TW200838546A

TW200838546A - Functionalized beta 1,6 glucosamine disaccharides and process for their preparation

Info

Publication number: TW200838546A
Application number: TW096143518A
Authority: TW
Inventors: Stephane Moutel; Jacques Bauer; Carlo Chiavaroli
Original assignee: Om Pharma
Priority date: 2006-11-16
Filing date: 2007-11-16
Publication date: 2008-10-01
Also published as: JP2010510190A; US20130035479A1; IL198748A0; EP2106403A2; WO2008059307A2; AU2007321172A1; AR063854A1; US20100168054A1; RU2481352C2; MX2009005054A; RU2009122714A; CA2669401A1; WO2008059035A3; BRPI0721482A2; CN101627048A; ZA200903340B; KR20090101162A; WO2008059035A2

Description

200838546 九、發明說明：【發日月所屬之技術領域】發明領域本發明涉及化學合成β_(1—6)連接葡糖胺二糖的新方 5法。該化合物可以用作脂質Α的衍生物。脂質Α衍生物的一個實例是OM-174-DP㊣衍生物，首先由〇Μ 從部分降解的大腸桿菌脂多糖中分離。本發明包括缺失兩個糖 -0-醯基取代基(在〇-3和〇_3，)並且因此僅攜帶尽連接的脂肪酸殘基的新脂質A類似物的設計和化學合成。這類化合物 10的免疫活性與該母體生物的^^以^的免疫活性有關。 I[先前】發明背景脂多糖類(LPS)是在幾乎所有革蘭氏陰性菌外膜表達的主要化合物。這些兩親的大分子具有常規的結構，由共 I5價連接至被稱爲脂質八的親脂部分的親水多糖（由核心募糖和〇-特異多糖生成）組成2，脂質A用作LPS膜固著點。 LPS還已知作爲内毒素，是宿主防禦系統的有效刺激物，作爲疫苗抗原的佐劑3和作爲在動物模型中非特異性抵抗感染的誘導劑4。這些兩親大分子具有非常有效的免疫刺 2〇激活性5°LPS的生物活性主要歸因於脂質A組分，同時脂質 A的毒性嚴袼依賴於其一級結構。通苇，脂質A具有高度保守的結構。它一般由β-(1—6)_ 連接的葡糖胺二糖主鏈組成，在〇」和〇_4，位磷醯化，並且連接六個或更多脂肪醯基作爲酯和醯胺。減少葡糖胺部分 5 200838546 的正位元異構化磷酸酯（0-1位）的構型毫無例外地是α構型。例如，通過Imoto事的說明從大腸桿菌細胞中分離的脂質A的完整化學結構（第丨圖）包含β_(1^6)•連接的葡糖胺二糖主鏈’在0-1和〇_4’位填醯化，並且在2, 3位與(幻各經基 5十四烷酸醯化，在2,位與⑺)_3·十二烷醯氧十四烷酸醯化，並且在3’位與(及)-3-十四烧酸氧十四烧酸酿化。由於生物活性的廣譜性，引起了工業和實驗室學術研究的巨大興趣。許多努力已經致力於脂質A結構的化學修飾，目的在於降低母體化合物天然内毒性同時保持或改善 10其有益的免疫刺激性質。在1980s，Ribi等人研究了目的在於從潛在有用的免疫調製作用中解開天然心〜⑽ CA/·;;脱RC595脂質A毒性作用的化學過程。基於！鱗醯基團7以及連接於脂質A糖3-位的0)-3-羥基十四烷醯8殘基的選擇性水解，此方法提供了已知的單磷醯基脂質A(MpL®) 15免疫促進劑’其疋與其母體脂質A相比具有大大降低毒性的在預防性和療性疫田中有效的佐劑。但是，由於Lp $本身的不均一性和不完全的化學選擇性水解步驟或純化步驟’ MPL及天然衍生的脂質a是幾種組分的混合物。因此，疫促進劑除了主要的六醯基化合物，還包含幾種較 20 少南度酿化的化合物。在90’s早期，一種新脂質a衍生物(〇M_174-Dp(D，第1 圖）由OM PHARMA從部分降解的大腸桿菌Lpsi中分離。該衍生物缺失兩個糖-Ο-醯基取代基(在〇_3和〇_3，），且因此僅攜帶大腸桿菌脂質A的連接的脂肪酸殘基，即在#_2的 200838546 (i?) - 3 - 基十四焼*酿基團和在U ’的（7?) 3 -十二烧^酿氧十四烷醯基團，因此僅在結構上留下三個長鏈醯基。此新化合物的充分藥學研究顯示其在一些邀冷腫瘤模型中1()具有有效的抗腫瘤活性並且其是具有非常低毒性的有效免疫佐 5 劑。近二十年廣泛研究了脂質A的構效關係。Shiba和合作者已經直接致力於研究合成的大腸桿菌脂質A的構效關係並且努力於研發這些化合物的化學合成。他們已經首先實現了單磷醯基大腸桿菌脂質A11的化學合成，但是尤其是他 10 們已經通過基於N-IYoc保護的葡糖胺衍生物的全化學合成明確地證實了大腸桿菌脂質A的結構12。該小組已經報導了就醯基部分(在糖主鏈上的類型，數量和位置）13而言以及就糖基磷酸酯部分(在1位元具有α或β構型的膦醯基氧乙基類似物）14而言大腸桿菌脂質Α的許多結構變化。 15 在1997，他們已經描述了最有效的脂質A前體的合成 15。通過此線路，已經報導了一些具有醯基鏈修飾的16以及糖基磷酸酯部分修飾的非天然類似物和脂質A自身的合成 17。該小組還公開了使用改進的路線化學合成從幽門螺桿菌分離的脂質A18。他們的出版物包括缺失兩個糖-0-醯基取 20 代基(在0-3和0-3’）的三醯化的脂質A類似物。但是除此之外該化合物在4’-0位還缺少取代。

Shiba的工作是後期合成各種脂質A的靈感來源。作爲證據，爲了闡明在衣原體相關炎症中脂質A的作用，最近已經由Kosma和合作者合成了合成的衣原體四-和五ϋ基脂質 200838546 錢似物'Biomira小組已經研發了非天'然合成的含有模擬天然出現的衍生自大腸桿菌的脂質A結構以及衍生自沙門氏菌的脂質A結構的新脂質部分的脂質a結構20。〇_3和合作者還報導了牙齦外琳單胞菌脂質A，一種僅攜帶^^連接 5的脂肪酸殘基並缺失4’_0_磷酸酯基團的三醯化脂質A，的化學合成21。 LPS和其相關化合物已經主要作爲^心激動劑被研九。近些年，月日貝A相關化合物已經作爲Lps拮抗劑被研究，其可以作爲免疫抑制劑並且通過滅活Lps_誘導的強力 10巨噬細胞在自身免疫疾病和敗血病上具有潛力。例如， Qureshi和合作者已經從類球紅細菌（Rs七pLA)分離了作爲有效的LPS拮抗劑的非毒性脂質a22，並且扭⑽丨小組已經研發了用它們自己的方法對所提出結構的全合成η和相關化合物即E5564, 一種有效抗-敗血病藥物μ。由於出現在所提 15 aRs_DPLA上的烯屬官能度，在前描述的基於最終水解的現有脂質A的合成方法而不能適用lid。近些年，合成了 Rs-DPLA和E5564的相關化合物25。脂多糖類和脂質A分子由於它們活化誘導受體 4(TLR4，toll like receptor 4)因此是免疫促進劑，甚至一歧 20 LPS可以活化TLR2，例如從牙齦卟琳單胞菌中的Lps26。通常，TLR2的應答僅通過例如胞壁醯基肽(MpM)、細菌脂月太 (BLP)、肽聚糖(PGN)和脂膜酸類(LTA)的試劑誘導。非常有趣的是，本發明的發明者現在發現：本發明合成的化合物 (且不僅是衍生自天然源的OM-174-DP，如描述在海報η或 200838546 者最近的綜述28)優先經人類TLR2起作用，且不是如在鼠類細胞的情形優先經預期的TLR4起作用。以前沒有公開過這種種間的顯著性質（在鼠類細胞中TLR4優先且在人類細胞中TLR2優先）。 5 【發明内容】發明概要

10 15

20 上面时論的現有技術沒有公開缺失兩個糖取代基 (在0-3和0-3’)並且包含4，-〇_磷酸酯基團或者在4，_〇位選擇性的取代的合成的脂質A的類似物。這樣的脂質A類似物具有有益的性質並且在（人類)藥物領域具有實用性。但是，這些脂質A類似物僅能夠艱苦地從天然源例如通過特殊的水解方法獲得。此外，以藥物可接受純度從天然源獲得這些化合物是進-步的技術挑戰，特別是由於原材料可能致病的生物獲得。考慮到這些問題，本發明的目、= 提供合成形式的此類化合物。爲此，根據本發明的第面是提供-種化學合錄(1，-連接_胺二糖的新: 法0 "、 ” ％口王I赞明合成方法獲得的產品的方法。用減理方法處理的産品具有改變的物理_ 化學組成並且根據優選的實施方案具有增加的生物活性。根據本發明的另-方面，涉及本發明方法獲得的化人物、合成方法獲得的中⑽、含有這些化合物的組合物: 及這些化合物在有機合成方法和/或藥物中的用途。在此值得提及的是本發明的化合物優先^人類T此 9 200838546 起作用。【實施方式3 較佳實施例之詳細說明本發明方法中的一個重要步驟是式10化合物與式7化 5 合物之間的糖基化反應：

⑽，

Ri是選自（C3-C6)烯基，例如C3或C4烯基，優選2-丙烯基或1 -丙稀基的基團， 10 X是氫，選自苄基或取代的苄基，例如4-甲氧苄基或3,4- 二甲氧苄基或2,5-二甲氧苄基或2,3,4-三甲氧苄基或3,4,5-三甲氧苄基的基團； R〇選自R5或者R2，其中R5是選自： ⑴從具有2至24個碳原子的直鏈羧酸衍生的醯基，優 15 選經基醯基，例如3-經基醯基，氧代醯基，例如3-氧代醯基，氣基酿基例如3 -氣基酿基， (ii) 醯基氧醯基，優選3-醯基氧醯基，醯基氨基醯基，優選3_醯基氨基醯基，醯基硫醯基，優選3-醯基硫醯基； (iii) 烷基氧醯基，優選(C2-C24)烷基氧醯基，烯基氧醯 20 基，優選(c2-c24)烯基氧醯基，炔基氧醯基，優選(c2-c24) 炔基氧醯基，烷基氨基醯基，優選(c2-c24)烷基氨基醯基，烯基氨基醯基，優選(c2-c24)烯基氨基醯基，炔基氨基醯 10 200838546 基，優選(CVC：24)炔基氨基醯基，烷基硫醯基，優選(C2-C24) 烷基硫醯基，烯基硫醯基，優選(C2-C24)烯基硫醯基，炔基硫S&基，優選(CVC24)快基硫醯基，從具有2至48個破原子的支鏈羧酸衍生的醯基，優選3位支鏈羧酸； 10 其中在(i)，（ii)，（iii)基團中，醯基的烴鏈可以飽和或不飽和，並且酿基，烧基，浠基，炔基的烴鏈可以是支鏈或直鏈並可以任選被一個或多個基團取代，該基團獨立地選自鹵素例如氟，氯，溴或碘；羥基或羥基衍生物_〇γ，其中Υ如下定義；胺或胺衍生物-NHW，其中w如下定義；ΟΖ 基團’其中Ζ選自（f)，（g)，⑻，⑴，⑴，⑻如下定義；並且R2疋％自（CrC6)鹵代規氧基羰基的基團，例如 2,2,2-三氣乙氧魏基(伙(冗)或甲基·2,2,2_三氣乙氧羰基(TCBOC);

15 ⑺，其中R4選自： (a) 如在(i)，（ii)or (Hi)中定義尺5的醯基； (b) 支鏈或直鏈烷基，優選支鏈或直鏈(Ci-C24)烷基；支鏈或直鏈烯基，優選支鏈或直鏈(Cl_C24)烯基；支鏈或直鏈炔基，優選支鏈或直鏈(CVC24)炔基； (c) -[(crc24)烧基]-COOX，-[(C2-C24)烯基]-COOX或 -[(CVC24)炔基]-coox基團，其中X如下定義； 11 20 200838546 (d) -[(CrC24)烷基]-NHW，-[(CrCW 烯基]-NHW 或 -[(CVC24)炔基]_NHW基團，其中w如下定義； (e) 甲醯基烷基，優選甲醯基[(Q-C24)烷基];甲醯基烯基，優選甲醯基[(C^C：24)烯基];甲醯基炔基，優選甲醯基 5 [(Q-C24)炔基]; (f) 二甲氧基磷醯基； (g) -P(〇)(〇Y)2基團，其中γ如下定義； (h) -P(0)(0H)-0[(cvc24)烷基]-NHW ， -Ρ(0)(0Η)-0[((ν(：24)烯基]_NHW 或-P(〇)(〇h)-〇[(Ci_C24) 10 炔基]-NHW基團，其中W如下定義； (i) -P(0)(0H)-0[(Cl-C24)烧基]，-P(0)(0H)-0[(Crc24) 烯基]，或·Ρ(0)(ΟΗ)-Ο[(〇ν€24)炔基]基團； ⑴-p(o)(oh)-o[(cvc24)烧基]-COOX ， -PCOXOHH^CCVCm)烯基]-coox，4(0)(01^0^,24) 15炔基]_COOX基團；其中X如下定義； (k) -S(0)(0H)2基團； (l) 選自苄基或取代的苄基的保護基團，例如4_甲氧节基或3,4-二甲氧苄基或2,5_二甲氧苄基或2,3,4-三甲氧苄基或3,4,5-二甲氧节基；或選自（〔3_匸6)烯基，例如cdQ烯 20基’優選2-丙烯基或1·丙烯基；其中烷基，烯基，炔基可以是支鏈或直鏈，並且可以是非取代或任選獨立地被一個或多個基團取代，該基團選自鹵素，例如氟、氯、溴或碘；羥基或羥基衍生物-〇γ，其中Υ如下定義；胺或胺衍生物，其中W如下定義；或 12 200838546 -OZ基團，其中Z選自（f)，（g)，（h)，⑴，⑴，（k); 並且其中Y選自氫，（CVC6)浠基，例如c2或c3烯基，優選2-丙烯基或1-丙烯基；選自苄基或取代苄基的基團，例如 4-甲氧苄基或3,4-二甲氧苄基或2,5-二甲氧苄基或2,3,4-三 5甲氧苄基或3,4,5-三甲氧苄基；0-亞二甲苯基；並且其中W選自氮，卞基氧幾基或9-苟甲氧幾基；並且其中R6是選自二氣乙δ&亞氣g旨’氣，氯，漠的基團’並且X和R2如上定義。可以根據本領域已知糖基化的通用方法實現該反應， 10 例如描述在如gew· CAem·, /此五％/·, (1986)，212中的方法。該方法使用作爲溶劑的二氯甲烷和催化劑量的酸，例如三曱基甲矽烷基三氟甲磺酸酯。當使用該方法時，僅獲得根據式llh的β-二糖。

(llh)，其中R!，R2，R4，R〇和X如上定義。連接的鍵表示 α和沒端基異構體都是可能的。可以選自如⑴定義的醯基或可選擇地爲在(H)，（Ui) 中定義的支鏈醯基。該醯基可以選自醯基氧醯基、醯基氨 20基醯基、醯基硫醯基、（CrC24)烷基氧醯基、（Ci-C24)烷基氨基醯基和(CrC24)烷基硫醯基。（Cn-Cn)，其中n是整數，例如如本說明書方式使用的（CrC24)和（CVC24)意指飽和或不 13 200838546 飽和烴鏈，其指的是可以含有間隔例如分別爲丨至24個碳原子和2至24個碳原子中指定數目的碳原子，例如2，4，6，^ 10 ’ 12 ’ 14 ’ 16 ’ 18 ’ 20，22個碳原子。在⑴，⑼或㈣的酿基和酸基衍生物中的酸基、烧基、烯基和炔基烴鍵可 5以各自獨立地含有從1至5〇個碳原子，例如從2至48個碳原子，包括1至24個碳原子，例如2至24個碳原子，尤其是2，心6’8’ 1〇’ 12’ 14’ 16’ 18,2〇,22個碳原子。例如（C2_Cy 烷基氧醯基中的烷基烴可含有2-24個碳原子而所述醯基部分的烴鏈可含有2-24個碳原子。 1〇醯基烴鏈可以是飽和的或者可以含有一個或多個不飽和碳雙鍵或三鍵。除此之外，該醯基、烷基、烯基和炔基的烴鏈可以是分支或直線的，並且可以任選獨立地由一個或夕個基團取代，該基團選自齒素例如氟，氯，演或埃；羥基或羥基衍生物-0Υ，其中γ如前定義；胺或胺衍生物 15 -NHW，其中W如前定義；·〇ζ基團，其中ζ選自⑴，⑻， (h) ’（1) ’⑴，⑻如前定義；在基氧基的情況下，兩個醯基經氧原子鏈接，在基氨基酿基的情況下，兩個ϋ基經NH基團鏈接，並且在基硫醯基的情況下，兩個醯基經硫好賴。（CIA)烧 20乳基酿基、（CVC24)烧基氣基醯基和(CVC24)烧基硫醯基可以由相應的羥基脂肪酸獲得。 Μ基優選地在3位取代，例如3·醯基氧醯基、3·酿基氨基酸基和3_醯基硫醯基。上述情況也適用於上述提及的 (Ci-C24)烷基等價物。 14 200838546 優選地’ R5基團的成員包括一個或多個醯基部分，優選地選自脂肪酸殘基、羥基脂肪酸殘基和氧脂肪酸殘基。當醯基氧醯基是3-醯基氧醯基時，這些醯基部分優選地包含3-羥基脂肪酸殘基或者酯連接的弘氧代脂肪酸殘基。醯基 5氧醯基的典型實例是酯連接在3-羥基位置的具有（(^(：24)- 魏酸的3-沒基(〇：4_(：24)-脂肪酸_酿基。優選地，該醯基氧醯基疋自日連接在3_羥基位置的具有（CiG_Ci士脂肪酸的3_羥基 (匕-匕8)-脂肪酸_醯基。該醯基氧醯基存在於革蘭氏陰性菌例如大腸柃菌、流感嗜血桿菌、空腸彎曲桿菌、膠狀紅長 10命菌、青紫色素桿菌、腦膜炎雙球菌、明尼蘇達沙門（氏）菌的脂質A組分中。在根據本發明第一組優選的葡糖胺二糖中爲尺5選擇的酿基乳醯基是S旨連接在3,基位置的具有Ci2·脂肪酸、在 N2位具有酸基氧醯基的3_經基Cw脂月方酸-醯基。在根據 I5本發明另一個優選的葡糖胺二糖中爲心選擇的酿基氧蕴基是醋連接在3_經基位置的具有.脂肪酸、並且優選醯基氧醯基在N2，-位的3-經基k脂肪酸邊基。在根據本發明另一個優選的葡糖胺二糖中机選擇的酸基氧醯基是醋連接在3令基位置的具有‘脂肪酸、在 20 N2-位具有醯基氧酿基的3嚷基Ci4_脂肪酸-醯基。在根據本發明另-個優選的葡糖胺二糖中爲Rs選擇的醯基氧酿基是酉曰連接在基位置的具有脂肪酸、在Nr位和位均具有ϋ基氧醯基的3_經基Ci4_脂肪酸醯基。當本發明的化合物含有手性中心時，本發明包括所有 15 200838546 R-和S-對映體以及任何外消旋混合物。，

Rs的其他選擇可以是醯基或者還可以是醯基氧醯基。 . 在根據本發明的第二組二糖中醯基是3_羥基(C4_C24)_脂肪酸，優選3-羥基脂肪酸。該脂肪酸的3_羥基可以被 5如刖疋義的X基團保護。在本發明優選的二糖中，該醯基是在N2-位或在N2，_位的3-羥基c14_脂肪酸。 · 仁疋Rs還可以疋上文定義的酿基氧醯基，並且含有 * 酯連接在3-經基位置的具有（c^c^羧酸的3_絲((^24)_ 脂肪酸醯基，優選醋連接在3邊基位置的具有A。*㈣ # 1〇酸的3-經基((ν(：18)-脂肪酸-醯基。更優選的是其中在觀立置的Rs是醋連接在3-經基位置的具有Ci2-脂肪酸或Ci6_脂肪酸的_3_經基脂肪酸-醯基並且其中在犯，位置的心是酯連接在3-經基位置的具有Ci2-脂肪酸或^•脂肪酸的_3名基Ch-脂肪酸-醯基的二糖。 15、輯優選的實施方案，第—組〜選自如定義的小組⑴ 並且第二組r5選自如申請專利範圍第】項中定義的小組⑼ 或㈣，其中優選在N_2位置的Rs選自⑴。在可選擇的實施 · 方案中，尺5基團相同或不同地都選自小組(i)或者相同或不同地都選自小組(ii)或(iii)。 20 f要指出的是，在R5基團中酿基間和/或醯基和烧基可以相互連接。在說明書中術語“脂肪酸殘基，，指的是：實質上疏水的 c2-c3。個原子的鏈，該鏈可以是直線的、分支的、飽和的、單或多不飽和的，具有-個或多健入的例如氮、氧、硫 16 200838546 的雜原子，並且該鏈可以被一個或多個例如經基、氧代、 &&氧基、烧氧基、氣基、瑣基、氣基、鹵素、魏基的取代基取代，只要生物活性實質上不受到相反的影響。取代的脂肪酸殘基的一個實例（包含一個酿胺連接的取代基）公開 5 於Onozuka，Κ· et al· in Int. J· Immunopharmac，Volume 15, pages 657-664 [1993])。 R4可以選自如上定義的（a)-(l)。R4取代基中的烷基、烯基、炔基鏈可以是分支的或直線的並且可以是不飽和的或任選地獨立地被一個或多個基團取代，該基團選自例如 1〇氟、氯、溴或峨的鹵素；經基或經基衍生物-ογ，其中γ如前定義；胺或胺衍生物-NHW，其中W如前定義。對於(a)， (b) ’（c)，（d) ’（e)基團來說，任選的取代基可以進一步包括 -OZ基團，其中Z選自（f)，（g)，（h)，⑴，⑴，（k)。優選地， R4選自⑴，(g)，⑻，⑴或⑴，更優選選自（g)。優選地基團 15 ⑻，（b) ’（c)，（d)，（e)，（f)，（g)，（h)，⑴，⑴包含 1 至5〇個碳原子，例如2至24個碳原子。在隨後的步驟中，從式llh化合物中水解地除去許多鹵化的（C1-C6)烧氧基羰基保護基團I。在說明書中除非另有說明許多意味著一個或多個。優選除去式llh化合物的全部 20 R2基團。如果R〇選擇爲，則式llh化合物將包含單個仏基團。如果R〇選擇爲R2，則式llh化合物將包含兩個I基團並且優選兩個基團都除去。所述R2基團可以用本領域技術人員已知的任何適合方法去除。本領域技術人員已知鹵化的 (C1-C6)烧氧基羰基保護基團例如Troc可以用鋅_銅偶合劑 17 200838546 在醋酸和水中去除。如果選擇R〇爲R5則將獲得式12a的化合物。

(12a)， 5 其中I，R4，R5和X如前定義。如果選擇R〇爲式llh中的則將優選獲得式12b的化合物：

(12b)，其中R!，R4，和X如前定義。 10 向式12a或12b化合物的游離氨基連接R5基團。其可以

在式12a或12b化合物與相應所述R5基團的（活化）羧酸間反應下完成。該反應可以在任何本領域技術人員已知的方式下完成，例如使用例如氯曱酸異丁酯或1-異丁基氧2-異丁基氧羰基-1,2-二氫喹啉或碳化二亞胺的偶合劑。在化合物12a 15 的反應中，該相應所述R5基團的（活化）羧酸包含相同或不同於式12a化合物R5基團的R5基團。式12a或12b化合物與相應所述R5基團的（活化）羧酸的反應使得產生式13化合物： 18 200838546

其中R〗，R4，R5和X如前定義。反5基團可以相同或不同。 13化合物的R5基圑是否相同或不同取決於是否在反應中使用12a化合物或12b化合物的事實和反應中（活化）羧酸的性質。如果使用12b化合物，則可能選擇不同於12b化合物R5 基團的（活化）羧酸的R5基團。在那種情況下13化合物的115 基團將不同。但是，（活化)羧酸的R5基團也可以與12b化合物的R5基團相同。並且清楚的是在那種情況下13化合物的 R5基團將相同。如果12a化合物與單一（活化)羧酸反應，則 13化合物的R5基團將相同。但是，還可能使用組合化學和使12b化合物與許多不同（活化)羧酸反應。在那種情況下，將獲得根據通式13化合物的混合物，其中R5基團相同或不同。本領域技術人員可以理解通式13的不同化合物數目以及它們在混合物中的比例依賴於在反應中使用的不同（活化）羧酸數目和它們的比例。優選地至少一個R5選自定義在 (ii)，（iii)中的支鏈醯基。更優選地連接至N2’-位的R5基團選擇成支鍵醯基。式14的半縮酸·

19 (14)， 200838546 其中IU，R5和X如前定義，通過去除式13化合物的心基團形成。（Cs-C6)烯基的脫保護可以以本領域技術人員已知的任何方式完成。例如（C3_C6)烯基可以以兩步轉換去除。如果(Q-C：6)烯基例如是2-丙烯基，首先通過(办 5 (1981)，305-308)在極性溶劑（例如四氫呋喃）中活性氫銀催化劑（例如市售的[二（甲基二苯基磷)]-(1，5_環辛二烯）六氟磷酸銥(I))的處理在13中的烯丙基可以異構化爲1-丙烯基。然後可以用含水峨源例如蛾酒或N-溴代琥珀醯亞胺清除1-丙烯基(J. CAem 心c” CT^m· C⑽所亂，（1982)，1274)。可以 10 以類似的方法去除R!的不同選擇。化合物13和式14的半縮醛在根據本發明的合成方法中是重要的中間體。根據在13和14化合物上進行的反應和從中衍生的中間體，可以獲得大量不同保護的在0-1位置具有不同Rs取代基的β-(1—6)-連接葡糖胺二糠。這些保護的 15 β-(1—6)_連接葡糖胺二糖可以用通式15表示： οχ

R5 (15)，其中R4，R5和X如前定義，並且R8選自如前尺4定義的 ⑻，⑻，（c)，⑷，⑷，（f)，（g)，⑻，⑴，⑴或(k)。 20 在本發明合成方法的一個實施方案中，化合物14游離羥基可以以任何本領域技術人員已知方式進行磷醯化。對此市售的四苄基焦磷酸酯可以在極性溶劑中存在適合碱的 200838546 情況下使用。該碱可以選自雙(三曱基矽烷基)氨基鋰’並且溶劑可以選自四氫呋喃。化合物14的磷醯化産生式15a的化合物··

5 (15a)

磷醯化可以用於獲得在〇」位具有選自r4定義的（g)， (h)，（i)或⑴取代的化合物。如果必要在化合物15a中獲得的填酸醋基可以進一步衍生化。在不同實施方案中化合物14的游離羥基可以以任何本 10 領域技術人員已知方式進硫酸化。化合物14的硫酸化産生式15b的化合物：

在另一不同實施方案中，本發明方法進一步包括化合 15 物14的游離羥基與式118011的（活化)羧酸反應，其中R8選自如前R4的定義。該反應可以以任何本領域技術人員已知的方式進行，例如在存在偶合劑例如氯甲酸異丁酯或1-異丁基氧2-異丁基氧羰基-1，2-二氫喹啉或碳化二亞胺下形成式 15c的化合物： 21 20 200838546

