密碼子最佳化，參見Villalobos等人, “Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments,” BMC Bioinformatics, 第7卷, 第285號文章(2006)或Operon/Eurofins Genomics密碼子最佳化軟體。

例如，核苷酸序列可經修飾以更好地反映宿主密碼子使用以提高宿主(例如，哺乳動物)中之基因表現(例如，蛋白質產生)。另一個修飾的非限制性實例為，所關注蛋白質之核苷酸序列中之剪接供體及/或剪接受體中之一或多者係經修飾以降低外來剪接之可能性。另一個修飾的非限制性實例為，可將一或多個內含子插入所關注蛋白質之核苷酸序列內或鄰近處以最佳化AAV載體封裝且增強表現。

在另一實施例中，與編碼對應非密碼子最佳化序列之天然存在的核苷酸序列相比，編碼所關注蛋白質之核苷酸序列係具有對於人類細胞而言改良的密碼子使用偏好。編碼所關注蛋白質之核苷酸序列對於人類細胞之密碼子使用的適應性可以密碼子適應指數(CAI)表示。密碼子適應指數在本文中的定義為基因之密碼子使用相對適應性朝向高度表現之人類基因之密碼子使用的量測值。各密碼子之相對適應性為各密碼子之使用與相同胺基酸之最富足的密碼子之使用的比率。CAI的定義為此等相對適應性值之幾何平均值。已排除非同義密碼子及終止密碼子（視基因密碼而定）。CAI值在0至1範圍內，其中較高值表明較高比例之最富足的密碼子（參見Sharp及Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295；亦參見：Kim等人, Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede等人, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635）。在某些實施例中，編碼所關注蛋白質之核酸分子的CAI為至少0.75、0.80、0.85、0.90、0.95或0.99。

這可以與手動降低CpG二核苷酸含量並在有義及反義方向上移除任何額外的ORF一起完成。已顯示CpG二核苷酸含量可活化樹突細胞中的TLR9，導致潛在的免疫活化及CTL反應。我們在AAV-載體基因組中的產品為ssDNA，因而降低了CpG含量，且這可降低肝臟發炎及ALT。

一般而言，密碼子最佳化不改變各密碼子編碼之胺基酸。其僅僅改變核苷酸序列，以使得其與非密碼子最佳化序列相比下更可能以相對高的程度表現。此意謂本文所提供之核酸之核苷酸序列及(例如) SEQ ID NO: 1或10-12可不同，但當其經轉譯時所產生之蛋白質之胺基酸序列相同。

在一些實施例中，密碼子最佳化的hC1EI核酸分子之CpG二核苷酸含量低於25、低於20、低於15或低於10。在另一實施例中，密碼子最佳化的hC1EI核酸分子之GC含量低於65%、低於60%或低於58%。

產生本文所提供之核酸分子將完全在熟習此項技術者的能力範圍之內。此可(例如)使用化學合成一給定序列來完成。此外，對於熟習此項技術者而言，適合用於判定本文所述之核酸是否表現功能性蛋白的方法將為顯而易知的。例如，一種適合的活體外方法係涉及將核酸插入載體（諸如AAV載體）中，用載體轉導宿主細胞（諸如293T或HeLa細胞），且測定C1EI活性。替代性地，一種適合的活體內方法係涉及將含有核酸之載體轉導至HAE小鼠中且測定小鼠之血漿中之功能性C1EI。適合的方法係更詳細地描述於下文中。

在一些實施例中，載體包含一或多個內含子。該等內含子可促進哺乳動物宿主細胞中之RNA轉錄物的處理過程，增加所關注蛋白質之表現及/或使載體封裝至AAV顆粒中最佳化。這類內含子的非限制性實例為血球蛋白(β-球蛋白)內含子、hAAT內含子及/或A1AT內含子。在一些實施例中，內含子為合成內含子。例如，該合成內含子可包括與SEQ ID NO: 6具有至少約80%、85%、90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核苷酸序列。載體中之內含子的位置及尺寸可不同。在一些實施例中，內含子係位於啟動子與編碼所關注蛋白質的序列之間。在一些實施例中，內含子係位於編碼所關注蛋白質的序列下游。在一些實施例中，內含子位於啟動子內。在一些實施例中，內含子包括增強子元件。在一些實施例中，內含子位於編碼所關注蛋白質之序列內，較佳地位於編碼所關注蛋白質之序列的外顯子之間。在一些實施例中，內含子可包含編碼所關注蛋白質之序列內之天然存在之內含子的全部或一部分。在一些實施例中，內含子為C1EI內含子，例如第二C1EI內含子。在一些實施例中，內含子序列為是複合hAAT/血紅蛋白內含子。在一些實施例中，內含子亦增強編碼C1EI之核酸的表現。

在一些實施例中，載體構築體可進一步包含外顯子序列或其片段，且較佳地鄰近內含子序列，例如hAAT內含子鄰近hAAT外顯子(SEQ ID NO: 72)或其片段且/或血球蛋白內含子(SEQ ID NO: 70)鄰近血球蛋白外顯子(SEQ ID NO: 71)。

在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 61至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約100至約300個核苷酸，或長度約150至約250個核苷酸。在例示實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 61至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且長度約50-300個核苷酸、約100-250個核苷酸、約100-225個核苷酸、約100-200個核苷酸、約150-225個核苷酸、約150-200個核苷酸、約175-300個核苷酸、約175-250個核苷酸、或約150-250個核苷酸。

在一些實施例中，內含子包含SEQ ID NO: 67或其片段。在一或多個實施例中，該內含子包含與SEQ ID NO: 64至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約300至約600個核苷酸，或長度約400至約500個核苷酸。在例示實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 64或其片段，且長度約100-900個核苷酸、約200-800個核苷酸、約200-700個核苷酸、約200-600個核苷酸、約200-500個核苷酸、約300-700個核苷酸、約300-600個核苷酸、約300-500個核苷酸、約400-700個核苷酸、約400-600個核苷酸、或約400-500個核苷酸。

在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 62至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約200至約500個核苷酸，或長度約300至約400個核苷酸。

在一或多個實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 63至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約200至約500個核苷酸，或長度約300至約400個核苷酸。

在一或多個實施例中，該內含子包含與SEQ ID NO: 65至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約600至約1000個核苷酸，或長度約800至約900個核苷酸。

在一或多個實施例中，該內含子包含與SEQ ID NO: 66至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約1000至約2000個核苷酸，或長度約1300至約1500個核苷酸。

在一或多個實施例中，該內含子包含與SEQ ID NO: 67至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約1500至約2000個核苷酸，或長度約1800至約1900個核苷酸。

在一或多個實施例中，該內含子包含與SEQ ID NO: 68至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約50至約150個核苷酸。

在一或多個實施例中，該內含子包含與SEQ ID NO: 69至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列，且該內含子長度可為約50至約125個核苷酸。

在一些實施例中，載體構築體可進一步包含外顯子序列或其片段；較佳地鄰近內含子序列。在一例示實施例中，載體構築體包含鄰近外顯子之hAAT內含子，該外顯子包含與SEQ ID NO: 72至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列。在另外的例示實施例中，載體構築體包含鄰近外顯子序列之血球蛋白內含子，該外顯子序列包含與SEQ ID NO: 70至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列。在例示實施例中，載體包含以下二者：(a)鄰近外顯子之hAAT內含子，該外顯子包含與SEQ ID NO: 72至少80%或85%或90%或95%一致之核苷酸序列；及(b)鄰近外顯子序列之血球蛋白內含子，該外顯子序列包含與SEQ ID NO: 70至少80%或85%或90%一致之核苷酸序列。在一例示實施例中，載體構築體包含hAAT內含子及鄰近血球蛋白外顯子序列之血球蛋白內含子，該血球蛋白外顯子序列包含與SEQ ID NO: 71至少80%或85%或90%一致之核苷酸序列。

與在不存在內含子元件之情況下的表現相比較，包括內含子元件可增強表現（參見(例如) Kurachi等人, 1995, J Biol Chem. 1995年3月10日；270(10):5276-81）。AAV載體通常接受具有經定義大小範圍（大致上為約4 kb至約5.2 kb，或略多）之DNA的插入。然而，封裝及較小載體基因組封裝的最小大小沒有非常有效。內含子及內含子片段滿足此要求且同時亦增強表現。因此，本發明並不限於在AAV載體中包括C1EI內含子序列，且包括其他內含子或其他DNA序列代替C1EI內含子之部分。另外，可使用核酸之其他5'及3'非轉譯區代替那些針對人類C1EI所述及者。

包括修飾之形式之聚核苷酸及多肽可使用各種標準選殖、重組型DNA技術，經由熟習此項技術者已知的細胞表現或活體外轉譯及化學合成技術（Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第2版）製得。基因遞送之方法

亦提供使用本文所述之載體構築體或AAV顆粒遞送編碼所關注蛋白質之基因。在一實施例中，基因遞送載體可為病毒基因遞送載體（諸如病毒顆粒），或非病毒基因遞送載體（諸如載體構築體或編碼所關注蛋白質之核酸）。病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、疱疹病毒載體。其較佳為重組型腺相關病毒(rAAV)載體。替代性地，可使用非病毒系統，包括使用藉由各種轉染方法（諸如脂質或電穿孔）引入細胞中之裸DNA（具有或沒有染色質附接區）或經結合的DNA。

本文所述之病毒載體構築體之非限制性實例係以SEQ ID NO: 9提供，且包含ApoE/HCR-hAAT啟動子、hAAT/血紅蛋白內含子(hhI)、人類C1EI之野生型編碼序列、及人類生長激素(hGH) poly(A)序列(“HAE15”或“ApoE/HCR-hAAT.hhI.SERPIN G1.hGH”)。本文所述之病毒載體構築體之其他非限制性實例係以SEQ ID NO: 20-36、57及58中之任一者提供。另一包含有衍生自雞β-actin (CBA)啟動子序列之啟動子、人類C1EI野生型編碼序列、及牛生長激素(bGH) poly(A)序列的載體構築體係提出於SEQ ID NO: 8中(“CBA-HAE”或“CBA.SERPIN G1.bGH”)。

在一些實施例中，載體構築體或AAV載體基因組包含與SEQ ID NO: 9具有至少約80%、85%、90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，載體構築體或AAV載體基因組包含與SEQ ID NO: 20-36中之任一者具有至少約80%、85%、90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，載體構築體或AAV載體基因組包含與SEQ ID NO: 57具有至少約80%、85%、90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，載體構築體或AAV載體基因組包含與SEQ ID NO: 58具有至少約80%、85%、90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多的序列一致性之核苷酸序列。

本發明可用於獸醫學及醫學應用兩者。適用於如本文中所述之基因遞送方法之個體包括禽類及哺乳動物，其中哺乳動物較佳且人類為最佳。人類個體包括新生兒、嬰兒、青少年及成年人。非病毒基因遞送

