[go: up one dir, main page]

TW201026328A - Antibodies against human angiopoietin 2 - Google Patents

Antibodies against human angiopoietin 2 Download PDF

Info

Publication number
TW201026328A
TW201026328A TW098142952A TW98142952A TW201026328A TW 201026328 A TW201026328 A TW 201026328A TW 098142952 A TW098142952 A TW 098142952A TW 98142952 A TW98142952 A TW 98142952A TW 201026328 A TW201026328 A TW 201026328A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
ser
gly
antibody
leu
Prior art date
Application number
TW098142952A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI396549B (zh
Inventor
Ulrich Brinkmann
Remko Albert Griep
Klaus Kaluza
Anita Kavlie
Christian Klein
Joerg Thomas Regula
Werner Scheuer
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40585738&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201026328(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of TW201026328A publication Critical patent/TW201026328A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI396549B publication Critical patent/TWI396549B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

201026328 * 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種抗人類血管生成素2抗體（抗ANG·2抗 體）、其製造方法、含有該等抗體之醫藥組合物及其用 ** 途。 . 【先前技術】 血管生成涉及於多種病症之發病機制中’包括實體腫 瘤、眼内新生血管症候群（諸如增生性視網膜病或年齡相 ® 關性黃斑變性（AMD))、類風濕性關節炎及牛皮癬 (Folkman，J.等人，J· Biol. Chem· 267 (1992) 10931- 10934 ; Klagsbrun，Μ.等人，Annu· Rev· Physiol. 53 (1991) 217-239 ;及 Garner, A·，Vascular diseases, Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A.及
Klintworth，G_ K.(編），第 2版，Marcel Dekker, New York (1994)，第1625_1710頁）。在實體腫瘤之情況下，新血管 • 生成使腫瘤細胞相較於正常細胞，獲取生長優勢及增殖自 主性。因此，觀察到腫瘤切片之微血管密度與患乳癌以及 若干其他腫瘤之患者存活率之間存在相關性（Weidner，N. . 等人，N. Engl. J. Med. 324 (1991) 1-8 ; Horak，E.R_等人， Lancet 340 (1992) 1120-1124 ;及 Macchiarini, P.等人，
Lancet 340 (1992) 145-146)。 ANG-2及抗ANG-2抗體 人類血管生成素-2(ANG-2)(或者縮寫為ANGPT2或 ANG2)(SEQ ID Nck 107)描述於 Maisonpierre，P_c·等人， 145048.doc 201026328
Science 277 (1997) 55-60 ;及 Cheung，A.Η.等人，Genomics 48 (1998) 389-91中。發現血管生成素-1及血管生成素-2(ANG-1(SEQ ID No: 108)及 ANG-2(SEQ ID No: 107))為在 血管内皮内選擇性表現之酪胺酸激酶家族Tie之配位鱧。 Yancopoulos, G.D.等人，Nature 407 (2000) 242-48。血管生 成素家族現有4個確定的成員。血管生成素-3及血管生成 素-4(Ang-3及Ang-4)可代表同一基因座在小鼠及人類中差 異很大之對應物。Kim，I·等人，？£88 1^1，443 (1999) 353-56 ; Kim，I.等人，J Biol Chem 274 (1999) 26523-28。ANG-1及ANG-2最初在組織培養實驗中分別被鑑別為促效劑及 拮抗劑（關於ANG-1，參看：Davies, S.等人，Cell, 87 (1996) 1161-1169 ;及關於ANG-2，參看：Maisonpierre， P.C·等人，Science 277 (1997) 5 5-60)。所有已知之血管生 成素均主要結合Tie2，且Ang-Ι與Ang-2均以3 nM(Kd)之親 和力結合Tie2。Maisonpierre，P.C.等人，Science 277 (1997) 55_6〇。Ang-1顯示幫助EC存活並促進内皮完整性（Davis, S.等人，Cell，87 (1996) 1161-1169 ; Kwak，H.J.等人，FEBS Lett 448 (1999) 249-53 ; Suri，C.等人，Science 282 (1998) 468-71 ; Thurston，G.等人，Science 286 (1999) 2511-14; Thurston, G.等人，Nat· Med. 6 (2000) 460-63)，而 ANG-2 具 有相反作用且在缺乏存活因子VEGF或鹼性纖維母細胞生 長因子下促進血管失去穩定性及消退。Maisonpierre，P.C. 等人，Science 277 (1997) 55-60。然而，多項有關 ANG-2功 能之研究已提出一種更為複雜之情況。ANG-2可能為血管 145048.doc 201026328 重塑之複雜調節因子，其在血管萌芽及血管消退中起作 用。表現分析揭示，ANG-2連同VEGF—起在成人新生血 管萌芽環境中迅速被誘發，而ANG-2在血管消退環境中在 缺乏VEGF下被誘發，支持了 ANG-2之該等作用。Holash， ’ J.等人，Science 284 (1999) 1994-98 ; Holash，J_ 等人， * Oncogene 18 (1999) 5356-62。與環境依賴性作用一致， ANG-2與經Ang-Ι活化之相同内皮細胞特異性受體Tie-2特 異性結合，但對其活化具有環境依賴性作用。 參
Maisonpierre，P.C.等人，Science 277 (1997) 55-60。 角膜血管生成檢定顯示，ANG-1與ANG-2具有類似作 用，均與VEGF協同作用，促進新血管生長。Asahara, T.等 人，Circ. Res.，83, (1998) 23 3-40。觀察到在活體外高濃度 ANG-2亦可促進血管生成，此提出存在劑量依賴性内皮反 應之可能性。Kim, I.等人，Oncogene 19 (2000) 4549-52。 在血清剝奪（serum deprivation)細胞凋亡期間，高濃度 _ ANG-2藉由經PI-3激酶及Akt路徑活化Tie2來充當内皮細胞 之細胞〉周亡存活因子。Kim, I.等人，Oncogene 19 (2000) 4549-52 。 - 其他活體外實驗表明，在持續暴露期間，ANG-2之作用 . 可能由充當Tie2之拮抗劑逐漸轉變為充當其促效劑，且在 隨後時間點，其可能直接促進血管形成及新血管穩定。 Teichert-Kuliszewska, K.等人，Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70。此外，若在血纖維蛋白凝膠上培養EC，則亦觀察 到Tie2經ANG-2活化，可能暗示ANG-2之作用可視EC之分 145048.doc 201026328 化狀態而定。Teichert-Kuliszewska，K.等人，Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70。在三維膠原蛋白凝膠中培養之微 血管EC中，ANG-2亦可誘導Tie2活化，且促進類毛細管結 構形成。Mochizuki，Y.等人，J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83。使用三維類球體共培養（3-D spheroidal coculture)作為 活體外血管成熟之模型表明，EC與間質細胞之間的直接接 觸消除了對VEGF之反應，而VEGF及ANG-2之存在誘發萌 芽。Korff, T·等人，Faseb J. 15 (2001) 447-57。Etoh, T等人 證明，在組成性表現Tie2之EC中，ANG-2在VEGF存在下 高度上調MMP-1、MMP-9及u-PA之表現。Etoh, T.等人， Cancer Res. 61 (2001) 2145-53。Lobov，I.B.等人利用活體 内曈孔膜模型顯示，ANG-2在内源性VEGF存在下促進毛 細管直徑迅速增加、基膜重塑、内皮細胞增殖及遷移，且 刺激新血管萌芽。Lobov，I.B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci· USA 99 (2002) 11205-10。相比之下，在缺乏内源性VEGF 下，ANG-2促進内皮細胞死亡及jk管消退。Lobov，I.B.等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10。類似 地，Vajkoczy，P.等人利用活體内腫瘤模型證明，多細胞聚 集體經由宿主及腫瘤内皮同時表現VEGFR-2及ANG-2而引 起新生血管萌芽，從而開啟血管生長。Vajkoczy, P.等人， J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85。此模型說明正在生長之 腫瘤中所建立之微血管結構特徵為連續不斷之重塑，推斷 由VEGF及ANG-2之表現所介導。Vajkoczy，M.A.等人，J. Clin. Invest. 09 (2002) 777-85。 145048.doc -6- 201026328
Tie-2及血管生成素-1之基因剔除小鼠研究顯示類似表 型，且表明血管生成素-1刺激之Tie-2磷酸化介導正在發育 之血管的重塑及穩定化，促進血管生成期間血管成熟以及 内皮細胞支持之細胞黏附之維持（Dumont, D.J.等人，Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909 ； Sato, T.N., Nature, * 376 (1995) 70-74 ; Thurston, G.等人，Nature Medicine 6 (2000) 460-463)。認為血管生成素-1之作用在廣泛且組成 性表現金管生成素-1之成人中得以保存（Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50 ; Zagzag, D.等人，Exp
Neurology, 159 (1999) 391-400)。相比之下，血管生成素-2之表現主要偈限於血管重塑位點，在該等位點中認為血 管生成素-2之表現阻礙血管生成素-1之組成性穩定或成熟 功能，致使血管回復至且保持在可能更易對萌芽信號起反 應之可塑狀態（Hanahan，D·，1997 ; Holash，J·等人， Orzcogerze 18 (1999) 5356-62 ； Maisonpierre, P.C., ⑩ 1997)。關於在病理性血管生成中血管生成素-2之表現的研 究發現多種腫瘤類型顯示血管中企管生成素-2表現 (Maisonpierre, P.C.等人，Science 277 (1997) 55-60)。在小 - 鼠異種移植模型中，功能研究表明血管生成素-2涉及於腫 . 瘤血管生成中，且將血管生成素-2之過度表現與腫瘤生長 增加相關聯（Ahmad, S.A.等人，Cancer Res.，61 (2001)1255-1259)。其他研究已將血管生成素-2之過度表現與腫瘤高血 管性相關聯（Etoh，T.等人，Cancer Res. 61 (2001) 2145-53 ; Tanaka, F.等人，Cancer Res. 62 (2002) 7124-29)。 145048.doc 201026328
近年來’已提出血管生成素-1 '血管生成素_2及/或Tie_ 2作為可能之抗癌治療劑。舉例而言，us 6,166,185、US 5,650,490及US 5,814,464每一者均揭示抗Tie-2配位體及受 體抗體。使用可溶性Tie-2之研究據報導會減少齧齒動物中 腫瘤之數量及尺寸（Lin，P, 1997 ; Lin，P., 1998)。 Siemester，G.等人（1999)產生表現Tie-2之細胞外域之人類 黑素瘤細胞株，將該等細胞株注射至裸小鼠中，且報導可 溶性Tie-2會使腫瘤生長及腫瘤血管生成受到顯著抑制。已 知血管生成素_1與血官生成素_2均結合Tie _2，但自此等研 究中尚不清楚血管生成素-1、血管生成素·2抑或Tie_2為抗 癌療法之關注標靶。然而，吾人認為有效抗血管生成素_2 療法有助於治療進程視異常血管生成而定之疾病（諸如癌 症），其中阻斷該過程可預防疾病發展（F〇lkman, j，Nature Medicine. 1，（1995) 27-31)。 此外，一些團體已報導使用結合血管生成素_2之抗體及 肽。例如參看 US 6,166,185 及 US 2003/10124129、WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134 或 US 2006/ 0122370。 關於血管生成素·2病灶性表現之影響的研究顯示，拮抗 血管生成素-l/Tie-2信號使緊密之血管結構鬆散，從而使 EC暴露於來自血管生成誘導因子（例如VEGF)之活化信號 (Hanahan，1997)。此由血管生成素·丨受抑制所引起之促血 管生成作用表明抗血管生成素-i療法並非有效抗癌治療。 ANG-2係在發育期間於發生血管重塑之位點表現。 145048.doc 201026328
Maisonpierre, P.C.等人，Science 277 (1997) 55-60。在成年 個體中，ANG-2之表現限於血管重塑位點以及高度血管化 之腫瘤中，包括神經膠質瘤（Osada，H.等人，Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09; Koga，K.等人，Cancer Res. 61 (2001) * 6248-54)、肝細胞癌（Tanaka，S.等人，J. Clin. Invest· 103 * (1999) 341-45)、胃癌（Etoh，T.等人，Cancer Res. 61 (2001) 2145-53 ; Lee, J.H·等人，Int. J· Oncol. 18 (2001) 355-61)、 甲狀腺腫瘤（Bunone, G.等人，Am J Pathol 155 (1999) 1967- ❹ 76)、非小細胞肺癌（Wong, Μ·Ρ·等人，Lung Cancer 29 (2000) 11-22)以及結腸癌（Ahmad, S.A·等人，Cancer 92 (2001) 1138-43)及前列腺癌（Wurmbach，J.H.等人， Anti cancer Res. 20 (2000) 5217-20)。發現一些腫瘤細胞表 現 ANG-2。舉例而言，Tanaka，S.等人，J. Clin. Invest· 103 (1999) 34卜45在12份人類肝細胞癌（HCC)標本中之10份中 偵測到ANG-2 mRNA。Ellis之團隊報導ANG-2在腫瘤上皮 ❹ 中廣泛表現。Ahmad, S.A.等人，Cancer 92 (2001) 1138-43。其他研究人員亦報導類似發現。Chen，L·等人，】· Tongji Med· Univ. 21 (2001) 228-30, 235 (2001)。藉由偵測 * 存檔之人類乳癌標本中ANG-2 mRNA之含量’ Sfilogoi，C 等人，Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74報導 ANG-2 mRNA與 輔助性淋巴結侵入、短暫無病期及不良總體存活率顯著相 關。Tanaka, F.等人，Cancer Res. 62 (2〇〇2) 7124-29觀察總 共236名分別處於病理期第I期至第IIIA期之非小細胞肺癌 (NSCLC)患者。使用免疫組織化學’其發現16.9%之 145048.doc -9- 201026328 NSCLC患者為ANG-2陽性。ANG-2陽性腫瘤之微血管密度 顯著高於ANG-2陰性。僅當VEGF表現高時見到ANG-2對 血管生成之此類作用。此外，ANG-2之陽性表現為預測不 良術後存活率之重要因素。Tanaka, F.等人，Cancer Res. 62 (2002) 7124-29。然而，其發現Ang-1表現與微血管密度之 間並無顯著關聯。Tanaka, F.等人，Cancer Res. 62 (2002) 7124-29。此等結果表明，ANG-2為患若干類型癌症之患 者不良預後之指示。 近來，Yancopoulos之團隊使用ANG-2基因剔除小鼠模 型，報導ANG-2為出生後血管生成所需。Gale，N.W.等人， Dev. Cell 3 (2002) 411-23。其顯示在ANG-2基因剔除小鼠 中未出現眼中玻璃體血管結構發育漸進式消退，且視網膜 血管無法由視網膜中央動脈萌芽。Gale, N. W.等人，〇6乂· Cell 3 (2002) 411-23。其亦發現ANG-2缺失會導致淋巴管 結構之定型（patterning)及功能極其不足。Gale, N.W.等人， Dev. Cell 3 (2002) 411-23。利用Ang-Ι進行遺傳拯救可醫 治淋巴管新生之缺乏，但無法醫治血管生成之缺乏。Gale, N.W·等人，Dev. Cell 3 (2002) 411-23。
Peters及其同事報導在小鼠模型中，當可溶性Tie2以重 組蛋白形式遞送或於病毒表現載體中遞送時，其抑制鼠類 乳腺癌及黑素瘤之活體内生長。Lin, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34 ; Lin，P.等人，J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78。經此處理之腫瘤組織中的血 管密度極大地降低。此外，在經腫瘤細胞改良性培養基刺 145048.doc •10· 201026328 激之大鼠角膜中，可溶性Tie2阻止血管生成。Lin, P.等人， J. Clin. Invest· 100 (1997) 2072-78。另外，Isner及其小組 證明，將ANG-2添加至veGF中相較於單獨VEGF，促進明 顯更長且更廣之新血·管分布（neovascularity)。Asahara，T. 等人，Circ. Res” 83 (1998) 233-40。過量可溶性 Tie2 受體 • 阻礙ANG_2對VEGF誘導之新血管生成之調節。Asahara, T. 等人，Circ. Res·，83，（1998) 233-40。Siemeister，G·等人， Caneer Res. 59 (1999) 3185-91利用裸小鼠異種移植物顯 9 ^ 不’在異種移植物中Fh-1或Tie2之細胞外配位體結合域之 過度表現會引起路徑顯著受到抑制，無法由對方來補償， 表明VEGF受體路徑及丁丨62路徑應視為對於活體内血管生 成過程而5必不可少之兩個獨立介體。Siemeister，G.等人， Cancer Res. 59 (1999) 3185_91。這可由 white, RR 等人，
Proc. Natl· Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33之更新公開 案所證實。在其研究中，證明在大鼠角膜微囊袋血管生成 ❹ 模型中，與ANG-2特異性結合並對其抑制之抗核酸_rna 適體顯著抑制bFGF所誘導之新血管生成。 【發明内容】 本發明包含一種與人類血管生成素_2(ANG_2)特異性結 • 合之抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 1 ' SEQ N〇 9、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID N〇. 33 SEQ ID NO: 41 或 SEQ ID N〇: 49 之 CDR3g作為重鏈可變 域CDR3區。 較佳地，該抗體之特徵在於 145048.doc -11 - 201026328 a) 重鏈可變域包含：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 41 或 SEQ ID NO: 49之 CDR3 區；SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 42或 SEQ ID NO: 50之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11 ' SEQ ID NO: 19 ' SEQ ID NO: 27 ' SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 43或 SEQ ID NO: 51之CDR1 區，及 b) 輕鏈可變域包含：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 44 或 SEQ ID NO: 52之 CDR3 區；SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 45 或 SEQ ID NO: 53 之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 46 或 SEQ ID NO: 54之 CDR1 區。 較佳地，該抗體之特徵在於包含： a) SEQ ID NO: 7 ' SEQ ID NO: 15 ' SEQ ID NO: 23 > SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 47或 SEQ ID NO: 55之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 48 或 SEQ ID NO: 56之輕鏈可變域。 較佳地，該抗體之特徵在於該抗體不與血管生成素- 145048.doc -12- 201026328 l(ANG-l)特異性結合。 本發明之另一實施例為一# h a ^ 種包含本發明抗體之醫樂組合 物。 本發明之另一實施例氣 J馬一種本發明抗體用於製造醫藥組 合物之用途。 本發明之另一實施例氣 ^ ^馬一種本發明抗體用於預防癌轉移 之用途。 _ 本發明之另一實施例氣―v φ 1 j為種本發明抗體用於治療癌症之 用途。 本發明之另-實施例為__種本發明抗體用於治療血管疾 病之用途。 本發明之另-實施例為-種本發明抗體用於治療視網膜 病之用途。 本發明之另一實施例為一種編碼本發明抗體之重鏈可變 域及/或輕鏈可變域的核酸。 Φ 本發明另外提供含有本發明核酸之表現載體，其能夠在 含有該等載體之原核或真核宿主細胞中表現該核酸以重組 產生此類抗體。 本發明另外包含一種包含本發明載體之原核或真核宿主 細胞。 本發明另外包含一種產生本發明之重組人類或人類化抗 體的方法，其特徵在於在原核或真核宿主細胞中表現本發 明核酸’及自該細胞或細胞培養物上清液中回收該抗體。 本發明另外包含可藉由此類重組方法獲得之抗體。 145048.doc •13· 201026328 本發明抗體特別適用於預防繼發性腫瘤/癌轉移或治療 血管疾病，諸如視網膜病。 【實施方式】 本發明包含一種與人類血管生成素-2(ANG-2)特異性結 合之抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 49之CDR3區作為重鏈可變 域CDR3區。 在本發明之一實施例中，該抗體之特徵在於 a) 重鏈可變域包含：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 41 或 SEQ ID NO: 49之 CDR3 區；SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 50之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 51 之 CDR1區，及 b) 輕鏈可變域包含：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 44 或 SEQ ID NO: 52之 CDR3 區；SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 45 或 SEQ ID NO: 53 之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 145048.doc •14- 201026328 38、SEQ ID NO: 46或 SEQ ID NO: 54之 CDR1 區。 較佳地，該抗體之特徵在於包含： a) SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 47或 SEQ ID NO: 55之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 48或 SEQ ID NO: 56之輕鍵可變域。 本發明之另一實施例為一種與人類ANG-2特異性結合之 抗體，其特徵在於，該抗體不與血管生成素l(ANG-l)特異 性結合。與人類ANG-2特異性結合但不與人類ANG-1特異 性結合之典型抗體為例如Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、 Ang2i_LC06、Ang2i_LC07，或與 Ang2s_R3_LC03、 Ang2s_LC09、Ang2i—LC06、Ang2i_LC07、Ang2i_LC10結 合同一抗原決定基之抗體，較佳為與Ang2i_LC06結合同一 抗原決定基之抗體。因此，在本發明之一實施例中，與人 類血管生成素-2(ANG-2)特異性結合但不與人類ANG-1特 異性結合之抗體與 Ang2s_R3_LC03、Ang2sJLC09、 Ang2i_LC06、Ang2i一LC07、Ang2i_LC10 結合同一抗原決定 基，較佳與Ang2i_LC06結合同一抗原決定基。該等與 ANG-2特異性結合但不與ANG-1特異性結合之抗體相較於 ANG-2及ANG-1特異性抗體，可具有改善之性質，諸如功 效、較低毒性、藥物動力學性質。 因此，在本發明之一實施例中，與人類血管生成素· 145048.doc •15· 201026328 2(ANG-2)特異性結合但不與人類ANG-1特異性結合之抗體 的特徵在於 a) 重鏈可變域包含：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33 或 SEQ ID NO: 49之 CDR3 區；SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 34 或 SEQ ID NO: 50之 CDR2 區；及SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 35 或 SEQ ID NO: 51 之 CDR1區，及 b) 輕鏈可變域包含：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 36或 SEQ ID NO: 52之 CDR3 區；SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 53 之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 38 或 SEQ ID NO: 54之 CDR1 區。 較佳地，該與人類血管生成素-2(ANG-2)特異性結合但 不與人類ANG-1特異性結合之抗體的特徵在於包含： a) SEQ ID NO: 7 ' SEQ ID NO: 15 ' SEQ ID NO: 31 ' SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 55之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 56之輕鏈可變域。 在一實施例中，該本發明抗體之特徵在於 a)重鏈可變域包含：SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 9之 CDR3 區；SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 10 之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 11之 CDR1 區，及 145048.doc -16- 201026328 b)輕鏈可變域包含：SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 12之 CDR3 區；SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 13 之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 6或 SEQ ID NO: 14之 CDR1區。 在一實施例中，該本發明抗體之特徵在於包含： a) SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 15之重鏈可變域，及 • b) SEQ ID NO: 8 或 SEQ ID NO: 16 之輕鏈可變域。 在一實施例中，該本發明抗體之特徵在於 a) 重鏈可變域包含SEQ ID NO: 1之CDR3區、SEQ ID NO: 2之 CDR2 區及 SEQ ID NO: 3之 CDR1 區，及 b) 輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 4之CDR3區、SEQ ID NO: 5之 CDR2 區及 SEQ ID NO: 6之 CDR1 區。 在一實施例中，該本發明抗體之特徵在於包含： a) SEQ ID NO: 7之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 8之輕鏈可變域。 在一實施例中，該本發明抗體之特徵在於