其中R4，R5，和X如前定義，並且118選自如前R4的定義 (a)，並且其中R8可以是α或/3構型並且優選的是/3構型。 5 在不同的實施方案中，可以在後面反應中作爲離去基團功能的基團例如三氯乙醯亞氨酸酯基團與化合物14的游離羥基偶合。該反應可以以任何本領域技術人員已知的方式實現，例如在有極性溶劑中無機碱例如碳酸铯或碳酸鉀存在情況下化合物14與三氯乙腈反應，優選質子惰性的極 10 性溶劑，例如二氯甲烷。化合物14的該反應産生式24的化合物：

化合物24可以進一步與有機分子118011反應以用R8基 15 團取代三氯乙醯亞氨酸酯基團。r8可以選自如r4定義的 (b)，（c)，（d)，（e)。本領域技術人員已知乙醯亞氨酸酯基團與有機醇的反應。其可以在極性溶劑優選非質子極性溶劑，例如二氯甲烧中存在催化量的酸例如三甲基甲石夕炫基三獻甲石黃酸S旨的 20 情況下進行，且可以以描述在dnyw· CTze/n·，/w/· £V/· £>zg/·， 200838546 (1986)，212中類似的方法進行。化合物24與118化合物的反應産生式15d的化合物：

5

其中R4 ’ R5 ’ Rs和X如前定義，並且其中r8可以是α或石構型並且優選的是万構型。化合物13，15a，15b，15c和15d可進一步反應例如以去除任何選自不同於Η的X，Y，W保護基團。可以根據本領域已知的方法完成保護基團的去除。苄基保護基可以例 10如通過在高級(high-grade)金屬例如碳載鈀存在下氫解去除。去除烯丙基和類似基團可以如上述從化合物13中去除烯丙基討論的那樣。可以通過氧化分解例如用二氯二氰基

醌(DDQ)或硝酸高鈽銨(CAN)而去除4_甲氧基苄基或3,4-二甲氧基卞基或2,5-二甲氧基节基或2,3,4_三甲氧基节基或 15 3,4,5_三甲氧基苯甲基或苯基或4_甲氧基苯基或认二甲氧基苯基或2,5-二甲氧基苯基或2,3,4_三甲氧基苯基或3,4,5_ 三甲氧基苯基基團。〇-亞二甲苯基基團和节基氧幾基基團 ^以通過在高級金屬例如碳統存在下氫解去除。9-苟甲氧幾基可料過_如_、嗎«除。可㈣解的是不同的保護基團可以獨立地去哈专除。因此，任何R8範圍内的保護基團可以在去除X之前去除。在仏中最初存在或者去除保護基團之後的反應基團可 23 20 200838546 以在去除（另外的）保護基團之前進一步反應。如果R8包含許多游離羥基，可以用本領域已知的方法形成酯類，包括磷酸酯和硫酸酯和醚類。游離羥基可以進一步由已知方法氧化以獲得竣酸或酮。如果R8包含許多羧酸基團，可以用本 5 領域已知的方法形成酯或醯胺。如果118包含許多游離胺基，可以用本領域已知的方法形成醯胺。如果r8&含許多不飽和碳鍵，這些可以用本領域已知的方法與四氧化锇反應以獲得α ’ /3經基化基團。這種〇；，θ經基化的游離罗至基可以在去除保護基團以前進一步反應。 10 除此之外，磷酸酯基團可以用本領域已知的方法甲基化’例如通過與CH2N2反應。應該注意的是與CH2N2甲基化可以在去除β-(1—6)-連接葡糖胺二糖上保護基團包括選自如上定義的X的保護基之前或之後發生。在本發明方法的另一個實施方案中，化合物14的保護 15 基團以本領域已知方法例如上述描述的那些而去除。在本發明方法的另一個實施方案中，化合物13的 (C3-C6)烯基的不飽和鍵例如C3或C2烯基，優選2-丙烯基或 1-丙烯基氫化爲相應的烷基。在本發明方法的另一個實施方案中，化合物13的 2〇 (C3-C6)炸基選作2-丙稀基並且2-丙細基的不飽和鍵用本領域已知的方法與四氧化餓反應以獲得〇^，点羥基化基團。這種α ’万羥基化的游離羥基可以在去除保護基團前進一步反應。可以明確根據本發明的合成方法可以獲得大量根據式 24 200838546 1的召_(1->6)-連接葡糖胺二糖：

/Nh\〇r’8 R，5 ⑴，其中R4’，R5,和r8,分別如前R4，R5和Rs的定義，其中 5 任何Y或W是Η，並且其中R8,的選擇還包括Η。

在根據本發明方法中有關的化合物7可以通過向式6化合物的游離羥基基團偶合離去基團而獲得，該離去基團選自三氯乙醯亞氨酸酯，氟化物，氯化物，溴化物：

其中R2, R4和X如前定義。這可以通過任何本領域已知方法完成。例如在極性溶劑中優選存在碱，更優選無機碱的情況下用三氯乙腈處理式6化合物，該無機碱例如碳酸铯或碳酸鉀’優選質子惰性的極性溶劑，例如二氯甲烷。可 15 以通過在溶劑例如吡啶中與醋酐反應且後續與在醋酸中的氣態HC1或HBr分別反應完成氯和溴的保護。可以通過與醋酐反應且後續與二醯基氨基硫三氟化物(DAST)反應完成氟的保護。式6化合物可以通過從式5化合物去除Ri基團的已知方 20法獲得： 25 1 1200838546

其中Ri，R2，R4和X如前定義。例如烯丙基可以以兩部轉換脫保護。首先根據描述在办W/^也，（1981), 305-308的 5 方法通過在極性溶劑（例如四氫呋喃）中用氫激活的銥催化劑（例如市售的[二（甲基二苯基磷)]-(1，5-環辛二烯）六氟磷酸銀⑴)處理，烯丙基可以異構化爲1-丙烯基。然後可以用含水蛾源例如碘或N-溴代琥珀醯亞胺清除所述丙烯基(J· CAem *S〇c·，c/^m· c謂m眺，（1982)，1274) 〇 ° 式5化合物可以根據選擇的R4基團用許多不同反應獲得。這些反應可以從式4化合物開始：

其中Ri ’ R2和X如前定義。起始於化合物4，許多不同 15取代基可以作爲IU加入到該化合物的游離羥基。可以用本領域已知的通用方法加入這些取代基。如果R4選自（f)，（g)，（h)，⑴或⑴，根據本發明的方法可以包括式4化合物游離羥基在適合的反應條件下的磷醯化： 26 1 200838546

其中l，R2，和X如前定義。這可以通過例如在極性溶劑，優選質子惰性的極性溶劑下在存在偶合劑如[1H]四唑 5下，與亞磷醯胺試劑反應而完成，該試劑例如二芳基n，N 二烷基亞磷醯胺或二芳基n，n二烷基亞磷醯胺，優選二烯丙基_二異丙基亞構酿胺。在該反應中首先形成亞磷酸醋，其可隨後例如在存在芳香族過氧羧酸例如間氯過苯甲酸下氧化爲磷酸酯。 10 如果R4選自⑻，根據本發明的方法可以包括式4化合物游離羥基在適合的反應條件下的硫酸化： Γ /H'〇Ri ⑷，八中Ri R2和X如力疋義。這可以通過例如與三氧化硫 15複^物反應而完成，例如在極性溶劑例如dmf中與三甲胺二氧化琉複合物反應。 A ,果4選自⑴根據本發明的方法可以包括式^化合物離匕基”適口爲式4化合物的游離經基提供保護化合物反應： 27 200838546

(4)，其中l，R2和X如前定義，這種提供保護基團的化合物可優選選自苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯或取代的苄基 5 -2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，例如4-曱氧苄基_2,2,2·三氯乙醯亞氨酸酯，3,4-二曱氧苄基-2,2,2-三氣乙醯亞氨酸酯，2,5-二甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，2,3,4-三甲氧苄基 -2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯或3,4,5-三甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯。或所述保護基可衍生自（C3-C6)烯基-2,2,2-三 10 氯乙醯亞氨酸酯，例如C3或C4-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，優選2-丙烯基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯或1-丙烯基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸醋。該反應優選在極性溶劑和/或存在酸性催化劑例如三氟代甲烧石黃酸錫II或三敗代甲烧硫酸中進行。如果R4選自（a)，根據本發明的方法可以包括式4化合物 15 游離羥基與式R4OH的（活化）羧酸的羧基反應：

⑷，其中Ri，R2和X如前定義，其中R4選自如前定義的（a)。該反應優選在存在偶合劑下例如氯甲酸異丁酯或1-異丁基 20 氧2-異丁基氧魏基-1，2-二氫啥琳或碳二亞胺下進行。 28 200838546 如果R4選自（b)，（c) ’（d)或(e)，根據本發明的方法可以包括式4化合物游離羥基與相應IU(b)，（c)，（d)或(e)選擇的 2,2,2，三氯乙醯亞氨酸S旨活化烷基醇衍生物反應：

其中Ri，R2和X如前定義，該反應優選在極性溶劑和/ 或存在酸性催化劑例如三氟代甲烷磺酸錫II或三氟代甲烷硫酸中進行。本領域技術人員可以理解相應R4(b)，（c)，（d) 或(e)選擇的2,2,2，三氯乙醯亞氨酸酯活化烷基醇衍生物可 10 以是烷基-2,2,2·三氣乙醯亞氨酸酯，當R4選自（b)作爲烷基時，例如丙基-2,2,2-三氣乙醯亞氨酸酯。類似的可能選擇其他相應RWb)，（c)，（d)或(e)選擇的2,2,2，三氯乙醯亞氨酸酯活化烧基醇衍生物，例如烯基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，炔基-2,2,2-三氣乙醢亞氨酸酿。 15 R4的不同取代基可以類似於心取代基含有反應基團，例如羥基、氨基、羰基或不飽和的碳鍵，例如雙鍵。在化合物5上這樣的反應基團可以進一步例如在選自酯化、醯胺化、氧化、氫化或α，/3的用四氧化锇羥化反應中衍生化。可以通過式3化合物的苯亞甲基還原開環反應獲得式4 20 化合物： 29 200838546

ORi ⑶，其中心，R2和X如前定義，並且R3是選自芳烴的基團，例如苯基或4-甲氧基苯基或3,4-二甲氧基苯基或2,5-二甲氧 5 基苯基或2,3,4-三甲氧基苯基或3,4,5-三甲氧基苯基。該反應可以以本領域已知的任何方法實施，例如在極性溶劑例如丁HF中使用氫化物，例如三甲胺棚烧配合物和路易斯酸，例如氯化銘。此方法描述在(2003)，修 69Ί-Ί03和 Tetrahedron Lett· (2000)，41， 6843-6847 中。 0 根據本發明方法與化合物7反應以形成式11化合物的式10化合物可以從式9化合物獲得：

其中Rj〇X如前定義。對於形成式1〇化合物而言，化合， 15物9的游離氨基與式R5〇h的（活化)羧酸反應而醯基化，其中馨 R5如别疋義。5亥方法可以在本領域技術人員已知的反應條件下進行，用例如混合酸酐如從描述在5w// 办” (1987)，2197_22〇4中的⑻·3_节基氧十四院酸製備的混合酸酐和氯甲酸烷基酯如氯甲酸異丁酯。 2〇可以通過已知方法將式8化合物的R2基團水解裂解以形成化合物9 : 30 200838546

⑻，其中Ri，R2和X如前定義。例如通過使用在醋酸中的鋅可以去除三氯乙氧基羰基保護基團（T r 〇 c)。可以通過式3化合物的亞苄基在適合反應條件下的還原開環反應獲得式8化合物··

(3)，其中Ri，R2，I和X如前定義。對此可以使用任何本領 10域已知的方法，例如使用氫化物例如二甲胺-硼烧配合物作爲試劑和路易斯酸例如三氟化硼在極性溶劑二氯甲烷中進行。

通過式2化合物與適合爲式2化合物的游離羥基提供保護基團的化合物反應獲得式3化合物：

(2)，其中&，R2, R3和X如前定義，所述提供保護基團的化合物優選選自苄基_2,2,2-三氣乙醯亞氨酸酯，4-甲氧苄基 -2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，3,4-二甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯 20亞氨酸酯，2,5-二甲氧苄基-2,2,2-三氣乙醯亞氨酸酯，2,3,4- 31 200838546 三甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯或3,4,5-三甲氧苄基 -2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯。該反應優選在極性溶劑和/或存在酸性催化劑例如三氟代曱烷磺酸錫II或三氟代甲烷硫酸情況下進行。適合的方法公開在/· C心m CAem. 5 （1981)，1240-1241)中。值得注意的是使用描述在

Tetrahedron Letters，（2QQV)，7613-7616 氣插遂在 Tetrahedron Z⑽· （2000), 41， 6843-6847中以獲得化合物3的方法沒

有觀察到反應，且僅回收了起始原料2。這樣認爲這些文件不能實際公開化合物3。如描述在dm (1996)， 10 1599-1607那樣製備化合物2。根據另一方面本發明涉及處理葡糖胺二糖優選 β-(1->6)-鏈接葡糖胺二糖的方法。該方法用於處理根據本發明合成方法獲得的化合物。該方法包括： (i)在適合將至少部分式1化合物結合至固相的條件 15 下混合式1化合物的溶液與固體反相樹脂：

其中R4’，R5’和Rs’如前定義； (11)除去液相並用包括水相和有機相的洗液洗滌固 20相’其中水相任選緩衝PH6-9, PH優選7-8且最優選7.3-7.7，水相和有機相混合的比率在15:1至5:1之間，優選9:1 (v/v); (in)除去洗液並用含有水相和有機相的洗脫液洗脫至 32 200838546 少部分結合至固相的化合物1，其中水相和有機相混合的比率在1:15至1:5之間，優選1:9 (v/v); (iv)收集含有一定量的式1化合物的洗脫液；並且任選地從含有式1化合物的洗脫液中除去有機相。 5 在優選實施方案中，該方法進一步包括調整包含一定量式1化合物洗脫液的pH至預選pH值，優選至pH 6-9，更優選PH 7-8，且最優選pH 7.3-7.7。在該pH值下，産品最穩定。令人驚奇地發現：用該方法處理的式1化合物致使化合物相對於起始原料具有增加的生物活性。 10 式1化合物在極性溶劑例WC2-C3有機醇任選與水混合下可以結合於固體反相樹脂。例如水和2_丙醇的混合物，混合的比率爲15:1 to 5:1，優選(v/v)。該反相樹脂可以疋VYDAC C18樹脂或任何其他適合的反相樹脂。清洗液和/或洗脫液的有機相可以含有有機溶劑例如 15 極性有機溶劑，例如cvc3有機醇。可以在適合反應的溶劑中提供式丨化合物，其中保護基團通過水解去除。這樣的溶劑的實例是四氫呋喃(THF)。同樣根據本發明的化合物可以在直接用發明方法的合成後根據本發明的處理方法處理。但是，優選首先純化本發明的 20化合物。可以用本領域已知的方法進行純化，例如使用反相色瑨法，優選離子對反相色譜法例如使用四丁基磷酸銨。用本發明合成方法可獲得的化合物是根據式1的 β-(1—6)-鏈接葡糖胺二糖： 33 200838546

⑴，其令R4 ’R5’和R8’如前定義。本發明的一方面涉及這些化合物。本發明優選的化合物在申請專利範圍47項和附 - 5圖中陳述。本領域技術人員可以理解這些化合物可以以带 · 離形式存在。本發明還涉及這樣電離形式的（藥學上可接: 的）鹽類’例如納鹽、鉀鹽或銨鹽。根據本發明的許多化合物就它們的化學結構來說是新 · 的。除了這個，根據本發_化合物可和已知化學結構， .H)但是來源於天然源的化合物區分，因爲它們沒有任何生物學雜質例如痕量核酸和/或肽和/或碳水化合物。儘管少量存在’這些痕量生物學雜質的存在對藥物產品來說是不可接受的。存在的生物學雜質可以用已知的方法測定例如選自免疫學料或PCR方法。這樣时法尤其是目標在於檢 * 15測革蘭陰性菌，例如大腸桿菌的細胞組分。肇在不同方面本發明涉及根據本發明方法的特定的新穎的中間體。尤其是根據此方面本發明涉及化合物3，7，8， l〇a ’ U ’ lib，12b，12a，13，14。本發明此方面優選的貫施方案涉及化合物3b，7b，8b，l〇b，lla，uc，12c， 20 12d，13b，14b。這些化合物可以用於在不對稱或對稱取代的β-(1>>6)-連接的葡糖胺二糖合成方法中作爲中間體，包括起始原料。 34 200838546 根據式1的化合物用於治療溫血動物例如哺乳動物包括人類的藥物。尤其是本發明的化合物可以用於治療免疫疾病，例如與炎性細胞因子的超量産生或炎性細胞減少産生有關的免疫病變。炎性細胞因子可以由活化的τ淋巴細 5 胞、單核細胞或抗原呈遞細胞産生並且可以屬於由IL-Ιβ， IL-4，IL-5 IL-6，IL-8，IL-9，IL-13，IFN-γ，TNF-α或MCP-1

組成的組。可用本發明化合物治療病症包括癌症、哮喘、特應性皮炎、過敏性鼻炎、炎性腸病、糖尿病、風濕性關節炎和其中向上和/或向下調節炎性細胞因子有益的其他病症。本發明化合物經人類TLR2優先起作用的事實對於治療癌症是有臨床意義的（Garay等人.，2007)。可用本發明化合物治療的潛在癌症包括結腸直腸癌，乳癌和黑素瘤。本發明的化合物進一步可以降低經肥大細胞的組胺分泌。同樣地它們在治療包括改善與肥大細胞過量組胺分泌有關的病症上是有用的。這類病症可以包括過敏性反應，包括發熱(枯草病），由昆蟲蟄傷引起的過敏性反應，例如蜜蜂蟄傷和頁蜂蟄傷或者食物過敏原的過敏反應。由於它們對免疫系統的刺激效應，本發明的化合物還可用作疫苗組分。本發明的化合物可以任選與藥學上可接受載體和/或其他賦形劑以製劑形式經口服、胃腸外的、靜脈内的、腫瘤内的、皮下的、直腸的、局部的或黏膜的途徑施與需要的患者。經腹膜、皮下、口服、鼻内、舌下、肌内或氣溶膠途徑給藥是可能的。依據選擇化合物的特定活性、患者 35 200838546 ^況以及處理的病錢擇本㈣化合物適合_量範圍。 ==可以根據其普通知識和在本領域的經驗選擇適合的劑1範圍。對對於病症例如哮喘、特應性皮炎、過 5 10 敏性鼻k、紐腸病、糖尿病錢濕_節炎，人類適合的劑量範圍可以從〇.〇1至5〇mg/m2。本發明的另—方面涉及制和/或合成本發明新穎並 ⑽造性的（巾_)化合物的方法。由於使神域産生新

^創1^1±的化合物，這些方法是新穎且創造性的。該方可X用於口成包括本發明化合物的不對稱或對稱取代的 1，6·/3 二糖。本^明將參考下述實施例和附圖進-步解釋說明，其中：第1圖顯示大腸桿菌脂質Α和〇Μ-174-DP®結構。第2圖概括根據本發明的合成方法實施方案；第3圖概括了根據本發明的合成方法優選實施方案；

第4_24圖概括了形成式1化合物和/或其直接前體的各種選擇性合成途徑；第25圖表示回應於本發明的化合物鼠類巨噬細胞産生 NO的曲線；第26圖表示當用根據本發明的方法進行處理時證明 β_(1-·»6)-連接葡糖胺二糖生物學活性增強的實驗結果。這些圖中，基團 R〇，Ri，r2，r4，r5，R6，R8，r4,， ’尺8’ ’ X，Y和W如申請專利範圍和説明書對各種化合物的定義。Bn代表苯曱基，Allyl代表烯丙基和Ipr代表異丙 36 200838546 在第1圖中表示的分子結構與所示大腸桿菌脂質A和 oM-m-DPl構符合。而且在第j圖中，指明了〇_3和㈤，的名稱。 5 第2圖概括根據本發明的合成方法實施方案。根據上文描述’顯然化合物7可與化合物1〇反應獲得化合物lih，其中R〇疋R5或二者擇一地與化合物8反應獲得化合Uh，其中 R〇選自I。在第2圖所示實施方案中，化合物7與化合物1〇反應。這開闢了在分子中引入不同Rs取代基的可能，因此 10可進行不對稱取代。對稱取代化合物可由化合物7和化合物 8反應’隨後反應獲得化合物uh來獲得，其中％選自化合物1213的112。對於化合物12b，反應順序以類似的方式進行以獲得在N-2和N-2,位進行對稱取代的化合物。第3圖概括了根據本發明的合成方法優選實施方案。在 15 該根據本發明方法的實施方案中，不對稱取代的 OM-174-DP®是最終産品。第4圖顯示了式14半縮醛游離羥基第一個可能的磷醯化反應。在該反應中，在雙(三甲矽烷基）氨基鋰(LiHMDS) 存在的情況下化合物14與四节基焦磷酸反應。反應可在極 20 性溶劑例如THF中發生。第5圖顯示了式14半縮醛游離羥基的替代磷醯化反應。在該反應中，化合物14與二烯丙基N，N-二異丙基亞鱗醯胺在偶聯劑，例如[1H]四唑存在的情況下進行反應。反應可在極性溶劑，優選質子惰性極性溶劑中發生。在#亥反 37 200838546 應中首先形成亞磷酸鹽。隨後在芳香過氧羧酸，例如間氯過氧苯甲酸存在下將該亞磷酸鹽氧化成被保護的磷酸鹽。第6圖顯示了例證性的由膦酸酯與被保護的式 HO_(CrC24)-NHW的有機氨基醇反應形成磷酸二酯。在形 5成磷酸二酯鍵後，將保護基團W與保護基團X—起除去或將保護基團W由保護基團X除去。當除去基團界時，基團χ保留在分子上，游離氨基可被進一步衍生化，例如通過與有機酸形成醯胺。第7圖顯示了磷酸酯基團另外的替代衍生化反應。在反 10應中，用CH2N2使磷酸酯基團甲基化。第7圖所示反應在磷酸酯基團沒有被保護的分子上進行。應該理解當一個磷酸酯基團被保護時，例如1-0磷酸酯基團，或4，-〇磷酸酯基團’這樣的被保護的基團在本反應中將不會被曱基化。這開闢了選擇性衍生任何一個磷酸酯基團或兩個磷酸酯基團 15 的可能性。第8圖顯示了化合物14的硫酸化反應。在本反應中，化合物14與三氧化硫絡合物反應。爲了獲得烴基直接連接於1-0位的化合物，存在幾種可能。第9圖顯示了其中的一些。首先，可將連接於式13化合 2〇物的1-〇位的（C3-C6)烯基氫化爲相應的烷基。1-烯丙基被氫化成丙基。其次，可通過首先活化式14化合物1-0位的羥基官能基，隨後使活化的基團與有機醇反應來連接烴基。在無機碱，例如碳酸絶或碳酸卸存在的情況下通過使化合物 14與三氯乙腈反應來實現化合物14游離羥基的活化。本反 200838546 應可在極性溶劑，優選非質子極性溶劑，例如二氯甲烷中進行。當化合物14與三氯乙腈在這樣的條件下反應時，將形成式24的化合物。化合物24與第9圖中通式反〇11表示的有機醇反應將得到具有烴鏈r連接於〇-1位的化合物。 5 第10圖顯示了化合物24與有機醇反應的另外的實例。在第10圖中，化合物24與具有1至24個碳原子的有機二醇反應’二醇的一個羥基被基團X，優選PMB保護。單保護的有機一醇以通式HC^Ci-C^-OX表示。此外，在第圖中顯示在單保護的有機二醇結合於0-1位後，如果單保護有機二 10醇的保護基X不同於碳水化合物上的基團X，則單保護的有機二醇的保護基團X被選擇性除去。在選擇性除去單保護的有機一醇的保護基團X後，可通過例如使用上文所討論的方法將其磷醯化而將游離羥基衍生化。應該理解磷酸醋基團可按如上所討論進一步被衍生化。 15 第11圖顯示了與第10圖相似的反應流程圖。但是，在第11圖中在除去單保護的有機二醇的保護基團X後，將經基硫酸化。選擇性地，如第12圖所示，在除去單保護的有機二醇的保護基團X後，可將羥基氧化成羧基。應該理解魏基可通 2〇過，例如形成醯胺或自旨進一步被衍生化。第13圖顯示可引入具有α ’ /3二經基取代的烴鏈的反應序列。在本反應流程圖中，具有不飽和碳碳雙鍵的有機醇與化合物24反應。連接羥基和所示有機醇不飽和鍵的烴鏈長度可變並且包括η個碳原子，其中η可在1至24之間變 39 200838546 化。雖然所示有機醇的不飽鍵位於有機醇的末端，但是靡該理解其也可位於烴鏈之中。在將有機醇連接於化合物24 的1-0位後，不飽和鍵可與四氧化锇反應進行α二經基與雙鍵的加成。通過這種方法引入的經基可進一步被衍 5 生化。例如，通過形成第13圖所示構酸酯或替代地形成硫酸酯、與有機酸的酯或醚。在第13圖中，僅有單獨一個輕基被碟酷化。這可以通過與微量的磷醯化試劑反應實現。應該理解在這樣的反應中還形成二磷酸酯。第14圖顯示了與第13圖所示相似的反應序列。但是， 10 在a，）5-二羥基與雙鍵加成後，羥基官能團被硫酸化。第15圖顯示了與第13圖所示相似的反應序列。但是，在α，/3-二羥基與雙鍵加成後，羥基官能團與氧化試劑，例如NaI〇4反應以獲得羧基官能團。在第16圖所示反應流程圖中，化合物24與被保護的式 15 HO-(CrC24)-NHW的有機氨基醇反應。在連接被保護的有機氨基醇後，如第6圖連接中所討論可進一步處理被保護的胺官能團。第17圖顯示由化合物14b獲得OM-174-MP (化合物16) 的部分反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序列。 2〇第18圖顯示由化合物14b獲得〇M-174-MP-PR(化合物 17)的部分反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序列。第19圖顯示由化合物13b通過化合物18獲得 ΟΜ-174-ΜΡ-Ρϋ(化合物19)的部分反應序列。在合成實施例 40 200838546 中提供了詳細的反應序列。第20圖顯示由化合物14b獲得化合物 OM]74-MP-AC(化合物26)的反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序列。 5 第21圖顯示由化合物14b獲得化合物 OM-174-MP-TE(化合物41C)的反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序列。第22圖顯示由化合物18獲得化合物OM-174-MP-EO(化合物32)的反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序 10 列。第23圖顯示由化合物32b獲得化合物〇M-174-MP-EP(化合物33)的反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序列。第24圖顯示由化合物32c獲得化合物 15 〇M-174-MP-CM(化合物35c)的反應序列。在合成實施例中提供了詳細的反應序列。以上所討論的反應還可用於將不同取代基連接至本發明的β-(1~>6)-葡糖胺二糖的〇_4,位。這可以通過以上討論向Μ位引入取代基的反應實現。相似地，這些反應可在式 20 4化合物游離經基上進行。根據上文’顯然可將很多不同的取代基連接至本發明的β·(1->6)-葡糖胺二糖的位和〇·4,位。在下文提供了合成本發明化合物的實驗性實施例和與本發明化合物生物學活性有關的實施例。 41 200838546 合成實施例在下述部分將詳述本發明化合物的合成。合成的各種化合物在第3圖中以它們的相應化合物指示編號顯示。烯丙基_3-0·苄基-4,6-0-亞苄基-2-去氧-2-(2,2,2-三氯 5 乙氧羰基氨基)-a-D-吼喃葡萄糖苷（3b) 向在乙醚(200 mL)中的烯丙基-4,6-0-亞苄基-2-去氧 -2-(2,2,2-三氯乙氧羰基氨基）-a-D-吼喃葡萄糖苷2b [Liebigs Ann. (1996)，1599-1607] (5 g，10.35 mmol)和市售的苄基2,2,2-三氣乙驢亞氨酸醋（2·9 mL，15·5 mmol)的攪拌 10 混懸液中加入三敗曱績酸烯錫（863 mg，2.1 mmol)。將該混合物在室溫下攪拌17小時，用飽和NaHC03中和並濃縮。殘留物在EtOAc中吸收、水洗，分離有機相並在MgS04上乾燥。蒸發該溶劑並且該殘留物從EtOH中重結晶，獲得白色結晶固體3b (4.43 g，75%)。Mp 168.7°C; [a]D + 65 (c 0.24, 15 CHC13); w max cm·1 3301，2915，1709，1546，1075，1013, 693;巾 NMR (500 MHz，CDC13): 5 7.54-7.26 (m，10 H， Ph)，5.90 (m，1H，C7/=CH2)，5.62 (s，1H，PhCH)，5.32-5.22 (m，2H，CH=C//2)，5·10 (d，1H，J2，NH 10·0 Hz，NH)，4·95 (AB， 1H，J 11.9 Hz，C//2Ph)，4.92 (d，1H，4,2 3.7 Hz，H-l)，4.81 (d， 20 1H，/12.0 Hz，C//2CC13)，4.71 (AB，d5 2H，C//2Ph，Ci/2CC13)， 4.30 (dd，1H，J6,6, 10.1 Hz，J6,5 4.6 Hz，H-6)，4.19 (m，1H， OCi/2CH)，4.07-3.97 (m，2H，H-2, OC//2CH)，3_88 (m，1H， H-5)，3.83-3.75 (m，3H，H-6，，H-4, H-3); 13C NMR (125.8 MHz5 CDCI3): δ 154.3 (C=0)9 138.2 (Cq)9 137.2 (Cq)? 200838546 133·2 (CH—CH2)，129.0，128.7，128.2，126.0 (CH arom)， 118.3 (CH=CH2)，101.2 (PhCH)，97·3 (C-l)，95.4 (CH2CC13)， 82.7 (04)，76.2 (C-3)，74.8 - 74.4 (CH2CC13, CH2Ph)，68.9 (C-6)，68.6 (OCH2CH)，62.9 (C-5)，54.9 (C-2); MS-ES 5 596-594 [M + Na]+; C26H28Cl3N〇7的計算值：C5 54·51; H， 4·93; N，2.44%。實驗測定值:c，54.51; H，4·94; N，2.34%。烯丙基_3,6_二苄基-2-去氧-2-(2,2,2-三氯乙氧羰基氨基)-a-D-^b喃葡萄糖普（4b) 室溫下向在乾燥THF (45 mL)中的3b (1·3 g，2.27 mmol) 10和硼烷三甲胺配合物（660 mg，9·〇8 mmol)的攪拌溶液中加入氯化鋁（1.81 g，13·6 mmol)。試劑溶解後，逐滴加入水(82 μΐ，4·54 mmol)，並在室溫下持續攪拌3〇分鐘。添加水後(2〇 mL)停止混合，隨後加入1M HC1溶液(20 mL)並用EtOAc稀釋。將有機相分離，用NaCl飽和溶液洗滌，在MgS〇4上乾 15燥，並在真空中除去溶劑。殘留物在矽膠(丘及虎/EtOAc，3:1) 上通過快速色譜法提供了白色固體化合物4b (113 g; 87% )。Mp 65〇C; [a]D + 64 (c 〇·8〇, CHC13); y max cm·1 3329, 2915, 1706, 1536, 1044, 730, 694; ^ NMR (500 MHz， CDC13): 5 7.40-7.26 (m，10 H，Ph)，5.90 (m，1H，C//=CH2)， 20 5.32-5.21 (m，2H，CH=Cfi2)，5.14 (d，1H，/2，NH 10.0 Hz，NH)， 4·92 (d，1H，J12 3·7 Hz，H-l)，4.82 (d, 1H，12.0 Hz, CH2CC\3), 4.80 and 4.77 (AB? 2H? J11.6 Hz? Ci^Ph), 4.67 (d, 1H5 J12.0 Hz5 CH2CCh), 4.64 and 4.57 (AB, 2H, /12.0 Hz,