非病毒基因遞送可使用裸DNA進行，其為非病毒轉染的最簡單方法。例如，可能使用裸質體DNA投與本文所提供之載體構築體。替代性地，可使用諸如電穿孔、聲波穿孔或使用「基因槍」之方法，所述基因槍係使用例如高壓氣體或反向0.22口徑的槍將經塗佈DNA之金顆粒射入細胞內(Helios® Gene Gun System (BIO-RAD))。

為改進載體構築體至細胞中之遞送，可能有必要保護核酸免受損壞且可促進其進入細胞中。為此目的，可使用在轉染過程期間具有保護核酸免受到非所需降解之能力的脂複合體及聚合複合體。

載體構築體可以用諸如微胞或脂質體之組織化結構中之脂質塗佈。在組織化結構與DNA複合時其係稱為脂複合體。陰離子及中性脂質可用於構建合成載體之脂複合體。在一實施例中，陽離子脂質由於其正電荷而可用於聚集帶負電的DNA分子，以使得有助於將DNA囊封至脂質體中。若可能有必要將輔助脂質（通常為電中性脂質，諸如DOPE）添加至陽離子脂質中以形成脂複合體(Dabkowska等人,J R Soc Interface . 2012年3月7日；9(68): 548–561)。

在某些實施例中，稱為聚合複合體的聚合物與DNA之複合體可用於遞送載體構築體。大多數聚合複合體係由陽離子聚合物組成，且其產生係由離子相互作用所調控。聚合複合體通常無法將其DNA負荷釋放至細胞質中。因此，可能需要與諸如失活腺病毒之胞內體裂解劑（以藉由聚合複合體進入細胞之方法而裂解在胞飲作用期間所製得之胞內體）共轉染(Akinc等人,The Journal of Gene Medicine . 7 (5): 657–63)。

在某些實施例中，雜交方法可用於遞送組合兩種或更多種技術之載體構築體。仿病毒顆粒為一個實例；其組合脂質體與失活的HIV或流感病毒。在另一實施例中，其他方法涉及混合其他病毒載體與陽離子脂質或雜交病毒且可用於遞送核酸(Khan, Firdos Alam,Biotechnology Fundamentals , CRC Press, 2015年11月18日，第395頁)。

在某些實施例中，樹狀體可用於遞送載體構築體，尤其是陽離子樹狀體，亦即具有陽性表面電荷者。在如DNA或RNA之基因材料存在時，電荷互補使得核酸與陽離子樹狀體暫時締合。為達至其目的，隨後經由胞飲作用將樹狀體-核酸複合體導入細胞中(Amiji, Mansoor M.編,Polymeric Gene Delivery: Principles and Applications , CRC Press, 2004年9月29日，第142頁)。病毒顆粒

在一實施例中，適合之病毒基因遞送載體（諸如病毒顆粒）可用於遞送核酸。在某些實施例中，適用於本文中之病毒基因遞送載體可為小病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒或單純疱疹病毒。小病毒可為腺病毒相關病毒(AAV)。

因此，本發明提供基於動物小病毒之用為基因遞送載體(包含本文所提供之載體構築體)的病毒顆粒，尤其是依賴病毒（諸如感染性人類或猴AAV）及其用於在哺乳動物細胞中引入及/或表現C1EI之組分（例如，動物小病毒基因組）。如本文所用之術語「小病毒」因此涵蓋依賴病毒，諸如任何類型之AAV。

小病毒科的病毒為小DNA動物病毒。小病毒科可在兩個亞科之間劃分：小病毒亞科，其感染脊椎動物；及濃核病毒亞科，其感染昆蟲。小病毒亞科之成員在本文中稱作小病毒，且包括依賴病毒屬。如自其屬之名稱可推論，依賴病毒之成員在其通常需要與輔助病毒(諸如腺病毒或疱疹病毒)共感染以用於在細胞培養物中之產生性感染方面具獨特性。依賴病毒屬包括通常感染人類（例如，血清型1、2、3A、3B、4、5及6）、靈長類動物（例如，血清型1及4）之AAV，以及除了鳥類及爬行動物以外之感染其他溫血動物的相關病毒（例如，牛、犬、馬、小鼠、大鼠及綿羊腺相關病毒）。關於小病毒之其他資訊及小病毒科之其他成員係描述於Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Fields Virology之第69章 (第3版 1996)中。為方便起見，本發明在本文中參考AAV進一步例示及描述。然而，應理解，本發明並不限於AAV但可同等地應用於其他小病毒。

AAV顆粒的產生需要AAV「rep」及「cap」基因，其分別為編碼複製及衣殼化蛋白的基因。AAV rep及cap基因係已於目前為止經檢驗的所有AAV血清型中發現，且描述於本文及所引用之參考文獻中。在野生型AAV中，通常發現到rep及cap基因在病毒基因組中是彼此鄰接的（亦即，其以鄰接或重疊轉錄單元「偶聯」在一起），且其在AAV血清型中通常是保守的。AAV rep及cap基因亦獨立地且統稱為「AAV封裝基因」。本文中所用之AAV cap基因係編碼Cap蛋白，其能夠在rep及腺輔助功能存在下封裝AAV載體且能夠結合目標細胞受體。在一些實施例中，AAV cap基因係編碼具有來源於特定AAV血清型之胺基酸序列的衣殼蛋白。

用於產生AAV之AAV序列可來源於任何AAV血清型之基因組。一般而言，AAV血清型具有在胺基酸及核酸層面具有顯著同源性之基因組序列，提供一組相似的遺傳功能，產生在物理上及功能上基本上等效之病毒粒子，且藉由幾乎一致之機制複製及組裝。關於AAV血清型之基因組序列及基因組類似性之討論。（參見例如GenBank寄存編號U89790；GenBank寄存編號J01901；GenBank寄存編號AF043303；GenBank寄存編號AF085716；Chiorini等人,J. Vir. (1997)第71卷, 第6823-6833頁；Srivastava等人,J. Vir. (1983)第45卷, 第555-564頁；Chiorini等人,J. Vir. (1999)第73卷, 第1309-1319頁；Rutledge等人,J. Vir. (1998)第72卷, 第309-319頁；及Wu等人,J. Vir. (2000)第74卷, 第8635-8647頁）。

所有已知AAV血清型之基因組組織極為類似。AAV之基因組為長度小於約5,000個核苷酸(nt)之線性單股DNA分子。反向末端重複序列(ITR)側接非結構複製(Rep)蛋白及結構(VP)蛋白之獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白形成衣殼。The 組裝活化蛋白(AAP)快速地伴護衣殼組裝物並防止游離衣殼裂解(Grosse等人, J. Virol. 91(20):e01198-17, 2017)。末端145 nt為自互補的且經組織以使得形成T形髮夾之能量穩定的分子內雙螺旋體可以形成。這些髮夾結構充當病毒DNA複製起點，作為細胞DNA聚合酶複合體之引子。Rep基因編碼Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。Rep78及Rep68係從p5啟動子轉錄，且Rep 52及Rep40從p19啟動子轉錄。cap基因編碼VP蛋白VP1、VP2及VP3。cap基因係從p40啟動子轉錄。本發明實施例之載體中採用的ITR可對應於與相關cap基因相同之血清型，或可不同。在一實施例中，本文中採用的ITR對應於AAV2血清型，且cap基因對應於AAV5血清型。

已知AAV VP蛋白用於判定AAV病毒粒子之細胞嗜性。比起不同AAV血清型中之Rep蛋白及基因，VP蛋白編碼序列之保守性顯著較低。Rep及ITR序列交叉互補其他血清型之對應序列的能力允許產生包含有血清型(例如，AAV1、5或8)之衣殼蛋白及另一AAV血清型(例如，AAV2)之Rep及/或ITR序列的假型AAV顆粒。這類假型rAAV顆粒為本發明的一部分。

本文所述之AAV顆粒（及其編碼AAV載體基因組）可包含WO 2018/022608或PCT/US19/32097中所述之該等衣殼蛋白中之任一者，其關於人類與猴AAV衣殼及其特性之揭露內容係以全文引用之方式併入本文中，所述特性諸如轉導效率、組織趨性、多醣類結合力及IVIG中和抗性，包括(但不限於)序列表中之任一衣殼及其變異體，例如帶有嵌合互換可變區及/或多醣結合序列及/或GH環套。

在一實施例中，用於本發明之上下文中之AAV ITR序列係衍生自AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6。同樣地，Rep (例如，Rep78及Rep52)編碼序列在一實施例中係衍生自AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6。然而，用於本發明之上下文中之編碼VP1、VP2及VP3衣殼蛋白之序列係可取自任一種血清型，諸如取自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12，或取自猴AAV，包括WO 2018/022608或PCT/US19/32097中所述之任一衣殼蛋白，或藉由例如衣殼改組技術及AAV衣殼庫獲得之新開發的AAV樣顆粒，或與SEQ ID NO: 37-53或56中之任一者至少90%一致之任一衣殼。

例如，已公開之各種衣殼的胺基酸序列。參見，例如：

AAVRh.1 / hu.14 / AAV9 AAS99264.1 (SEQ ID NO: 37)

美國專利公開第2013/0045186號之AAVRh.8 SEQ97 (SEQ ID NO: 38)

美國專利公開第2013/0045186號之AAVRh.10 SEQ81 (SEQ ID NO: 39)

國際專利公開第2013/123503號之AAVRh.74 SEQ 1 (SEQ ID NO: 40)

AAV1 AAB_95452.1 (SEQ ID NO: 41)

AAV2 YP_680426.1 (SEQ ID NO: 42)

AAV3 NP_043941.1 (SEQ ID NO: 43)

AAV3B AAB95452.1 (SEQ ID NO: 44)

AAV4 NP_044927.1 (SEQ ID NO: 45)

AAV5 YP_068409.1 (SEQ ID NO: 46)

AAV6 AAB95450.1 (SEQ ID NO: 47)

AAV7 YP_077178.1 (SEQ ID NO: 48)

AAV8 YP_077180.1 (SEQ ID NO: 49)

AAV10 AAT46337.1 (SEQ ID NO: 50)

AAV11 AAT46339.1 (SEQ ID NO: 51)

AAV12 ABI16639.1 (SEQ ID NO: 52)

AAV13 ABZ10812.1 (SEQ ID NO: 53)

經修飾之「AAV」序列亦可用於本發明之上下文中，例如，用於產生AAV基因療法載體。這類經修飾之序列，例如與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9 ITR、Rep或VP具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更多的核苷酸及/或胺基酸序列一致性之序列(例如，具有約75-99%的核苷酸序列一致性之序列)，其可用於取代野生型AAV ITR、Rep或VP序列。