φ a)重鏈可變域包含SEQ ID NO: 17之CDR3區、SEQ ID NO:18之CDR2區及SEQIDNO:19之CDRl區，及 b)輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 20之CDR3區、SEQ ID NO:21iCDR2g&SEQIDNO:22iCDRlg。 . 在一實施例中’該本發明抗體之特徵在於包含： a) SEQ ID NO: 23之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 24之輕鏈可變域。 較佳地，本發明抗體之特徵在於該抗體屬於人類IgG 1亞 類或人類IgG4亞類。 145048.doc •17· 201026328 術語抗體」涵蓋各種抗體結構形式，包括（但不限於） 全抗體及抗體片斷。本發明抗體較佳為人類化抗體、嵌合 抗體或經另外基因工程改造之抗體，只要保持本發明之特 徵性質即可。 「抗體片段」包含全長抗體之一部分，較佳為其可變 域’或至少包含其抗原結合位點。抗體片段之實例包括雙 功月抗體、單鍵抗體分子（scfv或SCFab)及由抗體片段形成 之多特異性抗體（例如雙特異性抗體）。SCFV抗體例如描述 於 Houston，J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88 中。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有Vh結構域之特 徵’即能夠與VL結構域組裝在一起，或具有與ANG-2結合 之VL結構域之特徵，即能夠與vH結構域組裝在一起，形成 功能性抗原結合位點且由此提供特性。可使用例如以下使 scFv穩定：a)二硫化物穩定（例如參看w〇 94/029350， Rajagopal，V.等人，Prot. Engin. (1997) 1453-59 ; Kobayashi，Η·等人，Nuclear Medicine & Biology,第 25 卷， (1998) 387-393 ;或 Schmidt，M.等人，Oncogene (1999) 18 1711-1721)或b)穩定構架（例如參看例如w〇 2007/109254特 疋穩疋化構架之特定突變，例如參看US7,258,985，Furr er， F.等人，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (2009),第 771-778 頁，或 Ottiger, M.等人，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci· 50 (2009)，第 779-786 頁 如本文所使用，術語「單株抗體」或「單株抗體組合 物」係指具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。 145048.doc -18· 201026328 術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變 區（亦即結合區）及源、自-種不同來源或物種之值定區之至 少一部分的抗體，通常由重組DNA技術製備。包含鼠類可 變區及人類恆定區之嵌合抗體為較佳。本發明所涵蓋之 • 「嵌合抗體」之其他較佳形式為Μ區已自原始抗體修飾 • 或改變以產生本發明之特性（尤其關於clq結合及/或卜受 體（FcR)結合）者。該等嵌合抗體亦稱為「類別轉換抗體」。 φ 嵌合抗體為包含編碼免疫球蛋白可變區之DNA區段及編碼 免疫球蛋白恆定區之DNA區段的免疫球蛋白基因之表現產 物。產生嵌合抗體之方法包含此項技術中熟知之習知重組 DNA及基因轉染技術。例如參看M〇rris〇n，s l等人，p⑺c
Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ； US 5,202,238 及 US 5,204,244。 術語「人類化抗體」係指構架或「互補決定區」（CDR) 經修飾以包含特異性與親本免疫球蛋白不同之免疫球蛋白 • CDR的抗體。在一較佳實施例中，將鼠類cDR移植至人類 抗體之構架區中’製得「人類化抗體」。例如參看 Rlechnlann’ L•等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及 Neuberger, M.S.等人，Nature 314 (1985) 268-270。尤其較 佳之CDR對應於顯示識別上文針對嵌合抗體所述之抗原之 序列的CDR。本發明所涵蓋之「人類化抗體」之其他較佳 形式為恒定區已自原始抗體另外修飾或改變以產生本發明 之特性（尤其關於Clq結合及/或以受體（FcR)結合）者。 如本文所使用，術語「人類抗體」意欲包括具有源自人 145048.doc •19- 201026328 類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。人類 抗體在當前技術中為熟知之（van Dijk，M.A.及van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) ° 亦可於轉殖基因動物（例如小鼠）中產生人類抗體，該等轉 殖基因動物能夠在免疫後缺乏内源性免疫球蛋白產生下產 生人類抗體完全譜系或選擇譜系。將人類生殖系免疫球蛋 白基因陣列轉移至此生殖系突變小鼠中將導致在抗原攻毒 後產生人類抗體（例如參看Jakobovits，A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，A.等人， Nature 362 (1993) 255-258 ; Brueggemann，M.等人，Year
Immunol. 7 (1993) 33-40)。亦可於噬菌體呈現文庫中產生 人類抗體（Hoogenboom，H.R.及 Winter，G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks, J.D.等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人 類單株抗體（Cole，S.P.C.等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Liss，A.R·，（1985) 77-96 ;及 Boerner, P.等 人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如本發明針對嵌合抗 體及人類化抗體所提及’如本文所使用，術語「人類抗 體」亦包含例如藉由「類別轉換」，亦即改變^部分或使 其突變（例如IgGl至IgG4及/或IgGl/IgG4突變），對恆定區 進行修飾以產生本發明之特性（尤其關於Clq結合及/或FcR 結合）的該等抗體。 如本文所使用，術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重 組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如自 145048.doc •20- 201026328 轉殖人類免疫球蛋白基因之宿主細胞（諸如NS0或CHO細 胞）或動物（例如小鼠）分離之抗體，或使用轉染至宿主細胞 中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有重 排形式之可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已經活 體内體細胞超突變。因此’重組抗體之VH及νχ區之胺基 酸序列儘管源自且相關於人類生殖系VH及VL序列，但可 能並不天然存在於活體内人類抗體生殖系譜系中之序列。 φ 如本文所使用，「可變域」（輕鏈可變域（VL)、重鏈可變 域（Vh))表示直接涉及抗體與抗原結合的成對輕鏈及重鏈域 之各域。輕鏈及重鏈可變域具有相同之一般結構，且各域 包含四個構架（FR)區’該等構架區序列普遍保守，由三個 「高變區」（或互補決定區，CDRs)連接。該等構架區採用 β片構形’且CDRs可形成連接β片結構之環。各鏈中之 CDRs由該等構架區保持三維結構且與其他鏈之CDRs 一起 形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈CDR3區對本發明抗 Φ 體之結合特異性/親和力具有特別重要之作用，且因此提 供本發明之另一目的。 術δ吾抗體之抗原結合部分」，當在本文_使用時，係 指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。抗體之抗原結合部 分包含「互補決定區」或「CDRS」之胺基酸殘基。「構 架」或「FR」區為本文所定義之高變區殘基以外的可變域 區。因此’抗體之輕鏈及重鏈可變域自N端至C端包含結 構域 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。重鏈 CDR3尤其為對抗原結合貢獻最大且確定抗體特性之區 145048.doc •21 - 201026328 域。CDR及 FR 區係根據 Kabat，E_A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 之標準定義及/或「高變環」之殘基確定。 如本文所使用，術語「核酸」或「核酸分子」意欲包括 DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳 為雙鏈DNA。 如本申請案内所使用，術語「胺基酸」表示天然存在之 羧基ex-胺基酸之群，包含丙胺酸（三字碼：ala; —字碼： A)、精胺酸（arg，R)、天冬醯胺（asn，N)、天冬胺酸（asp， D) 、半胱胺酸（cys，C)、麩胺醯胺（gin，Q)、麩胺酸（glu， E) 、甘胺酸（gly，G)、組胺酸（his，Η)、異白胺酸（ile， I)、白胺酸（leu，L)、離胺酸（lys ’ K)、甲硫胺酸（met ’ Μ)、苯丙胺酸（phe，F)、脯胺酸（pro，P)、絲胺酸（ser， S)、蘇胺酸（thr，T)、色胺酸（trp，W)、酪胺酸（tyr，Y)及 绳胺酸（val，V)。 當一核酸與另一核酸呈功能關係時，其為「可操作性連 接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為 參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA可操作性連 接；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其與該序 列可操作性連接；或若核糖體結合位點經定位以促進轉 譯，則其與編碼序列可操作性連接。一般而言，「可操作 性連接」意謂所連接之DNA序列共線，且在分泌前導序列 之情況下，其為鄰接的且在閱讀框架中。然而，增強子不 145048.doc -22- 201026328 必為鄰接的。連接藉由在適宜限制性位點處接合來實現。 若該等位點不存在，則根據習知做法使用合成寡核苷酸接 附子（adaptor)或連接子。 如本文所使用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養 物」可互換使用且所有該等名稱均包括子代。因此，詞語 「轉型體」及「轉型細胞」包括原代受檢細胞及源自其之 培養物，不考慮轉移次數。亦應瞭解由於存在有意或無意 突變，所以所有子代之DNA含量可能並不準確一致。本發 明包括具有與針對原始轉型細胞所篩檢相同之功能或生物 活性的變異子代。 如本文所使用，術語「結合」或「特異性結合」係指在 活體外檢定中抗體與抗原（ANG-2)抗原決定基之結合，較 佳為在電黎_共振檢定（BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)(實例3)中抗體與經純化之野生型ANG-2抗原的結 合。結合親和力由術語ka(抗體/抗原複合物中抗體之缔合 速率常數）、kD(解離常數）及KD(kD/ka)來定義。結合或特異 性結合意謂具有1〇_8 mol/1或低於10·8 mol/1，較佳10_9 Μ至 10_13 mol/1之結合親和力（KD)。 可由 BIAcore檢定（GE-Healthcare Uppsala，Sweden)研究 抗體與FcyRIII之結合。結合親和力由術語ka(抗體/抗原複 合物中抗體之締合速率常數）、kD(解離常數）及KD(kD/ka)來 定義。 如本文所使用，術語「不與ANG-1結合」或「不與 ANG-1特異性結合」表示在活體外結合ANG-1之ELISA檢 145048.doc -23- 201026328 定中，抗體之EC50值大於8000 ng/ml(根據實例2)。 術語「抗原決定基」包括任何能夠與抗體特異性結合之 多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基包括諸如胺基 酸、糖側鍵、填醯基或績酿基之分子之化學活性表面基 團，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及或 特定電荷特徵。抗原決定基為抗原結合之抗體區域。 抗體之「Fc部分」不直接涉及抗體與抗原之結合’但展 現各種效應功能。「抗體之Fc部分」為熟習此項技術者熟 知之術語且根據抗體之番木瓜蛋白酶裂解來定義。視重鍵 恆定區之胺基酸序列而定，抗體或免疫球蛋白可分為以下 類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中有若干 類可進一步分為亞類（同型），例如IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4、IgAl及IgA2。根據重鏈恆定區，不同類別之免疫球 蛋白可分別稱為α、δ、ε、γ及μ。基於補體活化、Clq結合 及Fc受體結合，抗體之Fc部分直接涉及ADCC(抗體依賴性 細胞介導之細胞毒性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）。補體 活化（CDC)由補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類之Fc部分 的結合引發。雖然抗體對補體系統之影響視特定條件而 定，但與C1 q之結合由Fc部分中確定之結合位點引起。該 等結合位點為當前技術所知，且例如描述於以下中： Boakle，R.J.等人，Nature 282 (1975) 742-743 ; Lukas, T.J. 等人，J. Immunol. 127 (198 1) 2555-2560 ; Brunhouse，R.及 Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ； Burton, D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E.等 145048.doc -24- 201026328 人，Mol. Immunol. 3 7 (2000) 995-1004 ; Idusogie，E.E.等 人，J. Immunol.164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M.等人，】· Virology 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan，A_ 等人，
Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 0307434 ° 該等結合位 點為例如 L234、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P331及P329(根據Kabat之EU索引編號，參看下 文）。亞類IgGl、IgG2及IgG3之抗體通常顯示補體活化以 及Clq及C3結合，而IgG4不活化補體系統且不結合Clq及 本發明抗體較佳包含人類來源之Fc部分’其為亞類IgGl 之人類抗體的Fc部分。 本發明抗體之特徵在於恆定鏈為人類來源。該等恆定鏈 為當前技術中所熟知，且例如由Kabat，E.A.所描述（例如參 看 Johnson, G.及 Wu，T.T.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)。舉例而言，適用人類重鏈恆定區包含SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。舉例而言’適用 人類輕鏈恆定區包含SEQ ID NO: 59之κ輕鏈恒定區之胺基 酸序列，或SEQ ID NO: 60之λ輕鏈恆定區之胺基酸序列。 如本申請案内所使用，術語「恆定區」表示抗體中除可 變區外之結構域的總和。恆定區不直接涉及抗原結合’但 展現各種效應功能。視重鏈恆定區之胺基酸序列而定’抗 體可分為以下類別：IgA、IgD、Ig£、〗gG及IgM，且該等 類別中有若干類可進一步分為亞類’諸如IgG1、IgG2、 IgG3及IgG4、IgAl及IgA2。對應於不同抗體類別之重鏈恆 145048.doc -25- 201026328 定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。所有5種抗體類別中可存在 之輕鏈恆定區稱為κ及λ。 如本申請案中所使用，術語「源自人類來源之恆定區」 表示亞類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之重鏈恆定 區及/或κ輕鏈怪定區。該等怪定區為當前技術中所熟知， 且例如描述由Kabat，E.A.所描述（例如參看Johnson，G.及 Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 » Kabat, Ε·Α.等人，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788) 〇 雖然IgG4亞類之抗體顯示減少之Fc受體（FcyRIIIa：)結 合，但其他IgG亞類之抗體顯示高度結合。然而， Pro23 8、Asp265、Asp270、Asn297(喪失 Fc碳水化合物）、 Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、 Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及 His435 為若 經改變則亦會減少Fc受體結合之殘基（Shields，R.L等人， J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Lund，J 等人， FASEB J. 9 (1995) 115-119 ; Morgan, A等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 0 307 434)。 在一實施例中，本發明抗體具有比IgGl抗體低之FcR結 合，且關於FcR結合，單特異性二價親本抗體屬於IgG4亞 類或 IgGl 或 IgG2亞類，具有 S228、L234、L235及/或 D265 之突變，及/或含有PVA236突變。在一實施例中，單特異 性二價親本抗體之突變為S228P、L234A、L235A、L235E 及/或PVA236。在另一實施例中，單特異性二價親本抗體 145048.doc -26- 201026328 之突變在IgG4 S228P以及IgGl L234A及L235A中。重鏈悝 定區顯示為SEQ ID NO: 57及58。在一實施例中’單特異 性二價親本抗體之重鏈恆定區具有含突變L234A及L235A 之SEQ ID NO: 57。在另一實施例中，單特異性二價親本 抗體之重鏈恆定區具有含突變S228P之SEQ ID NO: 58。在 另一實施例中，單特異性二價親本抗體之輕鏈恆定區為 SEQ ID NO: 59之κ輕鏈區，或SEQ ID NO: 60之λ輕鏈恆定 區。在一本發明實施例中，單特異性二價親本抗體之重鏈 恆定區具有SEQ ID NO: 57或具有含突變S228P之SEQ ID NO: 58。 抗體之恆定區直接涉及ADCC(抗體依賴性細胞介導之細 胞毒性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）。補體活化（CDC)由 補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類之恆定區的結合引發。 Clq與抗體之結合由所謂結合位點處確定之蛋白質-蛋白質 相互作用引起。該等恆定區結合位點為當前技術所知，且 描述於例如以下中·· Lukas，T.J·等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse, R.及 Cebra, J.J” Mol.
Immunol. 16 (1979) 907-917 ; Burton，D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E.等人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie，E.E.等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh，M.等人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A·等人，Immunology 86 (1995) 319-3 24 ;及EP 0 307 434。該等恆定區結合位點之特徵在於例 如胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、 145048.doc •27- 201026328 K322、P331及P329(根據Kabat之EU索引編號）。 術語「抗體依賴性細胞毒性（ADCC)」係指在效應細胞 存在下本發明抗體使人類標靶細胞溶解。較佳藉由在效應 細胞（諸如新分離之PBMC)或自白血球層純化之效應細胞 (如單核細胞或自然殺手（NK)細胞或持久生長之NK細胞株） 存在下，用本發明抗體處理表現CCR5之細胞之製劑來測 量ADCC。 術語「補體依賴性細胞毒性（CDC)」表示由補體因子 Clq與大多數IgG抗體亞類之Fc部分的結合引發之過程。 Clq與抗體之結合由所謂結合位點處確定之蛋白質-蛋白質 相互作用引起。該等Fc部分結合位點為當前技術中所知 (參看下文）。該等Fc部分結合位點之特徵在於例如胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據Kabat之EU索引編號）。亞類IgGl、IgG2及IgG3 之抗體通常顯示補體活化，包括Clq及C3結合，而IgG4不 活化補體系統且不結合Clq及/或C3。 本發明抗體由重組方式產生。因此，本發明之一態樣為 一種編碼本發明抗體之核酸，且另一態樣為一種包含該編 碼本發明抗體之核酸的細胞。重組產生方法為當前技術中 所熟知，且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質，隨後分 離抗體，及通常純化達到醫藥學上可接受之純度。為在宿 主細胞中表現上述抗體，將編碼各別經修飾輕鏈及重鏈之 核酸由標準方法插入表現載體中。在適宜原核或真核宿主 細胞，如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細 145048.doc -28- 201026328 胞、COS細胞、PER.C6、酵母或大腸桿菌細胞中表現，且 自該等細胞（上清液或溶解後之細胞）回收抗體。重組產生 抗體之一般方法為當前技術中所熟知且描述於例如 Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ； Geisse，S.等人，Protein Expr. Purif· 8 (1996) 271-282 ; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ；
Werner，R.G.，J. Drug Res. 48 (1998) 870-880之評論文章 • 中。 本發明抗體適宜藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋 白質A-瓊脂糖法、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親 和層析法自培養物中分離。編碼單株抗體之Dna及RNA易 於使用習知程序來分離及定序。融合瘤細胞可用作該DNA 及RNA之來源。分離後，即可將DNA插入表現載體中，隨 後轉染至不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞（諸如HEK 293 細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞）中，以在宿主細胞中合成 φ 重組單株抗體。 本發明抗體之胺基酸序列變異體（或突變體）藉由將適當 核苷馱變化引入抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製備。然 而，该等修飾只可在非常有限之範圍内（例如如上文所述） 進行。舉例而言，該等修飾不改變上述抗體特徵，諸如
IgG同型及抗原結合，但可提高重組產生之產率、蛋白質 穩定性’或促進純化。 如本申請案中所使用，術語「宿主細胞」表示可經工程 改k以產生本發明抗體之任一類細胞系統。在一實施例 145048.doc -29· 201026328 中，使用HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞。如本文 所使用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互 換使用且所有該等名稱均包括子代。因此，詞語「轉型 體」及「轉型細胞」包括原代受檢細胞及源自其之培養 物，不考慮轉移次數。亦應瞭解由於存在有意或無意突 變，所以所有子代之DNA含量可能並不準確一致。本發明 包括具有與針對原始轉型細胞所篩檢相同之功能或生物活 性的變異子代。 NS0細胞之表現描述於例如Barnes，L.M.等人， Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ; Barnes, L.M.等人， Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。短暫表現描述於例 如 Durocher, Y.等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 中。可 變域之選殖描述於Orlandi，R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter, P. #A，Proc.Natl. Acad. Sci· USA 89 (1992) 4285-4289 ;及 Norderhaug，L.等 人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 中。較佳短暫表 現系統（HEK 293)描述於 Schlaeger，E.-J.及 Christensen, K·， Cytotechnology 30 (1999) 71-83 ;及 Schlaeger，E.-J·，J. Immunol. Methods 194 (1996) 191 -199 中。 適於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況存在 之操縱序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動 子、增強子及聚腺苷酸化信號。 當一核酸與另一核酸序列呈功能關係時，其為「可操作 性連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表 145048.doc -30- 201026328 見為參與多肽分泌 性連接;若啟動…之疆可操作 姑广， 次增強子影響編碼序列之轉錄，則其盥 歹可細作性連接；或若核糖體結合位點經定位以促進 s、’則其與編碼序列可操作性連接。一般而言，「 =連接」意謂所連接之DNA序列為鄰接的，且在分泌前 J之it況下，其為鄰接的且在閱讀框架中。然而，增 強子不必為鄰接的。連接藉由在適宜限制性位點處接合來 ❿ fi右該等位點不存在’則根據習知做法使用合成寡核 苷酸接附子或連接子。 藉由標準技術，包括鹼/SDS處理、CsCl聯結、管柱層析 瓊月S糖喊膠電泳及此項技術中熟知之其他技術，純化 抗體，以去除細胞組份或其他污染物，例如其他細胞核酸 或蛋白質。參看 Ausubel, F 等人編，Current Pr〇t〇c〇ls in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience，New York (1987)。已充分確立不同方法且廣 拳 泛用於蛋白質純化’諸如利用微生物蛋白質之親和層析法 (例如蛋白質A或蛋白質G親和層析法）、離子交換層析法 (例如陽離子交換（羧甲基樹脂）、陰離子交換（胺基乙基樹 脂）及混合模式交換）、嗜硫吸附法（例如利用β_巯基乙醇及 其他SH配位體）、疏水相互作用或芳族吸附層析法（例如利 用苯基-境脂糖、氮雜親砂性樹脂（aza-arenophilic resin)或 間胺基苯基蝴酸）、金屬螯合親和層析法（例如利用Ni(II)-及Cu(II)-親和材料）、尺寸排阻層析法及電泳法（諸如凝膠 電泳法、毛細電泳法）（Vijayalakshmi, M.A.，Appl. 145048.doc -31 - 201026328
Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。 本發明包含一種治療需要療法之患者的方法，其特徵在 於向該患者投與治療有效量之本發明抗體。 本發明包含一種本發明抗體用於療法之用途。 本發明包含一種本發明抗體用於製備供預防癌轉移之藥 物的用途。 ' 本發明包含一種本發明抗體用於製備供治療癌症之藥物 的用途。 本發明之一態樣為一種包含本發明抗體之醫藥組合物。 本發明之另一態樣為一種本發明抗體用於製造醫藥組合物 之用途。本發明之另一態樣為一種製造包含本發明抗體之 醫藥組合物的方法^在另一態樣中，本發明提供一種含有 本發明抗體與醫藥載劑調配之組合物，例如醫藥組合物。 本發明之另一態樣為供預防癌轉移之該醫藥組合物。 本發明之另一態樣為一種供預防癌轉移之本發明抗體。 本發明之另一態樣為一種本發明抗體用於製造供預防癌 轉移之藥物的用途。 本發明之另一態樣為一種預防罹患原發癌之患者癌轉移 的方法’其藉由向需要該預防性治療之患者投與本發明抗 體。 可在正位及皮下癌模型中活體内顯示高效預防自發癌轉 移/繼發性膜瘤（參看實例9)(與經靜脈注射腫瘤細胞之實驗 模型對比）。此類似於細胞自原發性腫瘤散布且轉移至如 肺或肝之繼發器官（其中出現繼發性腫瘤）的臨床情形。 U5048.doc -32- 201026328 本發明之術語「癌轉移」係指癌細胞自原發性腫瘤傳至 患者體内一或多個其他位點’隨後形成繼發性腫瘤。此項 技術中已知確定癌症是否已轉移之測癌轉移方式 (MetastasMeans) ’且包括骨絡掃描、胸部X射線、cAT掃 描、MRI掃描及腫瘤標誌物測試。 如本文所使用，術語「預防癌轉移」或「預防繼發性腫 瘤」具有相同含義’且指針對罹患復發性HER2陽性癌之 患者之癌轉移的預防措施，以此方式抑制或減少癌細胞自 攀 原發性禮瘤進一步傳至患者體内一或多個其他位點。此意 謂原發性腫瘤或癌症之轉移得以預防、延遲或減少，且因 此預防、延遲或減少繼發性腫瘤之形成。較佳預防或減少 肺部之癌轉移（亦即繼發性腫瘤），此意謂預防或減少癌細 胞自原發性腫瘤轉移性傳至肺部。 本發明之另一態樣為供治療癌症之該醫藥組合物。 本發明之另一態樣為一種供治療癌症之本發明抗體。 • 本發明之另一態樣為一種本發明抗體用於製造供治療癌 症之藥物的用途。 本發明之另一態樣為一種治療罹患癌症之患者的方法， 其藉由向需要該治療之患者投與本發明抗體。 如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學 上可相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗布劑、抗細菌 劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。載劑 較佳適於靜脈内、肌肉内、皮下、非經腸、脊椎或表皮投 與（例如藉由注射或輸注）。 145048.doc •33- 201026328 本發明組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。 如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需 結果而變化。為藉由某些投藥途徑投與本發明化合物，可 能需要用p方止化合物失活之物質塗布化合物或將化合物與 該物質共投與。舉例而言，化合物可於例如脂質體或稀釋 劑之適當載齊！中投向個體。醫藥學接受之稀釋劑包括 生理食鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水性溶液 或分散液，及供臨用方製備無菌可注射溶液或分散液之無 菌粉末。該等介質及試劑用於醫藥活性物質之用途為此項 技術中已知。 如本文所使用，短語「非經腸投藥」及「非經腸投與」 意謂除經腸及局部投藥外之其他投藥模式，通常藉由注射 來實現’且包括（不限於）：靜脈内、肌肉内、動脈内、鞘 内、囊内、眶内、心臟内、皮内、腹膜内、經氣管、皮 下、表皮下、關節内、囊下、蛛網膜下、脊椎内' 硬膜外 及胸骨内注射及輸注。 如本文所使用，術語癌症係指增生性疾病，諸如淋巴 瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL)癌、細支 氣管細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚 或眼内黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、 胃癌（stomach cancer/gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮 癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門 癌、霍奇金氏病（Hodgkin’s Disease)、食道癌、小腸癌、 内分泌系統癌症、曱狀腺癌、副曱狀腺癌、腎上腺癌、軟 145048.doc -34· 201026328 組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或 輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道 癌、中樞神經系統（CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質 瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管 膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤 及尤文氏肉瘤（Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症之難 治癒型式或一或多種上述癌症之組合。 ❹ 本發明之另一態樣為作為抗血管生成劑之該醫藥組合 物。此抗血管生成劑可用於治療癌症，尤其實體腫瘤，及 其他血管疾病。 本發明之另一態樣為一種本發明抗體用於製造供治療血 管疾病之藥物的用途。 本發明之另一態樣為一種供治療血管疾病之本發明抗 體。 一較佳實施例為一種供治療視網膜病之本發明抗體。 • —較佳實施例為—種本發明抗體用於製造供治療視網膜 病之藥物的用途。 、、本發明之另一態樣為一種治療罹患血管疾病之患者的方 法，其藉由向需要該治療之患者投與本發明抗體。 術語「血管疾病」包括癌症、發炎疾病、動脈粥樣硬 化 '局部缺血、外傷、敗血症、COPD、哮喘、糖尿病、 、視網膜病、中風、肥胖症、急性肺損傷、出血、血 s滲漏（例如細胞因子誘發之血管滲漏）、過敏、葛瑞夫茲 (aves Disease)、橋本氏自體免疫甲狀腺炎 I45048.doc •35· 201026328 (Hashimoto's Autoimmune Thyroiditis)、特發性血小板減少 性紫癜、巨細胞動脈炎、類風濕性關節炎、全身性紅斑性 狼瘡症（SLE)、狼瘡性腎炎、克羅恩氏病（Cr〇hn，s Disease)、多發性硬化症、潰瘍性結腸炎，尤其為實體腫 瘤、眼内新生血管症候群（諸如增生性視網膜病或年齡相 關性黃斑變性（AMD))、類風濕性關節炎及牛皮癬 (Folkman，J·等人，】.則〇1(：1^111.267 (1992) 10931-10934 ; Klagsbnm，M·等人，Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239 ;及 Gamer，A.，Vascular diseases, Path〇bi〇1〇gy 〇f ocular disease，A dynamic approach，Garner，A.及 Klintworth，G. K.(編），第 2版，Marcel Dekker，New York (1994),第 1625-1710頁）。 此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化 劑及分散劑。上述殺菌程序及藉由包括例如對羥基苯曱酸 S曰' 氣丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物之各種抗細菌劑及 抗真菌劑可確保防止存在微生物。組合物中亦可能需要包 括諸如糖' 氣化鈉及其類似物之等張劑。另外，藉由包括 ，遲吸收之試劑（諸如單硬脂酸鋁及明膠）可延長可注射醫 藥形式之吸收。 :管選擇何種投藥途徑，均可藉由熟習此項技術者已知 之習知方法，將本發明化合物(其可以適合之水合形式使 用）及/或本發明醫藥組合物調配成醫藥學上可接受之劑 型0 本發明醫藥組合物中活性成份之確切劑量可變化，以便 145048.doc 201026328 療反t效實現針對特定患者、組合物及投藥模式之所需治 醫華動二=無毒性的活性成份量。所選劑量將視各種 1素“，包括：所用本發明之特定組合物之 鱼投藥途徑；投藥時間；所用特^化合物之排;世速 :，治療持續時間；與所用特定組合物組合使用之其他藥 、化合物及/或物質；所治療之患者之年齡、性別、體
:類=素:般健康狀況及先前病史;及醫藥技術中熟知 組合物須為無菌的’且在一定程度上為流動的，以使组 合物可經由注射器來遞送。除水之外，載龍佳為經緩衝 之等張鹽水溶液。 適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層，在分散 液情況下藉由維持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維 持。在多種情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、 多元醇（諸如甘露糖醇或山梨糖醇）及氯化鈉。 如本文所使用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養 物」可互換使用且所有該等名稱均包括子代。因此，詞語 轉型體」及「轉型細胞」包括原代受檢細胞及源自其之 培養物，不考慮轉移次數。亦應瞭解由於存在有意或無意 突變’所以所有後代之DNA含量可能並不準確一致。本發 明包括具有與針對原始轉型細胞所篩檢相同之功能或生物 活性的變異子代。當意欲使用不同名稱時，應自上下文可 使人明白該等名稱。 如本文所使用，術語「轉型」係指載體/核酸轉移至宿 145048.doc -37- 201026328 主細胞中之過程。若使用不含難以越過之細胞壁障壁的細 胞作為宿主細胞，則例如藉由如Graham, F.L.及van der Eb, Virology 52 (1973) 456-467所述之磷酸鈣沈澱法進行轉 染。然而，亦可使用將DNA引入細胞中之其他方法，諸如 核注射或原生質體融合。若使用原核細胞或含有實質細胞 壁結構之細胞，則例如一種轉染方法為使用氯化鈣之鈣處 理，如Cohen，F. N等人，PNAS· 69 (1972) 7110及以後各頁 中所述。 如本文所使用，「表現」係指核酸轉錄成mRNA之過程， 及/或隨後經轉錄mRNA(亦稱為轉錄物）轉譯成肽、多肽或 蛋白質之過程。轉錄物及經編碼多肽統稱為基因產物。若 多肽來源於基因組DNA，則在真核細胞中之表現可包括 mRNA之剪接。 「載體」為核酸分子，尤其為自我複製之核酸分子，其 將插入之核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞之 間。該術語包括··功能主要在於將DNA或RNA插入細胞 (例如染色體整合）中之載體；功能主要在於複製DNA或 RNA之複製載體；及功能在於轉錄及/或轉譯DNA或RNA 之表現載體。亦包括提供一種以上所述功能之載體。 「表現載體」為當引入適宜宿主細胞中時可轉錄並轉譯 成多肽之聚核苷酸。「表現系統」通常指包含表現載體之 適合宿主細胞，其可用於產生所需表現產物。 提供以下實例、序列表及圖式以幫助理解本發明，本發 明之真正範疇闡述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，在不 145048.doc -38- 201026328 背離本發明精神之情況下，可對所述程序進行修改。 胺基酸序列之描述 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
重鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2i—LC06 重鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC06 重鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC06 輕鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2i_LC06 輕鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC06 輕鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC06 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC06 輕鍵可變域，<ANG-2>Ang2i_LC06 重鏈CDR3， 重鏈CDR2， 重鏈CDR1， 輕鏈CDR3， 輕鏈CDR2， 輕鏈CDR1， 重鏈可變域 輕鏈可變域 重鏈CDR3， 重鏈CDR2， 重鏈CDR1， 輕鏈CDR3， 輕鏈CDR2， 輕鏈CDR1， <ANG_2>Ang2i_LC07 <ANG-2>Ang2i_LC07 <ANG-2>Ang2i_LC07 <ANG-2>Ang2i_LC07 <ANG-2>Ang2i_LC07 <ANG-2>Ang2i_LC07 ，<ANG-2>Ang2i_LC07 ，<ANG-2>Ang2i—LC07 <ANG-2>Ang2k_LC08 <ANG-2>Ang2k_LC08 <ANG-2>Ang2k_LC08 <ANG-2>Ang2k_LC08 <ANG-2>Ang2k_LC08 <ANG-2>Ang2k_LC08 145048.doc •39· 201026328 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC08 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC08 重鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2s_LC09 重鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2s_LC09 重鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2s_LC09 輕鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2s_LC09 輕鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2s_LC09 輕鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2s_LC09 重鏈可變域，<ANG_2>Ang2s_LC09 輕鏈可變域，<ANG_2>Ang2s_LC09 重鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2i_LC10 重鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC10 重鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC10 輕鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2i_LC10 輕鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC10 輕鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC10 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2iJLC10 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC10 重鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2k_LCll 重鏈CDR2，<ANG-2>Ang2k_LCll 重鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2k_LCll 輕鏈CDR3，<ANG-2>Ang2k_LCll 輕鏈CDR2，<ANG-2>Ang2k_LCll 輕鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2k_LCll 145048.doc -40- 201026328 SEQ ID NO: 47 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2k—LC11 SEQ ID NO: 48 輕鏈可變域，<ANG_2>Ang2k_LCll SEQ ID NO: 49 重鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 50 重鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 51 重鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 52 輕鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 53 輕鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 54 ❿ 輕鏈 CDR1，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 55 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2s—R3—LC03 SEQ ID NO: 56 - <ANG-2>Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 57 源自IgGl之人類重鏈恒定區 SEQ ID NO: 58 源自IgG4之人類重鏈恒定區 SEQ ID NO: 59 κ輕鍵怪定區 SEQ ID NO: 60 λ輕鏈恆定區 SEQ ID NO: 61 人類Tie-2受體 ❹ SEQ ID NO: 62 具有前導序列及His標籤之人類血管生 成素-2(ANG-2) SEQ ID NO: 63 具有前導序列及His標籤之人類血管生 實驗程序1 成素-l(ANG-l) 材料及一般方法 有關人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般信 息提供於 Kabat，E.A·等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, 145048.doc -41 - 201026328
National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中。抗 體鏈之胺基酸根據EU編號來編號及提及（Edelman, G.M.等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ； Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health， Bethesda，MD, (1991))。 重組DNA技術 使用標準方法操作DNA，如Sambrook，J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 中所 述。分子生物試劑根據製造商說明來使用。 基因合成 所需基因區段由利用化學合成製得之募核苷酸製備。藉 由寡核苷酸黏接及接合，包括PCR擴增，來組裝側接有單 獨限制性核酸内切酶裂解位點之基因區段，且隨後經由所 指示之限制性位點（例如KpnI/SacI或AscI/PacI)將該等基因 區段選殖至基於pPCRScript(Stratagene)之pGA4選殖載體 中。藉由DNA定序分析確定經次選殖之基因片段之DNA序 列。根據Geneart(Regensburg，Germany)所給之說明書安排 基因合成片段。 DNA序列測定 藉由在 MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)或 Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)進行之雙股定序 分析來測定DNA序列。 145048.doc -42- 201026328 DNA及蛋白質序列分析以及序列資料管理 使 用 GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)之套裝軟體 10.2 版及 Infomax 之 Vector NT1 Advance套裝8.0版建立序列、繪圖、分析、註解及說明。 表現載體 為表現所述抗體，應用基於具有CMV-内含子A啟動子之 cDNA結構或具有CMV啟動子之基因組結構（例如圖1)進行 短暫表現（例如在HEK293 EBNA或HEK293-F細胞中）或穩 定表現（例如在CHO細胞中）的表現質體之變異體。 除抗體表現卡匣外，載體亦含有： -複製起點，其允許此質體在大腸桿菌中複製，及 -β-内酿胺酶基因，其使大腸桿菌對安比西林（ampicillin) 具有抗性。 抗體基因之轉錄單元由以下元件構成： -5'端獨特限制性位點， -人類細胞巨大病毒之即刻早期增強子及啟動子， -在cDNA結構之情況下繼之以内含子A序列， -人類抗體基因之5’-非轉譯區， -免疫球蛋白重鏈信號序列， -呈具有免疫球蛋白外顯子-内含子結構之cDNA或基因 組結構的人類抗體鏈（重鏈、經修飾重鏈或輕鏈）， -具有聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區，及 -3'端獨特限制性位點。 藉由PCR及/或基因合成來產生如下所述之包含所選抗體 145048.doc •43- 201026328 重鏈序列之融合基因，且利用已知之重組方法及技術，藉 由例如使用基因組重鏈載體中之獨特Nsil及EcoRI位點連 接相應核酸區段進行組裝。藉由DNA定序分析驗證經次選 殖之核酸序列。藉由質體製劑由經轉型大腸桿菌培養物製 備大量質體用於短暫及穩定轉染（Nucleobond AX， Macherey-Nagel) ° 細胞培養技術 使用如 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及 Yamada, K.M.(編），John Wiley & Sons, Inc 中所述之標準細胞培養技術。 HEK293-F系統之短暫轉染 根據製造商說明，使用HEK293-F系統（Invitrogen)，藉 由使分別編碼重鏈或經修飾重鏈及相應輕鏈之兩種質體進 行短暫轉染，來產生抗體。簡言之，利用兩種各別表現質 體與293fectin或fectin轉染試劑（Invitrogen)之混合物轉染 在搖瓶中或在經攪拌醱酵罐中於無血清Freestyle 293表現 培養基（Invitrogen)中懸浮生長的HEK293-F細胞 (Invitrogen)。對於例如 2 L搖瓶（Corning)，以 1.0E*6個細 胞/毫升（共600 mL)之密度接種HEK293-F細胞，且在120 rpm、8% C02下培育。次日，用約42 mL以下混合物轉染 細胞密度為約1.5E*6個細胞/毫升之細胞：A)20 mL Opti-MEM(Invitrogen)與600 pg等莫耳比率之分別編碼重鍵或經 修飾重鏈及相應輕鏈之總質體DNA(1 pg/mL)的混合物； 145048.doc -44· 201026328 及 B)20 ml Opti-MEM+1.2 mL 293 fectin 或 fectin轉染試劑 (2 μΙ/mL)。根據葡萄糖消耗，在醱酵過程中添加葡萄糖溶 液。5-10天後收集含有所分泌抗體之上清液，且自上清液 中直接純化抗體，或將上清液冷凍並儲存。 蛋白質測定 根據 Pace，C.N.等人，Protein Science，4 (1995)，2411， 1423，藉由在280 nm下測定光學密度（OD)，使用基於胺基 酸序列計算之莫耳消光係數，來測定經純化抗體及衍生物 之蛋白質濃度。 上清液中抗體濃度之測定 藉由利用蛋白質A瓊脂糖-珠粒（Roche)進行之免疫沈澱 法估算細胞培養物上清液中抗體及衍生物之濃度。在TBS-NP40(50 mM Tris(pH 7.5) ' 150 mM NaCl ' 1% Nonidet-P40)中洗務60 pL蛋白質A緩脂糖珠粒3次。隨後，將1-15 mL細胞培養物上清液施加至在TBS-NP40中預先平衡之蛋 白質A瓊脂糖珠粒中。在室溫下培育1小時後，在
Ultrafree-MC-過渡管柱（Amicon)上用 0.5 mL TBS-NP40洗 滌珠粒1次，用0.5 mL 2χ磷酸鹽緩衝鹽水（2xPBS，Roche) 洗滌2次，且用0·5 mL 100 mM檸檬酸鈉（pH 5.0)簡單洗務4 次。藉由添加35 μΐ NuPAGE® LDS樣本緩衝液溶離結合之 抗體。將一半樣本分別與NuPAGE®樣本還原劑組合或保 持未還原’且在70 C下加熱10分鐘。隨後，施加2〇 μΐ至4_ 12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(對於非還 原性SDS-PAGE，利用MOPS緩衝液；及對於還原性SDS_ 145048.doc -45· 201026328 PAGE，利用具有NuPAGE®抗氧化劑電泳缓衝液添加劑 (Invitrogen)之MES緩衝液）中，且用考馬斯藍（Coomassie Blue)染色。 藉由蛋白質A-HPLC層析法測量細胞培養物上清液中抗 體及衍生物之濃度。簡言之，將含有結合蛋白質A之抗體 及衍生物的細胞培養物上清液隨50 mM K2HP〇4、300 mM NaCl(pH 7·3)施加至 HiTrap蛋白質 A管柱（GE Healthcare)， 且在0丨〇1^乂1^1^(：系統上利用50〇114乙酸（？112.5)自基質溶 離。藉由UV吸光度及峰面積積分定量所溶離之蛋白質。 使用經純化之標準IgGl抗體作為標準物。 或者，藉由夾心式IgG-ELISA測量細胞培養物上清液中 抗體及衍生物之濃度。簡言之，在室溫下用每孔1〇〇 μί之 0· 1 pg/mL經生物素標記之抗人類IgG捕捉分子F(ab’）2<h-Fcy>BI(Dianova)塗布StreptaWell高結合抗生蛋白鏈菌素 A (High Bind Strep atavi din A)-96孔微量滴定盤（Roche)並保 持1小時，或者在4°C下塗布並保持隔夜，且隨後用200微 升 /孔 PBS、0.05% Tween(PBST，Sigma)洗滌 3 次。將 100微 升/孔含有各別抗體之細胞培養物上清液於PBS(sigma)中 之連續稀釋液添加至各孔中，且在室溫下於微量滴定盤震 盪器上培育1-2小時。用200微升/孔PBST洗滌各孔3次’且 在室溫下於微量滴定盤震盪器上，使用100 μ1 0.1 Pg/mL 之F(ab，)2<hFcY>POD(Dianova)作為偵測抗體來偵測結合之 抗體，歷時卜2小時。用200微升/孔PBST洗滌3次，洗去未 結合之偵測抗體，且藉由添加每孔1 〇〇微升八8丁8偵測經結 145048.doc •46- 201026328 合福測抗體。在Tecan Fluor分光計上，於405 nm之測量波 長（參比波長492 nm)下測定吸光度。 蛋白質純化 參照標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液中純化蛋 白質。簡言之，施加抗體至蛋白質A瓊脂糖管柱（GE Healthcare)且用PBS洗滌。在酸性pH值下溶離抗體，隨後 立即中和樣本。藉由尺寸排阻層析法（Superdex 200，GE Healthcare)，在 20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6·0)中使 ❹ 聚集蛋白質與單體抗體分離。彙集單體抗體溶離份，視需 要使用例如 MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)離心濃縮 器濃縮，且儲存於-80°C下。一部分樣本用於隨後例如藉 由SDS-PAGE、尺寸排阻層析法、質譜法及内毒素測定法 進行蛋白質分析及分析表徵（參看圖2)。
SDS-PAGE 根據製造商說明，使用NuPAGE®預製凝膠系統（Pre-❿ Cast gel system)(Invitrogen)。詳言之，使用 4-20% NuPAGE® Novex® TRIS-甘胺酸預製凝膠及 Novex® TRIS-甘胺酸SDS電泳緩衝液。（例如參看圖1)。藉由在凝膠上跑 • 膠之前添加NuPAGE®樣本還原劑來還原樣本。 分析型尺寸排阻層析 利用HPLC層析法進行尺寸排阻層析以測定抗體之聚集 及寡聚狀態。簡言之，將經蛋白質A純化之抗體隨300 mM NaCl、50 mM KH2P04/K2HP04(pH 7.5)施加至 Dionex HPLC系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱中，或將其隨 145048.doc -47- 201026328 2xPBS施加至 Dionex HPLC 系統上之 Superdex 200 管柱（GE Healthcare)中。藉由UV吸光度及♦面積積分定量經溶離蛋 白質。使用BioRad凝膠過濾標準物151-1901作為標準物。 質譜法
經由電噴霧電離質譜法（ESI-MS)測定並證實抗體之總去 糖基化重量。簡言之’在37°C下，在100 mM ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04(ρΗ 7)中用 50 mU N-糖苷酶 F(PNGaseF， ProZyme)使100 pg蛋白質濃度高達2 mg/ml之經純化抗體 脫去糖基，歷時12-24小時，且隨後在Sephadex G25管柱 (GE Healthcare)上經由HPLC去鹽。在脫去糖基及還原後， 利用ESI-MS測定各別重鏈及輕鏈之質量。簡言之，用60 μΐ 1M TCEP及50 μΐ 8 Μ鹽酸胍培育50 gg抗體（115 μΐ)，隨 後去鹽。在裝備有NanoMate源之Q-Star Elite MS系統上， 經由ESI-MS測定總質量及經還原重鏈及輕鏈之質量。 ANG-1 及 ANG-2結合 ELISA 在ELISA檢定中，利用全長血管生成素-2-His蛋白質 (R&D Systems #623-AN/CF，或實驗室自製物質）或血管生 成素-l-His(R&D systems #923-AN)來評估針對 ANGPT(血 管生成素1或2)之抗體的結合特性。因此，在室溫下用1〇〇 μΐ 1 gg/mL重組人類血管生成素-1或血管生成素-2(無載劑） 之PBS(Sigma)溶液塗布96孔盤（Falcon聚苯乙烯透明增強型 微量滴定盤或Nunc Maxisorb)並保持2小時，或在4°C下塗 布並保持隔夜。用300 μΐ PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3 次，且在室溫下用200 μΐ 2% BSA、0.1% Tween 20阻斷30 145048.doc • 48- 201026328 分鐘，且隨後用300 μΐ PBST洗滌3次。將100微升/孔針對 <ANG-2>之經純化測試抗體於PBS中之連續稀釋液（40 pM-0_01 pM)及作為參比物之Mab536(01iner, J.等人，Cancer Cell. 11月 6 日（2004) 507-16，US 2006/0122370)於 PBS 中 之連讀稀釋液添加至各孔中，且在室温下於微量滴定盤震 盪器上培育1小時。用300 μΐ PBST(0.2°/〇 Tween 20)洗滌各 孔3次，且在室溫下，於微量滴定盤震盪器上，使用每孔 100微升之於 2% BSA、0.1% Tween 20 中的 0.1 pg/ml F(ab’） <hk>POD(Biozol目錄號206005)作為偵測抗體來偵測經結 合抗體，歷時1小時。用300微升/孔PBST洗滌3次，洗去未 結合之偵測抗體，且藉由每孔添加100微升ABTS來偵測經 結合彳貞測抗體。在Tecan Fluor分光計上，於405 nm之測量 波長（參比波長492 nm)下測定吸光度。