Cfi6Ph)，4·19 (m，1H，OCi/2CH)，4.03-3.97 (m，2H，H-2, 43 200838546 OC//2CH)，3_82_3·68 (m，4H，Η-6, Η-6，，Η-5, η·4)，3.63 (t， 1H，Λ，3 U.2 Hz，H-3)，2.60 (s，1H，〇H); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13): 6 154.2 (00)，138.2 (Cq)，137·7 (Cq)，133.4 (CH=CH2)，128.8, 128.5, 128·4, 127.8, 127.7, 5 127.6 (CH arom)5 118.0 (CH=CH2), 96.8 (C-l)5 95.4 (CH2CC13)，80.2 (C-3)，74.6，74·5, 73.6 (CH2CC13, 2 x CH2Ph)，72.0, 70.2 (C-4, C-5)，69.7 (C-6)，68.3 (OOi2CH)， 54.5 (C-2); MS-ES 598-596 [M + Na]+; C26H30Cl3NO7的計算值：C，54·32; H，5·26; N，2.44%。實驗測定值：C，54.55; H， 10 5.39; N5 2.39%. 細丙基-356-二-(9-节基-4-(9-(二节基氧鱗醯基)_2·去氧 -2-(2,2,2-二氣乙乳魏基氣基喃匍萄糖苷（5b) 室溫下向在CH2C12 (33 mL)中的4b (1.1 g，1.91 mmol) 和市售 1/f-四唑CH3CN (〜0·45 Μ) (8·5 mL，3.8 mmol)溶液 15攪拌溶液中加入二苄基二甲基亞磷醯胺（762 μΐ; 2.87 mmol)。在室溫下攪拌30分鐘，然後將溶液冷卻至低於-2〇 °C。加入在CH2C12 (20 mL)中的mCPBA (57-86%，1·22 g; 7.00 mmol)溶液，並在-2〇°C授拌該溶液3〇分鐘。加入ι〇〇/〇含水硫代硫酸鈉(50 mL)，並且攪拌混合物1〇分鐘，然後用 20 EtOAc稀釋，並且分離有機相。相繼用1〇%Na2S2〇3水溶液 (3χ)、飽和NaHC〇3水溶液(2x)、N HC1溶液（1χ)和鹽水洗滌有機層。有機相在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑。殘留物在矽膠肩虎/EtOAc，4:1)上通過快速色譜法提供了無色油狀化合物5b( 1.25g; 78%)。[a]D + 56 卜 1.32, CHC14 200838546 w max cm-1 3301，2920, 1728, 1542, 1453, 1264, 995, 731， 694; ]H NMR (500 MHz, CDC13): δ 7.40-7.10 (m? 20 H? Ph)，5.90 (m，1H，C//=CH2)5 5.33-5.23 (m，2H，CH=C//2)， 5.13 (d，1H，J2，NH 10.0 Hz，NH)，4.93 (d，1H，A’2 3.5 Hz，H-l)， 5 4.96-4.82 (m，4H，2 x CH2Ph)，4.86 (m，1H，Ci/2CC13)，4.76 and 4·65 (AB，2H，J 12.0 Hz，C/i2Ph)，4.73 (m，1H，Ci/2CC13)， 4.60 (t? 1H? JX4=As 9.5 Hz? H-4)9 4.57 and 4.47 (AB, 2H? J 12.0 Hz，Cii2Ph)，4.21 (m，1H，OC/i2CH)，4.10 (ddd，1H， H-2)，4·02 (m, 1H，OC//2CH), 3.92 (m，1H，H-5)，3·84 (dd， 10 1H，Λ，3 9·3 Hz，H-3)，3.80 (dd，1H，J6,5 2.0 Hz，J6,6,11.0 Hz， H-6)，3.76 (dd，1H，/6，，54·7 Hz，H-6，)； 13C NMR (125·8 MHz， CDC13)： 5 154.0 (〇〇)，138.1 (Cq)，137.8 (Cq)，135.8 (Cq)， 135.7 (Cq)，133·2 (CH=CH2)，128.6，128.5，128.4，128.3, 128.2, 128.1，128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.6, 127.5, 127.4 15 (CH arom)，118.1 (CH=CH2)，96.4 (C-l)，95.3 (CH2CC13)， 78·4 (C-3)，75.6 (C-4)，74·6，73.7，73.3 (CH2CC13，2 x CH2Ph)，70.2 (C_5)，69.5，69·4 (2 xCH2Ph)，68.4 (C-6, OCH2CH)? 54.3 (C-2); MS-ES 858-856 [M + Na]+; C40H43Cl3NO10P的計算值：c，57.53; H，5·19; N，1.68%·實驗 20 測定值:C，57.41; H，5.28; N，1·74%。 3,6-二-O-节基-4-0-(二苄基氧磷醯基)-2-去氧-2-(2,2,2-三氯乙氧羰基氨基)-D-吼喃葡萄糖（6b) 室溫下向 5b (659 mg; 0.79 mmol)在乾燥THF (10 mL) 中的攪拌溶液中加入[二（甲基二苯基磷)]-(l，5-環辛二烯)六 45 200838546 氟磷酸銥(1)(67 mg)。用氫活化銥催化劑1分鐘後(微紅的溶液變爲無色）’在氮氣下攪拌混合物1小時。加入埃(360 mg， 1·42 mmol)和水(850 μί)且反應混合物另外攪拌30分鐘。向混合物中加入10% Na2S203水溶液，並用EtOAc萃取該溶 5 液。相繼用l〇%Na2S2〇3水溶液(2x)和鹽水洗滌有機層。有機相在MgS04上乾燥並在真空中去除溶劑。殘留物從正庚 ‘ 烷/EtOAc中結晶獲得淡黃色固體6b (419 mg，67%)。p max · cm-1 3361，2920, 1716, 1522, 1452, 1216, 1006, 729, 693; 4 NMR (500 MHz5 CDC13) for α-anomer: δ 7.40-7.12 (m3 20 φ 10 H，Ph)，5.20 (d，1H，八2 3.4 Hz，H-l)，5.17 (d，1H，J2，nh9.8 Hz，NH)，4·96-4·40 (m5 10H，4 x CH2Ph，C%CC13)，4.45 (t， 1H，J3,4= J4,5 9.5 Hz，H-4)，4.15 (m，1H，J6,5 6.4 Hz，J4,5 9.5 Hz, H-5)，4.00 (dt，1H，J2,NH = J2,3 9·8 Hz，H_2)，3.78 (dd，1H， H-3)，3.78 (dd，1H，J6，，5 1.7 Hz，J6,6,11.0 Hz，H-6，)，3.76 (dd， 15 1H，J6,5 6.4 Hz，H-6); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13) for α-anomer: δ 154.1 (C=0)，137.8 (Cq)，137.7 (Cq)，135.7 ' (Cq)，135.6 (Cq)5 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1， · 128.0, 127.9, 127·8, 127·7, 127·6, 127.5, 127.4 (CH arom)， 95.3 (CH2CC13)，91.6 (C-l)，77·9 (C-3)，76.1 (C-4)，74.6， 20 73.7, 73.3 (Oi2CCl3, 2 xCH2Ph)，70.6 (C-5)，69.5, 69.4 (2 x CH2Ph)，68.8 (C-6)，54.7 (C-2); MS-ES 818-816 [M + Na]+; (：37Η39α3Ν01()Ρ的計算值：C，55.90; H，4·94; N，1.76%.實驗測定值:C，55.67; H，5.18; N，1.62%. 3,6-二-Ο-苄基-4-0-(二苄基氧磷醯基)-2-去氧-2-(2,2,2_ 46 200838546 三氯乙氧羰基氨基）-D-葡糖吡喃糖基三氯乙醯亞氨酸醋 (7b) 室溫下向 6b (419 mg; 〇·53 mmol)在乾燥Ch2c12 (6·5 mL)中的攪拌溶液中加入三氯乙腈(528 μ1; 5·3犯皿〇1)和碳 • 5酸鉋(86 mg，〇·26 mmol)。攪拌1小時後，用飽和NaHC〇3水溶液(5 mL)淬滅該反應，並且萃取該溶液。用鹽水洗滌該有機層’在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑獲得淡黃色油7b (400 mg)，其無需純化在下面步驟中使用。 ® 烯丙基-3,4-二-Ο-苄基-2-去氧-2-(2,2,2-三氯乙氧羰基 10 氨基)-a-D-吼喃葡萄糖苷（8b) 在(TC 向 3b (937 mg，1·63 mmol)和硼烧二甲胺(482 mg， 8·18 mmol)在乾燥CH2C12 (18 mL)中的攪拌溶液中緩慢加入BF3:Et20 (1 mL，8.18 mmol)。攪拌45分鐘後，緩慢加入 NaHC〇3飽和水溶液停止混合。將有機相分離，用Naci飽和 15溶液洗滌，在MgS〇4上乾燥。蒸發溶劑並且該殘留物從 EtOAc/正庚烷中重結晶獲得白色結晶固體8b (757 mg， 81%) 〇 Mp 119.9°C； [a]D + 74 (c 0.59, CHC13); max cm'1 3312, 2916, 1702, 1538, 1023, 732, 692; 4 NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.40-7.26 (m, 10 H, Ph)5 5.88 (m? 1H? CH=CU2), 20 5.30-5.20 (m，2H，CH=C//2)，5.07 (d，1H，J2，NH 10·0 Hz，NH), 4.89 (d，1H，J12 3·5 Hz，H-l)，4·87 (d，1H，J 11.0 Hz， Ci/2CC13)，4.87 and 4·75 (AB，2H，《711.0 Hz，Ci/2Ph)，4.78 and 4·68 (AB，2H，/12.0 Hz，C//2Ph)，4.68 (d5 1H，/11.0 Hz， C//2CC13)，4.16 (m，1H，OCi/2CH)，4.02-3.94 (m，2H，H-2, 47 200838546 OC/^CH)，3.86-3.64 (m，5H，Η_6, Η_6，，Η-5, Η-4, Η·3)，1·78 (m，1H，OH); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13)·· 5 154.2 (〇0)，138.0 (Cq)，137.8 (Cq)，133·3 (CH=CH2)，128.5， 128.4，128.1，128.0，127.8，127.7 (CH arom)，118.0 5 (CH=CH2)5 96.8 (C-l)5 95.4 (CH2CC13)5 80.2 (C-3)? 78.0 (C-4)，75.2, 75.1，74.6 (CH2CC13, 2 x CH2Ph)，71.5 (C-5)， 68.3 (OCH2CH)? 61.6 (C-6)5 55.2 (C-2); MS-ES 598-596 [M * + Na]+; C26H3〇Cl3N〇7的計算值:C，54.32; H，5·26; N，2.44%· 實驗測定值：C，54.76; H，5.53; N，2.31%。籲 10 稀丙基-2-氨基-3,4-二-(9-节基_2-去氧-〇^0-°比喃葡萄糖苷（9b) 在室溫向 8b (245 mg，0.43 mmol)在 AcOH (6 mL)中的攪拌溶液中加入辞粉(430 mg)。攪拌過夜後，混懸液通過 Celite濾過，在真空下除去溶劑並且殘留溶劑用甲苯共蒸發 15 三次。殘留物用EtOAc吸收，用NaHC03飽和水溶液和鹽水洗滌。將有機相分離，在MgS〇4上乾燥，並且在真空中除去溶劑獲得無色油狀9b (157 mg)，其無需純化在下面步驟馨中使用。樣品在石夕膠(CHWl2/丙酮，1〇:1 -> 1:1)上通過快速色譜法純化提供白色結晶固體9b。Mp 85.2°C; [a]D + 98 20 0.89，CHC13); v max cm·1 3190，2899，1664，1577，1496， 1452, 1363, 1024, 737, 695; 4 NMR (500 MHz，CDC13)·· 5 7·50·7·26 (m，10 H，Ph)，5.92 (m，1H，C//=CH2)，5·30_5·20 (m，2H，CH=C//2)，4.90 (d，1H，/〗，2 3.5 Hz，H-l)，5·01 and

4.73 (AB? 2H9 J11.0 Hz5 CH2?h), 4.88 and 4.75 (AB? 2H5 J 48 200838546 12.0 Hz，C/i2Ph)，4.16 (dd，1H，/ 5.0 Hz，J 12·9 Hz， OCH2CU), 4.02 (dd5 1H5 /6.0 Hz? J 12.9 Hz? OC^CH), 3·85-3·55 (m，5H，Η·6, H-6’，H-5, Η·4, H-3)，2.80 (dd，1H， J2?39.4 Hz? H-2); 13C NMR (125.8 MHz? CDC13): δ 138.6 5 (Cq)，138.1 (Cq)，133.9 (CH=CH2)，128.6，128.5，127·9, 127.8, 127.7 (CH arom)，117.3 (CH=CH2)，98·8 (C-l)，83.8, 78.7, 71·9 (C-3, C-4, C-5)，75.6, 74·8 (2 x CH2Ph)，68.3 (OCH2CH)，61·4 (C-6)，56.0 (C-2); MS-ES 400 [M + H]+;C23H29N〇5的計算值:C，69.15; H，7·32; N，3.51%·實驗 10 測定值：C，69.21; Η, 7·36; N，3.25%。稀丙基-2-[(R)-3-节基氧十四烧酸氨基]-3,4•二-(9-节基 -2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷（10b) 向THF (5 mL)中的(7?)-3-节基氧十四烧酸（145 mg; 0.43 mmol)冷卻溶液〇15°C) [Bull. Chem. Soc· Jpn，60 (1987)， 15 2197-2204]中加入尽甲基嗎啉(47 μί; 0.43 mmol)和氯甲酸異丁酯（57 gL; 0.43 mmol)。反應混合物在-15°C下授拌30分鐘。將THF (5 mL)中的化合物9b (157 mg; 0.39 mmol)溶液加入至反應混合物中。在室溫下繼續攪拌過夜。然後加入水和EtOAc，分離有機相，並且用EtOAc再次萃取水相。混 20 合有機層，用H20和鹽水洗滌，在MgS04上乾燥。蒸發溶劑並且殘留物從MeOH中重結晶獲得白色結晶固體i〇b(176 mg，兩個步驟63%)。Mp 141.3〇C; [a]D + 61 (c 0.31，CHC13); v max cm·1 3297, 2920, 2851，1637, 1544, 1025, 732, 693; !Η NMR (500 MHz，CDC13): 5 7.40-7.26 (m，15 H，Ph)， 49 200838546 6.32 (d，1Η，Λ，νη 9·0 Hz，NH)，5.76 (m，1H，C//=CH2)5 5.23-5.10 (m，2H，CH=C%)，4.82 and 4·65 (AB，2H，/11.0 Hz，Ci/2Ph)，4.80 (d，1H，义，2 4.0 Hz，H-l)，4.73 and 4.57 (AB? 2H? Jll.5 Hz, CH2?h), 4.54 and 4.49 (AB5 2H? JU.O 5 Hz，C/^Ph)，4·27 (m，1H，Λ，2 4·0 Hz，H-2)，4.00 (m，1H， OC//2CH)，3.85-3.62 (m，7H，OCi/2CH，H-6, H-6，，H-5, H-4, H-3, H-3”)，2·40 (dd，1H，/3.7, 15·1 Hz，H-2，，B)，2·28 (dd， 1H，/ = 7,6, 15.1 Hz，Η·2”Α)，1.58 (m，1H，H-4”A)，1.49 (m， 1H，H-4，，B)，1.35-1.12 (m，18H，9 CH2)，0.90 (t，3H，CH3); 10 13C NMR (125.8 MHz，CDC13): 5 171.2 (C二0)，138.3 (Cq)， 138.2 (Cq)? 137.9 (Cq)? 133.5 (CH=CH2)? 128.5? 128.45 128.3, 128.0，127.9，127.8，127.7，127.6，127.5 (CH arom)，117.7 (CH=CH2)，96·9 (C-l)，80.2 (C_3)，78.0 (C-4)，76.6 (C-3，，)， 74.7 (CH2Ph)? 74.6 (CH2Ph)5 71.4 (C-5)? 71.3 (CH2Ph)? 68.3 15 (OCH2CH)5 61.8 (C-6)5 52.6 (C-2), 41.5 (C-255)? 33.8 (C-4")5 31.9, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 25.1，22.7 (CH2)，14.1 (CH3); MS-ES 739 [M + Na]+; C44H61N07的計算值：C，73.81; H， 8·59; N，1.96%·實驗測定值：C，73·62; H，8·57; N，1.82%。烯丙基_3,4-二-O-苄基-6-0-[3,6-二-<9-苄基-4-0-(二苄 20 基氧磷醯基)-2-去氧-2-(2,2,2-三氣乙氧羰基氨基)比喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-苄基氧十四烷醯氨基]-2-去氧比喃葡萄糖苷（11a)

在-20°C 向 10b (231 mg，0·32 mmol和亞胺酸酯7b (400 mg，0·42 mmol)無水CH2C12 (9 mL)中的攪拌溶液中加入4A 200838546 分子篩。攪拌30分鐘後，加入TMSOTf (12 pL，64 μηιοί)並且繼續另外攪拌1小時。反應液通過Celite濾過，用EtOAc 稀釋並用飽和NaHC03水溶液中和。將有機相分離，用NaCl 飽和溶液洗滌，在MgS04上乾燥。在真空中除去溶劑。殘 5留物從MeOH中重結晶獲得白色結晶固體1U (335 mg， 70%)〇Mpl45.2〇C;[a]D + 37(c0.12，CHCl3); > ^xcm·1 3297, 2921，1713, 1641，1540, 1453, 1266, 997, 730, 693; 4 NMR (500 MHz，CDC13): 5 7.37-7.14 (m, 35 H，Ph), 6·32 (d，1H，J2，NH 9.0 Hz，NH-2)，5.76 (m，1H，C/f=CH2)， 10 5.23-5.10 (m，3H，NH-2，，CH=C//2)，4·95-4·42 (m，15H， C^CC13, 7 x C/^Ph)，4·79 (d，1H，八23.5 Hz, H-l)，4·74 (d， 1H，10.0 Hz，H-l’)，4·46 (t，1H，/3，，4，= J4，，5, 8.5 Hz， H-4’)，4.32 (m5 1H，八2 4.0 Hz，H-2)，4·25 (AB，1H，C/f2Ph), 4.13 (m，1H，H-6A)，4.08 (m，1H，H-3’)，4.04 (m，1H， 15 OCi/2CH)，3.90-3.60 (m，9H，OC/i2CH，H-5，，H-6，A，H-6’B， H-6B，H-5, H-4, H-3, H-3”)，3·42 (m，1H，H-2，），2.40 (dd， 1H，《7 3.7, 15.1 Hz，H-2，，B)，2.28 (dd，1H，J = 7.6, 15.1 Hz， H-2，’A)，1.58 (m，1H，H-4”A)，1.49 (m，1H，Η·4，’Β)， 1.35-1.12 (m，18H，9 CH2)，0.90 (t，3H，CH3); 13C NMR 20 (125.8 MHz5 CDCI3): δ 171.0 (C=0)? 153.7 (C=0)? 138.3 (Cq)，138.2 (Cq)，138,1 (Cq)5 137.9 (Cq)，137.7 (Cq)，135.7 (Cq)? 135.6 (Cq)? 133.6 (CH=CH2)5 128.5, 128.4, 128,3, 128.2, 128.1，128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.6, 127.5, 127.4 (CH arom)，117.7 (CH=CH2)，99.8 (C-l，），96.9 (C-l)，95·1 51 200838546 (CH2CC13)，80.6 (03)，78.6 (C-3，），78.0 (C-4)，76·6 (C-3”)， 76.2 (C-4,)，74.4 (C-5，），74.7，74.2，73.8，73.3，71·3 (CH2CC13，5 x CH2Ph)，70·2 (C-5)，69.6，69.4 (2 X P-OCH2Ph)，69.0 (06 or C_6，)，68.1 (OCH2CH)，67.7 (C-6 5 or C-6，），57.3 (C-2，），52·6 (C-2)，41·6 (C-2”)，33.8 (C_4，’)， 31·9, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 25.1，22·7 (CH2)，14.1 (CH3); MS-ES 1515-1513 [M + Na]+; C81H98C13N2016P的計算值：C， · 65.16; H，6.62; N，1.88%·實驗測定值：C5 65·31; H，6·70; N， 1.77%. · l〇烯丙基-6-0-[2-氨基-3,6-二-<9-节基-4-CK二爷基氧磷醯基)-2-去氧喃葡萄糖基]-2-[⑻-3·苄基氧十四烷醯氨基]·3,4_二-0-爷基-2-去氧-a-D-吡喃葡萄糖苷（12d) 室溫下向 11a (310 mg，0·21 mmol)在Ac0H/H20 9:1 (5 mL)中的攪拌溶液中加入鋅-銅偶合劑(260 mg)。攪拌1小 15 時，加入鋅-銅偶合劑(260 mg)並且再次重復該操作。繼續攪拌另外的3小時，並且混懸液通過Celite渡過。在真空下除去溶劑並且殘留溶劑用甲苯共蒸發三次。殘留物用φ 吸收，用NaHCCb飽和水溶液(2 X)和鹽水洗滌。將有機相分離，在MgS04上乾燥，並且在真空中除去溶劑獲得無色油狀12d (273 mg)，其無需純化在下面步驟中使用。廳观 1317 [M + H]+，1339 [M + Na]+ 烯丙基-3,4-二-〇_苄基_6_〇_{36_二_〇苄基切仁苄基氧鱗酿基)-2-去氧-2-_·3_十二院醯氧十四院醯氨基]仰4仙萄糖基}_2_[(R)巧基氧十四烧醯氨基碎 52 200838546 去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷（Bb) 向THF (4 mL)中的(及)各十二烷醯氧十四烷酸⑴5 mg; 0.27 mmol)冷卻溶液(_15°C) [Bull· Chem. Soc· Jpn，紐 (1987)，2205-2214]中相繼加入AT-甲基嗎啉（3〇 μι; ο』？ 5 mmol)和氯曱酸異丁酯（35 jiL; 0·27 mmol)。反應混合物在 -15°C下攪拌30分鐘。將THF (4 mL)中的粗品12 d (273 mg; 0.21 mmol)溶液加入至反應混合物中。在室溫下攪拌過夜後，在真空下除去溶劑並將H20加至殘留物。然後用Et0Ac 萃取混合物，相繼用NaHC〇3飽和水溶液、鹽水洗滌有機 10層，並在MgS〇4上乾燥。蒸發溶劑並且殘留物從Me〇H中重結晶獲得白色結晶固體13b (259 mg，兩個步驟72%) Mp 173 r；[a]D + 30(c〇.9〇5CHCl3); v ^^ 3302,2919,2850, 1726, 1636, 1544, 1453, 1357, 1266, 998, 730, 694; 4 NMR (500 MHz, CDC13): (5 7.40-7J0 (m，35 H，Ph)，6.31 (d，1H， 15 A，nh 9.4 Hz，NH-2)，6.01 (d，1H，Λ，，·，7·5 Hz，NH-2，），5.76 (m，1H，Ci/=CH2)，5.23-5.08 (m，2H，CHK：/^)，5.08 (d，1H， /^8.2 Hz，H-l’），5.05 (m，1H，H-3，，，），4.95-4.42 (m，14H，7 x Ci/2Ph)，4.79 (d，1H，Ju3.4 Hz，H-l)，4.46 (t，1H，/3，，4，= J4，，5, 8·7 Hz，H-4’），4.32 (m，2H，H-2, H-3，)，4·09 (m，1H， 20 H_6A)，4.03 (m，1H，〇Ci/2CH)，3.90-3.60 (m，9H，OCi/2CH， H-5’，H-6’A，H-6’B，H-6B，H-5, H-4, H-3, H-3，，)，3.46 (m， 1H，H-2’)，2.40 (dd，1H，/3.3, 15.1 Hz，H-2，，B)，2:34 (dd，1H， J 7.2, 15.5 Hz，H-2，，，B)，2.28 (dd，1H，= 7.6, 15.1 Hz， H-2”A)，2.21 (dd，1H，/5.0, 15.5 Hz，H-2，，，A)，2.11 (t，2H，/ 53 200838546 7.5, Η·2，，，，)，1·58 (m，1H，H-4”A)，1.55-1 ·36 (m，3H，H-4”B， 2 x H-4”，)，1.35-1.12 (m，54H，27 CH2)，0.90 (m，9H，3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz, CDC13): δ 173.3 (00)， 171.0 (00)，170.0 (OO), 138.4 (Cq)，138.3 (Cq)，138.2 5 (Cq)，138.1 (Cq)，137.8 (Cq)，135.7 (Cq)，135.6 (Cq)，133.6 (CH=CH2)，128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1，128.0, 127.9， 127.8，127.7，127.6，127.5，127.4 (CH arom)，117.6 ‘ (CH=CH2)，99.2 (C-l’)，96.8 (C-l)，80.5 (C-3)，78.3 (C-3，， C-4)，76.6 (C-3”)，76.0 (C-4，)，74.8, 74.7 (2 x CH2Ph)5 74.3 · 10 (C-5，)，73.2, 73.1 (2 x CH2Ph)，71.3 (CH2Ph)，70·5 (C-3，，，)， 70.3 (C-5)，69.4, 69.3 (2 x P-OCH2Ph)，69.1 (C-6 or* C-6，)， 68.1 (OCH2CH)，67.6 (C_6 or C_6，)，56.7 (C_2，)，52.4 (C-2)， 41.6 - 41.4 (C-2，，，C-2，，，），34·4，34·1，33·8 (C-4，，，C-4，，，， C-2””)，31.9, 29.9, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 29.0, 25.1， 15 25.0? 24.9, 22.7 (CH2)? 14.1 (CH3); MS-ES 1747 [M + Na]+;