在一些實施例中，編碼AAV衣殼蛋白之核酸序列係可操作地連接至用於在特定細胞類型（諸如Sf9或HEK細胞）中表現的表現控制序列。可以使用本領域中熟習此項技術者已知用於在昆蟲宿主細胞或哺乳動物宿主細胞中表現外來基因之技術來實施實施例。用於分子工程化及在昆蟲細胞中表現多肽之研究方法係描述於(例如)下列文獻中：Summers及Smith (1986) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. 第7555號，College Station, Tex.；Luckow (1991) In Prokop等人, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152；King, L. A.及R. D. Possee (1992) The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom；O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York；W.H. Freeman及Richardson, C. D. (1995) Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology，第39卷；美國專利第4,745,051號；US2003148506；及WO 03/074714，該等文獻係皆以全文引用之方式併入本文中。用於編碼AAV衣殼蛋白之核苷酸序列的轉錄之尤為適合的啟動子為(例如)多面體啟動子。然而，本領域中已知在昆蟲細胞中具有活性之其他啟動子，例如p10、p35或IE-1啟動子，且亦涵蓋以上參考文獻中所述的其他啟動子。

使用昆蟲細胞表現異源蛋白質為有據可查的，因為其為將核酸（諸如載體，例如昆蟲-細胞相容載體）引入這類細胞中之方法及將這類細胞維持於培養物中之方法。（參見例如METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Richard編，Humana Press, N J (1995)；O'Reilly等人, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人,J. Vir. (1989) 第63卷, 第3822-3828頁；Kajigaya等人,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991) 第88卷, 第4646-4650頁；Ruffing等人,J. Vir. (1992) 第66卷, 第6922-6930頁；Kirnbauer等人,Vir. (1996) 第219卷, 第37-44頁；Zhao等人,Vir. (2000) 第272卷, 第382-393頁；及美國專利第6,204,059號）。在一些實施例中，昆蟲細胞中編碼AAV之核酸構築體為昆蟲細胞相容的載體。如本文所用之「昆蟲細胞相容的載體」或「載體」係指能夠產生性轉型或轉染昆蟲或昆蟲細胞之核酸分子。例示性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組型病毒。可使用任何載體，只要其為昆蟲細胞相容的。載體可整合至昆蟲細胞基因組中，但昆蟲細胞中之載體的存在不必是永久性的且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知方式引入，例如藉由化學處理細胞、電穿孔或感染。在一些實施例中，載體為桿狀病毒、病毒載體或質體。在一實施例中，載體為桿狀病毒，亦即該構築體為桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及其使用方法係描述於關於昆蟲細胞之分子工程化在上文所引用之參考文獻中。用於產生重組型 AAV 顆粒之方法

本發明提供在昆蟲或哺乳動物細胞中產生重組型AAV顆粒之材料及方法，所述細胞包含本文所述之載體構築體中之任一者。在一些實施例中，載體構築體進一步包含啟動子及該啟動子下游之限制位點以允許插入編碼一或多種所關注蛋白質之聚核苷酸，其中該啟動子及限制位點位於5' AAV ITR的下游及3' AAV ITR的上游。在一些實施例中，載體構築體進一步包含於該限制位點下游及3' AAV ITR上游之轉錄後調節元件。在一些實施例中，載體構築體進一步包含位於限制位點下游及3' AAV ITR上游之轉錄後調節元件。在一些實施例中，載體構築體進一步包含在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游之轉錄後調節元件。在一些實施例中，病毒構築體進一步包含插入於限制位點處且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含所關注蛋白質之編碼區。如熟習此項技術者應瞭解，揭示於本申請案中之AAV載體構築體中之任一者可使用在該方法中產生重組型AAV顆粒。

在一些實施例中，輔助功能係由包含有腺病毒或桿狀病毒輔助基因之一或多種輔助質體或輔助病毒所提供。腺病毒或桿狀病毒輔助基因之非限制性實例包括(但不限於) E1A、E1B、E2A、E4及VA，其可對AAV封裝提供輔助功能。

AAV之輔助病毒為本領域中已知的且包括(例如)來自腺病毒科及疱疹病毒科之病毒。AAV之輔助病毒之實例包括(但不限於)美國公開第20110201088號(其揭示內容係以引用之方式併入本文中)中所述之SAdV-13輔助病毒及SAdV-13樣輔助病毒及輔助載體pHELP (Applied Viromics)。熟習此項技術者應瞭解，本文中可使用可對AAV提供足夠輔助功能之AAV之任何輔助病毒或輔助質體。

在一些實施例中，AAV cap基因係存在於質體中。該質體可進一步包含AAV rep基因，其可對應於或可不對應於與cap基因相同的血清型。可使用來自本文所述之任何AAV血清型（包括(但不限於) AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其任何變異體）之cap基因及/或rep基因以產生重組型AAV。在一些實施例中，AAV cap基因係編碼來自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其變異體之衣殼。

在一些實施例中，昆蟲或哺乳動物細胞可以用輔助質體或輔助病毒、病毒構築體及編碼AAV cap基因之質體轉染；且該重組型AAV病毒可以在共轉染後的不同時間點收集。例如，重組型AAV病毒可以在共轉染之後約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時或其中任何兩個時間點之間的時間收集。

重組型AAV顆粒亦可以使用本領域中已知適用於產生感染性重組型AAV之任何習知方法產生。在一些情況下，可以藉由使用穩定表現AAV顆粒產生所需之一些組件的昆蟲或哺乳動物細胞來產生重組型AAV。例如，包含AAV rep及cap基因之質體(或多個質體)，以及諸如新黴素抗性基因之可選標記物，係可整合至細胞之基因組中。該昆蟲或哺乳動物細胞可接著用輔助病毒（例如，提供輔助功能之腺病毒或桿狀病毒）以及包含有5'及3' AAV ITR（及若需要時之編碼異源蛋白質之核苷酸序列）之病毒載體構築體共感染。此方法的優點為細胞為可選擇的且適於大規模產生重組型AAV顆粒。作為另一個非限制性實例，可使用腺病毒或桿狀病毒而不是使用質體將rep及cap基因引入封裝細胞中。作為又一非限制性實例，含有5'及3' AAV ITR之病毒載體構築體及rep-cap基因皆可穩定整合至生產細胞的DNA中，且輔助功能可由野生型腺病毒提供以產生重組型AAV。

在一態樣中，本文所提供之方法係用於產生用作為基因遞送載體之AAV顆粒，該方法包含以下步驟： (a) 向容許AAV複製的細胞（例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞）提供一或多種核酸構築體，包含： (i) 本文所提供之核酸分子（例如重組型載體構築體），其由至少一個AAV反向末端重複核苷酸序列側接； (ii) 編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，該一或多種AAV Rep蛋白可操作地連接至能夠驅使Rep蛋白在細胞中表現的啟動子； (iii)編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，該一或多種AAV衣殼蛋白可操作地連接至能夠驅使衣殼蛋白在細胞中表現的啟動子； (iv) 及視情況存在之VP2/3 mRNA中含有的AAP及MAAP； (b) 在有助於表現Rep及衣殼蛋白之條件下培養(a)中定義之細胞；且視情況，(c)回收AAV基因遞送載體，及視情況，(d)純化AAV顆粒。例如，(i)之重組型載體構築體包括(1)至少一AAV ITR，(2)本文所述之異源肝特異性轉錄調節區，及(3)編碼功能性C1EI之核酸。(i)之重組型載體構築體較佳地包括5’及3’ AAV ITR二者。

接著，用於產生AAV基因遞送載體之本文所提供的方法通常包含：在足以將載體基因組複製及封裝至AAV衣殼中的條件下向容許AAV複製的細胞提供：(a)編碼用於產生載體基因組之模板的核苷酸序列，例如本發明之載體構築體(如本文中所詳細描述)；(b)足以複製模板以產生載體基因組(上文所定義之第一表現卡匣)的核苷酸序列；(c)足以將載體基因組封裝至AAV衣殼(上文所定義之第二表現卡匣)中的核苷酸序列，由此在細胞中產生包含有在AAV衣殼內衣殼化之載體基因組之AAV顆粒。

附著的HEK293細胞（Chahal等人, J. Virol. Meth. 196: 163-73 (2014)）之瞬時轉染，及使用桿狀病毒表現載體系統(BEVS)之Sf9細胞轉染（Mietzsch等人, Hum. Gene Ther. 25: 212-22 (2014)），為兩個最常使用的方法來產生AAV載體。

本文所提供之方法可包含使用抗AAV抗體（在一實施例中為固定抗體）對重組型小病毒(rAAV)（或包含有該重組型小病毒之病毒粒子）進行親和力純化的步驟。在另一實施例中，抗AAV抗體為單株抗體。本文中所用之一種抗體為如(例如)可獲自駱駝或駱馬之單鏈駱駝抗體或其片段（參見例如，Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302）。用於進行rAAV親和力純化之抗體為特異性結合至AAV衣殼蛋白上之抗原決定基的抗體，由此在一實施例中，該抗原決定基為存在於超過一種AAV血清型之衣殼蛋白上的一種抗原決定基。例如，可基於特異性結合至AAV5衣殼來培養或選擇抗體，但同時該抗體亦可特異性結合至AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8或AAV9衣殼。

本文提供之用以產生rAAV顆粒的方法係產生rAAV顆粒群。在一些實施例中，該顆粒群係藉由降低空的衣殼數量之步驟而富含包含有全長或幾乎全長的載體基因組之顆粒。

藉由本文提供之方法所產生的rAAV顆粒群係用以(例如)投與在本文所述之任一治療方法中。於 AAV 顆粒產生所用之細胞類型

包括有本文所述載體構築體之病毒顆粒係可使用任何允許產生AAV或生物產物且可維持於培養物中的無脊椎動物細胞類型來產生。例如，所用的昆蟲細胞株可來自草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)，諸如SF9、SF21、SF900+、果蠅細胞株、蚊子細胞株（例如白線斑蚊(Aedes albopictus)衍生的細胞株）、馴養的桑蠶細胞株（例如，家蠶(Bombyx mori)細胞株）、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞株（諸如High Five細胞）或鱗翅目(Lepidoptera)細胞株（諸如黑巫婆飛蛾(Ascalapha odorata)細胞株）。在一實施例中，昆蟲細胞為來自易受桿狀病毒感染之昆蟲物種的細胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。

桿狀病毒為節肢動物之包膜DNA病毒，其兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白質之熟知表現載體。桿狀病毒具有環狀雙股基因組(80-200 kbp)，其可經工程化以允許將大基因組內含物遞送至特定細胞。用作載體之病毒一般為加洲苜蓿夜蛾(Autographa californica)多衣殼核多角體病毒(AcMNPV)或家蠶核多角體病毒(BmNPV) (Kato等人, (2010), Applied Microbiology and Biotechnology, 第85卷, 第3期, 第459-470頁)。