ANG-2結合 BIACORE 使用 BIACORE T100儀（GE Healthcare Biosciences AB， Uppsala，Sweden)，藉由表面電漿共振法研究抗體與抗原 (例如人類ANG-2)之結合。簡言之，為測量親和力，經由 胺偶合將山羊<hIgG-FcY>多株抗體固定於CM4晶片上以呈 現針對人類ANG-2之抗體。在25°C下於HBS緩衝液（HBS-P(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20，pH 7.4))中測量結合。添加在0.41 nM與200 nM之間的各種濃 度之經純化ANG-2-His(R&D systems或實驗室自純化）溶 液。藉由經3分鐘注射ANG-2來測量締合；藉由用HBS緩 衝液洗滌晶片表面5分鐘來測量解離，且使用1:1朗繆爾結 145048.doc -49- 201026328 合模型（Langmuir binding model)估算 KD值。由於 ANG-2製 劑非均質，所以未觀察到1:1結合；因此，KD值僅為相對 估算值。自樣本曲線中減去陰性對照資料（例如緩衝液曲 線）以修正系統固有之基線漂移且減少雜訊。使用Biacore T1 00評估軟體1·1·1版分析感測器圖譜並計算親和力數據。 或者，可經由經胺偶合固定於CM5晶片（無BSA)上之 PentaHis抗體（無 BSA之 PentaHis-抗體，Qiagen編號 34660) 以2000-1700 RU之捕捉程度來捕捉Ang-2(參看下文）。 抑制 huANG-2舆 Tie-2結合（ELISA) 在室溫下在384孔微量滴定盤（MicroCoat，DE，目錄號 4647 18)上進行相互作用ELISA。各培育步驟後，用PBST 洗滌各盤3次。用 0.5 pg/ml Tie-2蛋白（R&D Systems，UK， 目錄號313-TI)塗布ELISA盤，保持至少2小時（h)。此後， 用補充有 0.2% Tween-20 及 2% BSA(Roche Diagnostics GmbH，DE)之PBS阻斷各孑L1小時。在室溫下，將經純化抗 體於PBS中之稀釋液與0.2 pg/ml人類血管生成素-2(R&D Systems, UK,目錄號623-AN) —起培育1小時。洗務後， 添加0.5 pg/ml生物素標記之抗血管生成素-2純系 BAM0981(R&D Systems, UK)與 1:3000稀釋之抗生蛋白鏈 菌素 HRP(Roche Diagnostics GmbH, DE,目錄號 11089153001)的混合物，保持1小時。此後用PBST洗滌各 盤6次。在室溫下，用新製ABTS試劑（Roche Diagnostics GmbH, DE，緩衝液 #204 530 001，錠劑 #11 112 422 001)顯 現培養盤，歷時30分鐘。在405 nm下測量吸光度。 145048.doc 50· 201026328 抑制 huANG-l與 Tie-2結合（ELISA) 在室溫下在384孔微量滴定盤（MaxiSorb Nunc#442768)上 進行相互作用ELISA。各培育步驟後，用PBST洗滌各盤3 次。用 0.5 pg/ml Tie-2 蛋白（R&D Systems, UK，目錄號 3 13-TI，或實驗室自製物質）塗布ELISA盤，保持至少2小 時（h)。此後，用補充有 0.2% Tween-20 及2% BSA(Roche Diagnostics GmbH, DE)之PBS阻斷各孔1小時。在室溫下， 將經純化抗體於PBS中之稀釋液與0.2 pg/inl人類血管生成 素-1(R&D Systems #923-AN/CF，或實驗室自製物質）一起 培育1小時。洗滌後，添加0.5 pg/ml生物素標記之抗血管 生成素-1純系（R&D Systems #BAF923)與1··3000稀釋之抗 生蛋白鏈菌素HRP(Roche Diagnostics .GmbH, DE,目錄號 11089153001)的混合物，保持1小時。此後用PBST洗滌各 盤6次。在室溫下，用新製ABTS試劑（Roche Diagnostics GmbH, DE,緩衝液 #204 530 001,錠劑 # 11 112 422 001)顯 現培養盤，歷時30分鐘。在405 nm下測量吸光度。 產生HEK293-Tie2細胞株 為測定血管生成素-2抗體對ANGPT2刺激之Tie2磷酸化 及ANGPT2與細胞上Tie2之結合的干擾，產生重組 HEK293-Tie細胞株。簡言之，使用 Fugene(Roche Applied Science)作為轉染試劑，將在CMV啟動子及新黴素 (Neomycin)抗性標誌、物控制下編碼全長人類Tie2(SEQ ID 61)之基於 pcDNA3之質體（RB22-pcDNA3 Topo hTie2)轉染 至 HEK293 細胞（ATCC)中，且在含 10% FCS、500 pg/ml 145048.doc -51 - 201026328 G418之DMEM中選擇抗性細胞。經由選殖柱分離個別純 系，且隨後利用FACS分析Tie2表現。純系22被鑑別為甚至 在無G418下仍具有高且穩定之Tie2表現的純系（HEK293-Tie2純系22)。隨後使用HEK293-Tie2純系22進行細胞檢 定：ANGPT2誘導之Tie2磷酸化及ANGPT2細胞配位體結合 檢定。 ANGPT2誘導之Tie2磷酸化的檢定 根據以下檢定原理，測量ANGPT2抗體對ANGPT2誘導 之Tie2磷酸化的抑制。在ANGPT2抗體不存在或存在下， 用ANGPT2刺激HEK293-Tie2純系22歷時5分鐘，且由夾心 式ELISA定量P-Tie2。簡言之，使每孔2χ105個HEK293-Tie2純系22細胞在塗布聚D-離胺酸之96孔微量滴定盤上於 100 μΐ 含 10% FCS、500 pg/ml 遺傳黴素（Geneticin)之 DMEM中生長隔夜。次日，在微量滴定盤中製備一滴定列 之ANGPT2抗體（4倍濃縮，每孔75 μΐ最終體積，一式兩 份），且與 75 μΐ ANGPT2(R&D systems # 623-ΑΝ)稀釋液 (3.2 pg/ml，4倍濃縮溶液）混合。抗體及ANGPT2在室溫預 培育15分鐘。100 μΐ混合物加入HEK293-Tie2純系22細胞 (與 1 mM NaV304， Sigma #S6508—起預培育 5 分鐘）中， 且在37°C培育5分鐘。隨後，用每孔200 μΐ冰冷PBS + 1 mM NaV3〇4洗細胞，且在冰上由每孔添加120 μ 1溶解緩衝液 (20 mM Tris(pH 8.0)、137 mM NaCn、1% ΝΡ-40、10% 甘 油、2 mM EDTA、1 mM NaV3〇4、1 mM PMSF及 10 Mg/ml 抑肽酶（Aprotinin))溶解。在4°C在微量滴定盤震盪器上溶 145048.doc -52- 201026328 解細胞30分鐘，且不預先離心及不測定總蛋白質，將loo μΐ溶解產物直接轉移至p-Tie2 ELISA微量滴定盤（R&D Systems, R&D #DY990)中。根據製造商說明定量p_Tie2之 量，且使用 Excel 之 XLHt4分析插件（XLfit4 analysis plugin)(劑 量反應 單點分 析模型 205)測定 抑制之IC50值 。可比 較一個實驗内之IC50值，但其可隨各實驗而變化。 ANGPT1誘導之Tie2磷酸化的檢定
根據以下檢定原理，測量ANGPT1抗體對ANGPT1誘導 之Tie2磷酸化的抑制。在ANGPT1抗體不存在或存在下， 用ANGPT1刺激HEK293-Tie2純系22歷時5分鐘，且由夾心 式ELISA定量P-Tie2。簡言之，使每孔2xl05個HEK293-Tie2純系22細胞在塗布聚D-離胺酸之96孔微量滴定盤上於 100 μΐ含10% FCS、500 pg/ml遺傳黴素之DMEM中生長隔 夜。次曰，在微量滴定盤中製備一滴定列之ANGPT1抗體 (4倍濃縮，每孔75 μΐ最終體積，一式兩份），且與75 μΐ ANGPT1(R&D systems # 923-ΑΝ)稀釋液（0.8 pg/ml，4倍濃 縮溶液）混合。抗體及ANGPT1在室溫預培育15分鐘。添加 100 μΐ混合物至HEK293-Tie2純系 22細胞（與 1 mM NaV3〇4, Sigma #S6508—起預培育5分鐘）中，且在37°C下培育5分 鐘。隨後，用每孔200 μΐ冰冷PBS + 1 mM NaV304洗滌細 胞，且藉由在冰上每孔添加120 μΐ溶解緩衝液（20 mM
Tris(pH 8.0)、137 mM NaCM、1% NP-40、10%甘油、2 mM EDTA、1 mM NaV304、1 mM PMSF及 10 pg/ml抑肽酶）進 行溶解。在4°C下，在微量滴定盤震盪器上溶解細胞30分 145048.doc •53· 201026328 鐘，且在不預先離心及不測定總蛋白質之情況下，將1 〇〇 μΐ溶解產物直接轉移至P-Tie2 ELISA微量滴定盤
Systems，R&D #DY990)中。根據製造商說明來定量p_Tie2 之量，且使用Excel之XLfit4分析插件（劑量反應單點分析 模型205)測定抑制之IC50值。可比較一個實驗内之iC5〇 值，但其可隨實驗不同而變化。 實例1 單株 <ANG-2> 抗體 Ang2i-LC06、Ang2i-LC07 及 Ang2k_ LC08之表現及純化 如上所述，在表現載體中構築相應抗體Ang2i-LC06、 Ang2i-LC07及Ang2k-LC08之輕鏈及重鏈。將重鏈及κ輕鏈 選殖至基因組表現卡匣中，而選殖具有内含子A之λ輕鏈作 為cDNA(圖1Β)。在大腸桿菌中擴增質體，純化且隨後轉 染至 HEK293-F 細胞（利用 Invitrogen之 FreeStyle 293 系統）中 以短暫表現重組蛋白。7天後，收穫HEK 293-F細胞上清 液，過濾且藉由蛋白質A及尺寸排阻層析來純化抗體。藉 由在非還原及還原條件下進行之SDS-PAGE，及分析型尺 寸排阻層析來確定所有抗體之均質性。在還原條件下（圖 1)，<ANG-2>抗體之多肽重鏈在SDS-PAGE後顯示約50 kDa之表觀分子尺寸，類似於所計算之分子量；多肽輕鏈 顯示25 kDa之表觀分子質量（根據其預計尺寸）。質譜確定 經純化抗體一致。藉由蛋白質A HPLC分析所有構築體之 表現量。 經純化抗體之尺寸排斥層析分析。類似於所述程序，製 145048.doc •54· 201026328 備所有抗體並分析表徵。相應抗體之SEc資料概述於下表 中〇 抗艘鍵 理論質量(Da) 實驗質量(Da) 主峰SEC(%) <ANG-2>Ang- 2i_LC07 HC 50343 50325(焦麩胺酸） 99.7% LC 22738 22720(焦麩胺酸） <ANG-2>Ang- 2i_LC06 HC 50343 50325(焦麩胺酸） 99.8% LC 22620 22605(焦麩胺酸） <ANG-2>Ang-2k—LC08 HC 49544 49527(焦麩胺酸） 99.8% LC 22685 22667(焦麩胺酸） 實例2 結合人類ANG-1及人類ANG-2之ELISA結合檢定 如上所述，在ANG-1或ANG-2結合ELIS A中測定<ANG-2> 抗體 Ang2i-LC06、Ang2i-LC07 及 Ang2k-LC08 與人類 ANG-1及人類ANG-2之結合。簡言之，ELISA型檢定係基 於將人類野生型血管生成素-1或-2固定於微量滴定盤中。 經由結合POD之〈人類Fc>(抗IgG)抗體測量針對經固定 ANG-1或ANG-2之抗體之結合。<ANG-2>抗體之連續稀釋 液允許測定EC50濃度。使用人類抗ANG-2抗體<ANG-2；^^ 體 Mab53 6(01iner 等人，Cancer Cell. 11 月 6 日（2004) 507-16, US 2006/012237〇)作為參照物。所測定之EC50濃度概述於 下表中。 145048.doc •55- 201026328
抗體 hANG-1結合 hANG-2結合 EC50 EC50 <ANG-2>MAb536 2538 ng/mL 133 ng/mL <ANG-2>Ang2i-LC06 >8000 ng/mL 84 ng/mL <ANG-2>Ang2i-LC07 >8000 ng/mL 3006 ng/mL <ANG-2>Ang2i-LC08 4044 ng/mL 105 ng/mL 所有抗體均與ANG-2特異性結合《 MAb536及Ang2k-LC08亦顯示與ANG-1特異性結合，而由於Ang2i-LC06及 Ang2i-LC07具有高於8000 ng/ml(偵測界限）之EC50值，故 其不與ANG-1特異性結合。 實例3 : 經由Biacore測定舆ANG-2之結合 如上文所述，利用Biacore檢定檢查與人類ANGPT2結合 之親和力。簡言之，在此檢定中，將捕捉抗體（抗Fc)固定 於Biacore晶片表面，其捕捉並呈現相應抗體（例如Ang2i-LC06)。自溶液中捕捉配位體（此處為ANGPT2)。假定1:1 相互作用，測定此相互作用之親和力。在一般方法部分中 可瞭解此實驗之詳情。所測定之關於ANGPT2結合之親和 力（KD)概述於下表中。 hAng-2 實驗1 實驗2 平均值 (由1+2得到） KD (pM) kd(l/s) 解離 (min) KD (pM) kd(l/s) t(l/2)解 離 (min) KD(pM) 解離 (min) Ang2i- LC06 11 7.16E- 05 161 21 1.14E-04 102 16 132 Ang2k- LC08 16 1.61E- 04 72 27 2.28E-04 51 22 61 MAb536 29 1.44E- 04 80 29 1.25E-04 92 29 86 145048.doc -56- 201026328 抗體Ang2i-LC06及Ang2k以高親和力與ANGPT2結合。 實例4 : 中和ANGPTl/2-Tie2之相互作用（人類） 利用受體相互作用EUSA顯示對人類ANGPT1/2/人類 Tie2之相互作用的阻斷。在室溫下，用〇·5 pg/ml人類 Tie2(R&D Systems, UK，目錄號313-TI，或實驗室自製物 質）塗布384孔Maxisorp盤（Nunc)並保持2小時，且在室溫 下，於震盪下，用補充有0.2% Tween-20及2% BSA(Roche Diagnostics GmbH, DE)之PBS阻斷1小時。同時，在室溫下 將經純化抗體於PBS中之稀釋液與0.2 pg/ml人類血管生成 素-1/2(R&D Systems #923-AN/CF，R&D Systems，UK，目 錄號623-AN，或實驗室自製物質）一起培育1小時。洗滌 後，添加0.5 pg/ml生物素標記之抗血管生成素-1/2純系 (R&D Systems #BAF923，BAM0981 R&D Systems，UK)與 1:3000稀釋之抗生查.白鍵菌素HRP(Roche Diagnostics GmbH, DE,目錄號11089153001)的混合物，保持1小時。 此後用PBST洗滌培養盤6次。在室溫下，用新製ABTS試 劑（Roche Diagnostics GmbH, DE，缓衝液#204 530 001，錠 劑#11 112 422 001)顯現培養盤，歷時30分鐘。在405 nm下 測量吸光度。 所得抑制濃度概述於下表中。
抗艟 ANGPT1/Tie2相互作用 ELISA ANGPT2/Tie2相互作用 ELISA Ang2i-LC06 >100 nM 0.1 nM Ang2k-LC08 11 nM 0.17 nM MAb536 無數據 0.15 nM 145048.doc •57· 201026328 上表顯示兩種抗體Ang2i-LC06及Ang2k-LC08之不同選 擇性概況。在對ANGPT1/2 Tie2相互作用之抑制中， Ang2i-LC06 具 ANGPT2選擇性，而 Ang2k-LC08 具 ANGPT1/2 交叉反應性。 實例5 :
Tie2磷酸化 在如上所述之ANGPT2及ANGPT1誘導之Tie2磷酸化檢定 中檢驗經鑑別ANGPT2抗體干擾ANGPT2及ANGPT1介導之 Tie2磷酸化的能力。檢定設置之示意圖描述於圖3中。 如圖4中所示，抗體Ang2i-LC06與Ang2k-LC08顯示對 ANGPT2刺激之Tie2磷酸化之劑量依賴性干擾，且其IC50 值相當。Ang2i-LC06 以約 508 ng/ml之 IC50值干擾 ANGPT2 刺激之Tie2磷酸化，且Ang2k-LC08以約499 ng/ml之IC50 值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。相比之下，僅Ang2k-LC08以約391 ng/ml之IC50值干擾ANGPT1刺激之Tie2磷酸 化，而在相同測試濃度範圍中，Ang2i-LC06不干擾 ANGPT2刺激之Tie2磷酸化（圖5)。 實例6 :活體内功效 抗ANGPT抗體對C〇1〇205異種移植物生長之影響 在分期皮下C〇1〇205異種移植物模型中<ANGPT2>抗體 Ang2i-LC06 及 Ang2k-LC08 相較於 <ANGPT2>Mab536 之活 體内功效 在雌性Scid米色小鼠之分期皮下C〇1〇205異種移植物模 型（Ang2_PZ_Colo205_006)中，將經純化 Ang2i-LC06 及 145048.doc -58- 201026328
Ang2k-LC08抗體與抗體Mab536相比較》
抗體：Mab536 以於 20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH
6.0) 中之冷束儲備溶液（c=4.5 mg/mL)形式提供’ Ang2i-LC06及 Ang2k-LC08 以於 20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6.0) 中之冷凍儲備溶液（c=l mg/mL)形式提供。注射前視需 要用PBS適當稀釋來自儲備溶液之抗體溶液，且PBS用作 媒劑。人類化IgGl抗IgE抗體柯耐爾（Xolair)(奥馬珠單抗 (Omalizumab))用作陽性對照且自藥房購得。 細胞株及培養條件：C〇1〇205人類結腸直腸癌細胞最初 自ATCC獲得，且在擴增後寄存於Roche Penzberg之内部細 胞庫中。在37°C下於含5% C02之濕潤氛圍中，在補充有 10%胎牛血清（PAA Laboratories，Austria)及 2 mM L-麵胺醯 胺之 RPMI 1640培養基（PAA, Laboratories, Austria)中常規 培養腫瘤細胞株。第3代用於移植。 動物：根據約定準則（GV-Solas; Felasa; TierschG)，在 無特定病原體之條件下，利用12小時白天/12小時黑夜之 曰循環維持雌性SCID米色小鼠（購自Charles River Germany)。實驗研究方案經當地政府審查並獲得批准。動 物到達後’維持在動物設施之檢疫區中1週以使其適應新 環境且進行觀察。持續定期監測健康狀況。提供飲食 (Provimi Kliba 3337)及水（酸性，pH 2.5-3)，讓其隨意取 食。研究開始時，小鼠年齡為約12-14週。 監測：每日針對臨床症狀及副作用偵測對動物進行控 制。為監測整個實驗過程，記錄動物體重且在分期後利用 145048.doc -59· 201026328 測徑規測量腫瘤體積。 腫瘤細胞注射：注射當天，離心C〇1〇205細胞，洗滌1次 且再懸浮於PBS中。再用PBS洗滌之後，使用細胞計數器 及分析系統（Vi-CELL, Beckman Coulter)測定細胞濃度及細 胞尺寸。對於C〇1〇205細胞之注射，將最終滴定濃度調至 5.〇xl 0E7個細胞/毫升，生存率為約90%。隨後，將100 μΐ 相當於每隻動物2.5*106個細胞之此懸浮液經皮下（s.c.)注 射至小鼠右肋中。 動物處理：動物處理始於隨機選擇當天，即細胞移植 (研究Ang2_PZ_Colo205—006)後16天平均腫瘤體積為178 mm3 時。 研究Ang2_PZ_Colo205_006之給藥時程： 組 動物數目 化合物 劑量 (mg/kg) 投藥途徑/模式 處理 數目 累積劑量 (mg/kg) 1 10 媒劑 腹膜内 一次 ，每週 5 2 10 柯耐爾 10 腹膜内 一次 ，每週 5 50 3 10 Ang2i- LC06 10 腹膜内 一次 ，每週 5 50 5 10 Ang2k- LC08 10 腹膜内 一次 ，每週 5 .50 6 10 MAB536 10 腹膜内 一次 ，每週 5 50 至第50天時腫瘤生長之抑制顯示於圖6中。資料顯示 ANGPT2選擇性抗體Ang2i-LC06為最具活性之抗體（腫瘤控 制率（TCR)值為0.39)。Ang2i-LC06抑制腫瘤生長比抗體 MAb53 6(TCR值為0.47)及ANGPT2選擇性之ANGPT1交叉反 應性抗體Ang2k-LC08(TCR值為0.46)有效。 145048.doc •60- 201026328 抗ANGPT抗體對KPL-4異種移植物生長之影響 在分期正位KPL-4異種移植物模型中<ANGPT2>抗體 Ang2i_LC06 及 Ang2k-LC08 相較於 <ANGPT2>Mab536 之活 體内功效 在雌性Scid米色小鼠之分期正位KPL-4異種移植物模型 (Ang2_PZ_KPL-4_002)中，將經純化 Ang2i-LC06 及 Ang2k-LC08抗體與抗體Mab536相比較。
抗體：Mab536 以於 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl(pH
6.0) 中之冷;東儲備溶液（c=4.5 mg/mL)形式提供，Ang2i-LC06及 Ang2k-LC08 以於 20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6.0) 中之冷凍儲備溶液（c=l mg/mL)形式提供。注射前視需 要用PBS適當稀釋來自儲備溶液之抗體溶液，且PBS用作 媒劑。 細胞株及培養條件：KPL-4人類乳癌細胞最初自出現發 炎性皮膚轉移之乳癌患者的惡性胸腔積液產生。KPL-4細 胞由 J. Kurebayashi 教授（Kawasaki Medical School, Kurashiki，Japan)友情提供。在37°C下於含5% C〇2之濕潤 氛圍中，在補充有10%胎牛jk清（PAN Biotech，Germany)及 2 mM L-麵胺醯胺（PAN Biotech, Germany)之DMEM培養基 (PAN Biotech, Germany)中常規培養腫瘤細胞。利用胰蛋 白酶/EDTA lx(PAN)進行繼代培養，每週分裂三次。 動物：根據約定準則（GV-Solas; Felasa; TierschG)，在 無特定病原體之條件下，利用12小時白天/12小時黑夜之 日循環維持雌性SCID米色小鼠（購自Charles River 145048.doc •61 · 201026328
Germany)。實驗研究方案經當地政府審查並獲得批准。動 物到達後’維持在動物設施之檢疫區中1週以使其適應新 環境且進行觀察。持續定期監測健康狀況。提供飲食 (Provimi Kliba 3337)及水（酸性，pjj 2.5-3)，讓其隨意取 食。研究開始時’小鼠年齡為約丨2週。 監測：每日針對臨床症狀及副作用偵測對動物進行控 制。為監測整個實驗過程，記錄動物體重且在分期後利用 測徑規測量腫瘤體積。 腫瘤細胞注射：注射當天，自培養瓶（Greiner THFlask) 中收穫腫瘤細胞（胰蛋白酶·ΕΟΤΑ)，並轉移至5〇 ml培養基 中，洗滌1次且再懸浮於PBS中。再用pBS進行洗滌步驟並 過濾（細胞濾網；FalCon™ ; 100 μιη)後，將最終細胞滴定 浪度調至1.5xlO8個細胞/毫升。用移液吸管小心地混合腫 瘤細胞懸洋液以避免細胞聚集。在密閉循環系統中，使用 具有預培育室（譜萊玻璃（plexiglas))、個別小鼠鼻罩（矽）及 不易燃或爆炸之麻醉化合物異氟醚（pharmacia_Upj〇hn， Germany)的供小動物用之斯蒂芬吸入單元（stephens，s inhalation unit)進行麻醉。注射前之2天剔去動物毛皮。 對於腹位乳房脂肪墊（i.m f p)注射，將體積為2〇 μ1(3*106 個細胞/動物）之細胞正位注射至各麻醉小鼠之右側倒數第 二個腹位乳房脂肪墊中。對於正位移植，使用Hamilt〇i^$ 升主射器及30Gxl/2'·針經由乳頭下之皮膚注射細胞懸浮 液。 動物處理始於隨機選擇60_180 mm3範圍内之腫瘤當天， 145048.doc 62· 201026328 002)後35天平均 腫瘤體 即細胞移植（研究Ang2_PZ—KPL-4 積為約90 mm3時。 研究Ang2_PZ_KPL-4_002之給藥時程 組 動物 數目 化合物 劑量 (mg/kg) 投藥途徑/模式 ——— 處理數目 ----— 5 —~5 ^^_, 累積劑量 50— ~~5T— 1 10 媒劑 腹膜内， 一次 2 10 柯耐爾 10 腹膜内， 一次 3 10 Ang2i-LC06 10 腹膜内，每週 一次 ------ 5 10 Ang2k-LC08 10 腹膜内， 一次 5 50 6 10 MAB536 10 腹膜内，每週 一次 5 50 至第64天時腫瘤生長之抑制顯示於圖7中。資料顯示
ANGPT2選擇性抗體Ang2i-LC06為KPL-4模型中最具活性 之抗體（TCR值為0·55)。Ang2i-LC06抑制腫瘤生長比抗體 MAb536(TCR值為0.57)及ANGPT2選擇性之ANGPT1交叉反 應性抗體Ang2k-LC08(TCR值為0.57)有效。 實例7 : 經由Biacore測定舆ANG-1之結合 利用Biacore檢定檢查與人類ANG-1結合之親和力：使用 胺偶合化學將huAng-1固定於CM5生物感測晶片上。以5 μΐ/min之流速注射於乙酸納（pH 4.5)中1 0 pg/ml之蛋白質， 歷時20分鐘。此產生約20000 RU之表面密度。在相同條件 下固定BSA作為參考流槽。用HBS-P將抗體稀釋至100 nM 且經3分鐘注射（締合期）。用電泳緩衝液洗滌3分鐘（解離 期）後，藉由以5 μΐ/min經1分鐘注射10 mM氫氧化納來恢 145048.doc -63 - 201026328 復表面。結果顯示於圖8中：Ang2k_LC08具有約50秒之複 合物解離半衰期，Ang2i_LC06為約5秒，且Ang2i_LC10未 顯示與ANG-1結合。 實例8:預防具有原發性腫瘤之活體内癌轉移/繼發性腫瘤 a)預防異種移植原發性C〇1〇205踵瘤之小鼠體内之癌轉移/ 繼發性腫瘤 細胞株及培養條件： C〇1〇205人類結腸直腸癌細胞最初自ATCC獲得，且在擴 增後寄存於Roche Penzberg之内部細胞庫中。在37°C下於 含5% C02之濕潤氛圍中，在補充有10%胎牛血清（PAA Laboratories, Austria)及2 mM L-楚胺醯胺之RPMI 1640培 養基（PAA, Laboratories, Austria)中常規培養腫瘤細胞株。 第3代用於移植。 動物： 根據約定準則（GV-Solas; Felasa; TierschG)，在無特定 病原體之條件下，利用12小時白天/12小時黑夜之日循環 維持到達時4-5週齡之雌性SCID米色小鼠（購自Charles River Germany)。實驗研究方案經當地政府審查並獲得批 准。動物到達後，維持在動物設施之檢疫區中1週以使其 適應新環境且進行觀察。持續定期監測健康狀況。提供飲 食（Provimi Kliba 3337)及水（酸性，pH 2.5-3)，讓其隨意 取食。研究開始時，小鼠年齡為約1 〇週。 腫瘤細胞注射： 注射當天，自培養瓶（Greiner)中收穫（騰蛋白酶- 145048.doc -64- 201026328 EDTA)C〇1〇205腫瘤細胞，並轉移至5〇 w培養基中，洗滌i -人且再懸浮於PBS*。再用pBS進行洗滌步驟並過濾（細胞 濾網；Falc〇nTM; 100 Pm)後，將最終細胞滴定濃度調至 2.5xl07個細胞/毫升。用移液吸管小心地混合腫瘤細胞懸 浮液以避免細胞聚集，此後，使用粗針（）1〇χ4〇 mm)將細 •胞懸浮液裝填至1.0 ml結核菌素注射器（tuberculin syringe)(Braun Melsungen)中；注射時，改變針尺寸 Φ (〇.45x25 mm)，且每次注射均使用新針。在密閉循環系統 中’使用具有預培育室（譜萊玻璃）、個別小鼠鼻罩（矽）及 不易燃或爆炸之麻醉化合物異氟醚（cp_pharnla)的供小動物 用之斯蒂芬吸入單元進行麻醉。注射前之2天，剔去動物 毛皮’並在細胞注射時，利用解剖用鑷子小心地提起麻醉 動物之皮膚’且將100 μΐ細胞懸浮液（=2.5xl〇6個細胞）皮下 注射至動物右肋中。監測原發性腫瘤之腫瘤生長（資料未 圖示）。 φ 藉由人類Alu序列定量來監測例如肺中繼發性腫瘤 研究結束（第103天）時，自所有動物組收集肺。簡言 之’將樣本立即轉移至液氮中。在另一步驟中，根據製造 • 商說明，利用MagNA Pure LC儀自樣本中分離出全部 DNA。選擇人類Alu特異性引子以藉由定量pcr (LightCycler儀）選擇性擴增Alu序列。（T. Schneider等人， Clin. Exp. Metas. 2002; 19: 571-582)。 動物處理 用阿瓦斯丁（Avastin)(10 mg/kg，每週一次經腹膜内投 145048.doc -65· 201026328 與）處理動物始於細胞移植（研究Ang2_PZ_Colo205_008)後 14天平均腫瘤體積為340 mm3時。7週後，隨機選擇小鼠， 隨後在第5 1天開始利用下表所列之化合物進行二次處理。 二次處理始於研究Ang2_PZ_Colo205_008第5 1天時。 組 動物 數目 化合物 劑量(mg/kg) 投藥途徑/模式 處理 數目 累積劑量 (mg/kg) 1 10 阿瓦斯丁 10 mg/kg 腹膜内，每週 一次 11 110 2 10 LC06+ 阿瓦斯丁 10 mg/kg 10 mg/kg 腹膜内，每週 一次 腹膜内，每週 一次 6 11 60 110 3 10 LC06 10 mg/kg 腹膜内，每週 一次 6 60 預防癌轉移/繼發性腫瘤（肺中）之結果列於下表中且顯示於 圖9A中
表1 :定量經不同抗體處理後，最初具有原發性C〇1〇205 腫瘤之小鼠之肺中的人類ALU DNA 阿瓦斯丁 阿瓦斯丁 +Ang2i-LC06 Ang2i_LC06 101 0.0264 201 0.0042 301 0.0047 102 5.6740 202 0.0044 302 0.0055 103 0.0307 203 0.0065 303 0.0050 104 0.0203 204 0.0081 304 0.0064 105 0.0215 205 0.0063 305 0.0062 106 0.0338 206 0.0061 306 0.0066 107 0.0075 207 0.0053 307 0.0250 108 0.0113 208 0.0506 308 0.0062 109 0.0087 209 0.0065 309 0.0067 110 0.0587 210 0.0160 310 0.0064 平均值 0.5893 0.0114 0.0079 中值 0.0240 0.0064 0.0063 結果表明ANG2i-LC06對繼發性腫瘤/癌轉移之預防相較 於阿瓦斯丁明顯改良。 145048.doc •66- 201026328 b)預防異種移植原發性KPL-4腫瘤之小鼠體内之癌轉移/繼 發性腫瘤 腫瘤細胞株 人類乳癌細胞株KPL-4(由J. Kurebayashi教授友情提供） 已自出現發炎性皮膚轉移之乳癌患者的惡性胸腔積液產 生。在37°C下於含5% C02之濕潤氛圍中，在補充有10%胎 牛 ok 清（PAN Biotech, Germany)及 2 mM L-.麩胺醯胺（PAN Biotech，Germany)之 DMEM培養基（PAN Biotech, Germany) 中常規培養腫瘤細胞。利用胰蛋白酶/EDTA lx(PAN)繼代 培養，每週分裂三次。 小鼠 雌性SCID米色小鼠（10-12週齡；體重18-20 g ; Charles River，Sulzfeld, Germany)到達後，維持在動物設施之檢疫 區中1週，以使其適應新環境且進行觀察。持續監測健康 狀況。根據國際準則（GV_Solas; Felasa; TierschG)，在 SPF 條件下利用12小時白天/12小時黑夜之日循環保持小鼠。 提供飲食（Kliba Provimi 3347)及水（經過濾），讓其隨意取 食。實驗研究方案經當地政府審查並獲得批准（Regierung von Oberbayern ;登記號 211.2531.2-22/2003)。 腫瘤細胞注射 注射當天，自培養瓶（Greiner TriFlask)中收穫（胰蛋白 酶-EDTA)腫瘤細胞，且轉移至50 ml培養基中，洗滌1次且 再懸浮於PBS中。再用PBS進行洗滌步驟並過濾（細胞濾 網；Falcon™ ; 100 μπι)後，將最終細胞滴定濃度調至 145048.doc -67- 201026328 1.5xlO8個細胞/毫升》用移液吸管小心地混合腫瘤細胞懸 浮液以避免細胞聚集。在密閉循環系統中，使用具有預培 育室（譜萊玻璃）、個別小鼠鼻罩（矽）及不易燃或爆炸之麻 醉化合物異氟謎（Pharmacia-Upjohn，Germany)的供小動物 用之斯蒂芬吸入單元進行麻醉。注射前之2天，剔去動物 之皮毛。對於腹位乳房脂肪墊注射，將體積為2〇 μ1之細胞 正位注射至各麻醉小鼠之右側倒數第二個腹位乳房脂肪墊 中。對於正位移植，使用Hamilton微升注射器及3〇Gxl/2M 針經由乳頭下之皮膚注射細胞懸浮液。監測原發性腫瘤之 腫瘤生長（資料未圖示）。 藉由人類Alu序列定量來監測例如肺中繼發性腫瘤 研究結束（第103天）時’自所有動物組收集肺。簡言 之’將樣本立即轉移至液氮中。在另一步驟中，根據製造 商說明’利用MagNA Pure LC儀自樣本中分離出全部DNA。 選擇人類Alu特異性引子以藉由定量PCR (LightCycler儀） 選擇性擴增 Alu序列。（T. Schneider等人，Clin. Exp. Metas. 2002; 19: 571-582) 動物處理 動物處理始於細胞移植後35天平均腫瘤體積為604 60 mm3時。化合物及給藥時程列於下表中。 145048.doc • 68- 201026328 組 動物 數目 化合物 劑量 (mg/kg) 投藥途徑/模式 處理 數目 累積劑量 (mg/kg) 4 10 媒劑 腹膜内，每调一二女 5 5 10 柯耐爾 10 腹膜内，每週一次 5 50 6 10 Ang2i LC06 10 腹膜内，每·通一次 4 40 7 10 Ang2i LC07 10 腹膜内，每週一次 4 40 8 10 Ang2k LC08 10 腹膜内，每週一次 4 40 預防癌轉移/繼發性腫瘤（肺中）之結果列於下表中且顯示於 圖9B中