Ci〇4H145N2017P的計算值：c，72·36; H，8·47; N，1.62%.實驗測定值：C5 72·52; H，8·43; N，1.51%。籲 3,4_二-(9-节基-6-0-{3,6_二_(9-节基·4·(9·(二苄基氧填醯基)-2-去氧-2-[(R)_3-十二烧醯氧十四烧醯氨基]_βα-吼 20 σ南葡萄糖基}-2-[(R)-3-苄基氧十四烧酸氨基]_2·去氧-D-0比喃葡萄糖（14b) 室溫下向 13b (259 mg; 〇·15 mmol)在乾燥THF (13 mL) 中的攪拌溶液中加入[二（甲基二苯基磷)]_(1，5_環辛二稀）六氟磷酸銥(1)(13 mg)。用氫活化銥催化劑！分鐘後(微紅的溶 54 200838546 5 • 液變爲無色）’在氮氣下攪拌混合物1小時。加入蛾(69 mg， 0·27 mmol)和水(13 mL)且反應混合物另外攪拌15分鐘。向混合物中加入10% Na2S203水溶液，並用EtOAc萃取該溶液。相繼用10%Na2S2O3水溶液(2x)和鹽水洗滌有機層。有機相在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑。殘留物從 (^301^中結晶獲得灰色固體1物(165 11^;65%)。：^1^議_1 3388, 3276, 3062, 2919, 2850, 1726, 1641，1544, 1453, 1358, 1263，997，731，694; 4 NMR (500 MHz，CDC13) for α-anomer: δ 7.40-7.10 (m5 35 Η? Ph)? 6.39 (d5 1H5 J2jnh9.4 10 Hz，NH-2)，6.18 (m，1H，NH-2，)，5·38 (d，1H，/r’2 7.7 Hz， Η-Γ)，5.12 (m，1H，Hz，H-l)，5.05 (m，1H，Η·3，，，）， 4·95-4·42 (m，14H，7 x C/i2Ph)，4.50 (m，1H，H-4，），4.23 (dt， 1H，/u3.2 Hz，J2，nh= Λ，3 9·4 Hz，H-2)，4.19 (t，1H，Λ，,3，= •73，，4,8·9 Hz，Η·3’），4.07 (m，1H，H-5)，3·96 (d，1H，/6A，6B 11.4 15 Hz，H-6A)，3.89-3.80 (m，2H，H-3”，H-6’A)，3.80-3.65 (m， • 4H，H-5’，Η·6，Β，H-6B，H-3)，3.35 (m，1H，H-2’)，3·32 (t，1H， J3,4 = J4,5 9.5 Hz，H-4)，2.40-2.20 (m，4H，2 x H-2”，2 x 20 H-2”’），2.16 (t，2H，7·5, H-2””)，1.58 (m，1H，H-4’’A)， 1.55-1.36 (m，3H，H_4，，B，2 x H-4，，，)，1.35-1.12 (m，54H，27 CH2)，0.90 (m，9H, 3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13) for α-anomer: δ 173.9 (C=0), 171.4 (C=0), 170.6 (C=0)? 138.4 (Cq)5 138.3 (Cq)? 138.2 (Cq)? 138.1 (Cq)? 137.8 (Cq)? 135.7 (Cq)，135.6 (Cq)，128.5，128.4, 128.3，128.2，128.1， 128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.6, 127.5, 127.4 (CH arom)， 55 200838546 98.8 (C-Γ)，91.7 (C.1)，8〇·6 (C-3)，78.8 (C-3，，C-4)，76·8 (C-3”)，76.2 (04’)，74·8 (CH2Ph)，74.2 (C-5，)，73·6, 73.4, 73.3 (3 x CH2Ph)，71·8 (C_5)，71.3 (CH2Ph)，70.8 (C_3，，，)， 69·4, 69·3 (2 x P-OCH2Ph)，69.0 (C-6，），67.6 (C-6)，57·〇 5 (C-2’），52.9 (C-2)，41.7 (C-2，，，C-2”，），34.4, 34.1，33.8 (C-4，，， C-4”’，C_2””)，31.9, 29.9, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 29.0, 25.1，25.0, 24.9, 22.7 (CH2)，14.1 (CH3); MS-ES 1708 [M + Na]+; C101H141N2O17P的計算值：c，71.94; H，8.43; N，1.66%· 實驗測定值：C，71.68; H，8.35; N，1.61%。 10 3,4_二4苄基各0-{3,6-二·0·苄基-4-0·(二苄基氧磷醯基）-2-去氧_2-[(R)_3-十二烷醯氧十四烷醯氨基丨_p_D_吡喃葡萄糖基}-2-[(11)_3-节基氧十四烷醯氨基]去氧_a_D-0比喃葡萄糖基二苄基氧磷酸酯（15b) 在-78°C 向 14b (1 g，〇·6〇 mm〇l)在THF (90 mL)中的攪 15拌溶液中加入二(二甲基甲石夕烧基)氨基鐘溶液(在THF中1M) (1.9 mL，1·88 mmol)。攪拌該混合物5分鐘然後加入四苄基焦磷酸酯（1.3 g，2.37 mmol)。繼續在_78°C攪拌2小時，然後用NaHC〇3飽和水溶液中和並用EtOAc稀釋。分離該有機相，在MgSCU上乾燥並在真空中除去溶劑獲得淡黃色油的 20 l5b (2幻，其無需純化在下面步驟中使用。 2去氧去氧-4-〇-(二羥基碗醯基)_2_[(R)-3-十二烷醯氧十四烷醯氨基]_0_〇_吡喃葡萄糖基屮r)_3_羥基十四烷醯氨基]_a_D_吼喃葡萄糖基二氫磷酸醋（ib) (OM-174-DP) 56 200838546 室溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (1.5 g)下，將THF (100 mL)中的粗品化合物15b (2 g)氫化17 h。然後用Et3N (500 pL) 中和混合物並通過過濾去除催化劑。濾液在真空下濃縮並且該殘留物通過HPLC根據本發明（方法D)純化獲得白色凍 5 乾物的 lb (鈉鹽）（342 mg;兩個步驟48%)。[a]D + 14 〇 0.6, H20);^ 舰 cnT1 3305, 2918, 2849, 1713, 1648, 1553, 1465, 1376，1174，1039，915，719，654; NMR (500 MHz， CDCl3/CD3〇D/Pyridine-d5/DCl 37% 5/2/1/1): 5 5.60 (dd， 1H，八2 7·5 Hz，《Λ,ρ 2·0 Hz，H-l)，5.27 (m，1H，H-3，，，），4.73 10 (d，1H，/r，2’8.5 Hz，H-1，X 4.09 (q，1H，73,4= Λ，5= Λ,ρ 9·0

Hz，H-4，），4.05-3.80 (m，6H，2 χ H-6, 2 x H-6，，H-4, H-3)， 4.00 (m，1H，H-3”)，3.85 (m，2H，Η·2, H-3，），3.85 (m，1H， H-2’)，3.50 (m，2H，H-5, H-5’)，2.67 (m，2H，6.4 Hz，2 x H-2，，，)，2.43(m，2H，/6.1Hz，2 x H-2，，)，2.29(m，2H，《/7.3, 15 15 Hz，2 xH-2””)，1.60-1.36 (m，6H，2 xH-4，，，2 x H-4，，，， 2 x H-3””)，1.35-1.12 (m，52H，26 CH2)，0.90 (m，9Ή，3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13/CD30D/吡啶-d5/DCl 37% 5/2/1/1): δ 174.9 (C=0)5 174.1 (C=0)5 172.9 (C=0)5 102.4 (C-l’)，94.7 (C-l)，75.3 (C-5’)，73.8 (C-4’)，73.4, 70.4, 20 70.1，69.6 (C-3，，C-5, C-4, C-3)，71.9 (C-3，，，），69.6 (C-3，，）， 69.4 (C-6)，60.8 (C-6’)，56.1 (C-2’)，54.8 (C-2)，44.2 (C-2”)， 41.7 (C-2，，，)，37.7，35.1，34·6 (C-4，，，C-4”，，C-2”，，)，32·3 (C-12，，，C-12”，，C-10”，，)，30.1-29.6 (C-6，，-> C-11，，，C-6，，，-〉 C-ll”，，C-4，，，，-> C-9，，”)， 25.7，25.6，25.2 (C-5，，，C-5，，，， 57 200838546 C-3””)，23.1 (C-13，，，C-13，，，，C-ll，”，)，14.5 (C-14”，C44”，， C-12””）； MS-ES 1155 [M + Na - 2ΗΓ，1133 [M Η]·; C52H97N2O20p2 Na3 + H20的計算值：c，51.23; Η, 8·18; N， 2·30%·實驗測定值：C，51.11; H，8·46; N，2.20%。 5 2-去氧去氧-4-0_(二羥基磷醯基)-2-[(R)-3-十二烧酸氧十四烷醯氨基]-β-D-吼喃葡萄糖基]-2-[(R)-3_羥基十四院酿氨基]-α-D-吼喃葡萄糖（16) (〇M_174-MP) 至溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (25 mg)下，將THF (50 mL)中的化合物14b(8〇 mg，47 μηιοί)氫化16 h。通過過 10濾去除催化劑，並且濾液在真空下濃縮。該殘留物通過 HPLC根據本發明（方法B)純化獲得白色凍乾物的16 (鈉鹽） (25 mg; 50%)。MS-ES 1053 [Μ - ΗΓ 丙基-2-去氧-6-C42-去氧·4-0-(二羥基磷醯基）-2-[(R)-3·十二烷醯氧十四烷醯氨基]吼喃葡萄糖 15 基]_2-[(R)-3_羥基十四烷醯氨基]-a-D-吼喃葡萄糖苷（17) (OM-174-MP-PR) 室溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (50 mg)下，將THF (100 mL)中的化合物 13b(100 mg，58 μηιοί)氫化 17 h。用 Et3N (5 00 μ L)中和該混合物並通過過濾去除催化劑。濾液在真空 20 下濃縮並且該殘留物通過HPLC根據本發明（方法D)純化獲得白色凍乾物的17 (鈉鹽）（28 mg; 44%)。4 NMR (500 MHz? CDCls/CDsOD/Pyridine-ds/DCl 37% 5/2/1/1): δ 5.25 (m? 1Η? Η-355,)5 4.72 (d5 1Η? Αα3.6 Ηζ5 Η-1)5 4.70 (d? 1Η? «Λ，，2, 9·9 Ηζ，Η-1’），4·16 (q，1Η，/3 4 = J4 5 = J4 P 9.2 Ηζ， 200838546 5 Η_4，)，4·01 (dd，1H，/6A，6B 9.3 Ηζ，Η·6Α)，3.95 (m，1Η, H_3，，)， 3.91 (t, 1H? 10.0 Hz，H-3’)，3.89 (ddd，1H，八2 3.6 Hz，《/3 2 1〇·5 Hz，《/nh，2 8·0 Hz，H-2)，3.86-3.81 (m，4H，2 x H-6，，H-6B，H-2，)，3·78 (dd，1H，/3,4 9·0 Hz，J3,2 10.5 Hz5 H-3)，3.64 (m，1H，Η·5)，3·56 (t，1H，/3,4 = «/4,5 8.8 Hz，H-4)， 3.54 (m，1H，OC历CH)，3.50 (m，1H，H-5’），3.27 (m，1H， OCi72CH)，2.63 (m，2H，J 6.2 Hz，2 x H-2，，，)，2.48 (dd，1H， • »^2，，，3，，3·4 Hz，·Τ2，，，2” 14.8 Hz，H-2”)，2·39 (dd，1H，*/2，，，3，，8.5 Hz， J2，，52，，14.8 Hz，H-2，，)，2.28 (m，2H，J 7.3, 15 Hz，2 χΗ·2，，，，)， 10 1.70-L36 (m，6H，2 xH-4，，，2 x H-4”，，2 x H-3，，，，)，1.55 (m， 2H，OCH2C//2)，1.35—1.12 (m，52H，26 CH2)，0·88 (m，12H， 4 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz，CDCl3/CD3OD/吡啶 -d5/DCl 37% 5/2/1/1): ά 174.7 (C=0)，174·0 (C=0)，172.5 (C=0)，101.9 (C-l，)，97.5 (C-l)，75.3 (C-5，)，75.0 (C-4，)， 15 73.7 (C-3’），71.7 (C-3’，，），71·6, 71·4, 70.6 (C-5, C-4, C-3)， • 70.1 (OCH2CH)，69.1 (C-3”)，69.0 (C-6)，60.8 (C-6，），55.9 (C-2，)，54.4 (C-2)，43.4 (C-2”)，41.5 (C-2，，，)，37.4, 35·0, 34.5 (C^\ C-4,9\ C-25M,)? 32.3 (C-12,55 C-10,,5,)5 30·0-29·6 (C-6”-> C-ll，，，C-6，，，_> C-ll，，，，C-4，，，，-> C-9，，”)， 20 26.1，25.6，25.5 (C-5”，C-5，，，，C-3，，，，)， 23·0，22.9 (OCH2CH2CH35 C-13"5 C-135,,? C-ll^)? 14.5 (C-14"9 CA4^\ C-12””），10.9 (OCH2CH2CH3); MS-ESI 1141 [M_H+2Na]+， C55H1()4N2017Na2P [M-H+2Na]+ 的 HRMS-ESI 計算值:1141.6868,實驗测定值：1141.6879。 59 200838546 2,3-二羥丙基-3,4-二苄基-6-0·{3,6_ 二-〇-苄基 -4-(9-(二卡基氧碟醯基)-2-去氧-2-[(R)-3-十二烧醯氧十四烧醯氨基]-β-〇-吼喃葡萄糖基}-2-[(R)-3-苄基氧十四烷醯氨基]-2-去氧-α-D-吼喃葡萄糖苷（18) 5 室溫下向 13b (500 mg; 0·29 mmol)在THF/i-Bu0H/H20 10:10:1 (15 mL)混合物中的攪拌溶液中相繼加入4_曱基嗎琳7V-氧化物(NMO) (156 mg; 1.16 mmol)和在2-丙醇(2.5%; 580 μί; 58 μπιοί)中的0s04。4小時後，加入Na2S203飽和水溶液，混合物用EtOAc萃取。用Na2S203飽和水溶液(2 X)、 10 鹽水洗滌有機相，並在MgS04上乾燥。蒸發溶劑並且殘留物從EtOH中結晶獲得白色固體18 (300 mg，59%)。1； max cm·1 3300, 2919, 2850, 1646, 1543, 1453, 1358, 1266, 998, 730? 694; NMR (500 MHz, CDC13): δ 7.40-7.10 (m? 35 H，Ph)，6.54 (m，1H，NH-2’），6.38 (m，1H，NH-2)，5.08 (m， 15 0·5Η，H-3”’)，5.03 (m，0.5H，H-3”’)，4·95-4·42 (m，14H，7 x C/i2Ph)，4·88 (m，1H，H-l’)，4.72 (m，1H，H-l)，4.52 (m，1H， H-4’)，4.27 (m，2H，H-2, H-3’)，4.18 -3.30 (m，15H，OC//2CH， Ci/(OH)，Ci^OH，H-2，，H-5，，2 x H_6，，2 x H-6, H_5, H-4, H-3, H-3，，)，2.50-2.45 (m，1H，H-2，，，），2.45-2.35 (m，1H， 20 Η·2，，)，2.30-2.20 (m，2H，H-2”，H-2”，)，2.15 (m，1H，H-2，，，，)， 1.65-1.45 (m，6H，2 x H-4”，2 χ H-4，，，，2 x H-3，”，)， 1.35-1.12 (m，52H，26 CH2)，0.90 (m，9H，3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz? CDC13)： δ 173.8 (C=0)3 173.7 (C=0)? 171.1 (C=0)，170.6 (OO)，170.4 (〇0)，138·2-138·02 (Cq)， 200838546 137.7 (Cq)5 137.6 (Cq), 135.7 (Cq)5 135.6 (Cq)? 128.4-127.4 (CH arom)，99·4 (C-Γ)，99·2 (C-Γ)，98.5 (C-l)，98·4 (C-l)， 80.6 (C-3)，80.4 (03)，78·7，. 78.4 (C-3，，C-4)，76.8, 76.7 (C-3，，)，75·6, 75.5, 75·4, 75·3 (C-4，)，74·8, 74.7 (2 x CH2Ph)， 5 74·1 (C-5，)，73.2, 72.6, 72.5, 72.0 (2 x CH2Ph)，71·3, 71·2 (CH2Ph)，70.8-70.5 (C-3，”，C-5, CH(OH))，69.4, 69·3 (2 x Ρ-ΟΟΙ2Ρ1ι)，68.8, 68·7, 68.6, 68.1 (C-6,（OCH2CH)，C-6，)， 63.7, 63.6 (CH2OH)，56.2, 56.1 (02，)，52.6, 52.5 (C-2)，41·8 -41·4 (C-2，，，C-2，，，)，34.4, 34.0, 33·7 (C-4，，，C-4，，，，C-2，，，，)， 10 31.9 (C-\T\ CATy\ 29.8-29.1 (C-65,-> CAV\ C-6’”-> C-ll’”，C-4””-> C-9”，，），25.2, 25.1，25.0, 24.9 (C-5，，， 22.6 (CA3J\ CA3"\ C-ir,95)? 14,1 (C-I4y\ C-14，，，，C-12，，，，)； MS-ES 1782 [M + Na]+; C104H147N2O19P的計算值：C，70·96; H，8·42; N，1·59%·實驗測定值·· C，70.44; 15 H，8.36; N，1.47%。 2,3-二羥丙基-2-去氧-6-CK2-去氧-4-CK二羥基磷醯基）-2-[(R)-3·十二烷醯氧十四烷醯氨基]-β-D」比喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基十四烷醯氨基]-0C-D-吼喃葡萄糖苷（19) (OM-174-MP-PD)

20 室溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (50 mg)下，將THF (100 mL)中的化合物 18 (113 mg，64 μηιοί)氫化 19 h。用 Et3N (500 pL)中和該混合物並通過過濾去除催化劑。濾液在真空下濃縮並且該殘留物通過HPLC根據本發明（方法D)純化獲得白色凍乾物的19 (鈉鹽）(26 mg; 36%)°MS-ESI 1173 61 200838546 [M-H+2Na]+，C55H1()4N2019Na2P[M-H+2Na]+ 的 HRMS-ESI 計算值:1173.6766,實驗测定值：1173.6763。 3,4-一·〇-午基-6-0-{3,6-二-(9-节基_4-(9-(二节基氧構醯基)-2-去氧·2·[(ΙΙ)-3-十二烷醯氧十四烷醯氨基]·β·〇_吡 5喃葡萄糖基}-2-[⑻-3-节基氧十四燒酿氨基]-2-去氧-D-外匕喃葡萄糖基三氯乙醯亞氨酸酯（24b) 室溫下向 14b (260 mg ; 150 μιηοΐ)在乾燥的CH2C12 (5 mL)中的攪拌溶液中加入三氣乙腈（155 μ1; 154 mm〇1)和碳酸鉀（11 mg，77 μηιοί)。攪拌1小時後，用飽和NaHC03水 10溶液(2mL)淬滅該反應，並且萃取該溶液。用鹽水洗滌該有機層，在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑獲得淡黃色油 24b (280 mg)，其無需純化在下面步驟中使用。 (6_卞基氧_厌基氣基己基）_3,4_二-(9-节基-6-(9- {3,6-二苄基_4·〇·(二节基氧麟醯基)_2_去氧士[⑻_3_十二烷醯 15氧十四烷醯氨基]♦〇·吼喃葡萄糖基}_2_[⑻_3_苄基氧十四烷醯氨基]-2-去氧-β-Du比喃葡萄糖苷（25) 在-20°C向無水CH2C12 (5 mL)中的市售攪拌溶液6-苄基氧Ik基氣基-1-己醇(43 mg，〇·17 mmol)和粗品亞胺酸酉旨 24b (280 mg)中加入4A分子篩。攪拌30分鐘後，加入 20 ™S0Tf (6叫，31师〇1)並且繼續另外攪拌2小時。反應液缓慢加熱至室溫，並且攪拌過夜。反應液通過Cdite濾過，用EtOAc稀釋並用飽和NaHC〇3水溶液中和。將有機相分離，用NaCl飽和溶液洗滌，在MgS〇4上乾燥。在真空中除去溶劑並且殘留物從MeOH中重結晶獲得白色結晶固體25 62 200838546 (174 mg ’ 兩個步驟59%)。MS_ES 1942 [M+ Na]+ 6-氨基己基-2-去氧冬〇_[2·去氧_4_α(二羥基磷醯基)-2-[(R)-3_十二烧醯氧十四烷醯氨基ρβΐη比喃葡萄糖基]-2-[⑻-3-羥基十四烷醯氨基ρβΑ σ比喃葡萄糖苷（26) 5 (OM-174-MP-AC) 室溫下在一個大氣壓、存在1〇%pd-C (50nig)下，將在

AcOH/2-丙醇/CH2C12 3:3:1 (7 mL)混合物中的化合物 25(102 mg，53 μπιοί)氫化24 h。通過過濾去除催化劑，並將濾液在真空下濃縮。該殘留物通過111>1^根據本發明（方法 10 D)純化獲得白色凍乾物的26 (鈉鹽）（17 mg; 28%)。MS-ES 1153 [Μ - H]、十四烧基_3,4_二_〇_苄基_6_〇_{3,6_二_〇_苄基冰〇_(二苄基氧磷醯基)-2-去氧-2-[(R)-3-十二烷醯氧十四烷醯氨基]-β-D-n比喃葡萄糖基卜2_[(幻_3_苄基氧十四烷醯氨基]_2_ 15 去氧+-〇_吼喃葡萄糖苷（41b) 在-20 C向市售十四醇（14 mg，65 μπιοί)和粗品亞胺酸醋24b(98mg)無水CH2Cl2(5mL)中的攪拌溶液中加入4入分子篩。攪拌30分鐘後，加入TMSOTf (2 μ£，12 μιη〇1)並且繼縯另外攪拌2小時。反應液緩慢加熱至室溫，並且攪拌過 20夜。反應液通過Celite滤過，用EtOAc稀釋並用飽和NaHC03 水溶液中和。將有機相分離，用Naci飽和溶液洗滌，在 MgS〇4上乾無。在真空中除去溶劑並且殘留物從版⑽中重結晶獲得白色結晶固體41b (58 mg，52%)。A NMR (500 MHz，CDC13): δ 7·37_7.11 (m, 35 H，Ph)，6.49 (d，1H，JNH2 63 200838546 8·0 Ηζ，ΝΗ·2)，6.21 (d，1H，JNH，2,7.5 Hz，NH-2，），5.11 (m， 1H，H-3””)，5.02 (d，1H，Jr，2,8.0 Hz，H-l，)，4.95-4.40 (m5 14H，7 x C//2Ph)，4.61 (d，1H，H-l)，4.51 (m，1H，H_4，)， 4·31 (t，1H，J3，，4，= 9.5 Hz，H-3，)，4.09 (m，1H，H-6)， 5 3·96 (m，1H，H-3)，3·84 (m，1H，H-6’），3·79 (m，1H， OCi/2CH)5 3.79-3.65 (m，5H，H-6，，H-6, H-5，，H-5, H-3，，)， 3.56-3.47 (m，2H，H-4, H-2，)，3.44 (m，1H，H_2)，3.36 (m，lH， OC//2CH)，2.42-2.23 (m，4H，2 x H-2，，，2 x H-2，，，)，2·12 (t， 2H，/7.2 Hz，2 x H-2，，，，)，1.65 -1.45 (m，8H，2 x H-4，，，2 x 10 H-4，，，，2 x H-3”，，，OCH2C//2)，1.35-1.12 (m，74H，37 CH2)， 0.90 (m，12H，4 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13): δ 173.4 (C=0)，171.3 (C=0)，170.1 (C=0)，138.2-138.0 (Cq)， 135.7-137.6 (Cq)? 128.5-127.4 (CH arom)5 99.9 (C-l)5 99.2 (C-l，)，80.9 (C-3)，78.5 (C_4)，78.3 (03，)，76.3 (C-3，，)，75.7 15 (C-4，），74.6, 74.9 (2 x CH2Ph)，74·2·74·1 (C-5，，C-5)，73.2, 73.0 (2 x CH2Ph)，71.0 (CH2Ph)，70.6 (C-3，，，），69.6 ((OCH2CH))，69.4-69.0 (2 x P-OCH2Ph，C-6，)，67.3 (C-6)， 56.6 (C-2)，56.0 (C-2，），41.4 - 41.2 (C-2，，，C-2，，，），34.4, 34.1， 33·6 (C-4，，，C-4，，，，C-2，，，，)，31.9 (C-12，，，C-12，，，，C-10，，”， 20 C-129,,,,)? 29.7-29.1 (C-65,-> C-IV\ C-6,,5-> C-1T5,3 C-45,55-> C-9^\ C-35^ -> C-ir5,,?)5 26.1, 25.2, 25.0 (C-555, C-5V5\ C-355,,)? 22.7 (C-139,? CA3^\ CA\^\ C-13,55,5)5 14.1 (C-14555 C-14，，，，CM2，”，，C-14，，，，，); MS-ES 1905 [M + Na]+· 十四烧基-2-去氧-6·0-[2-去乳-4-0-(二輕基構酿 200838546 基）-2-[⑻-3-十二烷醯氧十四烷醯氨基吡喃葡萄糖基]·2-[⑻-3-羥基十四烷醯氨基]_β|吼喃葡萄糖苷（41c) (OM-174-MP-TE) 室溫下在氫氣(6巴）、存在5% Pd-C (20 mg)下，將在THF 5 (200 mL)中的化合物41b (55mg，29 μπιοί)氫化17 h。通過過濾去除催化劑，並將濾液在真空下濃縮。該殘留物通過 HPLC根據本發明（方法B)純化以獲得白色凍乾物的41〇(鈉鹽）（17 mg; 28%)。MS-ES 1273 [M + Na]+，1251 [M + H]+。甲酿甲基-3,4-二-0苄基-6_0-{3,6-二-Ο-苄基-4_0·(二 10节基氧磷醯基）-2-去氧-2-[(R)_3-十二烷醯氧十四烷醯氨基]P D-吼喃葡甸糖基}-2-[(R)-3-节基氧十四烧酿氨基]-2· 去氧-α-D·吡喃葡萄糖苷（32c) 室溫下向 18 (300 mg; 0·17 mmol)在THF/H20 4:1 (5 mL)中的攪:拌溶液中加入高破酸納（182 mg; 0.85 mmol)。授 15 拌過夜後，用EtOAc稀釋反應液，並用NaHC03飽和水溶液洗滌混合物。用鹽水洗滌有機層，在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑。殘留物在矽膠(石油醚/EtOAc，2:3)上通過快速色譜法提供了無色油32c (250 mg; 85%)。[a]D + 26 0.90, CHC13); NMR (500 MHz，CDC13): 5 9·42 (1H，s， 20 Ci/O)，7.37-7.10 (m，35 H，Ph)，6.55 (d，1H，JNH 2 9.2 Hz, ΝΗ·2)，6·1〇 (d，1H，JNH，2, 7·7 Hz，NH-2，），5·07 (m，1H， H-3”’），4.95 (d，1H，Jr，2, 7.6 Hz，Η-Γ)，4.94-4.40 (m，15H， 7 x Ci/2Ph，H-4，)，4.70 (d，1H，^,2 3.6 Hz，H-l)，4·35-4·25 (m，2H，H-2, H-3，)，4.05 (d，1H，H-6)，3·95-3·75 (m，5H，H-5, 65 200838546 OC//2CHO, Η·6，，Η·3，，)，3.75-3.65 (m，3H，H-6，，H-5，，關， 3.60 (m，1H，H-6)，3.55-3.40 (m，2H，H-4, H-2，)，2.50-2.15 (m，4H，2 x H-2”，2 xH-2”，），2.13 (t，2H，《7 7.5 Hz，2 x H-2，，，，)，1.70 -1.45 (m，6H，2 x H-4，，，2 x H-4，，，，2 x 5 H-3””)，1.35-1.12 (m，52H，26 CH2)，0.90 (m，9H，3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13): δ 199.26 (CHO)，173.4 (C=0)，171.3 (00)，170.2 (00)，138.2-138.0 (Cq)，137.6 (Cq)，135.7 (Cq)，135.6 (Cq)，128.7-127.3 (CH arom)，99.5 (C-l，)，98.4 (C-l)，80.2 (C-3)，78·3 (C-4, C-3，)，76·7 (C-3，，)， 10 75.9 (C-4’)，74.8, 74.7 (2 x CH2Ph)，74.2 (C-5’)，73.2, 73.1， 73.0 (2 x CH2Ph，OCH2CHO)，71.2 (CH2Ph，C-5)，70.6 (C-3，，，)，69.3, 69.2 (2 x P-OCH2Ph)，69.0 (C-6，)，68.1 (C-6)， 56.6 (C-2，），52.3 (C-2)，41.4 - 41·2 (C-2，，，C-2，，，），34·4, 34.0, 33.8 (C-4”，C睡4’”，C-2”’’)，31.9 (CM2”，C-12’”，C-10””)， 15 29.6-29.1 (C-6，，-〉C-ll，，，C-6，”-〉C-ll，，，，C-4，，，，-> C-9”，，)， 25.2, 25.1，24.9 (C-5，，，C-5，”，C-3，，，，)，22.7 (C-13，，，C-13，，，， C-ll，，，，)，14·1 (C-14，，，C-14’’’，C-12””)； MS-ES 1750 [M + Na]+· 2-經乙基-3,4_二-O-节基 _6-0-{3,6·二-0节基-4-0-(二 20 苄基氧磷醯基）-2-去氧-2-[(R)-3_十二烷醯氧十四烷醯氨基吼喃葡萄糖基}-2-[(R)-3-苄基氧十四烷醯氨基]-2-去氧-α-D-吼喃葡萄糖苷（32b) 在0°C 向在EtOH/CH2C12 4:1 (5 mL)中的攪拌32c (119 mg; 69 μιηοΐ)溶液中加入硼氫化鈉（3 mg; 75 μηιοί)。在室溫 200838546 下繼續攪拌10分鐘，用ΝΗ4α飽和水溶液淬滅該反應，並用 CH2C12稀釋。萃取該有機層，用鹽水洗滌，在MgS04上乾燥。在真空中去除溶劑並且殘留物從EtOH中重結晶獲得白色固體321>(100 11^，84%)。111]\^175°0：印幻11);[〇1]1) + 27 5 (c 0.56, CHC13); max cm·1 3301，2920, 2850, 1724, 1649, 1543, 1453, 1358, 1264, 1008, 731，694; 4 NMR (500 MHz， β CDC13): δ 7.40-7.10 (m，35 H，Ph)，6.44 (d，1H，Jnh，2, 7.0