桿狀病毒一般係用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。尤其，在昆蟲中表現異源基因可如(例如)以下文獻中所述般完成：美國專利第4,745,051號； EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人, (1988), Journal of General Virology, 第68卷, 第765-776頁；Miller等人, (1988), Annual Review of Microbiology, 第42卷, 第177-179頁；Carbonell等人, (1998), Gene, 第73卷, 第2期, 第409-418頁；Maeda等人, (1985), Nature, 第315冊, 第592-594頁；Lebacq-Veheyden等人, (1988), Molecular and Cellular Biology, 第8冊, 第8號, 第3129-3135頁；Smith等人, (1985), PNAS, 第82冊, 第8404-8408頁；及Miyajima等人, (1987), Gene, 第58冊, 第273-281頁。可用於蛋白質產生之許多桿狀病毒菌株與變異體及對應容許昆蟲宿主細胞係描述於Luckow等人, (1988), Nature Biotechnology, 第6冊, 第47-55頁；Maeda等人, (1985), Nature, 第315冊, 第592-594頁；及McKenna等人, (1998), Journal of Invertebrate Pathology, 第71冊, 第1期, 第82-90頁之中。

在另一實施例中，用允許複製AAV或產生生物產物且可維持在培養物中之任何哺乳動物細胞類型進行本文所提供之方法。在一實施例中，所用哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。宿主生物體及 / 或細胞

在另一實施例中，提供包含上文所述之載體之宿主細胞。在一實施例中，載體構築體能夠在宿主中表現本文所提供之核酸分子。在一些實施例中，本文提供HAE治療劑，其為包含有載體構築體之宿主細胞且該載體構築體包含有編碼hC1EI之核酸，以用於HAE細胞治療中。

如本文所用，術語「宿主」係指存有本發明之核酸分子或載體構築體之生物體及/或細胞、以及適用於表現重組基因或蛋白之生物體及/或細胞。並不意欲將本發明侷限於任何特定類型之細胞或生物體。實際上，已設想到任何適合之生物體及/或細胞將在本文中用作宿主。宿主細胞可呈單細胞、類似或不同細胞之群體形式，例如呈培養物（諸如液體培養物或固體基質上之培養物）、生物體或其部分形式。在一實施例中，宿主細胞可准許本文所提供之核酸分子表現。因此，宿主細胞可為例如細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞或人類細胞。

在另一實施例中，提供將本文所提供之核酸遞送至廣泛的細胞（包括分裂及非分裂細胞）中之手段。可採用本發明將本文所提供之核酸在活體外遞送至細胞，例如，在活體外產生由這類核酸分子編碼或用於離體基因療法之多肽。

本發明之核酸分子、載體構築體、細胞及方法/用途係另外有用於將本文所提供之核酸遞送至宿主（通常為罹患HAE之宿主）中之方法。醫藥調配物

在一實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含有本文所提供之核酸或載體以及醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑、載劑及/或其他藥劑、醫藥劑或佐劑等。

「醫藥學上可接受」意謂非生物學或其他不合所需的材料，亦即可向一個體投與該材料而不會引起任何非所要的生物效應。因此，這類醫藥組合物可(例如)用於離體細胞之轉染或用於直接向個體投與病毒顆粒或細胞。

載劑可適用於非經腸投與，其包括靜脈內、腹膜內或肌肉內投與。替代性地，該載劑可適用於舌下或經口投與。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液之無菌散劑。這類用於醫藥活性物質之介質及藥劑的用途為此項技術中所熟知。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則已設想將其用於本文所提供之醫藥組合物中。

在其他實施例中，本文提供AAV顆粒之醫藥組合物（即調配物），其適用於向罹患遺傳病症之個體投與以遞送編碼所關注蛋白質之基因。在某些實施例中，本文所提供之醫藥調配物為包含重組型AAV顆粒之液體調配物，且該重組型AAV顆粒包含有本文所揭示之任一載體構築體。該重組型AAV病毒粒子之濃度可以變化。在某些實施例中，調配物中之重組型AAV顆粒之濃度可在1E12 vg/ml至5E14 vg/ml範圍內。在一實施例中，調配物中之重組型AAV顆粒之濃度為約6E13 vg/ml。

在其他實施例中，本文所提供之AAV顆粒醫藥調配物包含一或多種無菌之醫藥學上可接受的賦形劑，以提供具有用於儲存及/或向個體投與用以治療遺傳病症之有利特性的調配物。在某些實施例中，本文所提供之醫藥調配物能夠在-65^o C下儲存至少2週、在一實施例中至少4週、在另一實施例中至少6週且在又一實施例中至少約8週的期間，穩定性無檢出變化。在這點上，術語「穩定」意謂存在於調配物中之重組型AAV顆粒在儲存期間基本上保持其物理穩定性、化學穩定性及/或生物活性。在某些實施例中，存在該醫藥調配物中之重組型AAV顆粒在-65^o C下儲存一段確定的期間時，在人類患者中保持其至少約80%的生物活性，在其他實施例中在人類個體中保持其至少約85%、90%、95%、98%或99%的生物活性。在一實施例中，該個體為青少年人類個體。

在某些態樣中，包含有重組型AAV顆粒之調配物進一步包含一或多種緩衝劑。例如，在各種實施例中，本文所提供之調配物係包含約0.1 mg/ml至約3 mg/ml、約0.5 mg/ml至約2.5 mg/ml、約1 mg/ml至約2 mg/ml或約1.4 mg/ml至約1.6 mg/ml之濃度的磷酸氫二鈉。在一實施例中，本文所提供之AAV顆粒調配物包含約1.42 mg/ml之(無水)磷酸氫二鈉。可用於本文所提供之重組型AAV顆粒調配物之另一種緩衝劑為磷酸二氫鈉單水合物，其在一些實施例中以約0.1 mg/ml至約3 mg/ml、約0.5 mg/ml至約2.5 mg/ml、約1 mg/ml至約2 mg/ml或約1.3 mg/ml至約1.5 mg/ml的濃度使用。在一實施例中，本發明實施例之AAV顆粒調配物包含約1.38 mg/ml之磷酸二氫鈉單水合物。在另一實施例中，本文所提供之重組型AAV顆粒調配物包含約1.42 mg/ml之磷酸氫二鈉及約1.38 mg/ml之磷酸二氫鈉單水合物。

在另一實施例中，本文所提供之重組型AAV顆粒調配物可在一實施例中以約1 mg/ml至約20 mg/ml、例如約1 mg/ml至約10 mg/ml、約5 mg/ml至約15 mg/ml或約8 mg/ml至約20 mg/ml之濃度包含一或多種等張劑，諸如氯化鈉。在另一實施例中，本文所提供之AAV顆粒調配物包含約8.18 mg/ml氯化鈉。此項技術中已知之其他緩衝劑及等張劑是適合的且可常規地採用於本文所提供之該等調配物中。

在另一實施例中，本文所提供之重組型AAV顆粒調配物可包含一或多種膨化劑。例示性膨化劑包括(但不限於)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮(PVP K24)。在某些實施例中，本文所提供之調配物包含甘露糖醇，其可以約5 mg/ml至約40 mg/ml、或約10 mg/ml至約30 mg/ml、或約15 mg/ml至約25 mg/ml的量存在。在另一實施例中，甘露糖醇係以約20 mg/ml之濃度存在。

在又一實施例中，本文所提供之重組型AAV顆粒調配物可包含一或多種界面活性劑，其可為非離子界面活性劑。例示性界面活性劑包括離子界面活性劑、非離子界面活性劑及其組合。例如，該界面活性劑可為(但不限於)TWEEN 80 (亦稱為聚山梨醇酯80，或其化學名稱聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、月桂基硫酸銨、TRITON AG 98 (Rhone-Poulenc)、泊洛沙姆(poloxamer) 407、泊洛沙姆188及其類似物以及其組合。在一實施例中，本實施例之調配物包含泊洛沙姆188，其可以約0.1 mg/ml至約4 mg/ml、或約0.5 mg/ml至約3 mg/ml、約1 mg/ml至約3 mg/ml、約1.5 mg/ml至約2.5 mg/ml、或約1.8 mg/ml至約2.2 mg/ml之濃度存在。在另一實施例中，泊洛沙姆188係以約2.0 mg/ml之濃度存在。

本文所提供之重組型AAV顆粒調配物是穩定的且可在品質、效價或純度無不可接受的變化之情況下儲存極長的時間。在一態樣中，該調配物在約5^o C (例如2^o C至8^o C)之溫度下係穩定至少1個月，例如至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。在另一實施例中，該調配物在低於或等於約-20^o C之溫度下係穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更久。在另一實施例中，該調配物在低於或等於約-40^o C之溫度下係穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更久。在另一實施例中，該調配物在低於或等於約-60^o C之溫度下穩定至少6個月，例如至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月、至少36個月或更久。

醫藥組合物在製造及儲存條件下通常是無菌且穩定的。醫藥組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適於容納高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物）以及其適宜混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可(例如)藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。在一些實施例中，等張劑（例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇、山梨糖醇）或氯化鈉）係包括於該組合物中。藉由使組合物中包括延遲吸收之藥劑（例如單硬脂酸鹽及明膠），可引起可注射組合物的延長吸收。在某些實施例中，本文所提供之核酸或載體構築體可在時間或受控釋放調配物中，例如在包括防止化合物快速釋放之緩慢釋放聚合物或其他載劑之組合物（包括植入物及微囊封遞送系統）中投與。可(例如)使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸酯及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。

在某些實施例中，包含有本文所提供之載體構築體或AAV載體之醫藥組合物係可使用於將遺傳物質轉移至細胞中。這類轉移可在活體外、離體或活體內進行。因此，一實施例提供將核苷酸序列遞送至細胞之方法，該方法包含在本文所提供之這類核酸或載體進入細胞的條件下使如本文所述之核酸、載體構築體或醫藥組合物接觸。細胞可為活體外、離體或活體內細胞。治療方法

在某些實施例中，本文提供治療罹患遺傳病症之個體的方法，該等方法包含向該個體投與治療有效量之編碼C1EI的核酸、載體構築體、AAV顆粒、或表現C1EI的宿主細胞、或包含其之醫藥組合物。在此情況下，「治療有效量」為在投與後引起治療蛋白之表现水準足以至少部分地及較佳完全地改善該遺傳病症之症狀的數量。

在一實施例中，本文提供一種治療C1EI缺乏的方法，包含向患有C1EI缺乏（例如，HAE）之患者投與治療有效量之本文所提供之核酸、載體構築體、AAV顆粒、或宿主細胞、或醫藥組合物。在一實施例中，該患者為人類。在一實施例中，該個體患者群體為患有中度至重度C1EI缺乏之患者，包括患有HAE或HAE變異型之患者。在一實施例中，治療的目標為將重度HAE患者轉化為中度HAE，因而減輕與復發性急性HAE發作相關聯的負擔。在一實施例中，該治療增加血液中的功能性C1EI水準至正常範圍或者正常範圍（16 mg/dL (或1 IU/ml)至約32 mg/dL）的至少40%。在相關的實施例中，該治療改善HAE症狀或降低急性HAE發作的頻率、持續時間或嚴重性。在一些實施例中，該治療降低需要用來治療急性HAE發作之按需治療量（例如，人類C1EI蛋白、激肽釋放素酶抑制劑、緩激肽拮抗劑等），或降低施予用來治療急性HAE發作之按需治療的頻率。在一些實施例中，與未接受該治療的個體相比，接受該治療的個體係感受到發作頻率降低至少50%、60%、70%、80%或90%。