表2 :定量經不同抗體處理後，最初具有原發性KPL4腫 瘤之小鼠之肺中的人類ALU DNA 媒劑 相 耐爾 Ang2i—LC06 Ang2i LC07 Ang2i LC08 101 0.0098 201 0.0157 401 0.0273 501 0.0069 102 0.0090 202 0.0516 302 0.0076 402 0.0060 502 0.0261 103 0.0119 203 0.0108 303 0.0413 403 0.0046 503 0.0067 104 0.0405 204 0.0148 304 0.0042 404 0.0164 504 0.0044 205 0.0020 305 0.0041 405 0.0040 505 0.0039 106 0.0381 206 0.0340 306 0.0093 406 0.0044 506 0.0051 107 0.0281 207 0.0141 307 0.0038 407 0.0060 507 0.0037 208 0.0422 308 0.0044 408 0.0174 508 0.0037 109 0.0121 209 0.0227 309 0.0036 409 0.0314 509 0.0051 110 0.0143 210 0.0383 310 0.0094 410 0.0083 540 0.0200 I 卜值 0.0132 0.0192 0.0044 0.0072 0.0051 平均值 0.0205 0.0246 0.0098 0.0126 0.0086 結果表明 ANG2i-LC06、ANG2i-LC07、ANG2k-LC08 均 非常有效地預防繼發性腫瘤/癌轉移。 實例9:治療視網膜病之作用 方法 C57/B16幼畜由CD1哺乳母畜交叉哺育且P7至P12時暴露 於 75% 氧（PRO-OX 110 腔室氧控制器；Biospherix Ltd, 145048.doc -69- 201026328
Redfield，NY)，此將誘發視網膜中央血管破裂及毛細管中 斷。將幼畜及哺乳母畜置於正常空氣中，導致相對缺氧且 誘導新血管生成。P13時，使用異氟醚（5%誘導，3%與 1.5%氧組合用於維持）麻醉幼小鼠並暴露眼睛，且使用配 備有35號規格針之Nanofil注射器（WPI，Sarasota, FL)將1 μΐ 經眼内注射至左眼中。Ρ17時，剝離雙眼，固定於4°C下 4%三聚曱醛中4小時，且剝離視網膜。將視網膜浸於含有 0.5% Triton X-100及1%牛血清白蛋白之PBS中滲透之，用 PBS(pH 6.8 ; 1% Triton-X100、0.1 mM CaCl2、0.1 mM MgCh)中20 pg/ml生物素標記之同工凝集素B4(isolectin B4)(Sigma Aldrich, Gillingham, UK)，隨後 20 pg/ml ALEXA 488-抗生蛋白鏈菌素（Molecular Probes, Eugene, OR)染色，且平铺於 Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA)中。使用Nikon落射螢光顯微鏡以4倍放大 倍率使視網膜成像。使用Photoshop CS3以及Image J(NIH) 以不知情方式定量新血管及局部缺血面積，且表示為佔總 視網膜面積（=正常+局部缺血+新血管）之百分數。 結論 圖10A顯示藉由同工凝集素染色而可見之具有視網膜血 管結構之代表性平鋪視網膜。中央局部缺血區藉由上調血 管生成誘導因子來誘導視網膜血管之新血管生成及再生 長。新血管前緣為高增生性的，產生呈不規則血管圖案之 彎曲血管。最外側之區域含有未受影響之正常血管。視網 膜鋪片之定量顯示，利用阿瓦斯丁抑制VEGF如所預期， 145048.doc •70- 201026328 減少視網膜新血管生成（參看圖1〇B，未注射36·7土丨.8%相 對於經注射22.4±3.0%)。使用抗體1X06或LC〇8抑制Ang2 亦引起新血管生成減少（31.讨丨.1%相對於18·8±1.3%及 34.0±3.1%相對於25.4±3.4%)。作為對照之人類18(}注射對 新血管生成無影響（參看圖10Β，38·3 土丨·1%相對於 38.3±0.8%)。 【圖式簡單說明】 圖1供短暫表現之IgG選殖至表現載體中短暫表現： A)Ang2i-LC06(圖 1A) ; B)Ang2i-LC06(圖 1B)。 圖 2 經純化之抗 ANG-2 抗體 Ang2i-LC06、Ang2i-LC07 及 Ang2k-LC08 之 SDS-PAGE 凝膠。 圖3血管生成素-Tie2相互作用ELISA。 圖 4 Ang2i-LC06 及 Ang2k-LC08 對 ANG-2 與 Tie2 之結合 的抑制。 圖 5 Ang2i-LC06 及 Ang2k-LC08 對 ANG-1 與 Tie2 之結合 的抑制。 圖6測試抗ANG-2抗體之活體内功效的C〇1〇205異種移 植模型。 圖7 測試抗ANG-2抗體之活體内功效的KPL-4異種移植 模型。 圖8經由Biacore感測器圖譜測試ANG-1結合。 圖9藉由本發明抗體預防原發性結腸腫瘤異種移植物 (9A)及原發性乳房異種移植物（9B)之肺轉移/繼發性腫瘤。 圖10本發明抗體抑制視網膜病。 145048.doc -71 - 201026328 序列表 <110>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>抗人類血管生成素2抗體 <130> 25688 <140> 098142952 <141> 2009-12-15 <150> EP 08021835.7 <151> 2008-12-16 <160> 63 <170> Patentln version 3.2
<210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR3，<ANG-2>Ang2i_LC06 <400> 1
Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly 15 10 15
Ala Phe Asp lie 20 <210> 2 <211> 17
<212> PRT <213〉 人工 <220> <223〉重鏈CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC06 <400> 2
Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 1 5 10 15
Gly <210> 3 <211〉 5 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉重鏈CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC06 145048-序列表.doc 201026328 <400> 3
Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 4 <211> <212> <213> 11 PRT 人工 <220> <223> 輕鏈CDR3，<ANG_2>Ang2i_LC06 <400> 4
Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Tyr Val 1 5 10 <210> <211> 5 7 <212> <213> PRT 人工 <220> <223> 輕鏈CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC06 <400> 5
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> <212> <213> 11 PRT 人工 <220> <223> 輕鏈CDR1 ’ <ANG-2>Ang2i_LC00 <400> 6
Gly Gly Asn Asn lie Gly Ser Lys Ser Val His 15 10 <210> <211> <212> <213> 7 129 PRT 人工 <220> <223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC06 <400> 7
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 2- 145048-序列表.doc 201026328 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> 人工 <220> < 2 2 3 > 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC06 <400> 8
Gin Pro Gly Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15
Thr Ala Arg lie Thr Cys Gly Gly Asn Asn lie Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 145048·序列表.doc 201026328
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR3，<ANG-2>Ang2i_LC07 <400> 9
Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly 15 10 15
Ala Phe Asp lie 20 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR2，<ANG-2>Ang2i一LC07 <400> 10
Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉重鏈CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC07 <400> 11 -4- 145048-序列表.doc 201026328
Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR3，<ANG-2>Ang2i一LC07 <400> 12
Gin Val Trp Asp Ser Asp Ser Asp Gin Gly Val 15 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR2，<ANG-2>Ang2i_LC07 <400> 13 Asp Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5
<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鍵CDR1，<ANG-2>Ang2i_LC07 <400> 14
Gly Gly Asn Phe lie Gly Gly Lys Ser Val His 15 10 <210> 15 <211> 129 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC07 <400> 15
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 145048·序列表 _doc 201026328
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC07 <400> 16
Gin Pro Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Ala Arg Val Ala Cys Gly Gly Asn Phe lie Gly Gly Lys Ser Val 20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45
Asp Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg lie Ser Gly Ser 50 55 60 6- 145048·序列表.doc 201026328
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu lie lie Thr Arg Ala Glu Ala Gly 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Gin Val Trp Asp Ser Asp Ser Asp Gin 85 90 95
Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR3，<ANG-2>Ang2k一LC08
<400> 17
Pro Thr Leu Asp lie Tyr Met Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR2，<ANG-2>Ang2k一LC08 <400> 18
Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鍵CDR1，<ANG-2>Ang2k—LC08 <400> 19
Ser Tyr Gly Met His 1 5 145048-序列表,doc 201026328 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR3，<ANG-2>Ang2k_LC08 <400> 20
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 15 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR2，<ANG-2>Ang2k_LC08 <400> 21
Asn Asn Asp Gin Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR1，<ANG-2>Ang2k_LC08 <400> 22
Ser Gly Phe Ala Ser Asn lie Gly Ser Asn Ser Val Asn 15 10 <210> 23 <211> 124 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈可變域，<ANG-2> Ang2kJLC08 <400> 23
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 •8 145048·序列表.doc 201026328
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Thr Leu Asp lie Tyr Met Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC08 <400> 24
Gin Pro Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Phe Ala Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30 ❿
Ser Val Asn Trp Tyr Gin Gin Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
Pro Asp Arg Phe Ser 60 lie Tyr Asn Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val 50 55
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 9- 145048-序列表.doc 201026328
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110 <210> <211> 25 7 <212> <213> PRT 人工 <220> <223> 重鏈CDR3，<ANG-2>Ang2s_LC09 <400> 25
Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Val 1 5 <210> <211> <212> <213> 26 19 PRT 人工 <220> <223> 重鏈CDR2，<ANG_2> Ang2s_LC09 <400> 26
Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 15 10 15
Val Lys Gly <210> <211> <212> <213> 27 5 PRT 人工 <220> <223> 重鏈CDIU，<ANG_2> Ang2s一LC09 <400> 27
Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> <211> 28 7 <212> <213> PRT 人工 <220> <223> 輕鏈CDR3，<ANG-2>Ang2s一LC09 <400> 28 10- 145048-序列表.doc 201026328
Met Gin Ala Leu Gin lie Pro 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR2，<ANG-2> Ang2s_LC09 <400> 29
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 30
<211> 16 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉輕鏈 CDIU，<ANG_2>Ang2s—LC09 <400> 30
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 15 10 15 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉重鏈可變域，<ANG_2>Ang2s_LC09 <400> 31
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala 35 40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 • n- 145048·序列表.doc 201026328
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Val Trp Gly Ser Pro Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 109 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈可變域，<ANG-2> Ang2s_LC09 <400> 32
Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie 15 10 15
Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr 20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala Leu Gin lie Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr 100 105 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> 人工 •12· 145048·序列表.doc 201026328 <220> <223> 重鏈CDR3，<ANG-2> Ang2i_LC10 <400> 33
Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly 15 10 15
Ala Phe Asp lie 20 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉重鏈CDR2，<ANG-2> Ang2i_LC10
<400> 34
Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR1，<ANG-2>Ang2iJLC10 <400> 35
Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR3，<ANG-2>Ang2i_LC10 <400> 36
Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val 15 10 •13· 145048·序列表.doc 201026328 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR2，<ANG-2> Ang2i_LC10 <400> 37
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉輊鏈CDR1，<ANG_2>Ang2iJX10 <400> 38
Gly Gly Asn Asn lie Gly Ser Lys Ser Val His 15 10 <210〉 39 <211> 129 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈可變域，<ANG-2> Ang2i_LC10 <400> 39
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala 35 40
Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 14- 145048-序列表.doc 201026328 85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser <210> 40 <211> 105 <212> PRT <213> 人工
<220> <223> 輕鏈可變域，<ANG-2> Ang2i_LC10 <400> 40
Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin Thr Ala Arg lie Thr 15 10 15
Cys Gly Gly Asn Asn lie Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gin Gin 20 25 30
Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg 35 40 45
Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 50 55 60
Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr 65 70 75 80
Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val Phe Gly Gly 85 90 95
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> 人工 <220> -15- 145048-序列表.doc 201026328 <223> 重鏈CDR3，<ANG-2>Ang2k_LCll <400> 41
Pro Thr Leu Asp lie Tyr Met Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213〉 人工 <220> <223〉重鏈CDR2，<ANG-2> Ang2k_LCll <400> 42
Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly 3 4 5
Is <210> <211> <212> <213〉 <220> <223〉重鏈CDR1，<ANG-2>Ang2k_LCll <400> 43
Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 輕鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2k_LCll <400> 44
Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Pro Gly Val 15 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 145048·序列表.doc -16- 201026328 <220> <223〉輕鏈 CDR2，<ANG-2>Ang2k_LCll <400> 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈 CDIU, <ANG-2>Ang2kJLCll <400> 46 Gly Gly Asn Asn lie Gly Ser Lys Ser 1 5 <210> 47 <211> 124 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2kJLCll <400> 47 10
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Thr Leu Asp lie Tyr Met Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 • 17· 145048-序列表.doc 201026328
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈可變域，<ANG-2> Ang2k_LCll <220> <221> misc_feature <222> (98)7.(98) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基睃 <220> <221> raisc_f eature <222> (1027..(102) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 48
Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin Thr Ala Arg He Thr 1 5 10 15 Cys Gly Gly Asn Asn He Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gin Gin 20 25 30
Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg 35 40 45
Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 50 55 60
Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr 65 70 75 80
Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Pro Gly Val Phe Gly 85 90 95
Gly Xaa Thr Lys Leu Xaa Val Leu Gly Gin 100 105 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 145048-序列表.doc -18- 201026328 <22〇> <223〉重鏈CDR3，<ANG-2> Ang2s_R3_LC03 <400> 49
Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Val 1 5 <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR2，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 <400> 50
Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
Val Lys Gly <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 重鏈CDR1，<ANG-2>Ang2s_R3JLC03 <400> 51
Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈 CDR3，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 <400> 52
Gin Gin Tyr Asp Asn Leu Pro Met Tyr Thr
1 5 10 <210> 53 <211> 7 <212> PRT -19- 145048-序列表.doc 201026328 <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR2，<ANG-2> Ang2s—R3_LC03 <400> 53
His Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈CDR1，<ANG-2> Ang2s_R3一LC03 <400> 54
Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Arg Leu Asn 15 10 <210> 55 <211> 118 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03 <400> 55
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 •20· 145048-序列表.doc 201026328
Tyr Cys Thr Thr Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 110 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 輕鏈可變域，<ANG-2> Ang2s__R3_LC03 <400> 56
Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Arg 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Asn Leu Pro Met 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 57 <211> 330 <212> PRT <213> 智人 <400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 •21 145048-序列表.doc 201026328
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 65 70 75
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 145 150 155
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 225 230 235
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu
Ser Ser Thr 80 Lys Cys Pro Cys Trp 160 Glu Leu Asn Gly Glu 240 Tyr Asn 145048·序列表 _doc •22- 201026328 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 58 <211> 327 <212> PRT <213> 智人 <400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val -23- 145048-序列表.doc 140201026328 130
Asp Val Ser Gin Glu Asp 145 150 Gly Val Glu Val His Asn 165 Asn Ser Thr Tyr Arg Val 180 Trp Leu Asn Gly Lys Glu 195 Pro Ser Ser He Glu Lys 210 Glu Pro Gin Val Tyr Thr 225 230 Asn Gin Val Ser Leu Thr 245 lie Ala Val Glu Trp Glu 260 Thr Thr Pro Pro Val Leu 275 Arg Leu Thr Val Asp Lys 290 Cys Ser Val Met His Glu 305 310 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 59 Arg Thr Val Ala Ala Pro
Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 155 160
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 170 175
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 185 190
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 200 205 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 220
Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 235 240
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 250 255
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 265 270
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 280 285
Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 300
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 315 320
Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 145048-序列表.doc 24- 201026328 1 5 10 15 Gin Leu Lys Ser 20 Gly Thr Ala Ser Val 25 Val Cys Leu Leu Asn 30 Asn Phe
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 60 <211> 104 <212> PRT <213> 智人 <400> 60
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 15 10 15
Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr 20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His 65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 25- 145048-序列表.doc 100 201026328 <210> 61 <211> 1124 <212> PRT <213> 智人 <400> 61
Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu 15 10 15
Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu lie Leu lie Asn Ser Leu 20 25 30
Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys lie Ala Ser Gly 35 40 45
Trp Arg Pro His Glu Pro lie Thr lie Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu 50 55 60
Met Asn Gin His Gin Asp Pro Leu Glu Val Thr Gin Asp Val Thr Arg 65 70 75 80
Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys lie 85 90 95
Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala lie Arg 100 105 110 lie Arg Thr Met Lys Met Arg Gin Gin Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr 115 120 125
Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn lie Ser Phe Lys 130 135 140
Lys Val Leu lie Lys Glu Glu Asp Ala Val lie Tyr Lys Asn Gly Ser 145 150 155 160
Phe lie His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp lie Leu Glu Val 165 170 175
His Leu Pro His Ala Gin Pro Gin Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg 180 185 190
Tyr lie Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu lie Val 26· 145048-序列表.doc 201026328 195 200 205
Arg Arg Cys Glu Ala Gin Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys 210 215 220
Thr Ala Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys 225 230 235 240 lie Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu 245 250 255
Leu His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gin Glu 260 265 270 ❹
Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser 275 280 285
Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gin Cys Asn Glu Ala Cys His Pro 290 295 300
Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly 305 310 315 320
Glu Met Cys Asp Arg Phe Gin Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gin 325 330 335
Gly Leu Gin Cys Glu Arg Glu Gly lie Pro Arg Met Thr Pro Lys lie 340 345 350
Val Asp Leu Pro Asp His lie Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro 355 360 365 lie Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr 370 375 380
Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His 385 390 395 400
Thr Asp His Phe Ser Val Ala lie Phe Thr lie His Arg lie Leu Pro 405 410 415
Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met 420 425 430 •27· 145048-序列表doc 201026328
Val Glu Lys Pro Phe Asn lie Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu 435 440 445
Asn Ala Pro Asn Val lie Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val lie Asn 450 455 460 lie Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro lie Lys Ser Lys Lys 465 470 475 480
Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gin His lie Gin 485 490 495
Val Thr Asn Glu lie Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu 500 505 510
Tyr Glu Leu Cys Val Gin Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly 515 520 525
His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser lie Gly Leu Pro 530 535 540
Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gin Thr Thr Leu Asn 545 550 555 560
Leu Thr Trp Gin Pro lie Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val 565 570 575
Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gin Lys Ser Asp Gin Gin Asn lie Lys 580 585 590
Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg 595 600 605
Glu Gin Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gin Gly Glu 610 615 620
Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp lie Leu Pro Pro 625 630 635 640
Gin Pro Glu Asn lie Lys lie Ser Asn lie Thr His Ser Ser Ala Val 645 650 655 lie Ser Trp Thr lie Leu Asp Gly Tyr Ser lie Ser Ser lie Thr lie 660 665 670 -28 - 145048·序列表.doc 201026328
Arg Tyr Lys Val Gin Gly Lys Asn Glu Asp Gin His Val Asp Val Lys 675 680 685 lie Lys Asn Ala Thr lie Thr Gin Tyr Gin Leu Lys Gly Leu Glu Pro 690 695 700
Glu Thr Ala Tyr Gin Val Asp lie Phe Ala Glu Asn Asn lie Gly Ser 705 710 715 720
Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gin 725 730 735
Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu lie Ala lie Leu 740 745 750
Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu lie 755 760 765 lie Leu Gin Leu Lys Arg Ala Asn Val Gin Arg Arg Met Ala Gin Ala 770 775 780
Phe Gin Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gin Phe Asn Ser Gly Thr 785 790 795 800
Leu Ala Leu Asn Arg Lys Val Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr lie Tyr 805 810 815
Pro Val Leu Asp Trp Asn Asp lie Lys Phe Gin Asp Val lie Gly Glu 820 825 830
Gly Asn Phe Gly Gin Val Leu Lys Ala Arg lie Lys Lys Asp Gly Leu 835 840 845
Arg Met Asp Ala Ala lie Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp 850 855 860
Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly 865 870 875 880
His His Pro Asn lie lie Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly 885 890 895
Tyr Leu Tyr Leu Ala lie Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp 900 905 910 •29· 145048-序列表.doc 201026328
Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala lie 915 920 925 Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gin Gin Leu Leu His Phe 930 935 940 Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gin Lys Gin Phe 945 950 955 960 lie His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn He Leu Val Gly Glu Asn Tyr 965 970 975 Val Ala Lys He Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gin Glu Val Tyr 980 985 990
Val Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala lie G1 995 1000 1005
Ser Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser 1010 1015 1020
Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu lie Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro 1025 1030 1035
Tyr Cys Gly Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gin 1040 1045 1050
Gly Tyr Arg Leu Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr 1055 1060 1065
Asp Leu Met Arg Gin Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro 1070 1075 1080
Ser Phe Ala Gin lie Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu 1085 1090 1095
Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr 1100 1105 1110
Ala Gly I丄e Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala 1115 1120 <210> 62 -30· 145048-序列表 _doc 201026328 <211> 504 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>具有前導序列及His標籤之人類血管生成素-2 (ANG-2) <400> 62
Met Trp Gin lie Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 15 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser lie Gly Lys Lys 20 25 30
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu 65 70 75 80
Gin Val Leu Glu Asn lie Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys 85 90 95
Leu Glu Asn Tyr lie Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu lie 100 105 110
Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met lie Glu lie Gly 115 120 125
Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu 145 150 155 160
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin lie Leu Asp 165 170 175
Gin Thr Ser Glu lie Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190
Gin Leu Gin Ser 205
Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His lie lie 195 200 -31- 145048·序列表.doc 201026328 lie Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn 210 215 220
Ser lie lie Glu Glu Leu Glu Lys Lys lie Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270
Val Ala Lys Glu Glu Gin lie Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285
Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly lie Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300
Ser Thr Glu Glu lie Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320
Gly Trp Thr lie lie Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gin 325 330 335
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg 355 360 365
Tyr Val Leu Lys lie His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 工le His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys lie Ser Ser lie 405 410 415
Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430
Cys lie Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 32- 145048·序列表.doc 201026328 435 440 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin 450 455 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly lie Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met lie Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495
Ser Gly His His His His His His 500 <210> 63
<211> 506 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>具有前導序列及His標籤之人類血管生成素-1 (ANG-1) <400> 63
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala lie Leu Thr His 15 10 15 lie Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30
Tyr Asn Arg lie Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe lie Leu Pro 35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr 50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser 65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp 85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr lie Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met 100 105 110
Ala Gin lie Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu 115 120 125 -33 145048-序列表.doc 201026328
Glu lie Gly Thr 130
Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys 135 140
Leu Thr Asp Val 145
Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu 150 155 160 lie Gin Leu Leu
Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin 165 170 175
Leu Leu Gin Gin 180
Thr Asn Glu lie Leu Lys lie His Glu Lys Asn Ser 185 190
Leu Leu Glu His 195
Lys lie Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu 200 205
Leu Asp Thr Leu 210
Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr 215 220
Arg Gin Thr Tyr 225 lie lie Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala 230 235 240
Thr Thr Asn Asn
Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp 245 250 255
Thr Val His Asn 260
Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu 265 270
Lys Gly Gly Lys 275
Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp 280 285
Val Tyr Gin Ala 290
Gly Phe Asn Lys Ser Gly lie Tyr Thr lie Tyr lie 295 300
Asn Asn Met Pro 305
Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn 310 315 320
Gly Gly Gly Trp
Thr Val lie Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp 325 330 335
Phe Gin Arg Gly 340
Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser 345 350
Gly Glu Tyr Trp
Leu Gly Asn Glu Phe lie Phe Ala lie Thr Ser Gin 145048·序列表.doc 34- 201026328 355 360 365
Arg Gin Tyr Met Leu Arg lie Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg 370 375 380
Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His lie Gly Asn Glu Lys Gin Asn 385 390 395 400
Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser 405 410 415
Ser Leu lie Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn 420 425 430
Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp 435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala 450 455 460
Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly lie Lys Trp His Tyr Phe Lys 465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met lie Arg Pro Leu 485 490 495
Asp Phe Ser Gly His His His His His His 500 505
-35- 145048-序列表doc