Hz，NH-2，)，6·40 (d，1H，JNH，2 10·1 Hz，NH-2)，5·14 (m，1H， • H-3，，，)，5.00-4.42 (m，14H，7 x C/i2Ph)，4.88 (m，1H，/Γ，2, 10 8·72 Hz，H-l，)，4.73 (d，1H，/12 3.6 Hz，H-l)，4.53 (m，1H， H，4’），4.47 (m，1H，H-3’），4.29 (ddd，1H，/NH，2 = J2,3 10.1 Hz，八23_6 Hz，H-2)，4.15 (d，1H，H-6)，3.99 (m，1H，H-5)，3·86 (m5 2H，H-6，，H-3”)，3.77-3.60 (m，2H，H-6，，H-5，)，3.66 (t， 1H，/3,4= J2,3 10.1 Hz，H-3)，3.60-3.33 (m，7H，H-6, H-4, 15 H-2’，OCi/2CH2, OCH2C//2)，2.42 (m，1H，H-2”’），2.28 (m， 3H，2 x H-2”，H-2”’)，2·15 (t，2H，/7.5 Hz，2 x H-2””)， ⑩ 1.70-1.45 (m，6H，2 x H-4，，，2 x H-4”’，2 x H-3””)， 1.35-1.12 (m，52H，26 CH2)，0·90 (m，9H，3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz，CDC13)·· δ 173·3 (C=0)，171·0 (C=0)， 20 170.5 (00)，138.2-138.0 (Cq)，137.6 (Cq)，135.7 (Cq)， 135.6 (Cq)，128.7-127.3 (CH arom)，98·9 (C-Γ)，98.5 (C-l)， 80·3 (C-3)，78.6 (C-4)，78·1 (C-3，)，76.7 (C-3，，)，75.9 (C-4，)， 74.8，74.7 (2 x CH2Ph)，74.0 (C-5’)，73.2，73.1 (2 x CH2Ph)，72.3 (CH2OH)，71 ·2 (CH2Ph)，70·8 (C-5)，70.6 67 200838546 (C-3，，，），69·3, 69.2 (2 x P-〇CH2Ph)，68·8 (C-6，），68.2 (C-6) 61.8 (OCH2CH2)，57·1 (C-2，)，52·5 (C-2)，41.4 - 41·2 (C_2，， C-2^)5 34.4, 34.05 33.7 (C-4"5 C^\ C-25,55)3 31.8 (C^l255 C-125"? C-105^), 29.6-29.0 (C-655-> CAV\ C-6^^> Cell9„ 5 C-4，，” > C-9，，，，)，25.1，25.0, 24.9 (C-5，，，C-5，，，，C-3，，，，)，22 6 (C-13，，，C-13，，，，C-ll，，，，)，14.0 (C-14，，，C-14，，，，C、l2，，，，） MS-ES 1753 [M + Na]+. 2_經乙基-2-去氧-6-0-[2-去氧-4-0-(二羥基磷酸基）-2-[(R)-3-十二烧醯氧十四烷醯氨基]-β-D-吡喃葡萄糖 10基]-2-[(R)-3-經基十四烧醯氨基]_〇^-°比喃葡萄糖芽（32) (OM-174-MP-EO)

室溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (50 mg)下，將在TJiF (100 mL)中的化合物32b (160 mg，92 μηιοί)氫化 17 h。然後將混合物用EtsN (500 μΕ)中和並通過過濾去除催化劑。將 !5 濾液在真空下濃縮並且該殘留物通過HPLC根據本發明（方法D)純化以獲得白色凍乾物的32 (鈉鹽）（50 mg; 49%)。 MS-ESI 1143 [M-H+2Na]，C54H102N2〇i8Na2P [M_H+2Na]+ 的RMS-ESI計算值:6660,實驗测定值：1143.6659. 2-(二苄基氧磷醯基氧）乙基-3,4-二节基·6·〇-{3,6_ 20 二节基二苄基氧磷醯基)-2-去氧-2-[(R)-3-十二烷醯氧十四烷醯氨基]-β-D-吼喃葡萄糖基卜2-[(R)-3-苄基氧十四烧醯氨基]-2-去氧-a-D-吼喃葡萄糖苷（33b) 室溫下向在CH2C12 (5 mL)中的32b (1.1 g, 1·91 mmol) 和在CH3CN (〜〇·45 Μ) (321 pL，0.14 mmol)中的市售 1//_ 68 200838546 四唑攪拌溶液中加入二苄基二甲基亞碟醯胺（29 μΐ; 〇·11 mmol)。在室溫下繼續攪拌1〇分鐘，然後將溶液冷卻至低於 -20C。加入在CH2C12(3 mL)中的WCFBA (57-86%，46 mg; 0·27 mmol)溶液，並在·20°(：攪拌該溶液3〇分鐘。加入10% • 5含水硫代硫酸鈉（5 mL)，並且攪拌混合物1〇分鐘，然後用

EtOAc稀釋，並且分離有機相。相繼用1〇%Na2S2〇3水溶液 (3x)、飽和NaHC〇3水溶液(2x)、N HC1溶液(ΐχ)和鹽水洗滌有機層。有機相在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑。殘 _ 留物在石夕膠(石油醚/EtOAc，1:1至1:2)上通過快速色譜法提 10 供了無色油狀化合物33b (130 mg; 90%)。4 NMR (500 MHz，CDC13): δ 7.40-7.10 (m, 45 H，Ph)，7·07 (d，1H，JNH,2 9·4 Hz，NH-2)，6.56 (d，1H, JNH2,7.4 Hz，NH-2，)，5.09 (m， 1H，H-3，，，)，5.05 (m，1H，2, 7.8 Hz，H-l，)，5.00-4.36 (m， 18H，9 x C/^Ph)，4.66 (d，1H，J12 3.2 Hz，H-l)，4·50 (m，1H， 15 H-4，)，4.43 (m，1H，Η·3，)，4·33 (ddd，1H，= Λ 3 9 4 Hz，

Ji，2 3.2 Hz，H-2)，4·10 (d，1H，J6 610.0 Hz，Η·6)，4·05 (m，1H， OCH2C//2OP)，3·93 (m，1H，〇CH2C//2OP)，3·88 (m，1H， H-3”)，3.83 (d，1H，c/6，，6, 10·0 Hz，H-6’)，3.80 (m，1H，H-5)， 3.73-3.63 (m，3H，H-5’，H-3，OCf/2CH2OP)，3.62 (dd，1H, 20 H-6)，3·51 (t，1H，J3,4 = /4 5 9·5 Hz，H-4)，3.38 (ddd，1H， ;η，2’7·4 Hz，/Γ 2’7·8 Hz，J2, 3’8.8 Hz，H-2’），3·31 (m，1H, OCi/2CH2OP)，2.44 (dd，1H，J2，，,3，，7·5 Hz，/2，，2” 14.7 Hz， H.2”)，2.36 (m，2H，H-2，，，，H-2”)，2·23 (dd，1H，/2，，，，3，，，5·3 Hz, J2，，，，2，，，15.2 Hz，H-2”，)，2.10 (t，2H，/7.5 Hz，2 x H-2，，，，)， 69 200838546 1·60-1·40 (m，6H，2 x H-4，，，2 χ H-4，，，，2 x H-3””)， 1.35-1.05 (m，52H，26 CH2)，0.88 (m，9H，3 x CH3); 13C NMR (125.8 MHz, CDC13): 5 173.3 (C=0)，171.5 (00)， 170.3 (C=0)，138.7 (Cq)，138.5 (Cq)，138·3 (Cq)，138.2 (Cq)， 5 138.0 (Cq)，135.8 (Cq)5 135.7 (Cq)，135.6 (Cq)，135.5 (Cq)， 135.4 (Cq)，128.6-127.8 (CH arom)，99·2 (C-l，)，98.7 (C-1)， 80.8 (C-3)，78.1 (C-4, C-3’)，76.8 (C-3”)，76.0 (C-4’)，74.9, 74.8 (2 x CH2Ph)5 74.2 (C-59)? 73.2, 73.1 (2 x CH2Ph)? 71.4 (CH2Ph)，70.7-70.6 (C-5，C-3”’），69.5-69.3 (4 x 10 P-〇CH2Ph)，69.1 (C-6)，68.0 (C-6’)，67.2 (0CH2CH20-P)， 66.6 (0CH2CH20-P)? 57.0 (C-2?), 52.5 (C-2), 41.6 - 41.3 (C-2，，，C-2，，，），34.4, 34.2, 34.0 (C-4，，，C-4，，，，C-2，，，，)，31.9 (C-12”，C-12’”，C-10””)5 29.6-29.1 (C-6，，-> C-ll，，，C-6，，，-> C-ll，，，，C-4，，，，-> C-9，，，，)，25.2，25.0，24.9 (C-5，，，C-5，，，， 15 C-3””)，22.7 (C-13”，C-13，，，，C-ll，，，，)，14·1 (C-14，，，C-14，，，， C-12，，，，)· 2-(膦醯基氧）乙基·2·去氧-6-0-[2·去氧_4_0-(二羥基磷醯基)_2-[(R)-3-十二烧醯氧十四烧酸氨基]-β-D-。比喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-經基十四烧醯氨基]—a-D-吼喃葡萄糖苷（33) 20 (OM-174-MP-EP) 室溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (70 mg)下，將在THF (70 mL)中的化合物33b (107 mg5 54 μπιοί)氫化17 h。然後將混合物用EtsN (500 pL)中和並通過過濾去除催化劑。將渡液在真空下濃縮並且該殘留物通過Η P L C根據本發明（方法 200838546 D)純化獲得白色凍乾物的33 (鈉鹽）（35 mg; 55%)。MS-ESI 1245 [M-2H+3Na]+，C54H1D2N2021Na3P2 [M-2H+3Na]+ 的 HRMS-ESI計算值:1245·6143,實驗测定值:.1245.6136. 2-羧甲基-3,4-二-Ο-苄基 _6-0-{3,6-二-Ο-苄基-4-0-(二 5苄基氧填酸基）-2-去氧-2-[(R)-3-十二烧醯氧十四烧醯氨基]比喃葡萄糖基}_2-[(R)-3-苄基氧十四烷醯氨基]-2-去氧喃葡萄糖普（35d) 室溫下向 32c (100 mg; 58 μπιοί)，NaH2P04.H20 (8 mg， Φ 58 μπιοί)，2-甲基_2·丁烯(28 pL，260 μπιοί)在THF/H20 4:1 10 (5 mL)中的攪拌溶液中加入亞氯酸鈉(20 mg; 173 μηιοί)。攪拌6小時後，用1MHC1溶液（1 mL)淬滅該反應，並用CH2C12 稀釋。萃取該有機層，用鹽水洗滌，在MgS〇4上乾燥並在真空中去除溶劑。殘留物在矽膠(CH2C12/丙酮，5:1 + 1% AcOH)上通過快速色譜法提供了白色固體化合物35(1 (67 15 mg; 66%)。MS-ES 1766 [M + Na]+. 2-羧甲基-2-去氧-6-0-[2-去氧-4-0-(二羟基磷醯 _ 基)·2·[⑻-3-十二烷醯氧十四烷醯氨基吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基十四烷醯氨基]_a_D4b喃葡萄糖苷（35c) (OM-174-MP-CM)

20 室溫下在氫(6巴）、存在5% Pd-C (25 mg)下，將在THF

(20 mL)中的化合物35d (67 mg，38 μιηοΐ)氫化17 h。然後將混合物用EtsN (500 μΕ)中和並通過過濾去除催化劑。將濾液在真空下濃縮並且該殘留物通過HPLC根據本發明（方法 D)純化獲得白色凍乾物的35c(鈉鹽)(25 mg; 58 %)。MS-ESI 71 200838546 1179 [M-2H+3Na].，C54H99N2019Na3P [M-2H+3Na]+ 的 HRMS-ESI计异值：1179.6273，實驗测定值：H79.6275。

生物活性 1.處理方法A 將産品溶解在THF-水混合物（ι:1 ν〇1/ν〇1·)中。通過製備反相高效液相層析在下述條件下進行處理：

鱼_: VYDAC C18, 22 X 250 mm，1〇 μ% 300 A 流動相：

A:乙腈水（1:1，¥〇1./¥〇1.)，5111]\4碟酸四丁|安一元碱 B: 2-丙醇-水（9:1，vol./vol·)，5 mM磷酸四丁銨一元碱流動速率:20 ml/min. 洗脫：時間(min) %流動相（B) 0 10 50 100 55 10 60 10

檢測:UV，210 nm (波長）通過在HPLC，VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 μηι，300 A 15 上的吸附收集並濃縮四丁基銨鹽形式的含化合物的部分。用在水中pH 4.2的200 mM磷酸二氫鈉溶液+ 2-丙醇(9:1， v/v) (5體積）洗滌獲得化合物的鈉鹽。通過引入5體積水+2-丙醇(9:1 v/v)除去過量的構酸二氫納後，用水+ 2-丙醇（1:9, v/v)溶液洗脫該化合物。 20 用水稀釋並通過凍乾法除去溶劑後，獲得化合物的鈉 72 200838546

2.處理方法B 將産品溶解在THF_水混合物（1:1 vg1/vg1)中。通過製備反相高效液相層析在下述條件下進行處理：

担 VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 μηι，300 A 流動相： A:乙腈-水（1:1，¥〇1.〜〇1.)，5111]^磷酸四丁銨一元碱 B: 2-丙醇-水（9:1，voL/voL)，5 mM磷酸四丁銨一元碱

洗脫：流動速率:20 ml/min. 時間(min) %流動相（B) 0 10 50 100 55 10 60 10 檢測:UV，210nm (波長）通過在HPLC，VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 卿，3〇〇 a

上的吸附收集並濃縮四丁基銨鹽形式的含化合物的部分。用在水中pH 7.5的100 mM磷酸氫二鈉_磷酸二氫鈉溶液+ 15 2-丙醇(9:1，v/v) (5體積）+ 2-丙醇(9:1，v/v) (5體積)洗滌獲得化合物的鈉鹽。通過引入5體積水+2_丙醇(9:1 v/v)除去過量的填酸二氫鈉-碟酸氫二鈉後，用水+2-丙醇（i:9 v/v)溶、夜洗滌該化合物。用水稀釋並通過凍乾法除去溶劑後，獲得化合物的鈉鹽。

2〇慮理方法C 73 200838546 將産品溶解在THF-水混合物（1:1 ν〇1·/ν〇1·)中。通過製備反相高效液相層析在下述條件下進行處理：

技:VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 μιη，300 A 流動相： 5 A:乙腈-水（1:1，vol./vol·)，5 mM磷酸四丁銨一元碱 B: 2-丙醇-水（9:1，vol./vol·)，5 mM磷酸四丁銨一元碱流動速率:20 ml/min. 洗脫：時間（min) %流動相（B) 0 10 50 100 55 10 60 卜10

檢測:UV，210 nm (波長） 10 通過在HPLC，VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 _，300 a 上的吸附收集並濃縮四丁基鍈鹽形式的含化合物的部分。

用在水中pH 9.2的200 mM磷酸氫二鈉溶液+2_丙醇(9:1，v/v) (5體積）洗滌獲得化合物的鈉鹽。通過引入5體積水+2_丙醇 (9:1 v/v)除去過量的磷酸氫二鈉後，用水+2_丙醇（1:9, v/v) 15溶液洗滌該化合物。用水稀釋並通過凍乾法除去溶劑後，獲得化合物的納鹽。

k處理方法D 將産品溶解在THF-水混合物（1:1 v〇1/v〇1)中。通過製備反相高效液相層析在下述條件下進行處理：

〇 VYDAC C18, 22 X 250 mm5 1〇 μηι? 300 A 74 200838546 Α:乙腈-水（1:1，¥〇1.~〇1.)，5111]\1磷酸四丁銨一元碱 B: 2·丙醇-水（9:1，v〇l./v〇l·)，5 mM磷酸四丁銨一元碱 20 ml/min. 5 時間(min) %流動相（B) 0 10 50 100 55 10 _60 10

撿湏j_: UV，210 nm (波長）通過在HPLC，VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 μηι，300 A 上的吸附收集並濃縮四丁基銨鹽形式的含化合物的部分。用在水中pH 7.0的10 g/L氣化鈉溶液+2-丙醇（9:1，v/v) (5 10 體積)洗滌獲得化合物的鈉鹽。通過引入5體積水+2-丙醇 (9:1 v/v)除去過量的氯化鈉後，用水+2-丙醇（1:9，v/v)溶液洗滌該化合物。用水稀釋並通過凍乾法除去溶劑後，獲得化合物的鈉鹽。 5.處理的監淛 15 每個處理步驟後，通過反相分析HPLC色譜按照下列條件分析各部分：柱:Supelcosil C18? 3 μηι, 4.6 χ 150 mm? 100 Α5 Supelco 流動相：_ 20 A:乙腈-水（1:1，νο1·/νο1·)，5 mM磷酸四丁銨一元碱 75 200838546 B: 2-丙醇-水（9:1，voL/vol.)，5 mM磷酸四丁銨一元碱流動速率:1 ml/min 选凰：20分鐘内A: B梯度(75: 25至0:100) UV，210和254 nm (波長） 5 實施例1 : 人外周血單核細胞(PBMC)分泌的IL-6和TNF 本發明所合成的化合物與母體生物分子對IL-6及TNF 産生效果的比較用於檢測IL-6分泌的化合物 10 本發明用於檢測IL-6分泌的化合物是：化合物 lb (OM-174-DP)，化合物 16 (OM-174-MP);化合物 17 (OM-174-MP-PR)，化合物 19 (OM-174-MP-PD)，及化合物26 (OM-174 MP-AC) 而且，本發明還檢測了生物母體分子，即OM-174-DP (P3)的活性，用以作爲對照。在另一個序列實驗中，檢測了下述化合物對人PBMC 分泌的TNF-α。所述的化合物是：化合物 lb (OM-174-DP)，化合物 16 (OM-174-MP);化 20 合物 17 (OM-174-MP-PR)，化合物 19 (OM-174-MP-PD)，化合物26 (OM-174 MP-AC)，化合物41c (OM-174 MP-TE)，· 化合物32 (OM-174 MP-EO)，化合物33 (OM-174 MP-EP)，和化合物35c (OM-174 MP-CM). 介紹及理論 200838546 人外周血單核細胞(PBMC)産生IL-6是重要的體外實驗，用於篩選新化合物刺激免疫系統的能力。IL-6是一種多功能細胞因子，對於宿主防禦、急性期反應和紅細胞生成來說具有重要作用。 5 腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種多效性細胞因子，由多種類型的細胞産生，包括造血細胞、非造血細胞，其中大部分爲造血細胞。TNF-a對於消除多數的傳染物是必要的。因此本發明化合物的對上述細胞因子的激活具有重要治療價值。 10 方法: 人PBMC的製備和細胞培表離心健康供體（Centre de transfusion，Hdpital Uni versitaire，Geneva)的外周血以獲得血沈棕黃層。該血沈棕黃層與Hanks’平衡鹽水溶液混合（HBSS，Sigma，Buchs， 15 Switzerland)，在該混和液上覆蓋Ficoll Paque液(Amersham

Pharmacia)使濃度達到 1·〇77 g/mL並離心（2800 rpm，20〇C， 25 min)。在室溫下將分裂中期的細胞在hbSS中與800rpm 的條件下洗兩次，共15分鐘，所得的顆粒狀細胞再懸浮於 HBSS中。使用Neubauer cell細胞計數器計數。所有的細胞 20培養均在含有青黴素（1〇〇 U/mL)、鏈黴素（100 pg/mL)、L-谷氨酸(2 mmol/L)和1 〇%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640的培養液中進行(上述試劑均購於sigma公司）。用於體外刺激性試驗的細胞在濃度爲1 X 1〇6活細胞/孔的條件下培養。瘦叠中的刺激性試驗和IL-6及TNF-α的測定 77 200838546 PBMC在37°C，5%C02氣氛中培養。分別加入對照（見下述)及本發明樣品。當測定IL-6時，本發明樣品的濃度分別爲：1、5，和20 g/mL ;當測定TNF_a時，本發明樣品的濃度分別爲0.2、2和20 g/mL。介質：RPMI。 5 24小時後收集培養上清液並用酶聯免疫法(ELISA)檢測IL-6及TNF-a的濃度（人IL-6及TNF_a試劑盒和BD OptEIA由美國San Diego公司提供）。測定方法見産品說明。檢測限分別爲10 pg/mL和8 pg/mL。結果： 10 結果見下表： A: IL-6檢測表 1.1: 人外周血單核細胞産生的“IL_6±STDEV(單位：pg/ml)”的檢測採用的陰性對照爲：介質，陽性對照爲LPS。樣口口 (編號）+ [批次] +濃度Pg/ml 濃度 pg/ml IL6 (pg/ml) 標準差介質 NA 6.5 0.2 介質 NA 20.7 1·5 LPS [026:B6] 0.001 gg/mi 0.001 15105 627.7 (LPS [026:B6] 0.01 μα/ml 0.01 13194 632.9 LPS [026iB6] 0.1 |mg/rnl 0.1 16097 1004.7 15 結果說明： LPS按照預期，即便在最低的試驗劑量也能從人pBMC 産生大量IL-6。 78 200838546 表1·2 本發明合成化合物（1 b) (〇Μ_ 174-DP)誘導人PBMC産生IL-6 的效果。（與生物母體分子174-P3比較）樣品(編號）+[批次] +濃度pg/ml 濃度 (ig/ml IL6 (pg/ml) STDEV 標準差介質 ΝΑ 6.5 0.2 介質 ΝΑ 20.7 1.5 OM-174-DP [P3] 1 μδ/πι1 1 9.8 1.9 OM-174-DP [Ρ3]5μδ/πι1 5 18.5 4.2 OM-174-DP [Ρ3] 20 pg/ml 20 97.7 12.6 (lb) OM-174-DP [SMOR-189] 1 μβ/ιη1 1 20.2 2.0 (lb) OM-174-DP [SMOR-189] 5 Mg/ml 5 57.1 2.8 (lb) OM-174-DP [SMOR-189] 20 μδ/πι1 20 225.5 7.9 結果說明:

兩批次的OM-174均能誘導人PBMC分泌IL-6，且用合成分子獲得的水平稍高於用生物分子P3獲得的。表1.3 本發明的5個合成化合物誘導人PBMC産生IL-6的效果。樣品(編號）+[編碼] +濃度Mg/ml 濃度 pg/ml IL6 (pg/ml) 標準差 (lb) OM-174-DP [SMOR-189] 1 pg/ml 1 20.2 2.0 (lb) OM-174-DP [SMOR-189] 5 μβ/ηι1 5 57.1 2.8 (lb) OM-174-DP [SMOR-189] 20 pg/ml 20 225.5 7.9 (16) OM-174-MP [SMORII-30] 1 pg/ml 1 81.1 4.5 (16) OM-174-MP [SMORII-30] 5 pg/ml 5 473.3 32.0 (16) OM-174-MP [SMORH-30] 20 μ^ιηΐ 20 1348.2 22.8 (17)OM-174-MP-PR[SMORn-24] 1 μ^ιηΐ 1 171.6 9.1 (17) OM-174-MP-PR [SMORH-24] 5 μ^πιΐ 5 447.6 45.5 (17) OM474-MP-PR [SMORH-24] 20 μ^Ι 20 752.4 37.2 (19) OM-174-MP-PD [SMORn-32] 1 μ§/πύ 1 44.5 1.3 (19) OM-174-MP-PD [SMORII-32] 5 pg/ml 5 95.9 1.9 (19) OM474-MP-PD [SMORH-32] 20 μ^ηιΐ 20 199.1 6.4 (26)OM-174-MP-AC-[F4] 1 pg/ml 1 269.0 10.2 (26) OM-174-MP-AC [F4] 5 pg/ml 5 1923.2 69.3 (26) OM-174-MP-AC-[F4] 20 μβ/ιη1 20 8349.3 483.5 79 200838546 結果說明：、與生物母體分子OM-174-DP(批號：P3)相比，合成化合物（lb)誘導人單核細胞産生il-6的水平更高。化合物OM-174-MP (16)的檢測結果也同樣適用。甚至 5在最高劑量(2〇g/ml，表中未顯示）對應的生物樣品也不能誘導産生IL-6，而有關的合成化合物OM-174-MP (化合物16) 産生IL-6的濃度可以達到1348 pg/m卜總之所有供試合成化合物（lb、16、17、19和26)均能誘導IL-6的分泌。 10 mTNF_ 檢測 π 表 1.4: 人外周血單核細胞産生的“TNF-a±STDEV(單位·· pg/ml)，，的檢測採用的陰性對照爲：介質，陽性對照爲LPS。樣品(編號）+ [編碼] +濃度ug/ml 濃度 μβ/ml TNF-a (pg/ml) 標準差介質 ΝΑ 24 6.8 介質 ΝΑ 29 8.8 LPS [026:B6] 0.2 pg/ml 0.2 16112 411 LPS [026:B6] 2 μξ/χηΐ 2 14237 494 LPS [026:B6] 20 pg/ml 20 13602 472 結果說明： 15 受試三個劑量的LPS按照預期，均能刺激人PBMC産生 _ 極高水準TNF-a。表1.5 本發明合成化合物（1 b) (OM-174-DP)誘導人PBMC産生 TNF-a的效果。（與生物母體分子174-P3比較）。樣品(編號）+ [編碼] + 濃度 ILig/ml 濃度 Ug/ml TNF-a (pg/ml) STDEV 標準差 OM-174-DP [P3] 0.2 μ8/πι1 0.2 2.5 2.1 OM-174-DP [Ρ3] 2 pg/ml 2 7.1 1.1 ΟΜ-174-DP [Ρ3] 20 pg/ml 20 300 31 (lb) OM-174-DP [SMORII-132] 0.2 pg/ml 0.2 37 4.9 (lb) OM-174-DP [SMORII-132] 2 pg/ml 2 Γ 117 22 (lb) OM-174-DP [SMORII-132] 20 pg/ml 20 1105 69 80 200838546 結果說明：兩批次的OM-174均能誘導人PBMC分泌TNF-α，且用合成分子獲得的水平稍高於用生物分子P3獲得的。表1.6

5 本發明的9個合成化合物實例誘導人PBMC産生TNF-a的效果。樣品(編號）+[編碼] '- + 濃度 μβ/πιΐ 濃度 ing/ml TNF-a a (ps/ml) 標準差 (lb) OM-174-DP [SMORn-132] 0.2 0.2 37 4.9 (lb) OM-174-DP [SMORD-132] 2 pg/ml 2 117 22 (lb) OM-174-DP [SMORII-132] 20 pg/ml 20 1105 69 (16) OM474-MP [SMORH-30] 0.2 μ^ιηΐ 0.2 0.69 0.1 (16) 0M-174-MP [SMORH-30] 2 pg/ml 2 49 14 (16) OM-174-MP [SMORH-30] 20 μ^πιΐ 20 1705 16 (17) OM-174-MP-PR [KAS1-108] 0.2 μ^ιηΐ 0.2 46 4.6 (17) OM-174-MP-PR [KAS1-108] 2 μ^πιΐ 2 474 16 (17) OM-174-MP-PR [KAS1-108] 20 μβ/ηι1 20 2114 35 (19) OM-174-MP-PD [SMORII-113] 0.2 |ig/ml 0.2 9.2 4.1 (19) OM-174-MP-PD [SMORH-113] 2 μ^πιΐ 2 5.1 2.7 (19) OM-174-MP-PD [SMORH-113] 20 μ^ιηΐ 20 11.2 6.0 (26) OM-174-MP-AC [KAS1-103] 0.2 μ^πιΐ 0.2 29.3 3.6 (26) OM-174-MP-AC [KAS1-103] 2 μ^πιΐ 2 1264 33 (26) OM-174-MP-AC [KAS1-103] 20 μ^ιηΐ 20 7016 186 (41c) OM-174-MP-TE [KAS2-10] 0.2 μ^πιΐ 0.2 570 34 (41c) OM-174-MP-TE [KAS2-10] 2 μ^ιηΐ 2 6036 306 (41c) ΟΜ-174-ΜΡ^ΓΕ [KAS2-10] 20 20 9769 119 (32) OM-174-MP-EO [SMORH-74] 0.2 μ^ιπΐ 0.2 5.5 3.5 (32) OM-174-MP-EO [SMORn-74] 2 μ^ιηΐ 2 7.8 6.4 (32) OM-174-MP-EO [SMORII-74] 20 μ_ 20 251 20 (33) OM-174-MP-EP [SMORn-83] 0.2 μ^πιΐ 0.2 8.0 1.4 (33) OM-174-MP-EP [SMORH-83] 2 μ^πιΐ 2 8.3 1.7 (33) OM-174-MP-EP [SMORD-83] 20 μ^πιΐ 20 21 4.7 (35c) OM-174-MP-CM [SMORH-135] 0.2 μ^πιΐ 0.2 48 3.6 (35c) OM-174-MP-CM [SMORH-135] 2 pg/ml 2 502 11 (35c) OM474-MP-CM [SMORII-135] 20 pg/ml 20 591 11 81 200838546 結果說明：除化合物（19)和(33)以外的所有合成化合物，包括lb、 16、17、26、41c和32,都具有誘導人單核細胞産生高濃度 TNF-α的作用，說明上述化合物可以作爲免疫刺激藥物。 5 結果同時顯示化合物（19，即OM-174-MP-PD)和（33，即OM-174-MP-EP)也可以開發成“抗炎，，藥物。 ’ 有趣的是，化合物（19)和（33)均表現出“抗炎，，特徵。 * 其實，化合物（19)在LACK誘導的哮喘模型中表現出的抗哮喘特徵具有“預防”和“治療”意義（見實施例6)，該化合 _ 10物也能抑制由化合物48/80誘導的鼠巨核細胞組胺分泌的釋放（見實施例7)。實施例7的後一個模型顯示化合物(33)也具有活性。實施例2 生物化合物OM-174-DP生物學活性的調節：通過母體 15生物分子OM-174-DP原始的純化方法提高THP-1細胞分泌 TNF-a。供試化合物: · 本發明的供試化合物是：本發明批號GMP004的母體生物分子〇M_! 74_Dp用儲 20備液檢測，或者用下述方法進行再提純，主要的檢測方法爲HPLC，採用不同pH範圍的流動相。介紹及合理性說明：腫瘤壞死因子(TNF-a)是一種多效性細胞因子，由多種類型的細胞産生，包括造血細胞、非造血細胞，其中大部 82 200838546 分爲造血細胞。TNF-α對於消除多數的傳染物（白色念珠菌，單核細胞增多性李司忒氏菌，分枝桿菌···）是必要的，並且發揮有效的促炎症反應效應，例如誘導黏著分子例如 VCAM-1，細胞間黏附分子1 (ICAM-1)，或内皮細胞上的内 5皮細胞選擇素和其他類型細胞的表達。在各種疾病的病理過程中均有TNF高度表達，包括·· 風濕性關節炎、胰島素依賴型糖尿病、炎症性腸病，尤其是克隆氏症。因此TNF-α的分泌是引發免疫反應的必要因素，但是〇這過程應當有所控制以防止炎症性疾病的發生。一批原始生物産物OM-174-DP (GMP004)用以下兩種方法進行再配製：方法：

1.方法A 15 用製備反相HpLC進行純化，UV檢測，檢測波長21〇 nm。收集含有四丁銨鹽的形式存在的化合物的餾分，用吸附HPLC濃縮。用200 mM的磷酸二氫鈉水溶液(ρΗ 4·23)和 2-丙醇的混合物(9:1，ν/ν)(5倍體積）洗滌獲得上述化合物的鈉鹽。用5倍體積的水和2-丙醇混合物(9:1，ν/ν)除去多餘的 20磷酸二氫鈉後，再用水和2-丙醇混合物（1:9, ν/ν)洗脫化合物0 用水稀釋後用凍乾法除去溶劑，獲得化合物的鈉鹽。然後檢測所得化合物，在ΤΗΡ-1細胞中，可以調節也可不調節Ph (pH爲7.5)，分析化合物誘導了^^心分泌的潛能（見 83 200838546 下）。

2.方法B 用製備反相HPLC進行純化，UV檢測，檢測波長210 rnn。收集含有四丁銨鹽的形式存在的化合物的餾分，用吸 5 附HPLC濃縮。用100 mM的磷酸氫二鈉_填酸二氫納水溶液 (pH 7.5)和2-丙醇的混合物（9:1，v/v)(5倍體積）洗滌，獲得上述化合物的鈉鹽。用5倍體積的水和2-丙醇混合物（9:1，v/v) 除去多餘的構酸氫二鈉後，再用水和2-丙醇混合物(9:1，v/v) 洗脫化合物。 10 用水稀釋後用凍乾法除去溶劑，獲得化合物的鈉鹽。然後檢測所得化合物，在THP-1細胞中，可以調節也可不調節pH(pH爲7 · 5)，分析化合物誘導TNF-α分泌的潛能（見下）。 THP-1細胞培養： 15 THIM，人白細胞單核細胞株，購於ATCC公司（美國馬納薩斯州） THP-1細胞（1〇6個/mi，2〇〇 11/孔)在96孔平板組織培養凰中培養（Costar)，以含有1〇%的人血漿（HS;

Gibco-BRL)、1〇 mM HEPES緩衝液、1 mM丙酮酸鹽、0.1 Μ 20非必需氨基酸、2 mM谷氨酸、50 mM的2-巯基乙醇、1〇〇 U/ml青黴素和1〇 mg/ml鏈黴素的RPMI爲介質（完全介質）。在37°C下，將細胞置於含有5%的c〇2的濕度可控的孵化箱中’以不同濃度的本發明化合物刺激細胞不同的時間。收穫培養上清液並在_20°C保存，備於ELISA法檢測細胞因子。 84 200838546 培卷上清液中的刺激性試驗和TNF-α的測定細胞在37°C，5%C02氣氛中培養。加入本發明産品的濃度分別爲0.2、2和20 g/mL。介質：RPMI。 24小時後收穫培養上清液並用酶聯免疫法(ELISA)檢 5 測TNF_a的濃度(BD OptEIA由美國San Diego公司提供）。測定方法見産品說明。檢測限爲8 pg/mL。 • 結果: 結果見下述表2.1 : • 表I:本發明化合物誘導THP-1細胞産生TNF-α的效果。樣品[批號]/方法/劑量/pH TNFa (pg/ml) 標準差介質 0.51 0.33 介質 0.68 1.24 OM-174-DP [GMP004J (0.2 μ^πύ) 13.03 0.39 OM-174-DP [GMP004] (2 pg/rnl) 64.42 4.81 OM- 174-DP [GMP004] (20 pg/ml) 193.02 14.68 方法A的OM-174-DP [GMP004] (0.2 pg/ml) 10.85 3.59 方法A的OM-174-DP [GMP004] (2 pg/ml) 11.20 12.56 方法A的OM-174-DP [GMP004] (20 pg/ml) 74.90 7.22 方法A的OM-174-DP [GMP004] (0.2 pg/ml)，pH 7.5 1.22 0.46 方法A的OM-174-DP [GMP004] (2 pg/ml), pH 7.5 9.09 1.20 方法A的OM-174-DP [GMP004] (20 pg/ml)，pH 7.5 96.10 4.80 方法B 的 OM-174-DP [GMP004] (0.2 pg/ml) 205.96 43.94 方法B 的 OM-174-DP [GMP004] (2 pg/ml) 447.36 6.00 方法B的OM-174-DP [GMP004] (20 pg/ml) 591.09 23.14 方法B的OM-174-DP [GMP004] (0.2 pg/ml), pH 7·5 141.55 3.86 方法B 的 OM-174-DP [GMP004] (2 pg/ml)，pH 7.5 473.89 18.56 方法B 的 OM-174-DP [GMP004] (20 pg/ml)，pH 7.5 636.78 51.78 10 結果說明: 20pg/ml的OM-n4-DP生物産品[GMP004]誘導産生的 85 200838546 TNF-α值爲193 pg/ml。我們證明純化方法B提高了母體生物産物的生物學活性到3倍。總之，本發明所述的純化方法可以用於臨床，提高藥物的治療活性。 5 實施例3: 本發明所述的3個合成單磷醯基化合物的生物學活性效應：本發明3個單磷醯基合成化合物刺激鼠巨噬細胞産生1^〇。供試化合物：本發明此處所述化合物是： 10 化合物16 (OM-174-MP)；化合物 17 (OM-174-MP-PR)，；化合物 i9(〇M-174-MP-PD)· 介紹及合理性說日月· 巨嗟細胞產生的一氧化氮(NO)對於體外篩選新的化合物刺激免疫系統的能力具有重要作用。No是包括人在内的 15哺乳動物體内的一個重要的信號分子，也是少數已知的氣體信號分子中的一員。乳化氮疋自由基分子，極活潑且不穩定。體内的一氧化氮疋由精氨酸和氧氣在多種的一氧化氮合酶(N〇S)的催化下’並由無機硝酸鹽相繼還原合成得到的。 20 巨噬細胞産生一氧化氮是爲了殺滅侵入細菌。在某些條件下’廷一過程可能逆轉引起不良反應··突發性感染（敗血病）引起巨噬細胞過度產生一氧化氮，導致血管擴張(血管變寬），可能是敗血病低血壓（血壓降低)發生的主要原因之一。 20世紀80年代人們發現了一氧化氮的生物學功能，1992 200838546 年《科學》將該化合物命名爲“年度分子，，。估計幾乎每年約有3000篇關於一氧化氮的生物學作用的學術論文發表。因此本發明所述化合物激活一氧化氮，可以具有重要的治療價值。 5 鼠巨喔細胞産生一氧化氮的試驗方法：通過C02吸入處死6周的雄性C57/BL6小鼠（6周，雄性，符合SPF標準，購於法國Charles Rivier)。移除後附屬肢體--臀部、大腿骨和腰骨。切除骨兩端部位後注入DME介質（DH)從管腔提 1〇取骨趙。洗滌後將骨髓細胞再懸浮於DH介質，濃度爲40，000 個/mL，介質補充有20%的馬血清和30%的L929細胞上清液。將所得的細胞懸液在37°C下置於含8%C02，濕度飽和的氣氛中孵化8天。用冰水冷卻的pbs分離其中的巨噬細胞，洗滌並懸浮於含有5%的胎小牛血漿(FCS)、氨基酸和抗 15生素的DH介質（DHE介質）中。將細胞密度調整到700,000個 /mL。直接在滴定板中以DHE介質依次稀釋本發明樣品的水溶液。分別在三個板中檢測樣品，每個滴定板含有一個由介質組成的陰性對照。每孔溶液的最後體積1〇〇 pL。將上述100 μί的細胞懸浮液加入稀釋的樣品中並在37〇c下置於 20含8%C〇2 ’濕度飽和的孵化器中孵化22小時。在赙化後期，將100 pL的上清液移至另一個滴定板，通過㈤⑽反應測定每一上清液中亞硝酸鹽濃度。將溶於2.5%的磷酸水溶液中的100 gL的Griess試劑（組成爲5 mg/mL的磺胺+0.5 mg/mL N-(l-萘基）乙烯-二胺鹽酸鹽)加入每一個孔内。用分光光度 87 200838546 計（SpectraMax Plus,分子設備）于562励對照69〇謹處讀滴定板。亞硝酸鹽的濃度和形成的一氧化氮的含量成一定比例。基於標準曲線法測定亞硝酸鹽濃度。結果以平均值土標準方差的方式表達，繪製劑量回應曲線。 5 結果: 結果見第25圖，3個受試化合物均能誘導鼠巨噬細胞產生咼水準的一氧化氮。化合物19 (OM-174-MP-PD)的起效劑 ϊ爲0.01 pg/ml，較化合物i6(〇M-174-MP)和化合物17 (OM-174_MP-PR)低。 10 實施例4 : 在前述經方法D獲得的本發明非活性合成的化合物通過人類外周血單核細胞産生IL-6上，根據方法B純化的效果：供試化合物：在此列出本發明的化合物是：

15 合成産品的0174_DP (化合物1 b) 14批次，根據方法D 再處理或非再處理，（參見如下）。介紹及合輝极_ aq · 在此呈現的化合物批次（合成的〇M-丨74-Dp)最初是沒有活迭的，因爲它們是用方法D獲得，其中最終的pH值沒有得到良好的控制。實際上在經受根據方法B純化之前（參見如下）’批次14具有的pH爲4.88。非常有意思的是，純化方法B(參見實施例2)增加了批次14可觀的活性。還參見實施例1描述的IL-6的生物效應。 200838546 在上文中詳細地描述了該方法。將合成的産物OM-174-DP (lb)的産品（14批次）溶解在 THF-水的混合物中（1:1 ν〇ΐ·/ν〇ι·)。通過製備反相jjpLc進行純化並且在210nm進行UV檢測。 5 收集含有四丁銨鹽的形式存在的化合物的餾分，用吸附HPLC ’ VYDAC C18, 22 X 250 mm，10 μηι，300 A濃縮。用10 g/L氣化鈉水溶液pfj 7·0 + 2-丙醇的混合物（9:1，v/v)(5 倍體積）洗滌上述化合物獲得相應的鈉鹽。用5倍體積的水和2-丙醇混合物(9:1，v/v)除去多餘的氯化鈉後，再用水和2_ 10丙醇混合物（1:9, v/v)洗脫。用水稀釋並且通過凍乾法去除溶劑後，獲得該化合物的鈉鹽。通過使用方法(D)，最終的pH值沒有得到良好的控制。實際上批次14具有的pH爲4.88。然後根據方法B再次處理該批次（參見如下）。

15 純化方法B 在上文中詳細地描述了該方法。通過製備反相只^^匸進行純化。進行uv檢測，檢測波長爲21〇nm。收集含有四丁銨胤的^/式存在的化合物的餾分，用吸關似濃縮。用 πιΑ知ϊ欠氫_鈉_磷酸二氫鈉水溶液入丙醇的混 2〇。物(9·1’ V/V)(5倍體積)洗滌上述化合物獲得相應的納鹽。用5倍體積的水和2韻混合物(Μ，*财多餘_酸氮二納痛酸二氫鈉後，再用水和丙醇混合物（1:9, v/v)洗脫所述化合物。用水稀釋並通财乾法除去溶難，得到化合物納鹽。 200838546 然後在ρΗ(7·5)調節或不調節下在ΤΗΡ-1細胞上測試獲得的化合物以分析它們誘導TNF-α分泌的潛能（參見如下）。人PBMC的準備和細胞接養· 離心健康供體（Centre de transfusion，H6pital 5 Universitaire，Geneva)的外周血以獲得血沈棕黃層。該血沈棕黃層與Hanks’平衡鹽水溶液混合(HBSS，Sigma，Buchs， Switzerland) ’ 在該混和液上覆蓋Fic〇u Paquej^Amersham Pharmacia)使濃度達到 ΐ·〇77 g/mL並離心（2800 rpm，20°C， 25 min)。在室溫下將分裂中期所得的細胞在jjBSS中與 10 800rpm的條件下洗兩次，共15分鐘。成粒的細胞再懸浮於 HBSS中。使用Neubauer cell細胞計數器計數。所有的細胞培養均在含有青黴素（1〇〇 U/mL)、鏈黴素（lOOjig/mL)、L-谷氨酸(2 mmol/L)和1 〇%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640的培養液中進行(上述試劑均購於Sigma公司）。用於體外刺激性 15試驗的細胞在濃度爲1 X 106活細胞/孔的條件下培養。培養上清液中的剌激性誠給*IL_6測定：在37°C和5%C02氣氛下用本發明産物孵化PBMC。 24小時後收集該培養上清液，根據製造說明書，使用酶-聯免疫吸附試驗(Human IL-6 ELISA Set，BD OptEIA， 20 SanDieg〇，USA)測量IL-6的濃度。該檢出限爲l〇pg/mL。結果：結果顯示在第26圖中，其顯示了向本發明化合物(在此爲化合物lb)應用方法B(即在純化過程中應用適當的pH)，將非活性化合物(批次14)轉變爲對人類pBMC(批次3 9)完全 200838546 有效的激活劑。實施例5 化合物lb(OM-174-DP)生物活性的修飾：通過不同批次分子OM-174-DP的原來的純化方法來加 5 強分化成巨嗟細胞的THP-1細胞誘導分泌TNF-a 供試化合物：在此列出本發明的化合物是：根據方法A或B再處理化合物1 b(OM-174-DP)的兩個生物批次(P3和GMP004)和隨後的合成批次（14)(參見如下） 1〇 LPS用作陽性對照。介紹及合理性說明: TNF-a 腫瘤壞死因子(TNF-a)是一種多效性細胞因子，由多種類型的細胞産生，包括造血細胞和非造血細胞，其中大部 15分爲造血細胞。TNFw對於消除多數的傳染物（白色念珠菌，單核細胞增多性李司忒氏菌，分枝桿菌···）是必要的並且發揮有效的促炎症反應效應，例如誘導黏著分子例如 VCAM-1，細胞間黏附分子丨叩鳩，，或内皮細胞和其他類型細胞上的E-選擇蛋白的表達。 20 但是在各種疾病的病理過程中均有TNF高度表達，例如：風滿性關節炎、胰島素依賴型糖尿病、炎症性腸病，尤其是克隆氏症。因此ΤΝΡ·α的分泌料發免狀應的必要时，但是之 -過程應當有所㈣叫止炎症性疾病的發生。根據下述兩 91 200838546 個方法再闡述非活性合成的批次(批次“14”，參見實施例4)。方法

1.方法A 通過製備反相HPLC進行純化。在21〇nm進行Uv檢測。 5 收集含有四丁銨鹽形式存在的化合物的德分，用吸附hplc 濃縮。用200 mM的磷酸氫二鈉水溶液(pH 4.23)和2-丙醇的 · 混合物（9:1，v/v)(5倍體積）洗滌上述化合物獲得相應的鈉 · 鹽。用5倍體積的水和2-丙醇混合物(9:1，v/v)除去多餘的麟酸二氫鈉後，再用水和2-丙醇溶液(1:9, v/v)洗脫。鲁 10 用水稀釋並且通過柬乾法去除溶劑後，獲得該化合物的鈉鹽。在pH(7· 5)調節或不調節下在ΤΗΡ-1細胞上測試獲得的化合物以分析它們誘導TNF-α分泌的潛能（參見如下）。

方法B 15 通過製備反相HPLC進行純化。在21〇nm進行UV檢測。收集含有四丁錢鹽形式存在的化合物的顧分，用吸附Hplc 濃縮。用100 mM的構酸氫二鈉-磷酸二氫鈉水溶液(pH 7 5) % 和2-丙醇的混合物(9:1，v/v)(5倍體積）洗滌上述化合物獲得相應的鈉鹽。用5倍體積的水和2-丙醇混合物(9:1，v/v)除去 20多餘的磷酸二氫鈉-磷酸二氫鈉後，再用水和2-丙醇混合物 (1:9, v/v)洗脫化合物。用水稀釋並且通過康乾法去除溶劑後，獲得該化合物的鈉鹽。在p Η (7 · 5)調節或不調節下在τ η p _丨細胞上測試獲得的 92 200838546 化合物以分析它們誘導TNF-α分泌的可能性（參見如下）。 THP-1細胞培養：在有0 % FCS + 100 ng/ml PMA (Sigma)的RPMI中培養 THP-1細胞(5 X 105小細胞/ml)(參見實施例1的方法）。3天後 • 5 收集黏附細胞並調整濃度3 X 105細胞/孔，並在37°C、5 % C02下與所述産物孵化6小時。 24小時後收集該培養上清液，根據製造商說明書，使用酶-聯免疫吸附測試（ELISA) (BD OptEIA，San Diego, 鲁 US A)測量TNF-α的濃度。該檢出限爲8 pg/mL。 10 結論: 結果以3個不同表格分別顯示如下：表5.1 :通過介質、LPS和母體産物OM-174-DP的生物批次 GMP004 et P3誘導分化成巨噬細胞的ΤΗΡ_ 1細胞分泌産生TNF-a 産物[批次]劑量pg/ml pg/ml 平均值標準差介質 0 3637 土 145 LPS 0.001 0,001 5400 土 1989 LPS 0.01 0,01 8770 土 687 LPS 0.1 〇,1 53165 土 2536 OM-174-DP [GMP004] 2 2 5045 土 2275 OM-174-DP [GMP0041 20 20 10150 土 3044 OM-174-DP [P3] 2 2 4628 土 206 OM-174-DP [P3] 20 20 9579 土 2381 15 結論說明: 像預期的那樣，LPS誘導高水準的TNF_a。通過OM-174 兩個生物批次(P3和GMP 004)誘導產生的TNF-a是非常低的。表5·2:經^發明方法A或方法B純化前後，生物批次GMP004 20 誘導分化成巨噬細胞的THP-1細胞分泌産生TNF-a的 93 200838546 比較（以獲得批次54). 産物[批次]，方法，劑量pg/ml pg/ml 平均值標準差介質 0 3637 土 145 OM-174-DP [GMP004] 2 2 5045 土 2275 OM-174-DP [GMP004] 20 20 10150 土 3044 OM-174-DP [SM0RII-54]A1 2 2 4208 土 308 OM-174-DP [SMORII-54] A1 20 20 10223 土 2142 OM-174-DP [SMORII-54] A2 2 2 4328 土 421 OM-174-DP [SMORII-54] A2 20 20 22802 土 5612 OM-174-DP [SMORII-54] B1 0.2 〇,2 19039 土 5497 OM-174-DP [SMORII-54] B1 2 2 22049 土 3442 OM-174-DP [SMORII-54] B1 20 20 43301 土 3069 OM-174-DP [SMORII-54] B2 0.2 0,2 8079 土 1704 OM-174-DP [SMORII-54] B2 2 2 11401 土 694 OM-174-DP [SMORII-54] B2 20 20 22513 土 2584

結論說明：該結果清楚地顯示了向批次GMP004應用方法B會大大增加生物學母體批次GMP004的生物活性。

5 表5.3: OM-174-DP (參見實施例4)的原始非活性批次(SMORII 14)誘導分化成巨噬細胞的THP-1細胞分泌産生TNF-a 和經本發明方法B明確地增強了其活性(“39”序列的 _一代)的比較°_ 産物[批次]，劑量pg/ml pg/ml 平均值標準差介質 0 3637 士 145 OM-174-DP [SMORII-14-150306] 2 2 14603 土 1030 OM-174-DP [SMORII-14-150306] 20 20 9582 土 2243 OM-174-DP [SMORII-14-So] 2 2 8853 土 2328 OM-174-DP [SMORII-14-So] 20 20 9894 土 3319 OM-174-DP [SMORII-39-060509] 2 2 23331 土 3019 OM-174-DP [SMOR1I-39-060509] 20 20 37637 土 3945 結論說明： 10 編號爲批次“39”的産物可以由命名爲批次“14”的合成 94 200838546 化合物經方法B獲得。清楚地，方法B增強了母體分子的活性。相反，聲裂法步驟沒有效果(序列“so). 實施例6 在LACK-誘導的哮喘模型中合成的OM-174-DP和合成 5 的OM-174-MP-PD“預防”和“治療”的效果在此呈現本發明兩個代表性化合物在體内生物活性的 • 實施例。使用先前公開的過敏性哮喘小鼠模型（描述在Julia 等人.Immunity. 2002 Feb;16(2):271-83)。我們的目標是研究 _ 腹腔注射給予合成分子〇M_ 174-DP和OM-174-MP-PD是否 10 可以抑制在LACK-致敏以及激發小鼠的氣管炎症。爲了此目標，自始至終對小鼠進行誘導哮喘（預防性模型）或治療上 (即在動物已經對致病原致敏後，三次注射蛋白lack)的處理。如讀出那樣，在支氣管肺泡灌洗(BAL)中計數嗜酸性細胞，並且已知的過敏性哮喘標記即Th2細胞因子IL-4，IL-5, 15 和IL-13能夠從肺定量。此外，還報導了細胞質的igE水平。實驗記錄： ⑩ 材料 -在氣溶膠中的鹽水溶液作爲對照 -如描述(Mougneau et al·，1995)在大腸桿菌中産生重組 20 LACK蛋白並且在Ni-NTA親和層析柱上純化 -從Pierce購買氫氧化鋁(Alum) 細胞離心是細胞離心塗片器4 (Thermo-Shandon，

Cheschire，U.K·)，cytoslides 由 Thermo_Shandon和 Wright購買並且吉姆薩染色劑由Sigma購買 95 200838546 -使用超聲波嘴霧器Ultramed (Medicalia，Forenze，Italy) 提供氣溶膠 -與生物素配對的抗-IgE (R35-118)購自BD Biosciences (Le Pont de Claix? France). 5 動物購自 Centre d’Elevage Janvier，France的 6周齡的雌性 BALB/c ByJ小鼠·小鼠保持在特殊_病原體游離條件下並 - 且用Safe (Augy，France)提供的標準膳食飼養。 f驗組 · 10 測試下述5組： • A:陰性對照: 未處理LACK-致敏以及鹽水-激發的小鼠（3只小鼠） • B:陽性對照：未處理LACK-致敏以及激發的小鼠(6只小鼠） 15 · 174-DP 預防劑: OM-174-DP (Lp>處理LACK-致敏以及激發的小鼠（6 只小鼠） · • P: 174-MP-PD 預防部|· ΟΜ-174-MP-PD (i.p·)-處理LACK-致敏以及激發的小 20鼠(6只小鼠） • IL174-DP 治瘙劑: OM-174-DP (i.p·)-處理LACK-致敏以及激發的小鼠（6 只小鼠）复鱼是和對照品的處理及瞎問砉 96 200838546 實驗開始於第0天。在第〇，2, 3, 4, 7 ’9’ 10, 11和 12天，組C和D的小鼠分別以lmg/kg的劑量(每只小鼠20μ§) 腹腔注射合成的0Μ-174-DP (化合物1 b)和0Μ-174-MP-PD (化合物19)。 5 組E的小鼠在15，17和19天以1 mg/Kg (20 pg每小鼠）的劑量腹腔注射進行治療性處理。在第1天和第8天，小鼠對腹腔注射LACK/Alum致敏。從第16天至第20天，除了組A所有組用LACK的溶液(0.15%) 氣溶膠激發。組A接受40分鐘鹽水(NaCl 0.9%)(組A)的替代 10 處理。方法 Λ:支i管肺泡灌洗(BAU以及嗜酸細胞計數對全部動物實施支氣管肺泡灌洗(BAL)。在最後氣溶膠激發兩天後’給小鼠放血並向它們的氣管中插管。用lml 15 加熱的清洗肺3遍。用PBS清洗細胞，並使用紅細胞溶胞緩衝液溶解紅細胞。在PBS中進一步清洗細胞並計數。爲了鐾別BAL細胞計數，製備細胞離心塗片器製劑並用 Wnght/Giemsa染色。在每個載玻片上至少記數4〇〇個細胞，並且通過顯微鏡檢查測定淋巴細胞、中性白細胞、嗜酸性細 20胞以及巨嗟細胞/DC/肺細胞(如其它單核細胞記數)的數量。 g:肺細胞因子的測定：爲了分析肺細胞因子的含量，採集肺並且左肺用於製備蛋白提取物。每個左肺回收4〇〇 μ〗。使用FACy^j定多重分析測量細胞因子(在分析第一序列的IL_4*IL_n，並且隨 97 200838546 後是IL-5和IFN- r )。標準化蛋白含量的結果以呈現。 C: LACK-特定IgE的谢定：爲了分析特定Ig E的含量，組A，B#G的小鼠在最後氣溶膠兩天後經心臟穿刺放血，並且配製血清。通過elisa 5 測量LACK-特定的IgE。結果: · A)嗜酸粒細胞增多 - 嗜酸性細胞在支氣管肺泡灌洗中數量的特徵記述·· 每個個體小鼠的結果和每個測試組的平均值都顯示在馨 10 下表中：嗜酸性細胞 xlO6 小鼠1 小鼠2 小鼠3 小鼠4 小鼠5 小鼠6 平均值土 SEM A: NEG CTRL 0 0 0 ND ND ND 0 B: POS CTRL 144540 9 218957 286483 664662 183142 1 895714 890441 土 641887* C: OM-174-DP (lb)預防性 75359 385612 33412 54158 105352 4792 109781土 139453* D: OM-174-MP-PD (19)預防性 33286 64010 47018 252294 82555 123305 100411土 80738* E: OM-174-DP(lb) 治療性 16744 3802 7411 21739 12500 21343 13923土 7362* =ρ<0·05 (Student t檢驗）用化合物lb和19預防性處理的動物顯示比陽性哮喘組 (B) BAL嗜酸粒細胞增多小$倍。此外，當動物用化合物ib (E組）治療性處理三次，它們的嗜酸細胞計數急劇減少（到6 4 15 分之一）。旦因子的待徵記沭: 在第一系列分析中，每個個體小鼠的結果和每個測試組的平均值都顯示在下表中： (化合物 lb和 iq) 98 200838546 首先为析處理和未處理小鼠肺中數量。然而，IL-4肺含量是非常低的以至於在pBS_激發動物中不能探查，IL-4的數量在LACK-激發未處理對照小鼠中增加 20倍。用 OM-174_DP (lb)和OM-174-MP-PD (19)預防性處 5理，在肺中1L·4的數量分別減少6和4倍（P<〇.0〇i Mann&Whitney)(見下表）。應该注意的是經合成分子lb (組E)治療性處理獲得 IL_4類似的減少（與組B對比，4倍）。組/小鼠小鼠1 小鼠2 小鼠3 小鼠4 小鼠5 小鼠6 平均值 IL-4 SEM IL-4 A:未處理/PBS 0.49 0.44 0.39 ΝΑ ΝΑ ΝΑ 044^ 0.05 B:未處理 /LACK 9.88 4.51 10.47 631 11.27 9.54 8.66 2.65 C: (lb) OM-174-DP [SMORII-39] 預防性 1.1 3.33 0.71 2.43 1.23 0.17 1.50** 1.17 D: (19) OM-174-MP-PD [SMORII-32] 預防性 1.01 1.47 0.91 5.68 1.79 1.66 2.09** 1.79 E: (lb) OM-174-DP [SMORII-39] 治療性 2.5 1 1.58 3.48 1.94 3.48 233** 1.02 料=p<0.01 (Mann & Whitney)與陽性哮喘組(B)對比 10 IL-13在PBS-激發小鼠中低於檢測限，但是在哮喘對照小鼠中以50 pg/ml平均值定量（見下表，B組）。與這些哮喘小鼠相比，在OM-174-DP-預防性處理的小鼠中IL-13的數量減少4倍（化合物lb)(p<0.001 Mann&Whitney)，並且在 OM-174-MP-PD-處理的小鼠中IL-13的數量減少3倍(化合物 15 19) (ρ<〇.〇〇ι)(見下表）。應該注意的是經合成分子lb (組E)治療性處理獲得 99 200838546 IL-3類似的減少（與組b對比，3倍）。組/小鼠小鼠1 小鼠2 小鼠3 小鼠4 小鼠5 小鼠6 平均值 IL13 (pg/ml) SEM IL13 Α:未處理/PBS 1.06 1.56 0.38 NA NA NA 1.00 0.59 Β:未處理 /LACK 50.83 26.62 55.06 42.91 62.21 65.98 50.60 14.32 C: (lb) OM-174-DP [SMORII-39] 預防性 8.39 25.39 8.2 24.29 12.52 1.59 13.40* 9.54 D: (19) OM-174-MP-PD [SMORII-32] 預防性 12.08 17.1 8.59 30.6 16.14 15.21 16.62* 7.52 E: (lb) OM-174-DP [SMORII-39] 治療性 20.35 5.43 9.93 23.68 21.99 26,02 17.90* 8.26 #= ρ<0·05 (Mann & Whitney)與陽性哮喘組(B)對比在> 次、冶療」主給予化合物1 b後測量其他的細胞因早因爲我們棟尋到在用測試分子治療性處理時氣管嗜酸 5 粒細胞增多劇烈減少，在第二系列分析中，監測在肺内含物（僅用化合物lb)中的其他細胞因子。結果顯示在下表中：實際上，當與未處理小鼠的肺比較，在處理小鼠肺中 Th2-細胞因子IL-5的數量急劇減少。在用OM-174-DP (化合物 lb5 p< 0:015 Mann&Whitney)處理時，IL_5的數量減少2S8 倍。組/小鼠小鼠1 小鼠2 小鼠3 小鼠4 小鼠5 小鼠6 平均值 IL-5 _ (pg/ml、 SEM IL-5 X:未處理 /PBS 0.25 0.25 0 NA NA NA 0.17 0.14 B:未處理 /LACK 14.86 7.61 18.42 11.74 22.99 23.9 16.59 6.40 & (lb) OM-174-DP [SMORn-39] 治療性 7.41 1.06 2.15 9.23 5.81 10.33 6.00** 3.75 10 Mann & Whitney, ** ρ < 0.01 清楚地是，與組Β相比，經合成分子lb (組Ε)治療性處 100 200838546 理獲得IL-5(已知活化嗜酸性細_細麵子）的減少。此減少不是由於向™細胞因子的轉變，因爲與組B動物(在化合物lb-處理的小鼠中跡γ水平甚至降低兩倍見下表）比較

C:變應原-特異性IgE系列的宗斧> 爲了進-步表徵用OM-174-DP (化合物113)治療性處理後小鼠的免疫狀態，我們已經通過ELISA*析了在處理小鼠和那些沒有處理小鼠血清中的LACK-特異性igE。每個個 10體小鼠的結果和每個測試組的平均值都顯示在下表中（用化合物lb治療性實驗）：組/小鼠小鼠1 小鼠2 小鼠3 小鼠4 小鼠5 小鼠6 平均值 IrE (ng/ml) SEM IgE A:未處理 /PBS 84 32 133 NA NA NA 82.82 _ 50.25 B:未處理 /LACK 679 400 996 219 559 659 585 265.28 E: (lb) OM-174-DP [SMORII-39] 治療性 188 159 94 382 395 129 224.56* 130.64

Mann & Whitney, * p < 0.05 與未處理LACK激發的小鼠(ρ<0·05; Mann & Whitney)相比，OM-174-DP·處理小鼠含有少2.6倍的LACK-特異性igE， 15 然而暴露於LACK氣溶膠時LACK-特異性IgE水平增加7倍。 101 200838546 結論：本研究的第一部分，研究了預防性給藥時化合物（lb) 和（19)的效應。兩個合成的化合物全身用藥顯著地影響了 BAL嗜酸粒細胞增多的發展，並且顯著減少了肺中1L_4和 5 IL-13細胞因子。此外，在此顯示本發明合成的化合物還呈現了治療性抗哮喘的可能性，由化合物lb獲得的結果(在變應原誘導的 BAL嗜酸粒細胞增多、肺IL-4，IL-5和IL-13強且顯著地減少並且IgE水平減少）證實。 ίο 總之，實施例6中提供的結果提供了在臨床上測試本發明化合物預防性或治療性對抗哮喘的清楚實例。實施例7 OM-174-DP (化合物 16), OM-174-MP-PD (化合物 19) OM-174-MP-EP (化合物33)，OM-174-MP-CM (化合物35c) 15 和OM-174-MP-PR (化合物17)在體内化合物48/80-受激測定組胺分泌模型中的效果使用體内大鼠肥大細胞脫顆粒作用模型（由CRO CEREP 提供，目錄編號2006: 771-c)，我們的目標是研究合成分子 OM-174-DP (化合物 lb)，OM-174-MP-PD (19)，OM-174-MP-20 EP(33)，OM-174-MP-CM(35c)和OM_174_MP- PR(17)是否可以抑制由化合物48/80-受激肥大細胞組胺分泌。使用的實驗記錄如下簡要概述：實驗記錄：一般程式 102 200838546 測定來源參考化合物文獻組胺分泌 (化合物48/80-受激）大鼠肥大 SCG 細胞 1Hakanson et al. 試驗條件測定刺激物孵化反應産物檢測方法組胺分泌 (化合物48/80·受激）化合物48/80 9 (0.1 μ^πύ) 2 麵./37 C 組胺螢光比色法結果分析及表读結果以測試化合物存在下獲得的對照特異活性的百分比表達(測定的特異活性/對照特異活性χ 100)) 〇使用希爾方程 (Y = D + [(A - D)/(l + (C/C50)nH)]通過非線性回歸分析用重復數值的平均值産生的抑制曲線測定 IC50值（引發對照特異活性半數最大抑制的濃度），其中γ = 特異活性，D=最小特異活性，a =最大特異活性，c=化合物濃度，C50 = IC50，並且nH =坡度因子）。使用由Cerep 10開發的軟體(Hill software)進行分析，並通過對照由商購的針對Windows ⑧（SPSS Inc· © 1997)的 SigmaPlot ⑧ 4.0軟體産生的資料確認。

Ml式化合物：測試化合物批次數量分子量 OM-174-DP (lb) SMORII-69_l 10906 1134 OM-174-MP-PD (19) SMORII-32_050906 1128 OM-174-MP-EP (33) SMOR-II-83 1179 OM-174-MP-CM (35c) SMORII-135 1113 OM-174-MP-PR (17) KASM08 1097 103 200838546 在母個貫驗中，爲了評估測定的適應性參考化合物盘 T化合_日_。在若干濃度測㈣了 ^值的測疋）’並且資料與在CEREP測得的歷史值對比。按昭相岸的標準操作料，如果劇適魏鮮，料㈣

ikM 在下表中標出測試化合物和參考(5個不同的試的IC5。值。參考化合物的IC5❶值在CEREp獲得的歷史平均值

的可接受限度範圍内。測試化合物 IC50 OM-174-DP(lb) 8.6E-08 OM-174-MP-PD (19) 1.6E-07M OM-174-MP-EP (33) 2.1E-07M OM-174-MP-CM (35c) 3.2E-07 Μ OM-174-MP-PR (17) 1.6E-06 Μ SCG(ref 1) 4.7Ε-06 Μ SGC (ref 2) 1.1E-06M SGC (ref 3) 1.3Ε-05Μ SCG (ref 4) 2.3Ε-05 Μ SCG(refS) 9.5Ε-07 Μ 參考平均值 8.6Ε-06 Μ

10 ikMi 顯然，測試的藥物是由化合物48/80•受激肥大細胞誘導的組胺分泌的潛在抑制劑。它們都比測試對照（SGS)更有活性。貫施例8 OM-174-MP-PD (化合物 19) OM-174_MP-EP (化合物 104 200838546 33)，OM-174-MP (化合物 16)和OM-174-MP-PR (化合物17) 在體外細胞模型中表達人toll樣受體(TLRs)的效果。本發明産品的化學結構和來源（最初由E c〇li降解的 LPS獲得OM-174-DP)可提示藥物可能通過TLRs受體，更具 5 體是通過TLR4和TLR2受體具有活性。TLR受體主要（但不是唯獨地）由免疫細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、T·細胞等表達，而且是微生物産物的關鍵接受器，可被宿主識別爲信號危險物。雖然它們首先觸發非特異性先天免疫’ TLR活化將啓動完全的免疫級聯，在抗原存在的 10 情況下，將導致得到獲得性免疫。構成地表達給定功能性TLR基因的細胞對於許多應用是有價值的工具，例如研究TLR識別或發信號所涉及的機製和開發新的潛在治療藥物。因此，以下所述實驗的目的在於測試本發明4種化合物對這些免疫應答關鍵適配器的 15 活性。在_以下細胞系統中對應答谁粁淛試 a) THPl藍（48小時後625nm的光密度報告） b) HEK-TLR2 (24小時後IL-8 ELISA) c) HEK-TLR2-CD14 (24小時後IL_8 ELISA ) 20 d) HEK-MD2-TLR4-CD14 (24小時後IL-8 ELISA) a)THP-l 藍最初的一系列試驗在天然表達TLR2和TLR4的THP-1 細胞上進行。 THP-1細胞是人外周企液單核細胞。單核細胞在先天免 105 200838546 疫中發揮關鍵作用並且表達不同水平的多數TLRs。作爲初級細胞，回應於TLR配體THP-1細胞活化nf-/cB和其他轉錄因子。與設計回應於特定TLR激動劑（參見下文）的JJEK293相 5反，THP-1細胞天然表達TLR基因和在信號級聯中涉及的全部基因。爲便於刀析早核細胞中TLR的反應，invivoGen (Toulouse，France)提供了用稱作THPl-Blue™的NF- /c B誘導的報導分子系統穩定轉染的THP-1克隆。在控制由幾種轉 10 錄因子，例如NF-zcB和AP-1誘導的啓動子的條件下用表達分泌胚胎驗性礙酸酶(SEAP)基因的報導分子質粒穩定轉染 THP-1藍細胞。當刺激TLR時，THPl-Blue™細胞活化轉錄因子，隨後分泌SEAP，當使用在SEAP存在的情況下可變成紫色/藍色的QUANTI-Blue\u2122介質時，可容易地檢測 15 SEAP。根據製造商的說明使用對照和本發明的化合物刺激細胞。結果：48小時後625nm的OD值增加在下表提供了對照的結果（陰性=LPS K12CD25超 20 純，TLR4激動劑；PAM3CSK4=陽性，TLR2激動劑）。結果 (表示爲任意單位的OD值）顯示對照在37 °C刺激（高達 1000ng/ml)後48小時時，在625nm讀取的光密度平均值（重復測兩次）。對照: 106 200838546 對照ng/ml LPS平均值 1000 LOO 1.35 333 0.97 1.38 111 0.69 1.30 ^ 37 0.46 1.22 12 0.27 1.11 4 0.16 0.85 1 0.13 0.48 0 0.10 0.11 顯然細胞株分別對TLR2和TLR4激動劑、超純的 PAM3CSK4 和 LPSK12CD25 應答。

在此測定中實驗下面四個本發明的化合物 OM-174-MP-PD (化合物 19) OM-174-MP_EP (化合物 33) 5 OM-174-MP (化合物 16)和 OM-174-MP-PR (化合物工 7)· 結果(48小時後在625 nm雙份OD數值的平均值)顯示如下· 化合物：化合物/劑里 (ng/ml) (化合物16) (化合物19) 平均值 (化合物33) (化合物17、 10000 0.22 0.77 0.35 1.15 3333 0.18 0.58 0.25 1.02 一" 1111 0.17 0.37 0.19 0.74 370 0.16 0.24 0.16 0.36 124 0.15 0.17 0.13 0.19 41 0.13 0.13 0.12 0.15_一 14 0.15 0.15 0.13 0.13 0 0.14 0.14 0.13 —

化合物（19)和（17)是THP-1細胞的良好活化劑，然而化合物（16)和（33)的活性較弱。由於本發明的化合物在表達TLR2*TLR4的系統中是有活性的，然後我們檢驗它們在僅TLR2或僅TLR4但是不同時TLRs表達的HEK細胞株上的活性。 107 200838546 b) HEK-TLR2 由於HEK293細胞株對TLR基因無或低表達，所以選擇 HEK293細胞株。使用ELISA分析例如IL-8滴定法或者監測 TLR-誘導NF- /c B激活的報導分子基系統能夠使這些細胞 5 有效監測TLR的活性。

HEK-TLR2細胞（Invivogen，Toulouse，France)被設計成用來自包括TLR2的TLR2途徑多基因和參與識別或涉及信號級聯的基因穩定轉染的HEK293細胞。這些細胞在刺激 TLR2後分泌IL-8。根據製造商的說明書進行該實驗。 10 簡要地，在37°C下孵化2xl04細胞/孔(200ul RPMI) 3天(5% C02)。去除該培養基，並且向孔中加入9〇uiRPMi + 5 %FCS，然後加入激動劑和對照（l〇ul/孔）。將細胞放回保溫箱24小時。收集上清液並且根據製造商的說明書進行IL-8 ELISA。結果：IL-8分泌 15 對照的結果（陰性=超純的LPS K12CD25, TLR4激動

劑；以及PAM3CSK扣陽性，TLR2激動劑)提供在下表中。該結果（以Pg/ml的IL_8表達）顯示了用對照（高至1〇〇〇 ng/ml) 刺激24小時後IL-8分泌的平均值(雙重測量）. 對照：對照ng/ml LPS平均值 PAM平均值 1000 0.90 32.94 333 0.41 28.24 111 0.30 23.93 37 0.23 18.33 12 0.19 9.12 4 0.23 3.89 1 0.29 1.84 0 0.28 0.38 108 200838546 該細胞株僅明確地對TLR2激動劑PAM3CSK4應答。在該測定中試驗本發明的下述四個化合物： OM-174-MP-PD (化合物 19) OM-174-MP-EP (化合物 33)，OM-174-MP (化合物 16)和OM-174-MP-PR (化合物 17)· 5 下面顯示結果(24 h後IL-8以pg/ml分泌兩份值的平均值)：化合物: 化合物/劑量 (ng/ml) 平均值 (化合物16) 平均值 (化合物19) 平均值 (化合物33) 平均值 (化合物17) 10000 0.27 0.62 3.64 2.02 3333 0.19 0.37 1.66 0.88 1111 0.15 0.27 0.68 0.39 370 0.12 0.20 0.31 0.25 124 0.15 0.16 0.23 0.24 41 0.09 0.15 0.18 0.20 14 0.07 0.06 0.12 0.19 0 0.18 0.12 0.17 0.23 清楚地，化合物33和17能夠經TLR2活化IL-8分泌。 c) HEK-TLR2-CD14 10 這些初步結果在同時表達TLR2和CD14的其他細胞株進一步證實。使用的步驟類似於上面描述的步驟。對照和4個測試化合物的結果顯示在下面的表2中：結杲:IL-8分泌對照的結果（陰性=超純的LPS K12CD25，TLR4激動 15劑；以及PAM3CSK4==陽性，TLR2激動劑）提供在下表中。該結果（以pg/ml的IL_8表達）顯示了用對照（高至1〇〇〇 ng/ml) 刺激24小時後IL- 8分泌的平均值(雙重測量）：對照： 109 200838546 對照ng/ml LPS平均值 PAM平均值 1000 0.67 39.04 333 0.32 33.30 111 0.19 22.64 37 0.13 15.90 12 0.16 6.78 4 0.11 2.55 1 0.11 1.33 0 0.22 0.32

至於HEK-TLR2細胞株，HEK-TLR2-CD14細胞還僅明確地對TLR2激動劑PAM3CSK4應答。彳匕合物：然後在該HEK-TLR2-CD14測定中試驗本發明的下述 5 四個化合物： OM-174-MP-PD (化合物 19) OM-174-MP-EP (化合物 33)，OM-174-MP (化合物 16)和OM-174-MP-PR (化合物 π). 下面顯示結果(24 h後IL-8以pg/ml分泌雙份值的平均值）: 化合物/劑畺 (ng/ml) 平均值 (化合物16) 平均值 (化合物19) (化合物33、平均值 (化合物17) 3.59 10000 0.22 0.65 4.24 ^ 3333 0.13 0.26 1.49 1.06 1111 0.06 0.17 0.52 0.40 370 0.01 0.10 0.19 0.22 124 0.03 0.11 0.17 0.20 41 0.00 0.03 0.03 0.14 14 0.03 0.05 0.10 0.13 0 0.12 0.11 0.17 0.19 该結果證貫了由HEK-TLR2細胞株獲得的那些··化合物

33和17能夠經TLR2活化IL-8分泌。 d)HEK-MD2-TLR4-CD 14 110 200838546 TLR4由於是與疑似休克負有責任的脂多糖(Lps)識別有關的主要受體已經得到了廣泛的研究。 HEK-MD2-TLR4-CD14對LPS高敏感度。通過用 TLR4，MD2和CD14基因穩定轉染HEK293細胞株以及NF-5 /cB-誘導報道分子系統獲得它們。它們分泌IL-8。我們使用與如上描述的其他HEK細胞株相同的實驗步驟。

對照和4個測試化合物的結果顯示在下述的表2中：結果：IL-8分泌 10 對照的結果（陽性=超純的LPS K12CD25，TLR4激動劑；以及PAM3CSK4 =陰性，TLR2激動劑)提供在下表中。該結果顯示了用對照（高至1000 ng/ml)刺激24小時後IL-8 分泌的平均值(雙重測量）：對昭. ^j 4\\\ · 對照ng/ml LPS平均值 PAM平均值 1000 58.43 2.17 333 56.58 1·87 111 58.20 1.83 37 50.24 1.72 12 32.15 1.76 4 18.08 1.78 1 10.04 1.75 0 1.87 1.97 15 如期望的那樣，細胞株HEK-MD2-TLR4-CD14僅明確地對TLR4陽性對照超純的LPS-K12應答，但是對 PAM3CSK4激動劑的陰性對照TLR2不應答。化合物： 111 200838546 然後在該HEK-MD2-TLR4-CD14測定中試驗本發明的下述四個化合物： OM-174-MP-PD (化合物 19) OM-174-MP-EP (化合物 33)，OM-174-MP (化合物 16)和OM-174-MP-PR (化合物 17). 5 下面顯示結果(24 h後IL-8以pg/ml表示的分泌雙份值的平均值): 化合物/劑里 (ng/ml) 平均值 (化合纟匆16) 平均值 (化合物19) 平均值 (化合物33) 平均值 _ (化合物17、 10000 1.90 1.96 1.78 1.70 3333 1.63 1.88 1.62 1.89 1111 1.60 1.73 1.58 1.94 370 1.66 1.67 1.64 1.85 124 1.62 1.56 1.65 1.93 41 1.68 1.64 L79 1.97 14 1.75 1.69 1.83 1.88 0 1.88 1.84 1.88 2.11

很清楚，測試的化合物沒有一個在TLR4測定中是有活性的。這些TLR測定的總結論：

10 非常有趣的是’獲得的結果顯示本發明的化合物對優先表達人類TLR2受體的人類細胞是有活性的。 112 200838546 參考文獻 1 (a) Davies, J.G.; Bauer. J.; Hirt, R; Schulthess, A. PCX 9514026 (Chem. Abstr, 124, 9326). (b) Brandenburg, K.; Lindner，B.; Scliromm，A·; Koch，M.H.J·; Bauer，J.; Merkli， 5 A.; Zbaeren, C.; Davies, J.G.; Seydel, U. Euk J. Biochem. 2000, 267, 3370-3377. 2 (a) Zahringer? U.; Lindner, B.; Rietschel, T.H. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, 211-276. (b) Seydel, U·; Schromm，A.B.; Blunck? R.; Brandenburg, K. Chem.

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20 Soga，Τ·; Ono，Y.; Kumazawa，E·; Shioya，E·; Osada，Y·; Kusumoto， S·; Shiba，T. Chem. Pharm· Bull. 1991，39, 1994-1999. 15 Oikawa，M·; Wada，A·; Yoshizaki，H·; Fukase，K·; Kusumoto, S.; Bull. Soc. Chim. Jpn. 1997, 70, 1435-1440. 25 16 (a) Fukase，K·; Liu，W-C.; Suda，Y.; Oikawa，M·; Wada，A·;

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Claims

200838546 十、申請專利範圍： 1. 一種製備不對稱或對稱取代的β-(1—6)-連接的葡糖胺二糖的方法，包括式10化合物與式7化合物的反應：

5 (10)，其中：

I是選自（C3-C6)烯基，例如C3或C4烯基，優選2-丙烯基或1-丙烯基的基團； X是氫，選自苄基或取代的苄基，例如4-甲氧苄基 10 或3,4-二甲氧苄基或2,5-二甲氧苄基或2,3,4-三甲氧苄基或3,4,5-三甲氧苄基的基團； R〇選自R5或者R2,其中R5是選自：

⑴從具有2至24個碳原子的直鏈羧酸衍生的醯基，優選羥基醯基，例如3-羥基醯基，氧代醯基，例如3-氧 15 代醯基，氨基醯基例如3-氨基醯基； (ii) 醯基氧醯基，優選3-醯基氧醯基，醯基氨基醯基，優選3-醯基氨基醯基，醯基硫醯基，優選3-醯基硫醯基； (iii) 烷基氧醯基，優選(C2-C24)烷基氧醯基，烯基氧 20 醯基，優選（C2-C24)烯基氧醯基，炔基氧醯基，優選 (C2-C24)炔基氧醯基，烷基氨基醯基，優選(C2-C24)烷基氨基醯基，烯基氨基醯基，優選(C2-C24)烯基氨基醯基， 118 200838546 炔基氨基醯基，優選(c2-c24)炔基氨基醯基，烷基硫醯基，優選(c2-c24)烷基硫醯基，烯基硫醯基，優選(c2-c24) 烯基硫醯基，炔基硫醯基，優選(c2-c24)炔基硫醯基，從具有2至48個碳原子的支鏈羧酸衍生的醯基，優選3位支鏈羧酸；

10 15 其中在(i)，（ii)，（iii)基團中，酸基的烴鏈可以飽和或未飽和，並且醯基，烷基，烯基，炔基的烴鏈可以是支鏈或直鏈並且可以任選被一個或多個基團取代，該基團獨立地選自iS素例如就，氯，演或蛾；經基或經基衍生物-OY，其中Y如下定義；胺或胺衍生物-NHW，其中 W如下定義；OZ基團，其中Z選自如下定義的（f)，(g)， (h)，（i)，（j)，（k) ·，並且R2是選自（CVC6)鹵代烷氧基羰基的基團，例如 2,2,2-三氯乙氧羰基（TROC)或1，1 -二甲基-2,2,2-三氯乙氧羰基(TCBOC);

其中R4選自： ⑻如在(i)，（ii)or (iii)中定義R5的醯基； (b)支鏈或直鏈烷基，優選支鏈或直鏈(CVCW烷基；支鏈或直鏈烯基，優選支鏈或直鏈(CrC24)烯基；支鏈或直鏈炔基，優選支鏈或直鏈(CVCm)炔基； 119 20 200838546 (cHCCVCm)烷基]-COOX，_[(c2-c24)烯基]_coox 或-[(cvcy炔基]-COOX基團，其中X如下定義； (dHA_C24)烷基]-NHW，-[(CVC24)烯基]-NHW或 -[(CrC^)炔基]-NHW基團，其中W如下定義； 5 (e)甲醯基烷基，優選甲醯基[(CrC24)烷基];甲醯基烯基，優選甲醯基[(CrC24)烯基];甲醯基炔基，優選甲酿基[(C1-C24)诀基];

(f)二曱氧基磷醯基； ω-ρ(〇)(〇γ)2基團，其中γ如下定義； 10 (1ι)-Ρ(0)(〇Η)-0[(〇ν〇：24)烷基 ]-：NHW， -P(0)(0H)-0[(Ci-C24) 稀基 ]丽W 或 •PCOXOHhOKCi-CM)炔基]-NHW基團，其中W如下定義； (i) -P(0)(0H)-0[(C1-C24) 烷基]， 15 -P(〇)(〇H)_〇[(Cl-C24)烯基]，或 4(0)(011)-0)^ -(324)炔基]基團；

(j) -P(〇)(〇H)-0[(C1-C24)燒基]-C00X， -P(0)(0H)-0[(C1-C24) 烯基 ]-C00X， -Ρ(〇)(〇Η)-0[((^(^24)炔基]-C00X基團；其中X如上定 2〇義； (k) -S(0)(〇H)2基團； ⑴選自苄基或取代的苄基，例如4_甲氧苄基或3,4_ 二曱氧苄基或2,5-二甲氧苄基或2,3,4_三甲氧苄基或 3A5-三甲氧f基；或選自（C3-c6)烯基，例如C^C4稀 120 200838546 基，優選2-丙烯基或1-丙浠基的保護基團；其中烧基，細基’快基可以是支鍵或直鍵，並且可以是非取代或任選獨立地被一個或多個基團取代，該基團選自鹵素，例如氟、氯、溴或蛾；經基或羧基衍生物 5 -OY ’其中Y如下疋義，胺或胺衍生物-NHW，其中W如下定義；或·OZ基團，其中Z選自（f)，（g)，⑻，⑴，⑴， (k); 並且其中Y選自氫；（C^C：6)烯基，例如C24C3烯基，優選2-丙烯基或1-丙烯基；選自苄基或取代苄基的基團， 10 例如4·甲氧苄基或3,4-二甲氧苄基或2,孓二甲氧苄基或 2,3,4-三甲氧苄基或3,4,5-三甲氧苄基；〇_亞二甲苯基；並且其中W選自氫；苄基氧羰基或9_芴甲氧羰基；並且其中&是選自三氯乙醯亞氨酸酯，氟，氯，溴的基團，並且X和R2如上定義，在適合形成式識化合物 15 的反應條件下:

〇lh)? 其中Rl，R2，R4，R〇和X如上定義。 2.如申明專利|&圍第1項的方法，進一步包括仙化合物的 20 反應’、在適合水解去除所述式lllvib合物的R2基團的條件下，形成式12a化合物： 121 200838546

(12a)，當在式llh中R〇選作R5時，其中Ri，R4，R5和X如申請專利範圍第1項的定義：或形成式12b的化合物

(12b) 當在式llh中R〇選作112時，其中&，R4和X如申請專利範圍第1項的定義。 10 3.如申請專利範圍第2項的方法，進一步包括在適合在所述式12a或12b化合物的游離氨基和式R5OH(活化）羧酸的羧基之間形成醯胺鍵的反應條件下式12a或12b化合物反應形成式13的化合物，其中尺5如上定義，優選存在偶合劑例如氯甲酸異丁酯或1-異丁基氧2-異丁基氧羰基 -1，2-二鼠啥琳或碳化二亞胺·

(13)，其中Ri，R4，R5和X如前定義。 200838546 4.如申請專利範圍第3項的方法，進一步包括如前定義那樣，通過在適合的反應條件下去除式13化合物的心基團形成式14的半縮醛：

R5 (14)，其中R4，R5和X如申請專利範圍第1項的定義。

10

15 5.如申請專利範圍第4項的方法，進一步包括在適合形成式15a的化合物的反應條件下化合物14游離羥:基的構酸化，優選在極性溶劑例如THF中在有適當碱如雙（三甲基矽烷基)氨基鋰用四苄基焦磷酸酯反應：

6.如申請專利範圍第4項的方法，進一步包括在適合形成式15 b化合物的反應條件下化合物14游離羥基的硫酸化，例如通過在溶劑例如DMF中與三氧化硫複合物例如三甲胺三氧化硫複合物反應：

(15b) 123 200838546 7.如申請專利範圍第4項的方法，進一步包括化合物14的游離羥基與式R8〇H的（活化)羧酸反應，其中118選自如前定義R4的（a)，優選存在偶合劑例如氯甲酸異丁酯或1-異丁基氧2-異丁基乳被基-1，2·二氮啥淋或碳化二亞胺 5 下，形成式15c的化合物： OX

(15c) 其中R4，R5，和X如前定義，並且尺8 is選自如前定義R4的(a)。 10 8.如申請專利範圍第4項的方法，進一步包括在適合形成式24的化合物的反應條件下偶合離去基團例如三氯乙聽亞氨酸醋基團至化合物14的游離經基，例如在極性溶劑優選極性非質子溶劑例如二氯甲烷中在存在無機碱如碳酸鉋或碳酸鉀的情況下化合物14與三氯乙腈反應：

其中R4，R5和X如前定義。 9.如申請專利範圍第8項的方法，其中化合物24與有機分子R8OH在適合形成式15d的化合物的反應條件下反 20 應，其中R8選自如前定義R4的⑼，（C)，⑷或⑷： 124 200838546

(15d)

10.如申請專利範圍第3至9項的方法，進一步包括在適合的反應條件下反應基團例如式15a，15b，15c，15d或13化合物上的羥基、胺基、羧基或碳雙鍵在例如酯化、甲基化、醯胺化、氧化、氫化或α，石經基化反應中與四氧化锇反應，其中所述反應基團的反應任選地在去除保護基團例如Υ或W基團以釋放所述反應基團後進行。 11·如申請專利範圍第4至10項的方法，進一步包括在適合形成式1化合物的反應條件下從式13，14，15a，15b， 15c或15d的化合物去除許多保護基團χ，優選通過所述保護基團X的氫解，更優選在碳載貴金屬例如纪存在下：

其中RV ’ R5’和R/分別如前R4，R+r7的定義，據且 Rs 選自如前定義 R4 的（a)，（b)，（c)，（d)，，⑴，（g)， (h) ’⑴’（j)或(k)，或者選作Η，且其中Y*w優選爲h。 12·如申請專利範圍第3項的方法，其中比是烯丙基，該烯丙基通過在極性溶劑中用活化氫金屬催化劑優選活化氫的銀催化劑處理而首先將烯丙基同分異構化成^烯 125 20 200838546 丙基，隨後優選借助於含水的碘源通過裂解異構化的烯丙基形成半縮醛而除去。 13.如申請專利範圍第1至12項的方法，包括在適合的反應條件下通過偶合選自三氯乙醯亞氨酸酯、氟化物、氯化 5 物、溴化物的離去基團至式6化合物的游離羥基而形成式7化合物：

⑹，其中R2，R4和X如前定義。 10 14.如申請專利範圍第1至13項的方法，進一步包括通過在適合的反應條件下去除式5化合物的心基團而形成式6 化合物：

(5)， 15 其中I，R2，R4和X如前定義。 15.如申請專利範圍第1至14項的方法，其中包括式4化合物的游離羥基在適合的反應條件下磷酸化形成式5的化合物，其中R4選自（f)，（g)，（h)，⑴或⑴： 126 200838546

ORi (4)，其中Ri，R2，和X如前定義，例如通過在極性溶劑優選質子惰性的極性溶劑下在存在偶合劑例如[1H]四 5 唑，與亞磷醯胺，例如二芳基N，N二烷基亞磷醯胺或二烷基N，N二烷基亞磷醯胺，優選二烯丙基Ν,Ν二異丙基亞磷醯胺反應，形成亞磷酸酯且隨後優選在芳香族過氧羧酸例如間氯過苯甲酸存在下將亞磷酸酯氧化爲磷酸酯。 16.如申請專利範圍第1至14項任一項的方法，其中包括式4 10 化合物的游離羥基在適合的反應條件下硫酸化形成式5 的化合物，其中R4選自（k):

ox R2 (4)，其中，R2和X如前定義，例如通過在極性溶劑例 15 如DMF中與三氧化硫複合物例如三甲胺三氧化硫複合物反應。 17.如申請專利範圍第1至14項任一項的方法，其中包括式4 化合物的游離經基與適合爲式4化合物的游離經基提供保護基團的化合物反應以形成式5的化合物，其中R4選 20 自（1): 127 200838546

NH ^〇Rl ⑷， 10 15 其中Ri，R2和X如前定義，其中提供所述保護基團的化合物優選選自苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯或取代的苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，例如4-曱氧苄基 -2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，3,4-二甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，2,5-二甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，2,3,4-三甲氧苄基_2,2,2_三氯乙醯亞氨酸酯或3,4,5-三甲氧苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，或（C3-C6)烯基 -2,2,2·三氯乙醯亞氨酸酯，例如C3或C4-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，優選2-丙烯基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯或1-丙烯基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，並且其中該反應優選在極性溶劑和/或存在酸性催化劑例如三氟代甲烧磺酸錫II或三氟代甲烷硫酸中進行。 18.如申請專利範圍第1至14項任一項的方法，其中包括式4 化合物的游離羥基與式R4〇H的（活化）羧酸的羧基反應形成式5的化合物，其中R4選自（a):

⑷， 20 其中I，R2和X如前定義，其中R4選自如上定義的 128 200838546 (a) ’優送在存在偶合劑例如氣甲酸異丁醋或1 _異丁某氧 2-異丁基氧幾基_ι，2-二氫啥琳或礙二亞胺下。 19·如申請專利範圍第1至14項任一項的方法，包括式4化合物的游離羥基與相應R4b)，（c)，（d)或（e)選項的2,2,2, 二氣乙醯亞氨酸醋活化烧基醇反應形成式5的化人物，其中選自（b)、（c)、⑷或(e):

⑷，其中R1 ’ R2和X如前定義，其中該反應優選在極性溶劑和/或存在酸性催化劑例如三氟代甲烷續酸錫三氟代甲烧硫酸中進行。 20·如申請專利範圍第1至19項的方法，進—步包括在式w匕 0物上的反應基團的衍生化，該基團例如輕基、胺某、羧基或碳雙鍵，例如在選自酯化、醯胺化、氧化、氫化或與四氧化餓的α，点經化反應中。 21·如申請專利範圍第1至20項的方法，包括通過在適合反應條件下式3化合物的苯亞甲基還原開環，形成式4化合物:

⑶，其中Ri，R2和X如前定義，並且r3是選自苯基或取代苯基的基團，例如4_甲氧基苯基或3,4-二甲氧基苯基 129 200838546 或2,5_二甲氧基苯基或2,3,4-三甲氧基苯基或3,4,5-三甲氧基苯基，在氫化物例如三甲胺-甲硼烷複合物和路易斯酸例如氯化鋁存在下，在極性溶劑例如THF中。 22·如申請專利範圍第1至21項的方法，進一步包括式9化合物胺官能團在適合醯化的條件下與式1(〇11)的（活化)羧酸反應，其中RG如先前&定義，化如前定義，形成式1〇化合物：

(9)，其中R!是選自a(C3-C6)埽基的基團，例如基’優選2·丙稀基丙稀基，並且灿中請專利範圍第1項定義的。 23.如申請專利第丨至22項的方法，包括在適合的反應條件下式8化合物的I基團水解斷裂，形成式9化合物：

其中Ri，R2和X如前定義。 24. 如申請專·圍第1至23項的方法，包括在適合的反應條件下式3化合物的苯亞甲基還原開環，形成式8化合物：

130 20 (3)， 200838546 其中Ri ’ R2和χ如前定義，並且r3是選自苯基或取代苯基的基團，例如4_甲氧基苯基或3,4_二甲氧基苯基或 2,5_二甲氧基笨基或2,3+三甲氧基苯基或UK甲氧基苯基，例如在氫化物例如二甲胺-甲硼烷複合物和路易斯酸例如三^^存在下，在極性溶劑例如二氯甲烧中。仏如申請專利範圍第w項的方法，包括在適合反應條件

下^過式2化合物與爲式2化合物的游離經基提供保護基團的化合物反應形成式3化合物：

15

其中I，R々R3如前定義，其中爲化合物提供㈣的基團k選選自节基·2,2,2_二氯乙亞氨㈣或取代的苄基-2,2,2-三氯乙醯亞氨酸酯，例如‘甲氧苄基_2,2,2_ 三氯乙醯亞氨_，3,4·二甲氧节基_2,2,2三氣乙酿亞氨酸=5-二甲氧节基_2,2,2•三氯乙酿亞氨酸醋，2,3,4_ 三甲氧节基_2,2,2-三a乙酿亞氨酸函旨或3,4,5_三甲氧节基_2,2,2-三氯乙醯亞氨酸醋，並且其中反應優選在極性溶劑和/或存在酸性催化劑例如三氧代甲烧石黃酸錫π或二氣代曱燒硫酸中進行。 26.如申請專利範圍第3·25項的方法，包括從式挪合物中去除R4基團： 131 20 200838546

(13) 其中R!，R5如申請專利範圍第1項的定義，並且R4 是對曱氧基苄基(PMB)，形成式13c化合物：

(13c) 其中R!，R5，R4和X如上定義。 27·如申請專利範圍第25項的方法，包括通過在適合反應條件下’式13c化合物游離羥基的反應形成式13d化合物： 10

R5

(13d) 其中Ri，R5，R4和X如上定義，反應選自磷酸化、硫酸化、酯化、醯胺化和烷基化作用。 28.如申請專利範圍第3_27方法，包括在適合2_丙稀基羥基化優選二羥基化的反應條件下，反應式13化合物，其中1^疋2-丙烯基，在氧化劑例如4•甲基嗎啉氧化物存在下，優選在四氧化餓溶液存在下形成式以的化合物: 132 15 200838546

(15e)，其中R4，R5和X如前定義並且R8選作2,3二羥丙基。 29. 如申請專利範圍第1-28項的方法，進一步包括化合物 15e的許多游離羥基的磷酸化、硫酸化、烷基化、酯化、醯胺化作用。

30. 如申請專利範圍第3-29項的方法，其中第一個R5基團選自如申請專利範圍第1項所定義的⑴小組並且第二個R5 基團選自如申請專利範圍第1項所定義的（ii)或(iii)小組，其中優選在N-2位置的R5基團選自（i)。 31. 如申請專利範圍第3-29項的方法，其中R5基團都相同或不同地選自如申請專利範圍第1項所定義的⑴小組。 32. 如申請專利範圍第3-29項的方法，其中R5基團都相同或不同地選自如申請專利範圍第1項所定義的(ii)或(iii)小組。 33. —種方法，包括： (i)在適合將至少部分式1化合物結合至固相的條件下混合式1化合物的溶液:

(1) 其中R,，115’和118，如前定義，與固體反相樹脂； (v)除去液相並用包括pH 6-9優選7-8且最優選 133 200838546 7.3-7.7緩衝的水相和有機相的洗液洗務固相’水相和有機相混合的比率在15:1至5:1之間，優選9:1 (v/v); (vi) 除去洗液並用含有水相和有機相的洗脫液洗脫至少部分結合至固相的化合物1，其中水相和有機相 5 混合的比率在1:15至1:5之間，優選1:9 (v/v); (vii) 收集一定量的含有式1化合物的洗脫液； (viii) 任選地從含有式1化合物的洗脫液中除去有機相。 34. 如申請專利範圍第33項的方法，進一步包括調整包括一 10 定量式1化合物的洗脫液的pH至預選pH值，優選至pH 6-9，更優選pH 7-8，且最優選pH 7.3-7.7。 35. 如申請專利範圍第33或34項的方法，其中式1化合物如申請專利範圍第1-32項的方法獲得。 36. —種式3的化合物：

其中Ri，R2，R3和X如前申請專利範圍第1項的定義，並且R3如前申請專利範圍第21項的定義，優選式3b 的化合物：

134 200838546 其中Ph爲苯基且Bn爲苄基。 37. —種式7的化合物:

5 其中R2，R4，R6和X如前申請專利範圍第1項的定義，優選式7b的化合物：

其中Bn如前定義。 10 38. —種式8的化合物：

(8)，其中K，R2和X如前定義，優選式8b的化合物:

15 (8b)， 135 200838546 其中Bn如前定義。 39. —種式10a的化合物：

(10 a)， 5 其中，R5和X如前申請專利範圍第1項的定義，優選式10b的化合物：

其中Bn如前定義。 10 40. —種式11的化合物：

(11)，其中R!，R2, R4, R5和X如前申請專利範圍第1項的定義，優選式11a的化合物： 136 200838546

(lla)，其中Bn如前定義 41. 一種式lib的化合物：

(llb)，其中R!，R2，R4和X如前申請專利範圍第1項的定義，優選式11 c的化合物： BnO、〇

10 (llc)， 42. 其中Bn如前定義。種式12b的化合物:

(12b)， 137 200838546 其中l，R4和X如前申請專利範圍第1項的定義，優選式12c的化合物：

(12c)， 5 其中Bn如前定義。 43. —種式12 a的化合物：

(12a)，

其中R!，R2，R4，R5和X如前申請專利範圍第1項的 10 定義，優選式12d的化合物：

其中Bn如前定義。 44. 一種式13的化合物：

R5 (13)， 15 138 200838546 其中&，R4，R5和X如前申請專利範圍第1項的定義，優選式13b的化合物：

(13b)， 5 其中Bn如前定義。

45. —種式14的化合物：

R5 (14)，其中R4, R5*X如前申請專利範圍第1項的定義，優 10 選式14b的化合物：

其中Bn如前定義。 46. —種合成的不對稱或對稱取代的式1的1，6-/3二糖： 139 200838546

其中R’4，R’5和R’8如前申請專利範圍第11項的定義，優選申請專利範圍第1-22項的方法獲得。 5 47.如申請專利範圍第46項的二糖，其中該二糖選自：

30 31 140 10 200838546

5

10 35 36 其中η爲0或者1至21的整數

39 40 其中η爲1至21的整數其中η爲1至21的整數 141 200838546

41 其中η爲1至21的整數，例如13。 48. 如申請專利範圍第46項的二糖，其中第一個R5基團選自 5 如前申請專利範圍第1項的⑴小組，並且第二個R5基團選自如前申請專利範圍第1項的（ii)或(iii)小組，其中優選地在N-2位的R5基團選自⑴。 49. 如申請專利範圍第46項的二糖，其中兩個基團相同或不同地選自如申請專利範圍第1項中定義的小組⑴。 10 50.如申請專利範圍第46項的二糖，其中兩個R5基團相同或不同地選自如申請專利範圍第1項中定義的小組(ii)或 (沿）。 51.如申請專利範圍第33至35項獲得的化合物，其中根據式1 的化合物優選是申請專利範圍第46至50項的化合物。 15 52. —種組合物，優選藥物組合物，包括一種或多種申請專利範圍第46至51項的化合物，任選地與適合的載體或稀釋劑組合。 53. 如申請專利範圍第36至45項的化合物作爲中間體，包括起始原料在合成不對稱或對稱取代的β-(1—6)-連接的 20 葡糖胺二糖方法中的用途。 54. 如申請專利範圍第46至51項的化合物，任選地在申請專 142 200838546 利範圍第52項的組合物中，用於藥物，優選用於治療受益於免疫系統活性調節包括免疫抑制或免疫活化的病症，如選自免疫病症和/或癌症的病症，最優選用作疫苗組分。 5 55.如申請專利範圍第54項的化合物，其中免疫病症與炎性細胞因子的超量産生有關，例如通過活化T淋巴細胞、單核細胞或抗原呈遞細胞炎性細胞因子的超量産生，其中炎性細胞因子或炎性標記物優選屬於由IL-Ιβ，IL-4, IL-5 IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IFN-γ，TNF-α或MCP-1 組成 10 的組。 56. 如申請專利範圍第54至55項的化合物，其中免疫病症選自哮喘、特應性皮炎、過敏性鼻炎、炎性腸病、糖尿病和風濕性關節炎。 57. 如申請專利範圍第54項的化合物，其中免疫病症與炎性 15 細胞因子的減少産生有關。 58. 如申請專利範圍第54至57項的化合物，其中在通過激活人類免疫系統病症的治療中是有益的。 59. 如申請專利範圍第54至58項的化合物，其中在通過肥大細胞減少組胺分泌的病症的治療中是有益的。 20 60. —種包括在適合的反應條件下式3化合物亞苄基的還原性開環而形成式4化合物的方法：

143 200838546 其中R! ’ R2和X如前定義，並且R3是選自苯基或取代苯基的基團，例如4-甲氧基苯基或3,4-二甲氧基苯基或2,5-二甲氧基苯基或2,3,4-三曱氧基笨基或3,4,5_三甲氧基苯基基團’在氫化物例如三甲胺、硼烷複合物和路易斯酸例如氯化鋁存在下在極性溶劑例如THF中。 61· —種包括在適合的反應條件下式3化合物亞苄基的還原性開環而形成式8化合物的方法：

(3)，其中Rl，R2和X如前定義，並且心是選自苯基或取代苯基的基團，例如4-甲氧基苯基或3,4_二甲氧基苯基或2,5-二甲氧基苯基或2,3,4-三甲氧基笨基或3,4,5_三甲氧基苯基基團，例如在氫化物例如三甲胺_硼烷複合物和路易斯酸例如三氟化硼存在下在極性溶劑例如二氯甲燒中。、

62· —種包括通過在適合的反應條件下偶合選自三氯乙醯亞氰酸自曰，氟化物，氣化物，漠化物的離去基團至式6 化合物的游離羥基形成式7化合物的方法：

其中R2，R4和X如前定義。 144 200838546 63. —種包括通過在適合的反應條件下水解裂解式8化合物 R2基團形成式9化合物的方法：

5 其中Ri，尺2和X如前定義。 64. —種包括從式13化合物除去R4基團形成式13c化合物的方法：

Rs (13) 10 其中Ri，R5如申請專利範圍第1項的定義，並且R4 是對甲氧基苄基（pmb):

(13c) 其中R!，R5，R4和X如前定義。 15 65. —種包括通過適合醯化的條件下式9化合物的醯胺官能團與式R5OH的（活化）羧酸反應形成式10化合物的方法，其中R〇如前R5的定義，其中R5如前定義：

145 200838546 ⑼，其中R!是選自（C3_c0)浠基的基團，例如(：3或(：4烯基’優選2-丙烯基或1-丙烯基，且X如申請專利範圍第1 項的定義。 5 66· —種包括通過式丨丨^化合物在適合水解去除所述式ilh化合物的R2基團的條件下反應的方法，形成式12a化合物：

(12a)，當R〇選作如式llh的R5時，其中心，r4，r^x如申請專利範圍第1項的定義，或形成式12b的化合物：

(12b)，

當R〇選作如式llh的R2時，其中Rl5 R4和X如申請專利範圍第1項的定義。 67· —種包括通過在適合在所述式12a或12b化合物的游離氨基和式R5OH (活化）羧酸的羧基之間形成醯胺鍵的反應條件下式12 a或12b化合物反應形成式13化合物的方法，其中R5如上定義，優選存在偶合劑例如氯甲酸異丁

20 亞胺： 146 200838546

(13)，其中R!，R4，R5和X如前定義。 68. —種包括如前定義那樣，通過在適合的反應條件下去除式13化合物的仏基團形成式14的半縮醛的方法：

其中R4，R5和X如申請專利範圍第1項的定義。 69. —種包括通過在適合形成式15a化合物的反應條件下化合物14的游離羥基磷酸化的方法，優選在適合碱例如雙 (三甲基曱矽烷基）氨基鋰存在下在極性溶劑例如T H F中用四苄基焦磷酸酯：

(15a) 70. —種包括通過在適合形成式15b化合物的反應條件下化合物14的游離經基硫酸化的方法，例如通過與三氧化硫複合物例如三甲胺三氧化硫複合物在溶劑例如DMF中反應： 147 200838546

(15b) 5 71. —種包括通過化合物14的游離羥基與式118011的（活化) 羧酸反應以形成式15c化合物的方法，其中118選自如前定義R4的（a)，優選存在偶合劑例如氯甲酸異丁酯或1-異丁基氧2_異丁基氧魏基-1，2-二氮喧琳或碳化二亞胺：

(15c) 其中R4，R5和X如前定義，並且R8 is選自如前R4 的定義（a)。 72. —種包括通過偶合離去基團例如三氯乙醯亞氨酸酯基團至化合物14的游離羥基，在適合的反應條件下形成式 24化合物的方法，例如在極性溶劑中在無機碱的存在下化合物14與三氣乙腈反應，該無機碱例如碳酸铯或碳酸鉀，極性溶劑優選質子惰性的極性溶劑，例如二氯甲烷:

(24)，其中R4，R5和X如前定義。