在一實施例中，本文提供增加循環有需要之個體中之C1EI蛋白水準的方法，該等方法包含向該個體投與表現C1EI蛋白之本文所提供之核酸、載體構築體、AAV顆粒、宿主細胞或醫藥組合物中之任一者。

在另一實施例中，本文提供有效量之本文所述重組型AAV顆粒之用以製備用於治療患有功能性C1EI或HAE缺乏之個體的藥劑的用途。在一實施例中，該患有HAE之個體為人類。在一實施例中，該藥劑係以靜脈(IV)給藥。在另一實施例中，投與該藥劑會導致該個體的血流中有C1EI蛋白表現，其足以增加該個體血液中之功能性C1EI蛋白至至少正常範圍或者正常範圍（16 mg/dL (或1 IU/ml)至約32 mg/dL）的至少40%。

在一或多個實施例中，本文所提供之治療方法亦包含投與防治性及/或治療性皮質類固醇，用於預防及/或治療任何與投與AAV C1EI病毒相關之肝毒性。該防治性或治療性皮質類固醇治療可包含每天至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60毫克或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，該防治性或治療性皮質類固醇可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更久之連續時段投與。

在一或多個實施例中，本文提供之治療方法視情況包括投與（例如，同時投與）其他用以治療HAE的治療劑，例如，達那唑(danazol)、司坦唑醇(stanozolol)、氧雄龍(oxandrolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、替勃龍(tibolone)、羥甲烯龍(oxymetholone)。在一實施例中，本文提供之治療方法包含輔助性投與以下一或多者：用於急性HAE發作之C1EI蛋白、視情況存在之重組型或血漿衍生型、激肽釋放素酶抑制劑、緩激肽拮抗劑。

如本文所述出於治療目的之核酸、載體構築體、AAV顆粒、宿主細胞或包含其之醫藥組合物的「治療有效量」可憑經驗且以常規方式判定。然而，在某些實施例中，重組型AAV顆粒之「治療有效量」在約1 x 10¹² 至約1 x 10¹⁴ 或1 x 10¹⁵ vg/kg之範圍內。在另一實施例中，rAAV顆粒係以約2 x 10¹² 至約2 x 10¹⁴ vg/kg遞送。在又一實施例中，rAAV顆粒係以約2 x 10¹² 至約6 x 10¹³ vg/kg遞送。在又一實施例中，rAAV顆粒係以約1 x 10¹³ 至約1 x 10¹⁵ vg/kg遞送。

在一實施例中，可通過多種已知的投與技術向一個體（在一實施例中向一哺乳動物個體或人類個體）投與本文所提供之重組型載體構築體或AAV顆粒。在一些實施例中，係以單次劑量或較長時間期間以靜脈注射投與該載體構築體或重組型AAV顆粒，該時間期間可為至少約1、5、10、15、30、45、60、75、90、120、150、180、210或240分鐘或更久。

在本文所述之任一治療方法中，治療的有效性係可藉由測量在經治療個體之血液中之所表現功能性C1EI水準程度來監測。用於量化C1EI之循環量的精確定量測定法在此項技術中是眾所周知的，且包括ELISA、西方墨點法、螢光測定法（參見，McCaman, M.W.及Robins, E., (1962)J. Lab. Clin. Med., 第59冊, 第885-890頁）；質譜儀、基於薄層層析之測定法（參見，Tsukerman, G. L. (1985)Laboratornoe delo , vol. 6, 第326-327頁）；酵素測定法（參見，La Du, B. N.等人(1963)Pediatrics , 第31冊, 第39-46頁；及Peterson, K.等人(1988)Biochem. Med. Metab. Biol. , 第39冊, 第98-104頁）；採用高壓液相層析(HPLC)的方法（參見，Rudy, J. L.等人(1987)Clin. Chem. , 第33冊, 第1152-1154頁）；及高通量自動化（參見，Hill, J. B.等人(1985)Clin. Chem. , 第5冊, 第541-546頁）。確認C1EI活性的功能性測定法是市售可得的，例如TECHNOCHROM®色素原套組，其中C1-inh係經以過量的C1-酯酶滴定以形成抑制性複合物，且殘留的C1-酯酶活性係使用色原素受質來測量。此外，治療的有效性可通過降低急性HAE發作頻率(次數)及/或HAE發作的嚴重性，以及降低需要用來治療急性HAE發作之按需治療量，來對應監測。

在一些情況下，本發明之AAV顆粒之投與可引起觀察得到的程度之肝毒性。肝毒性可藉由多種熟知及常規地使用的技術測量，例如在AAV投與之前(亦即，基線)及在AAV投與之後皆測量個體之血流中之某些肝相關酶(例如，丙胺酸轉胺酶，ALT)的濃度。AAV投與之後(與投與之前相比)ALT濃度之觀察得到的增加係表明藥物誘導之肝毒性。在某些實施例中，除了投與治療有效量之AAV病毒外，該個體可在防治上、治療上或這兩方面上使用皮質類固醇治療，以預防及/或治療任何與投與AAV病毒相關之肝毒性。

「防治性」皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以預防肝毒性及/或預防個體中之所測得ALT水準增加。「治療性」皮質類固醇治療係指投與皮質類固醇以降低由投與AVV病毒所引起之肝毒性及/或降低由投與AAV病毒所引起之個體血流中的ALT濃度升高。在某些實施例中，防治性或治療性皮質類固醇治療可包含每天向該個體投與至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60毫克或更多的皮質類固醇。在某些實施例中，個體之防治性或治療性皮質類固醇治療可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更久之連續時段進行。可用於本文所述之方法中之皮質類固醇包括任何已知或常規採用的皮質類固醇，包括(例如)地塞米松(dexamethasone)、潑尼松(prednisone)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氫皮質酮(hydrocortisone)及其類似物。抗 AAV 抗體之偵測

為了使藉由全身性AAV介導之治療性基因轉移之成功肝轉導的可能性最大化，在針對如上文所述之人類患者的治療方案中投與AAV顆粒之前，可針對能夠阻斷細胞轉導或以其他方式降低治療方案之整體效率之抗AAV衣殼抗體的存在來評估預期患者。這類抗體可存在於預期患者之血清中且可針對任何血清型之AAV衣殼。在一實施例中，預先存在之抗體針對之血清型為AAV5。

偵測預先存在之AAV免疫性之方法是眾所周知的且常規地採用於此項技術中，且包括基於細胞之活體外轉導抑制(TI)測定法、活體內(例如小鼠內)TI測定法及總抗衣殼抗體(TAb)之基於ELISA的偵測（參見(例如)Masat 等人 , Discov. Med. , 第15卷, 第379-389頁以及Boutin等人, (2010)Hum. Gene Ther. , 第21卷, 第704-712頁）。TI測定法可採用已預先引入AAV誘導性報告載體之宿主細胞。報告載體可包含在藉由AAV病毒轉導宿主細胞時誘導其表現之誘導性報告基因，諸如GFP等。能夠防止/減少宿主細胞轉導之存在於人類血清中之抗AAV衣殼抗體將藉以減少報告基因在系統中之整體表現。因此，該等測定法可用於偵測能夠藉由治療性AAV-C1EI病毒防止/減少細胞轉導之抗AAV衣殼抗體在人類血清中的存在。

偵測抗AAV衣殼抗體之測定法可採用固相結合AAV衣殼作為人類血清越過之「捕獲劑」，進而允許存在於血清中之抗衣殼抗體結合至固相結合衣殼「捕獲劑」。一旦洗滌移除非特異性結合，可採用「偵測劑」來偵測結合至捕獲劑之抗衣殼抗體的存在。偵測劑可為抗體、AAV衣殼或其類似物，且可以可偵測標記方式以幫助偵測及定量經結合的抗衣殼抗體。在一實施例中，偵測劑係以可使用電化學發光技術及設備偵測之釕或釕複合體標記。

相同上述研究方法可用於評估及偵測預先用所關注之治療性AAV病毒治療之患者中之抗AAV衣殼免疫反應的生成。於是，這些技術不僅可用於評估在用治療性AAV病毒治療之前抗AAV衣殼抗體的存在，其亦可用於在投與之後評估及量測針對所投與治療性AAV病毒之免疫反應的誘導。於是，本文涵蓋將偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體之技術與治療HAE之治療性AAV病毒之投與組合的方法，其中用於偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體之技術可在投與治療性AAV病毒之前或之後進行。

本發明之其他態樣及優點將在考量以下說明性實例後理解。實例實例 1 ：評估由肝特異性啟動子所驅動之 C1EI 表現卡匣。 表現可操作地連接至肝特異性啟動子之野生型人類 C1EI 的產生

多種重組型AAV基因療法載體係設計成包含有可操作地連接至雜合人類脂蛋白元E (ApoE)/HCR增強子/人類α抗胰蛋白酶(AAT)啟動子之野生型或密碼子最佳化的SERPING1 cDNA (表1)。在圖1中進一步提供了載體配置的代表性圖示。載體基因組配置視情況包括hAAT/血紅蛋白內含子序列(hhI)，以及牛或人生長激素聚腺苷酸化信號(分別為bGHpA或hGHpA。載體基因組係由AAV serotype 2 (AAV2)衍生的反向末端重複序列(ITR)側接，且大小在3087 bp至4779bp長度範圍內。該等載體係使用例如由以下所述之習知選殖技術製備：Gibson等人(2009). "Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases". Nature Methods. 6 (5): 343–345，及Gibson DG. (2011). "Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments". Methods in Enzymology. 498: 349–361，其以引用之方式併入本文中。表1 – AAV-C1EI載體構築體

編碼	構築體	SEQ ID NO:
HAE1	pFB-ApoE-hAAT-LGI-50-SERPIN G1	20
HAE2	pFB-ApoE-hAAT-LGI-225-SERPIN G1	21
HAE3	pFB-ApoE-hAAT-LGI-450-SERPIN G1	22
HAE4	pFB-ApoE-hAAT-LGI-900- SERPIN G1	23
HAE5	pFB-ApoE-hAAT-LGI-900-SEPRIN G1-JCAT	24
HAE6	pFB-ApoE-hAAT-LGI-900-SERPIN G1-JCAT-HCG	25
HAE7	pFB-ApoE-hAAT-LGI-900-SERPIN G1-opt	26
HAE8	pFB-ApoE-hAAT-LGI-SERPIN G1-JCAT-HCG	27
HAE9	pFB-ApoE-hAAT-LGI-SERPIN G1-Cop-GS-RCG	28
HAE10	pFB-ApoE-hAAT-LGI-SERPIN G1-IDT	29
HAE11	pFB-ApoE-hAAT-LGI-SERPIN G1-JCAT	30
HAE12	pFB-ApoE-hAAT-SERPIN G1-Cop-GS-RCG-hGHpA-4300	31
HAE13	pFB-ApoE-hAAT-SERPIN G1-IDT-hGHPA-4300	32
HAE14	pFB-ApoE-hAAT-SERPIN G1-JCAT-hGHPA-4300	33
HAE15	pFB-ApoE-hAAT-SERPIN G1-P1-hGHPA-4300	9
HAE16	pFB-ApoE-hAAT-LGI-SERPIN G1-WT	34
HAE17	pFB-ApoE-hAAT-LGI-SERPIN G1-WT 4399刪除標記	35
HAE23	pFB-ApoE-hAAT-HB intron-SERPIN G1-WT-bGHpA	57
HAE24	pFB-ApoE-hAAT-HB intron-SERPIN G1-WT-hGHpA	58

測試 AAV-C1EI 載體之表現及活性之測定法

測試本文所提供之重組型AAV-C1EI載體之測定法包括(例如)：(1)在HepG2細胞（來源於人類肝臟之細胞株）中瞬時轉染包含有AAV載體核酸之雙股DNA質體，以檢查肝特異性C1EI蛋白在活體外的產生及分泌；(2)在293細胞及經桿狀病毒感染之昆蟲細胞中產生包含有AAV-C1EI載體之AAV病毒粒子，隨後確認293細胞中的AAV-C1EI載體及經桿狀病毒感染之昆蟲細胞，且隨後確認該AAV載體核酸及衣殼蛋白質的完整性；(3)評估Rag2^- /^- 小鼠中之C1EI表現及C1EI活性。 瞬時轉染測定法

進行預先活體外測定法以比較來自上述重組型AAV基因治療載體之C1EI的表現及活性(亦參見圖1)。在一實施例中，載體構築體之質體瞬時轉染至人類肝細胞株HepG2中。轉染後，例如24或48或72小時後，量測C1EI表現。使用此測定法，可展現重組型AAV基因治療載體能夠在瞬時轉染之HepG2細胞中表現C1EI蛋白，水準約20220 ng/mL至721 ng/mL（如圖2所示）。在 293 細胞及經桿狀病毒感染之昆蟲細胞中產生 AAV-C1EI 病毒粒子

為展示本實施例之重組型載體確實封裝編碼C1EI之核酸，將如上文所述產生之雙股形式之AAV-C1EI載體引入能夠產生AAV病毒粒子之細胞中。產生表現AAV-C1EI載體核酸及AAV Cap及Rep蛋白之桿狀病毒構築體，且接著共感染到昆蟲細胞中，該昆蟲細胞最好不含源自Sf9細胞之棒狀病毒(rhabdovirus)。所得AAV病毒粒子係藉由此項技術中已知的標準方法純化及分析。在一替代性AAV病毒產生系統中，包含有呈雙股形式之AAV-C1EI載體核酸的質體係與表現AAV Cap及Rep蛋白之質體以及表現AAV病毒粒子產生所需之腺病毒輔助功能之質體共轉染至293細胞中。

執行鹼性凝膠電泳測定法以判定封裝核酸之尺寸。結果顯示核酸具有期望的長度。替代性的測定法包括了複製中心測定法以判定何等AAV-C1EI載體以完整形式封裝。引子延伸測定法係用於定量具有完整末端，亦即在AAV2 5′ ITR (有義鏈)或3′ ITR (反義鏈)中之髮夾環之5'端處終止之AAV-C1EI載體核酸的量。替代性地，PCR測定法係用於判定AAV-C1EI載體核酸是否具有完整末端，亦即在AAV2 5' ITR (有義鏈)或3' ITR (反義鏈)中之髮夾環之5'端處終止。

瞬時轉染測定法顯示出該載體能夠在肝細胞中表現高含量的外源性C1EI。AAV病毒粒子大體上係如本文所述使用兩種不同類型的衣殼（AAV5型衣殼及狒狒衍生型AAV衣殼）所產生。對由此產生的核酸的評估顯示出其具有預期的長度。 HepG2 細胞中之可轉導性評估

如上述使用兩種不同類型的衣殼（AAV5型及狒狒AAV衍生型(Bba49)衣殼）所產生之AAV病毒粒子係經由HepG2細胞之活體外轉導做進一步評估。HepG2細胞係以3個不同的MOI（20,000；100,000；及500,000）及若干具有AAV5型或AAVBba49衣殼之AAV顆粒製劑進行轉導。轉導96小時之後，收集培養液並藉由質譜儀測量bCG蛋白，且在所有製劑中顯示出良好的可轉導性及相似的轉導結果。實例 2 ： HAE15 在 Rag2^- /^- 小鼠中的效果

AAV5 HAE15 (或AAV5-ApoE/HCR-hAAT.hhI.SERPIN G1.hGH)係使用桿狀病毒表現載體(BEV)系統所產生，而另一個肝趨性狒狒衍生型AAV衣殼AAVBba49 HAE15 (或AAVBba-ApoE/HCR-hAAT.hhI.SERPIN G1.hGH)係使用三重轉染293細胞所產生。經純化的載體係以qPCR定量並以2e14 vg/kg對8週齡的Rag2-/- (敲除)小鼠與載劑控制組一起給藥。給藥後，在第2、4、6、8、10及12週收集血清及血漿。藉由獲自Sino Biological公司(型錄# SEK10995)之配對ELISA套組(型錄# SEK10995)測量人類C1EI水準，並使用獲自DiaPharma公司的Technochrom C1-inh套組(型錄# 5345003)測量功能性C1EI水準。

在以兩種不同的rAAV顆粒給藥的群組中，超越生理水準的人類C1EI表現（圖3A及B）及血清中的功能性蛋白濃度（圖4A及B）係皆遠高於載體背景值。以AAVBba49-HAE15給藥的群組具有最高的蛋白質表現，且大於50倍的功能性人類C1EI蛋白的正常分泌水準。在以AAV5及AAVBba49治療的群組中，在12週的研究期間內皆觀察到有持續的表現。在AAVBba49 HAE15組中，人類C1EI的表現係於第2至6週減少，到第6週時穩定且與AAV5 HAE15治療組(25-48 IU/mL)相比時係有較高的人類C1EI蛋白表现水準(40-70 IU/mL)。於群組B之血漿中所偵測到的C1EI蛋白表現：2e14 vg/kg AAV5 HAE15從第4周到第12周保持穩定（蛋白質定量及功能性C1EI水準皆是）。群組C：2e14 vg/kg AAVBba49 HAE15血漿C1EI水準從第6周到第12周保持穩定（蛋白質定量及功能性C1EI水準皆是）。其全部皆保持正常值25至50倍的高水準。 生長速率

亦在經以載體做為控制組治療之Rag2-/-小鼠中測量生長速率，並基於取得血漿樣本之前的體重量測而與經AAV-C1EI治療之小鼠進行比較（圖5）。直到10週，所有組的體重圖均展現體重增加速率無顯著變化。 毒性指標之量測

血漿中之丙胺酸轉胺酶(ALT)活性可用作肝細胞健康狀況之指標，且較高水準之ALT指示肝細胞毒性。在投與AAV5或AAVBba49治療之前以及投與後每2週自這些小鼠採取血漿樣品(圖6)。使用市售套組(Sigma)來量測血漿ALT。圖中表明以不同劑量投與帶有HAE15 C1EI載體基因組之AAV5或AAVBba49不會引起ALT水準顯著變化。虛線表示C57-BL6 WT小鼠的歷史正常範圍(7-23 IU/L)。

在給藥12周之後評估這些經治療之小鼠肝臟的組織學及C1EI表現。如圖7A中所繪示，以2e14 vg/kg AAV5-HAE15或Bba49-HAE15給藥的8週齡Rag2-/-小鼠導致了人類C1EI之肝表現增加。更具體而言，在AAV5-HAE中偵測到中心周圍信號，且在Bba49-HAE15觀察到泛肝臟信號。與載體相比，使用C1EI免疫組織化學(IHC)測定法觀察到在每個構築體之間有顯著不同（圖7B）。C1EI (+)肝細胞的百分比係基於一設定閾值而定量。計算每隻動物中的兩到三個由約4600 +/- 770個肝細胞所組成之所關注區域(2-3 ROI)。在經投與2e14 vg/kg劑量之AAV5-HAE15的小鼠中，大約30%的肝細胞為C1EI陽性，表明其在給藥後12周製造載體衍生型人類C1EI。

基於諸如肝核增大、肝竇狀小管塌陷、及出現肝病變等因素的定性評估，以AAV5 HAE15或Bba49 HAE15給藥並未影響肝組織結構。採用呈現出架構性病理學的H&E組織進行比較分析。

IBA1為駐存巨噬細胞及浸潤巨噬細胞二者的標記物，且包括基本狀態及活化狀態。以2e14 vg/kg AAV5-HAE15或Bba49-HAE15對8週齡Rag2-/-小鼠給藥係導致Rag2-/-小鼠之肝臟中的IBA-1(+)集落(Foci)升高。使用IBA1 IHC測定法時，在給予AAV5及Bba49的動物中皆觀察到IBA1信號顯著增加（增加大約~10%）（單因子變異數分析(One-way ANOVA)；誤差槓 = SEM）。IBA-1 (+)集落的數量係除以影像的總面積來分析（排除空白處），以計算每個像素之#IBA-1集落。先前的基因療法計畫已報導當以2e14 vg/kg (或更高)的濃度給藥時會有相似的發現。肝臟 DNA 及 RNA qPCR

以2e14 vg/kg的AAV5-HAE15或Bba49-HAE15載體構築體給藥的Rag2-/-小鼠在治療12週之後，係以qPCR測量進一步評估肝臟中的HAE15 DNA及RNA。群組B及群組C之間的RNA倍數差異：圖8中係繪示群組C/群組B與副本數/ng RNA之對應圖（副本數/ng RNA – 0.69; ΔΔct – 0.62）。以2e14 vg/kg AAV5-HAE15或Bba49-HAE15對8週齡Rag2-/-小鼠給藥係導致該等治療組的肝臟中的HAE15 DNA及RNA皆增加。實例 3 ：給藥範圍研究

給藥反應研究係於兩組中以AAV5-HAE15進行，第一組係評估12週，第二組係評估12個月。

在第一組中，8週齡之雄性Rag2-/-小鼠係以載劑或是6e13 vg/kg、2e13 vg/kg、6e12 vg/kg或2e12 vg/kg之AAV HAE15治療。注射前和注射後每兩周至長達12週，均通過尾部切口進行採血及血漿採集。在12週時，以微滴式數位核酸偵測(ddPCR)測量及評估小鼠肝臟中的HAE15 DNA及RNA量。也藉由免疫組織化學(IHC)來評估肝臟之組織學及C1EI表現。在2週時，所有治療組皆有可偵測程度的人類C1EI水準，其中兩個最高的族群顯現出超越生理水準的人類C1EI蛋白表現（圖9A及B）。在AAV5-HAE15看到有良好的劑量反應。在給藥2週後，6e13 vg/kg劑量群的平均水準為386 mg/dL及7.94 IU/mL人類C1EI；2e13 vg/kg劑量群的平均水準為91 mg/dL及2.06 IU/mL人類C1EI；6e12 vg/kg劑量群的平均水準為13 mg/dL及0.59 IU/mL人類C1EI；2e12 vg/kg劑量群的平均水準為3 mg/dL及0.23 IU/mL人類C1EI。接受治療後4及6週，在6e13 vg/kg及2e13 vg/kg治療組中的這些超越生理水準係仍維持住。投與AAV5-HAE15亦提供肝臟中可偵測到之HAE15 DNA量的劑量依存性增加（圖12）。在投與後12週以IHC評估C1EI(+)肝細胞，其顯示出劑量依存性之中心周圍信號。至於投與2e13 vg/kg劑量之小鼠在12週時大約7%的肝細胞為C1EI(+)，而投與6e13 vg/kg劑量之小鼠在12週時大約12%的肝細胞為C1EI(+)（圖13）。

在第二組中，8週齡之雄性Rag2-/-小鼠係以載劑或是2e14 vg/kg、6e13 vg/kg、2e13 vg/kg、6e12 vg/kg或2e12 vg/kg之AAV5-HAE15治療。血液及血漿係如上述在注射後約每兩週採集直到12週，接著每4週採集直到52週。評估血漿中之總人類C1EI蛋白(mg/mL)（圖10A），及功能性C1EI蛋白(IU/mL)（使用測量C1酯酶抑制劑之測定法）（圖10B），以及指示肝毒性之生物標記物ALT (IU/L)（圖11）。小鼠血漿中之人類C1EI蛋白量係以液相層析串聯質譜儀(LC-MS)/MS使用人類專一性肽TLYSS進行測量。功能性C1EI蛋白係以市售套組(Technochrom)進行測量。在52週時，對小鼠施無痛致死術。以微滴式數位核酸偵測(ddPCR)測量及評估該等小鼠肝臟之HAE15 DNA及RNA量（圖12）。也藉評估肝臟之組織學及C1EI表現。C1EI(+)肝細胞的百分比係基於一設定閾值而定量；經載體治療的動物係用以設定最低閾值並減去任何背景/自發螢光信號。計算每隻動物中的兩到三個由大約5000 +/- 580個肝細胞所組成之ROI。

總人類C1EI蛋白及功能性C1EI蛋白的表現皆具劑量依存性且在4與12週之間達到高峰。2e13 vg/kg及更高的劑量係皆提供超越生理水準的人類C1EI及功能性人類C1EI蛋白表現持續至少一年。人類C1EI蛋白水準在12週時的範圍為約2.5x至25x之正常量，且在52週時逐漸下降到約2x至約12x之正常量的水準範圍（圖10A）。功能性人類C1EI水準係依循相似的模式，在12週時的範圍為約3.5x至約35x，且在52週時下降到約2x至約11x之水準（圖10B）。總C1EI蛋白及功能性C1EI蛋白的水準有很好的相關性。

這些數據表明AAV5-HAE15載體誘導治療性程度的功能性C1E表現，在一年的評估期間內具有良好的持久性，且具有期望在超過這一年表現的充足水準。

投與AAV5-HAE15提供了在52週之肝臟中可偵測到之HAE15 DNA量的劑量依存性增加（圖12）。在投與後52週以IHC評估C1EI(+)肝細胞，其顯示出程度相當於第一組的12週研究之所期待的劑量依存性信號（圖13）。在52週時，投與2e13 vg/kg劑量之小鼠中大約5%的肝細胞保持C1EI陽性，投與6e13 vg/kg劑量之小鼠中大約12%的肝細胞保持C1EI陽性，而投與2e14 vg/kg劑量之小鼠中大約15%的肝細胞保持C1EI陽性。至於2e13 vg/kg及6e13 vg/kg劑量，在12週與52週相對下的C1EI(+)肝細胞百分比沒有顯著差異。

這數據表明肝細胞轉導在直到52週的研究期間具有良好且一致之持久性，且具有期望繼續超過這一年的持久性表現。

所有劑量在直到52週的研究期間，ALT水準係保持在正常範圍內，表明肝臟正常運作。經治療的小鼠在體重增加率方面未顯示出顯著的改變，且沒有顯著的肝臟組織發現。這數據表明AAV載體的投與是安全且可忍受的。

實例 4 ：非人靈長類動物中之 AAV-C1EI 載體的評估。

非人靈長類動物研究係以用16隻食蟹猴(Macaca fascicularis)進行。該等猴子係經投與載體或(a)低劑量之編碼食蟹猴C1EI (cC1EI)或人類C1EI (hC1EI)（其每一者大約為2e14 vg/kg）之AAV5-SERPING1載體，或(b)或更高劑量之編碼cC1EI (大約6.5e14 vg/kg)或hC1EI (大約5e14 vg/kg)之AAV5-SERPING1載體。AAV5-HAE15係經投與作為編碼人類C1EI之載體。每週收集血漿持續13週(低劑量)至17週(高劑量)，並評估hC1EI蛋白水準。在研究結束時，評估肝臟中的SERPING1 DNA及RNA量（分別為總DNA或RNA之DNA複本數或RNA/μg）。監測臨床病理學及血液學讀數。

高劑量及低劑量的AAV5-HAE15皆產生出有效水準的人類蛋白質，儘管水準低於在小鼠中所見的。可看到有劑量依存性反應的趨勢，儘管其在C1EI水準的正常範圍內波動。載體DNA複本數係對應蛋白質表现水準，且載體RNA複本數趨向於對應蛋白表现水準。例如，以3x更多的AAV顆粒治療會產生出3x更高的DNA複本數。

安全評估指標包括每週的身體及體重量測，以及監測抗AAV5抗體和抗C1EI抗體的反應。監測靈長類動物的腫脹，若發現則執行額外的分析。血栓評估指標包括APTT、PT、可溶性纖維蛋白、D-二聚體、凝血酶-抗-凝血酶複合物及纖維蛋白原。在研究終止時，執行大體屍檢並評估肝臟的C1EI，同時評估所有主要器官（包括性器官）的H&E及纖維蛋白染色。

表2 – 針對生物標記物之採血（基準線、每週、研究終止） v 肝臟酵素 • 天門冬胺酸轉胺酶(AST) • 丙胺酸轉胺脢(ALT) v 血栓評估： • APTT（通過內在途徑的凝結性能） • PT（通過外在途徑的凝結性能） • D-二聚體（存在纖維蛋白凝塊的標記物） • 可溶性纖維蛋白單體（彌散性血管內凝結的標記物） • 凝血酶-抗凝血酶複合物（高凝狀態的標記物）

纖維蛋白原（發炎及擾動的標記物可表明纖維蛋白凝集形成）

沒有觀察到肝臟酵素、凝血參數或發炎標記物的異常結果，顯示出非人靈長類動物耐受高劑量的AAV5載體且沒有副作用。實例 5 ：在遺傳性血管性水腫之小鼠模型中的 AAV-C1EI 載體評估。

AAV-SERPING1引導的hC1EI蛋白表現係於HAE小鼠模型中評估。與模擬HAE症狀的野生型小鼠相比，SERPING1⁻ ^/ ⁻ 小鼠的血管通透性顯著增加。在注射伊凡斯藍染劑後，與野生型同窩小鼠相比，同型合子及異型合子的C1EI缺陷型小鼠皆展現出血管通透性增加。增加的血管通透性可藉由用靜脈注射C1EI與激肽釋放素酶抑制劑或緩激肽第2型受體拮抗劑治療而逆轉。見Han等人, J. Clin. Invest. 109:1057–1063 (2002)。

AAV5-HAE15的治療效果係於6至8週齡的同型合子的SERPING1⁻ ^/ ⁻ 小鼠中評估。小鼠係以載體、陽性對照組（4 mg/kg人類C1EI蛋白）、或者6e13 vg/kg、2e13 vg/kg或6e12 vg/kg劑量之AAV5-HAE15治療。以每克體重4 μl執行靜脈注射。在6週期間內每2週間隔從尾部靜脈採血，並處理以收集血清以評估hC1EI水準及活性。經載體治療的小鼠係與對照組之經載體治療的小鼠進行比較。6e13 vg/kg及2e13 vg/kg劑量的群組之血漿中的功能性人類C1EI水準皆大約在第4週至第6週達到治療水準（圖14）。6e13 vg/kg劑量之群組的功能性人類C1EI表現實質上係高於該群組全部小鼠的正常量，約4x至約14x正常量的範圍。以IHC評估肝臟中的C1EI(+)肝細胞顯示出，6e13 vg/kg劑量之在6週時大約10%的肝細胞為C1EI(+)。

在投與AAV5-HAE15 2週、4週或6週之後，也評估該等群組的小鼠之血管通透性。小鼠係經注射30 mg/kg伊凡斯藍染劑之磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)，隨後在15分鐘內向右耳表面施以兩次刺激劑（5%芥末油）。在注射染劑30分鐘之後，對小鼠施無痛致死術。從右耳、小腸及腎抽取染劑，並以光譜儀在600 nm進行測量。

與野生型小鼠相比，經以載體治療之對照的SERPING1敲出小鼠的血管通透性顯著增加。如所期待的，以使用人類血漿衍生型C1EI蛋白之小鼠治療使功能性C1EI之血漿水準正常化（大約1 IU/mL），且該治療顯著降低耳朵、小腸及腎的血管通透性。在耳廓中，小鼠顯示出對於投與AAV5-HAE15之劑量依存性反應。與野生型小鼠相比，以2e13 vg/kg給藥之小鼠的耳廓中的血管通透性係正常化（與野生型沒有顯著不同），而以6e13 vg/kg給藥之小鼠則顯示出甚至更少的血管通透性（圖15A）。在小腸及腎中（圖15B及圖15C中），以2e13 vg/kg或6e13 vg/kg給藥之小鼠的血管通透性係正常化（與野生型沒有顯著不同）。實例 6 ：評估毒性及食蟹獼猴中之 HAE15 之生物分佈

非人靈長類動物研究係以食蟹獼猴對HAE15、HAE23或HAE24進行。在整個研究中，係跟進急性及慢性毒性、藥效動力學及免疫原性評估指標。在注射後8週及12週，評估持久性及長期療效。藉由原位雜交法計算生物分佈，評估組織病理學，並評估性器官中的DNA和RNA。AAV載體係經判定為安全且可忍受的。

本文所述之實施例僅意欲為例示性的，且熟習此項技術者將認識到，或將能夠僅使用常規實驗確定特定化合物、材料及程序之許多等效物。所有這類等效物係視為在本發明之範疇內。

本文所提及之所有專利、專利申請案及公開案係以全文引用之方式併入本文中。本申請案中對任何參考文獻的引用或認同並非承認這類參考文獻可用作本申請案之先前技術。參考隨附申請專利範圍會更好理解本發明之完整範疇。

圖1A-1C係描繪多種載體構築體結構之示意圖。

圖2係描繪來自瞬時轉染HepG2細胞之Serpin G1 ELISA結果。

圖3A及3B係描繪在實例2中之經投與包含有載體構築體ApoE/HCR-hAAT.hhI.SERPIN G1.hGH (HAE15)（圖3A）之AAV顆粒的小鼠血液中的人類C1EI水準。已舉例兩種不同AAV衣殼，AAV5型衣殼（大於90%與SEQ ID NO: 46一致）及狒狒衍生型AAV衣殼AAVBba49（大於90%與SEQ ID NO: 56一致）。圖3B係顯示個別動物/群組之Serpin G1 ELISA結果。小鼠係以AAV5 HAE15 2e14 vg/kg或AAVBba49 HAE15 2e14 vg/kg之劑量治療。

圖4A及4B係描繪在相同小鼠中之功能性人類C1EI水準。

圖5係描繪相同小鼠之體重。

圖6係描繪取自以AAV5-HAE15或Bba49-HAE15治療之小鼠的血漿中之丙胺酸轉胺酶(ALT)活性。

圖7A及7B係描繪以AAV5-HAE15或Bba49-HAE15治療（圖7A）之小鼠肝臟中的人類C1抑制劑的肝臟表现水準，以及肝細胞C1抑制劑(+)百分比(%)的測量結果（圖7B）。

圖8A及8B係分別描繪在肝臟中以qPCR測得之HAE15 DNA及RNA水準。

圖9A及9B係描繪在實例3中之經投與不同劑量的AAV5型顆粒之小鼠血液中之人類C1EI蛋白（圖9A）及功能性人類C1EI（圖9B）水準，所述AAV5型顆粒包含載體構築體ApoE/HCR-hAAT.hhI.SERPIN G1.hGH (HAE15)。小鼠係以四個不同劑量的AAV5-HAE15: 6e13 vg/kg、2e13 vg/kg、6e12 vg/kg、或2e12 vg/kg（第一組）治療。

圖10A及10B係分別描繪在實例3中以五個不同劑量的AAV5-HAE15: 2e14 vg/kg、6e13 vg/kg、2e13 vg/kg、6e12 vg/kg、或2e12 vg/kg（第二組）治療小鼠直到第52週，血漿中之總人類C1EI蛋白濃度(mg/mL)及血漿中之功能性人類C1EI蛋白濃度（國際單位IU/mL）。

圖11係描繪第二組直到第52週之ALT水準(IU/L)。

圖12係描繪第一組在第12週或第二組在第52週之肝臟中，經載體誘導的人類SERPING1 DNA量(每μg的DNA中之DNA複本數)。

圖13係描繪第一組（在第12週）及第二組（在第52週）以免疫組織化學染色得到之有C1EI陽性表現的肝細胞百分比。圖13亦包含與來自實例2中投與AAV5-HAE15之數據的比較目的（最左邊）。

圖14係描繪在以6e13 vg/kg、2e13 vg/kg或6e12 vg/kg AAV5-HAE15治療之HAE動物模型（同型合子的SERPING1-/-小鼠）中，在六週期間內血漿之功能性人類C1EI水準(IU/mL)。

圖15A、15B及15C係描繪以6e13 vg/kg、2e13 vg/kg、或6e12 vg/kg AAV5-HAE15治療之同型合子的SERPING1-/-小鼠，以OD600（光學密度/組織重量）評估分別累積在耳廓、小腸及腎臟之伊凡斯藍(Evan’s blue)染劑量。在此HAE動物模型中，偵測到的藍色染料量與血管通透性通透性相關聯。

Claims

一種重組型載體構築體，包含編碼可操作地連接至異源肝特異性轉錄調節區之功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)之核酸序列，及視情況存在之包含有SEQ ID NO: 1、10、11、12、13、59或60之核酸序列。
如請求項1之載體構築體，其中該哺乳動物為人類且該C1EI為人類C1EI。
如請求項1或2之載體構築體，其中該功能性C1EI包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項1或2之載體構築體，其中該肝特異性轉錄調節區包含一合成啟動子序列，該合成啟動子序列包含有部分的hAAT啟動子及HCR增強子/ApoE增強子。
如請求項4之載體構築體，其中該肝特異性轉錄調節區包含(a)與SEQ ID NO: 16至少90%一致之縮短ApoE增強子序列；(b)與SEQ ID NO: 3至少90%一致之α抗胰蛋白酶(hAAT)近端啟動子序列；及/或(c)選自由(i)與SEQ ID NO: 4至少90%一致之ApoE/HCR增強子組成之群中之一或多種增強子。
如請求項4之載體構築體，其中該肝特異性轉錄調節區包含(a)與SEQ ID NO: 17至少90%一致之α-微球蛋白增強子序列，及(b)與SEQ ID NO: 3至少90%一致之α抗胰蛋白酶(AAT)近端啟動子。
如請求項4之載體構築體，其中該肝特異性轉錄調節區包含與SEQ ID NO: 5至少80%一致之核苷酸序列。
如請求項1或2之載體構築體，其更包含聚腺苷酸化信號。
如請求項8之載體構築體，其中該聚腺苷酸化信號為人類生長激素聚腺苷酸化信號或其功能性片段。
如請求項1或2之載體構築體，其更包含內含子。
如請求項10之載體構築體，其中該內含子為複合hAAT/血球蛋白內含子序列。
如請求項10之載體構築體，其中該內含子包含與SEQ ID NO: 6或61-69中之任一者至少80%一致之核苷酸序列。
如請求項10之載體構築體，其中該編碼功能性C1酯酶抑制劑(C1EI)之核酸序列係包含內含子。
如請求項1或2之載體構築體，其更包含來自AAV2之AAV 5' ITR及/或AAV3' ITR。
如請求項1之載體構築體，其包含與SEQ ID NO: 9、20-36、57或58中之任一者至少80%一致之核苷酸序列。
2及15中任一項之載體構築體，其為大小約2.7 kb至約4 kb、或約4 kb至約5 kb之rAAV載體構築體。
一種rAAV顆粒，包含如請求項1至16中任一項之載體構築體及AAV衣殼。
如請求項17之rAAV顆粒，其包含AAV5型衣殼。
如請求項17之rAAV顆粒，其包含猴AAV衣殼。
如請求項17之rAAV顆粒，其狒狒衍生型AAV衣殼。
如請求項17-20中之任一項之rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含具有肝趨性之AAV衣殼。
一種產生rAAV顆粒之方法，包含以下步驟：(a)向容許AAV複製的細胞提供一或多種核酸構築體，包含：(i)重組型載體構築體，其包含(1)至少一AAV ITR，(2)異源肝特異性轉錄調節區，及(3)編碼功能性C1EI之核酸；(ii)編碼一或多種AAV Rep蛋白之核苷酸序列，該一或多種AAV Rep蛋白可操作地連接至能夠驅使Rep蛋白在細胞中表現之啟動子；以及(iii)編碼一或多種AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，該一或多種AAV衣殼蛋白可操作地連接至能夠驅使衣殼蛋白在細胞中表現之啟動子；(b)在允許表現Rep及衣殼蛋白之條件下培養細胞；及視情況(c)回收AAV顆粒。
如請求項22之方法，其中該細胞為昆蟲細胞。
如請求項22之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
如請求項22之方法，其中該細胞係與請求項1-16中之任一項之重組型載體構築體一起提供。
一種rAAV顆粒群，係由如請求項22-25中之任一項之方法所產生，其視情況藉由降低空的衣殼數量之步驟而富含包含有全長或幾乎全長的載體基因組之顆粒。
一種醫藥組合物，其包含在含有無菌的醫藥學上可接受的賦形劑之水性懸浮液中之如請求項1-16中之任一項之載體構築體、或如請求項17-21中之任一項之rAAV顆粒、或如請求項26之rAAV顆粒群。
一種如請求項1-16中之任一項之載體構築體、或如請求項17-21中之任一項之rAAV顆粒、或如請求項26之rAAV顆粒群、或如請求項27之醫藥組合物之用途，其係用以製備治療哺乳動物中之遺傳性血管性水腫、或治療或預防其症狀的藥物。
一種包含有載體構築體之rAAV顆粒之用途，其係用以製備治療哺乳動物中之遺傳性血管性水腫、或治療或預防其症狀的藥物，該載體構築體包含一核酸序列，該核酸序列編碼視情況可操作地連接至異源轉錄調節元件之功能性C1EI。
如請求項29之用途，其中該C1EI為包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸23-500至少95%一致之胺基酸序列的功能性人類C1EI。
如請求項28-30中之任一項之用途，其中該方法降低哺乳動物中之黏膜下或皮下水腫的頻率或嚴重性。
一種如請求項1至16中之任一項之載體構築體、或如請求項17-21中之任一項之rAAV顆粒、或如請求項26之rAAV顆粒群、或如請求項27之醫藥組合物之用途，其係用以製備在哺乳動物肝臟中表現C1EI之藥物，其中該藥物可有效增加該哺乳動物肝臟中之C1EI表现水準。
一種如請求項1至16中之任一項之載體構築體、或如請求項17-21中之任一項之rAAV顆粒、或如請求項26之rAAV顆粒群、或如請求項27之醫藥組合物之用途，其係用以製備增加哺乳動物血液中之功能性C1EI水準的藥物，其中該藥物可有效增加該哺乳動物血液中之功能性C1EI水準。
一種如請求項1至16中之任一項之載體構築體、或如請求項17-21中之任一項之rAAV顆粒、或如請求項26之rAAV顆粒群、或如請求項27之醫藥組合物之用途，其係用以製備治療哺乳動物中之功能性C1EI缺乏的藥物，其中該藥物可有效增加該哺乳動物血液中之功能性C1EI水準。
如請求項33或34之用途，其中該量係有效增加功能性C1EI水準至少約0.4 IU/ml，或至少約1 IU/ml或更高，或約16 mg/dL或更高。
如請求項28-30及32至34中任一項之用途，其中該rAAV顆粒或載體構築體係經靜脈投與。
如請求項28-30及32至34中任一項之用途，其中該哺乳動物係同時投與皮質類固醇療法與載體構築體或rAAV顆粒或醫藥組合物。
如請求項28-30及32至34中任一項之用途，其中該哺乳動物係經投與1 x 10¹² 至約1 x 10¹⁵ vg/kg劑量範圍之rAAV顆粒。