Claims (1)

  1. 201026328 七、申請專利範圍： 1. 一種與人類血管生成素-2(ANG-2)特異性結合之抗體， 其特徵在於包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 49之CDR3區為重鏈可變域CDR3區。 2. 如請求項1之抗體，其特徵在於 a) 該重鏈可變域包含：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33、 ® SEQ ID NO: 41 或 SEQ ID NO: 49之 CDR3 區；SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 50之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 51之 CDR1 區，及 b) 該輕鏈可變域包含：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 36、 ❿ SEQ ID NO: 44 或 SEQ ID NO: 52 之 CDR3 區；SEQ ID NO: 5 ' SEQ ID NO: 13 ' SEQ ID NO: 21 > SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 45 或 SEQ ID NO: 53之 CDR2 區；及 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 46或 SEQ ID NO: 54之 CDR1 區。 3. 如請求項1之抗體，其特徵在於包含 a) SEQ ID NO: 7 > SEQ ID NO: 15 ' SEQ ID NO: 23 ' 145048.doc 201026328 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 47或 SEQ ID NO: 55之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 48或 SEQ ID NO: 56之輕鏈可變域。 4.如請求項1之抗體，其特徵在於 a) 該重鏈可變域包含SEQ ID NO: 1之CDR3區、SEQ ID NO: 2之 CDR2 區及 SEQ ID NO: 3 之 CDR1 區，及 b) 該輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 4之CDR3區、SEQ ID NO: 5 之 CDR2 區及 SEQ ID NO: 6之 CDR1 區。 5·如請求項4之抗體，其特徵在於包含 a) SEQ ID NO: 7之重鍵可變域；及 b) SEQ ID NO: 8之輕鏈可變域。 6. 如請求項1之抗體，其特徵在於 a) 該重鏈可變域包含SEQ ID NO: 17之CDR3區、SEQ IDNO: 18 之 CDR2 區及SEQIDNO: 19 之 CDR1區，及 b) 該輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 20之CDR3區、SEQ ID NO: 21 之 CDR2 區及 SEQ ID NO: 22之 CDR1 區。 7. 如請求項6之抗體，其特徵在於包含 a) SEQ ID NO: 23之重鏈可變域；及 b) SEQ ID NO: 24之輕鏈可變域。 8·如請求項1至7中任一項之抗體，其特徵在於 該抗體不與人類血管生成素l(ANG-l)結合。 9.如請求項1至7中任一項之抗體，其特徵在於該抗體屬於 145048.doc 201026328 人類IgG4亞類或屬於人類1§<31亞類。 10. —種醫藥組合物’其特徵在於包含如請求項丨至8中任一 項之抗體或片段。 11. 如請求項1至7中任一項之抗體，其用於預防轉移。 12. —種如請求項丨至8中任一項之抗體的用途，其係用於製 造供預防轉移之藥物。 13. 如請求項1至7中任一項之抗體，其係用於治療癌症。 ❿14. 一種如請求項丨至8中任一項之抗體的用途其係用於製 造供治療癌症之藥物。 15. 如請求項丨至7中任一項之抗體，其係用於治療血管疾 病。 16. —種如請求項〗至8中任一項之抗體的用途，其係用於製 造供治療金管疾病之藥物。 17·如請求項！至7中任一項之抗體，其係用於治療血管疾 病0 參 如月求項1至7中任一項之抗體，其係用於治療視網膜 病。 19. 一種如請求項丨至8中任一項之抗體的用途，其係用於製 造供治療視網膜病之藥物。 20. —種編碼與人類血管生成素_2(ANG_2)特異性結合之抗 體之重鏈的核酸，其特徵在於該抗體包含如請求項 述之可變域。 21·種表現載體’其特徵在於包含如請求項2〇之核酸，其 用於在原核或真核宿主細胞中表現與人類血管生成素-2 145048.doc 201026328 (ANG-2)特異性結合之抗體。 22. 一種原核或真核宿主細胞，其包含如請求項21之載體。 145048.doc
TW098142952A 2008-12-16 2009-12-15 抗人類血管生成素２抗體 TWI396549B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08021835 2008-12-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201026328A true TW201026328A (en) 2010-07-16
TWI396549B TWI396549B (zh) 2013-05-21

Family

ID=40585738

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102107374A TWI482631B (zh) 2008-12-16 2009-12-15 抗人類血管生成素２抗體
TW098142952A TWI396549B (zh) 2008-12-16 2009-12-15 抗人類血管生成素２抗體

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102107374A TWI482631B (zh) 2008-12-16 2009-12-15 抗人類血管生成素２抗體

Country Status (34)

Country Link
US (12) US8133979B2 (zh)
EP (1) EP2379592B1 (zh)
JP (2) JP5559191B2 (zh)
KR (2) KR101445518B1 (zh)
CN (3) CN103739709B (zh)
AR (2) AR074756A1 (zh)
AU (1) AU2009328613B2 (zh)
BR (2) BR122013022089B1 (zh)
CA (2) CA2744624C (zh)
CL (2) CL2011001285A1 (zh)
CR (2) CR20110321A (zh)
CY (1) CY1116264T1 (zh)
DK (1) DK2379592T3 (zh)
EC (2) ECSP11011139A (zh)
ES (1) ES2534635T3 (zh)
HK (2) HK1172349A1 (zh)
HR (1) HRP20150439T1 (zh)
HU (1) HUE024545T2 (zh)
IL (2) IL213039A (zh)
MA (1) MA32876B1 (zh)
MX (1) MX2011005908A (zh)
MY (2) MY155654A (zh)
NZ (2) NZ600005A (zh)
PE (2) PE20140814A1 (zh)
PH (1) PH12013502192B1 (zh)
PL (1) PL2379592T3 (zh)
PT (1) PT2379592E (zh)
RU (2) RU2569107C2 (zh)
SG (1) SG172216A1 (zh)
SI (1) SI2379592T1 (zh)
TW (2) TWI482631B (zh)
UA (2) UA103912C2 (zh)
WO (1) WO2010069532A1 (zh)
ZA (2) ZA201103990B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI559931B (en) * 2013-12-20 2016-12-01 Hoffmann La Roche Combination therapy with an anti-ang2 antibody and a cd40 agonist

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8574577B2 (en) 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
US8454960B2 (en) 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
CN108864285A (zh) 2008-01-03 2018-11-23 斯克里普斯研究院 通过模块识别结构域的抗体靶向
US8557242B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
US8133979B2 (en) * 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
BRPI1014089A2 (pt) 2009-04-02 2016-04-19 Roche Glycart Ag anticorpos multiespecíficos que compreendem anticorpos de comprimento completo e fragmentos fab de cadeia simples
JO3182B1 (ar) * 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
US20120189635A1 (en) 2009-07-29 2012-07-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for Treating or Preventing Malaria by Administering an Antibody that Specifically Binds Angiopoietin-2 (Ang-2)
US8980268B2 (en) 2009-07-29 2015-03-17 Regeneron Pharamceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering an anti-Ang-2 antibody
SG10201408401RA (en) 2009-09-16 2015-01-29 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
AR080793A1 (es) * 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
WO2012009705A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Zyngenia, Inc. Ang-2 binding complexes and uses thereof
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
CN102221615A (zh) * 2011-03-31 2011-10-19 广州华灿医药科技有限公司 一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US9512220B2 (en) 2011-04-05 2016-12-06 Neopharm Co., Ltd. Antibodies against angiopoietins 1 and 2, and their use
CN103857699B (zh) 2011-05-24 2016-08-31 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
ES2757473T3 (es) 2011-09-30 2020-04-29 Dana Farber Cancer Inst Inc Péptidos terapéuticos que comprenden anticuerpos que se unen a la secuencia A relacionada con el polipéptido del CMH de clase I (MICA)
CN104105711B (zh) 2012-02-10 2018-11-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单链抗体及其他异多聚体
JP2015520168A (ja) * 2012-05-24 2015-07-16 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 多重特異性抗体
EP2867253B1 (en) 2012-06-27 2016-09-14 F. Hoffmann-La Roche AG Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
BR112014028368A2 (pt) 2012-06-27 2017-11-14 Hoffmann La Roche método de produção de conjugado de região fc de anticorpo, conjugado de região fc de anticorpo e formulação farmacêutica
US9695233B2 (en) 2012-07-13 2017-07-04 Roche Glycart Ag Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
KR101967345B1 (ko) 2012-10-18 2019-04-09 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도
WO2014108854A1 (en) * 2013-01-09 2014-07-17 Fusimab Ltd. Monospecific anti-hgf and anti-ang2 antibodies and bispecific anti-hgf/anti-ang2 antibodies
EP2970483A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-ccr7 antigen binding proteins
KR20150130462A (ko) 2013-03-15 2015-11-23 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 치료 펩티드
CA2907181C (en) 2013-03-15 2023-10-17 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
KR102131371B1 (ko) 2013-07-02 2020-07-08 삼성전자주식회사 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도
EP2835380B2 (en) 2013-07-29 2021-04-07 Samsung Electronics Co., Ltd Method of blocking vascular leakage using an anti-Ang2 antibody
KR102146845B1 (ko) 2013-07-30 2020-08-21 삼성전자주식회사 앤지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
KR102196450B1 (ko) 2013-09-17 2020-12-30 삼성전자주식회사 Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제
KR102206029B1 (ko) 2014-01-27 2021-01-20 삼성전자주식회사 Ang-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
EP3925973A1 (en) 2014-03-14 2021-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
US9957333B2 (en) * 2014-04-17 2018-05-01 Case Western Reserve University Anti-CEP antibody or fragment thereof
AR100270A1 (es) * 2014-05-19 2016-09-21 Lilly Co Eli Anticuerpos ang2
KR102349370B1 (ko) 2014-05-26 2022-01-10 삼성전자주식회사 인간화 또는 친화도 성숙된 항 앤지오포이에틴-2 항체 및 그의 용도
CA2963091A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Angiopoietin-2 biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response
CA2964470A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Amgen Inc. Antibodies directed to angiopoietin-1 and angiopoietin-2 for ocular therapies
CN107001456A (zh) * 2014-11-10 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ang2 抗体及使用方法
JP6721590B2 (ja) 2014-12-03 2020-07-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
KR20170105609A (ko) * 2015-01-28 2017-09-19 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 신생혈관형성에 특이적인 신규한 단백질
EP3770171A1 (en) 2015-04-03 2021-01-27 XOMA Technology Ltd. Treatment of cancer using inhibitors of tgf-beta and pd-1
AU2016307943A1 (en) 2015-08-14 2018-02-15 Allergan, Inc. Heavy chain only antibodies to PDGF
PE20181363A1 (es) 2015-09-23 2018-08-27 Genentech Inc Variantes optimizadas de anticuerpos anti-vegf
WO2017091850A1 (en) 2015-11-30 2017-06-08 Pieris Australia Pty Ltd. Novel anti-angiogenic fusion polypeptides
WO2018114728A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with a bispecific anti-ang2/vegf antibody and a bispecific anti-her2 antibody
KR102143132B1 (ko) * 2016-12-26 2020-08-10 기초과학연구원 항 Ang2 항체를 포함하는 안구질환 예방 및 치료용 조성물
AU2018237359B2 (en) 2017-03-22 2024-06-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
SG11201908547VA (en) 2017-03-22 2019-10-30 Genentech Inc Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
KR102497171B1 (ko) * 2018-02-20 2023-02-08 기초과학연구원 항-안지오포이에틴-2(Ang2) 항체 및 그의 용도
WO2019164219A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Institute For Basic Science Anti-angiopoietin-2 antibodies and uses thereof
TW202027794A (zh) 2018-10-03 2020-08-01 瑞士商諾華公司 血管生成素樣３多肽之持續遞送
SG11202108832XA (en) * 2019-02-25 2021-09-29 Pharmabcine Inc Anti-ang2 antibody and use thereof
AU2020308569A1 (en) 2019-06-27 2021-12-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-ANGPT2 antibodies
WO2021183849A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
JP2023519213A (ja) 2020-03-24 2023-05-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｉｅ２結合剤および使用方法
JP2023504675A (ja) 2020-05-19 2023-02-06 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ガンの処置のための結合分子
CA3190173A1 (en) * 2020-06-22 2021-12-30 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-ang-2 antibody and use thereof
IL302087A (en) 2020-10-15 2023-06-01 Genentech Inc Hyaluronic acid binding derivatives of versican (vg1) for long acting delivery of therapeutics
AU2023347848A1 (en) * 2022-09-19 2025-03-27 Sonoma Biotherapeutics, Inc. Citrullinated antigen-specific chimeric antigen receptors for targeting regulatory t cells to treat hidradenitis suppurativa

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5814464A (en) * 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US7521053B2 (en) * 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
RU2277411C1 (ru) * 2004-12-15 2006-06-10 Ольга Алексеевна Кост Фармацевтическая композиция для лечения глазных болезней, связанных с нарушением микроциркуляции и/или воспалительными процессами
DK1838733T3 (da) 2004-12-21 2011-11-28 Medimmune Ltd Antistoffer rettet mod angiopoietin-2 og anvendelser deraf
CA2799802A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
ES2390354T3 (es) * 2005-07-22 2012-11-12 Amgen, Inc Liofilizados de proteínas concentrados, procedimientos y usos
WO2007033216A2 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods and compositions for the treatment and diagnosis of diseases characterized by vascular leak, hypotension, or a procoagulant state
EP2518083A3 (en) 2005-12-15 2012-12-05 Medimmune Limited Combination of angiopoietin-2 antagonist and of VEGF-A, KDR and/or FLTL antagonist for treating cancer
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
EP1987064A4 (en) * 2006-02-01 2010-04-07 Arana Therapeutics Ltd DOMAIN ANTIBODY CONSTRUCT
JP5596559B2 (ja) * 2008-01-28 2014-09-24 メディミューン リミテッド 安定化アンジオポエチン２抗体とその用途
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
US8133979B2 (en) * 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
US9695233B2 (en) * 2012-07-13 2017-07-04 Roche Glycart Ag Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI559931B (en) * 2013-12-20 2016-12-01 Hoffmann La Roche Combination therapy with an anti-ang2 antibody and a cd40 agonist

Also Published As

Publication number Publication date
CN102746400A (zh) 2012-10-24
AU2009328613B2 (en) 2013-09-05
US20200262904A1 (en) 2020-08-20
PE20120551A1 (es) 2012-05-21
US20120141500A1 (en) 2012-06-07
JP5559191B2 (ja) 2014-07-23
JP2014000089A (ja) 2014-01-09
IL226350A (en) 2016-10-31
CR20130418A (es) 2013-10-04
HK1195775A1 (zh) 2014-11-21
RU2013140625A (ru) 2015-03-10
WO2010069532A1 (en) 2010-06-24
ZA201307297B (en) 2019-07-31
AR074756A1 (es) 2011-02-09
MY158438A (en) 2016-10-14
ECSP11011139A (es) 2011-07-29
RU2011129204A (ru) 2013-01-27
PT2379592E (pt) 2015-03-24
US20130156789A1 (en) 2013-06-20
CA2744624A1 (en) 2010-06-24
US20150284457A1 (en) 2015-10-08
MX2011005908A (es) 2011-06-20
US20210388071A1 (en) 2021-12-16
HRP20150439T1 (hr) 2015-05-22
US20180282404A1 (en) 2018-10-04
KR20130103822A (ko) 2013-09-24
WO2010069532A8 (en) 2012-05-10
CA2916481C (en) 2018-05-15
UA103912C2 (uk) 2013-12-10
US9109027B2 (en) 2015-08-18
CN103739709B (zh) 2016-08-24
NZ592856A (en) 2012-06-29
SI2379592T1 (sl) 2015-06-30
TWI396549B (zh) 2013-05-21
UA105151C2 (uk) 2014-04-10
US8133979B2 (en) 2012-03-13
ECSP13011139A (es) 2014-10-31
US20230227543A1 (en) 2023-07-20
TWI482631B (zh) 2015-05-01
ES2534635T3 (es) 2015-04-27
US20140065707A1 (en) 2014-03-06
NZ600005A (en) 2012-08-31
PE20140814A1 (es) 2014-07-10
HUE024545T2 (hu) 2016-01-28
US20170029493A1 (en) 2017-02-02
US8399626B2 (en) 2013-03-19
CN102257008A (zh) 2011-11-23
AR092487A2 (es) 2015-04-22
CL2012003054A1 (es) 2012-12-14
US9073986B2 (en) 2015-07-07
KR101445518B1 (ko) 2014-10-01
US20140065151A1 (en) 2014-03-06
EP2379592A1 (en) 2011-10-26
US8361747B2 (en) 2013-01-29
JP5814317B2 (ja) 2015-11-17
TW201322996A (zh) 2013-06-16
JP2012511897A (ja) 2012-05-31
DK2379592T3 (en) 2015-03-02
AU2009328613A1 (en) 2010-06-24
ZA201103990B (en) 2016-01-27
PL2379592T3 (pl) 2015-07-31
PH12013502192A1 (en) 2015-10-12
CL2011001285A1 (es) 2011-09-16
SG172216A1 (en) 2011-07-28
CA2916481A1 (en) 2010-06-24
MY155654A (en) 2015-11-13
RU2569107C2 (ru) 2015-11-20
CA2744624C (en) 2018-01-02
MA32876B1 (fr) 2011-12-01
KR101381012B1 (ko) 2014-04-11
BR122013022089A2 (pt) 2019-05-28
IL213039A0 (en) 2011-07-31
IL226350A0 (en) 2013-06-27
US20100159587A1 (en) 2010-06-24
HK1172349A1 (zh) 2013-04-19
PH12013502192B1 (en) 2015-10-12
US9340609B2 (en) 2016-05-17
CN103739709A (zh) 2014-04-23
BRPI0923434A2 (pt) 2017-09-19
EP2379592B1 (en) 2015-02-11
BR122013022089B1 (pt) 2021-10-13
CR20110321A (es) 2011-07-14
CY1116264T1 (el) 2017-02-08
RU2569461C2 (ru) 2015-11-27
KR20110084536A (ko) 2011-07-25
CN102746400B (zh) 2015-12-16
US20120142091A1 (en) 2012-06-07
IL213039A (en) 2015-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230227543A1 (en) Antibodies against human angiopoietin 2
TW201018485A (en) Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
AU2013203458B2 (en) Antibodies against human Angiopoietin 2

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees