NL1024578C2

NL1024578C2 - Inrichting voor het uitvoeren van een reactie.

Info

Publication number: NL1024578C2
Application number: NL1024578A
Authority: NL
Inventors: Pasqualina Maria Sarro; Adrianus Bossche; Ventzeslav Iordanov; Jeroen Bastemeijer
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 2003-10-21
Filing date: 2003-10-21
Publication date: 2005-04-22
Also published as: CA2542773A1; US20060251553A1; EP1677912A1; JP2007514405A; WO2005037433A1

Description

r

Inrichting voor het uitvoeren van een reactie

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een inrichting voor het uitvoeren van een reactie, welke inrichting een wafel omvat voorzien van een groep van ten minste twee putjes.

5 Een dergelijke inrichting is in het vak bekend, bij voorbeeld voor het uitvoeren van biochemische reacties.

Een belangrijk aspect van met technologie voor geïntegreerde schakelingen vervaardigde inrichtingen is dat deze, om in de praktijk te kunnen worden toegepast, de praktijkcon-10 dities (zoals mechanische en thermische belasting) kunnen weerstaan. Met andere woorden, de inrichting dient voldoende stevig te worden uitgevoerd. Echter, voor thermisch belaste inrichtingen geldt dat dit zo min mogelijk ten koste moet gaan van de benodigde thermische isolatie, opdat naburige 15 putjes niet of althans zo min mogelijk worden beïnvloed.

De onderhavige uitvinding beoogt een inrichting te beschaffen welke een grote mechanische sterkte combineert met een goede thermische isolatie.

Hiertoe verschaft de uitvinding een inrichting van 20 de in de aanhef genoemde soort, welke hierdoor wordt gekenmerkt dat de putjes thermisch van elkaar zijn gescheiden, en de inrichting verder middelen omvat voor het wijzigen van de temperatuur van de putjes, waarbij de wafel ten minste twee lagen omvat, waarbij een eerste, bovenste laag de bodem van 25 een putje vormt, en de thermische scheiding is verschaft door ten minste een uitsparing in een onder de eerste laag gelegen tweede laag, zodanig dat - zich ten minste een uitsparing bevindt tussen twee aanliggende putjes, 30 - de tweede laag geprojecteerd op de eerste laag ter plaatse van de bodem van een putje ten minste een deel van de bodem beslaat, welk deel van de tweede laag dat in projectie ten minste een deel van de bodem beslaat mechanisch versterkend deel wordt genoemd, en de tweede laag middels ten minste 35 één brug is verbonden met een deel van de tweede laag dat zich buiten de projectie van de bodem van het putje op de 1024578 , ' 2 tweede laag bevindt, welk deel van de tweede laag dat in projectie zich buiten de bodem bevindt bulkdeel wordt genoemd, en de middelen voor het wijzigen van de temperatuur van de 5 putjes zich, in projectie op de eerste laag, ter plaatse van de bodem van een putje bevinden.

De uitsparing of uitsparingen verschaffen een uitstekende thermische isolatie, terwijl anderzijds het mechanisch versterkende deel de bodem versterkt en de ten minste 10 ene brug een de stevigheid verhogend verband met de tweede laag verzekert. De ten minste ene brug kan zich al dan niet in contact met de eerste laag bevinden. De middelen voor het wijzigen van de temperatuur omvatten bijvoorbeeld een Pel-tier-element. Wanneer in de onderhavige uitvinding wordt ge-15 sproken over een eerste laag en een tweede laag, wordt daarmee niet uitgesloten dat één of beide uit meer sublagen zijn opgebouwd. Zo kan de eerste laag bijvoorbeeld een eerste sublaag kunnen omvatten welke de middelen voor het elektrisch wijzigen van de temperatuur omvat, een tweede sublaag welke 20 de eerste sublaag elektrisch isoleert, een elektriciteit-geleidende derde sublaag welke deels door de tweede sublaag dringt voor contact met de eerste sublaag voor het kunnen toevoeren van de eerste sublaag van stroom. Een vierde sublaag welke over de derde sublaag is aangebracht en zorgt 25 voor elektrische isolatie ten opzichte van een elektrisch geleidende vijfde sublaag, welke eveneens in verbinding staat met de eerste sublaag maar niet met de derde elektriciteit-geleidende sublaag, alsmede een elektrisch isolerende zesde sublaag welke de feitelijke bodem van het putje vormt. In de 30 onderhavige aanvrage wordt onder een putje een plaats op de inrichting verstaan welke omgeven is door een opstaande wand, maar ook, in afwezigheid van een dergelijke wand, door de plaats waar zich de middelen bevinden voor het wijzigen van de temperatuur. De inrichting volgens de uitvinding kan één 35 of meer geïntegreerde sensoren omvatten, bij voorkeur ter plaatse van een, in het bijzonder elk, putje. Het kan gunstig zijn als de laag met aansluitingen voor transducenten (middelen voor het wijzigen van de temperatuur, sensoren enz.) de 1024578 3 . ' tweede, onderste laag is, aangezien aldus een meer gedefinieerde, zoals vlakkere, bovenste zijde van de eerste laag kan worden bereikt. Dit is gunstig voor het uitvoeren van assays. De uitsparingen kunnen de vorm hebben van een rij niet-5 doorgaande, waarbij niet-doorgaand betrekking heeft op de gehele dikte van de inrichting.

Kersjes R. et al (Sensors and Actuators A, 46-47, blz. 373 - 379 (1995)) beschrijven een stromingssensor waarbij thermische isolatie wordt verschaft door met oxide-10 gevulde groeven. Het gebruik van gevulde groeven geeft enerzijds een verhoging van de mechanische sterkte, doch verhoogt anderzijds bij wisselende temperaturen, de mechanische stress in de inrichting. Verder is de mate van isolatie beperkt.

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm heeft de uit-15 sparing de vorm van een groef.

Een dergelijke uitsparing verschaft over een grote afstand een uitstekende thermische isolatie. Verder kan deze gemakkelijk middels bekende technieken voor IC-fabricage worden aangebracht.

20 Een voorkeursuitvoering wordt hierdoor gekenmerkt dat het mechanisch versterkende deel dat zich onder een putje bevindt met ten minste 3 over de omtrek van het versterkende deel verdeelde bruggen met het bulkdeel is verbonden.

Aldus kan een uitstekende mechanische sterkte worden 25 bereikt.

Met voordeel zijn de middelen voor het wijzigen van de temperatuur van de putjes geïntegreerd in de tweede laag.

Volgens een belangrijke uitvoeringsvorm zijn de middelen voor het wijzigen van de temperatuur middelen voor het 30 verwarmen van het putje.

Middels verwarmen kan bijvoorbeeld lokaal een chemische reactie worden gestart, terwijl dat op nabij gelegen plaatsen op de inrichting niet verloopt. Een dergelijke reactie kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor synthese van oli-35 gopeptiden of oligonucleotiden ter plaatse van de putjes. Een andere belangrijke mogelijkheid is het gebruik van de inrichting voor polynucleotide-amplificatie, zoals een Polymerase Chain Reaction (PCR).

10c4573 ; 4

Met voordeel is ten minste de eerste laag een optisch transparante laag.

In een dergelijk geval kan een optische meting worden uitgevoerd in het putje waarbij het niet noodzakelijk is 5 dat de detector en/of optionele excitatiebron zich aan de zijde van het putje bevinden. Zo kan de excitatie bijvoorbeeld door de eerste laag heen geschieden.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het vervaardigen van een inrichting volgens de 10 uitvinding. Deze wordt hierdoor gekenmerkt dat - een wafel, welke een tweede laag zal vormen, wordt voorzien van een eerste, bovenste laag, - de wafel aan de onderste zijde in de tweede laag van een uitsparing wordt voorzien tussen twee aanliggende putjes in 15 de eerste laag.

Tenslotte heeft, als belangrijke toepassing van de inrichting volgens de uitvinding, de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het uitvoeren van een polynucleotide-amplificatie. Deze wordt hierdoor gekenmerkt dat een inrich-20 ting volgens de uitvinding wordt toegepast, waarbij de temperatuur cyclisch wordt gevarieerd.

De inrichting volgens de uitvinding is zeer geschikt, aangezien deze weinig thermische massa omvat en goede thermische isolatie biedt, waardoor de polynucleotide-25 amplificatiecyclus snel kan worden doorlopen (weinig tijdverlies door opwarmen/afkoelen). Het afkoelen kan passief geschieden.

De onderhavige, uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van een uitvoeringsvoorbeeld en de teke-30 ning, waarin

Fig. 1 een bovenaanzicht toont van een inrichting volgens de uitvinding, welke vier putjes omvat;

Fig. 2 een perspectivisch bovenaanzicht toont van een deel van de in Fig. 1 weergegeven inrichting; 35 Fig. 3 een perspectivisch onderaanzicht toont van een deel van de in Fig. 1 weergegeven inrichting;

Fig. 4 een doorsnede toont langs lijn IV-IV van de in Fig. 1 afgeheelde inrichting; en 1024578 5

Fig. 5 een grafiek voorstelt van een met de inrichting volgens de uitvinding uitgevoerde temperatuurcyclus.

Fig. 1 toont een bovenaanzicht van een middels Inte-5 grated Circuit (IC) -technieken vervaardigde inrichting 1 volgens de uitvinding. Aangegeven zijn aan de onderzijde van de inrichting aangebrachte groeven 2, welke een eiland 3 begrenzen. De hier getoonde inrichting bevat vier eilanden 3. Eiland 3 is, in de hier getoonde uitvoeringsvorm, op vier 10 plaatsen middels verbindingsbruggen 4 met een ander deel van de tweede laag 5 (Fig. 3) verbonden, welk andere deel een bulk deel is. Eiland 3 fungeert als mechanisch versterkend deel en middels de verbindingsbruggen 4 wordt, volgens de uitvinding, een uitermate stevige constructie verschaft.

15 In de hier getoonde uitvoeringsvorm zijn de verbin dingsbruggen 4, 4' van aanliggende eilanden 3, 3' zodanig geplaatst dat zij zich op een zo groot mogelijke afstand van elkaar bevinden. De eilandjes 3 van de inrichting 1 zijn ook voorzien van resistieve verwarmingselementen 6, gevormd uit 20 gedoteerd polykristallijn silicium. Wanneer stroom door een verwarmingselement 6 wordt gevoerd, wordt het eiland 3 verwarmd, waarbij de warmte dankzij groeven 2 slecht weg kan vloeien.

Fig. 2 toont de inrichting van Fig. 1 in een per-25 spectivisch bovenaanzicht. Te zien zijn een eerste laag 7, welke laag 7 de resistieve verwarmingselementen 6 omvat, en de tweede laag 5. De inrichting bezit een viertal putjes 8, welke worden begrensd door de opstaande wand 9, welke hier deeluitmaakt van de eerste laag 7.

30 Fig. 3 toont de inrichting van Fig. 1 in een per spectivisch onderaanzicht. Te zien zijn de eerste laag 7, en de tweede laag 5, welke groeven 2 bezit. Verbindingsbruggen 4 verbinden eiland 3 met dat deel van de tweede laag 5 dat zich buiten de eilanden 3 bevindt, voor het verschaffen van mecha-35 nische stevigheid. Deze stevigheid is belangrijk voor het hanteren van de inrichting, maar ook om bestand te zijn tegen spanningen in de inrichting als gevolg van het opwarmen van eiland 3.

1024578 6 .

In de getoonde uitvoeringsvorm zijn de groeven 2 zo diep dat aldaar geen materiaal van de tweede laag 5 aanwezig is, doch dit is niet verplicht. Bij voorkeur is de groef diepte ten minste 50% van de dikte van de tweede laag 5, met meer 5 voorkeur ten minste 80%, zoals 100%.

De hierboven beschreven uitvoeringsvorm is geschikt voor het uitvoeren van de Polymerase Chain Reaction, een biochemische nucleotidenamplificatie-techniek waarbij de reac-tietemperatuur cyclisch dient te worden gevarieerd. Voor het 10 real-time volgen van de reactie is, in de hier beschreven uitvoeringsvorm, elk eilandje voorzien van een lichtgevoelig gebied 10, en voor het meten van de door het verwarmingselement 6 bereikte temperatuur een temperatuursensor 11. Thans zullen de stappen worden beschreven voor het vervaardigen van 15 de beschreven inrichting.

PCR chip fabricage Standaard fabricagestappen 20

Het fabricageproces voor de vervaardiging van Polymerase Chain Reaction (PCR) chips is gebaseerd op een standaard 1,6 pm conventioneel polysilicium-gate Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) proces, gebaseerd op lokale 25 oxidatie van het silicium (LOCOS). De structuur wordt gevormd op een 525 um dik p-type substraat met een epitaxiaal gegroeide laag van 12 pm aan de voorzijde. Als eerste stap in het fabricageproces worden aan de voorzijde van de wafel de actuatoren (verwarmingselementen 6), sensoren (10 en 11; voor 30 temperatuurmeting en optische detectie) en uitlees- en bestu-ringselektronica gevormd. Deze stap op zichzelf bestaat uit meerdere fabricage stappen welke standaard zijn in de halfgeleider fabricage techniek.

De fotodetectors 10 bestaan uit twee gestapelde PN-35 overgangen. De onderste overgang wordt gevormd door de P-epilaag en de N-bak. De bovenste overgang wordt gevormd door de N-bak en een vlakke geïmplanteerde P-laag, welke normaal gesproken wordt gebruikt voor drain-contacten en source- 1024578 7 contacten. De resistieve verwarmingselementen 6 zijn gemaakt van fosforgedoteerde poly-kristallijn silicium. De tempera-tuursensor 11 wordt gevormd door een laterale PNP-transisitor in het CMOS-proces, de laterale transistor is opgebouwd uit 5 een geïmplanteerde P-laag, de N-bak en de P-epilaag. Voor isolatie en bescherming van de gevormde structuren wordt een 800 nm laag aangebracht van siliciumnitride met behulp van een Plasma Enhanced Chemical Vapor Depositor (PECVD).

10 Speciale post-fabricage stappen

Na de bovenstaande standaard CMOS fabricage stappen worden een aantal niet standaard postfabricage stappen toegepast. Voor de lithografische stappen in deze postfabricage 15 wordt slechts gebruik gemaakt van een drietal maskers. Deze maskers worden gebruikt voor de (optionele) vorming van de putjes in SU-8 fotolak 9, het etsen van het membraan en het vormen van de isolatiegroeven 2. Als eerste stap in de postfabricage wordt een 1 tot 2 pm dikke laag siliciumnitride 20 aangebracht op de achterzijde van de wafer. Door middel van lithografie en etsstappen wordt een patroon aangebracht in de SiN laag, zodanig dat met behulp van een kaliumhydroxide (KOH) etsstap de siliciumbulklaag terug geëtst kan worden tot een membraan met een dikte van circa 150 pm. Vervolgens wordt 25 het restant van de SiN-laag op de achterzijde van de wafel, middels een etsstap, verwijdert. Op de voorzijde van de wafel wordt een (optionele) laag SU-8 fotolak aangebracht. Deze laag wordt door middel van lithografie voorzien van een patroon dat correspondeert met de te vormen putjes op de voor-30 zijde en de openingen voor de elektrische verbindingen. Na het ontwikkelen van de fotolak zijn de gewenste putjes en openingen om de elektrische aansluitingen te kunnen maken gevormd in de SU-8 fotolak. Op de achterzijde wordt nu een laag siliciumoxide aangebracht met een dikte van 2 pm. Door middel 35 van lithografie wordt in deze laag een patroon aangebracht wat correspondeert met de te etsen groeven. Als laatste stap worden de groeven 2 voor temperatuurisolatie aangebracht door aan de achterzijde een Reactive Ion Etch-stap (RIE) uit te 1024578 t ' 8 voeren, welke stopt op het siliciumoxide.

De zo gevormde wafel wordt vervolgens gezaagd zodat de chips individueel gebruikt kunnen worden.

5

UITVOERING EXPERIMENTEN

De, zoals hiervoor beschreven, gefabriceerde chip 10 wordt afgemonteerd op een drager. De chip wordt op de drager bevestigd door middel van een lijmverbinding. Er dient voor te worden gewaakt dat de lijm de thermische isolatiestructuur niet verstoort. Deze drager heeft tot doel, de hanteerbaarheid van de chip te vergroten, het tot stand brengen van de 15 elektrische verbindingen en het beschermen van de chip.

De chip kan voorzien worden van besturings- en rege-lelektronica. Indien dit het geval is zal de communicatie tussen de chip en de buitenwereld plaats vinden via de op de chip aanwezige besturing. De hieronder staande beschrijving 20 gaat uit van de chip in zijn meest eenvoudige vorm, dit betekent zonder besturings- of regelelektronica, alleen de poly-silicium verwarmingsweerstand en een op het membraan geïntegreerde diode voor temperatuurmeting worden gebruikt.

In deze experimentele opstelling is gebruik gemaakt 25 van een externe stroombron om de stookweerstand aan te sturen. Een stroombron heeft als voordeel dat het toegevoerde vermogen beperkt is, in geval van bijvoorbeeld doorslag van het substraat, iets wat niet het geval is bij gebruik van een spanningsbron. Bij praktisch gebruik van de chip, buiten de 30 testfase, zijn zowel een stroombron als een spanningsbron bruikbaar.

De membraantemperatuur wordt gemeten middels de op het membraan geïmplementeerde diode. Deze diode heeft een temperatuurcoëfficiënt van de voorwaartse spanning van onge-35 veer -2,1 mV/°C. Om deze voorwaartse spanning te meten wordt een, door middel van een stroombron opgewekte constante, stroom door de diode gestuurd. Met behulp van een, bij voorkeur, digitale voltmeter wordt de voorwaartse spanning van de 1024578 9 diode gemeten. Voor een nauwkeurige bepaling van de temperatuur kan voorafgaand aan de metingen de temperatuursafhanke-lijkheid van de diode nauwkeurig bepaald worden. Hiertoe wordt de chip met de diode in een klimaatkast geplaatst. De 5 temperatuur in de klimaatkast wordt in een aantal stappen omhoog gebracht, bij iedere temperatuurstap wordt de temperatuur in de klimaatkast voldoende lang constant gehouden, zodat de diode in de klimaatkast zijn temperatuur kan stabiliseren. Bij deze temperatuur wordt vervolgens de voorwaartse 10 spanning van de diode gemeten. De zo verkregen temperatuurkarakteristiek kan worden gebruikt bij de uiteindelijke tempe-ratuurmeting tijdens de PCR-cyclus.

Voor het uitvoeren van een PCR-cyclus wordt gebruik gemaakt van een programmeerbare gelijkstroombron. Deze bron 15 wordt zodanig geprogrammeerd dat de volgende temperatuurstappen worden doorlopen:

• 1® stap: 94°C

• 2® stap: 55°C

• 3® stap: 72°C

20 · 4® en volgende stappen (ca. 30x): herhaling van stap 1 tot en met 3 • laatste stap: afkoelen naar omgevingstemperatuur

Het bereiken van de gewenste temperatuur wordt gere-25 gistreerd door middel van de geïntegreerde diode. Bij het bereiken van de gewenste temperatuur wordt de stroombron ingesteld op de stroom, welke nodig is om de temperatuur van de volgende temperatuurstap te bereiken.

Om dit proces automatisch te laten verlopen kan ge-30 bruik worden gemaakt van een computer die is verbonden met een digitale multimeter, voor meting van de voorwaartse spanning van de diode, en een programmeerbare stroombon, voor aansturing van de verwarmingsweerstand. De computer wordt voorzien van besturingssoftware, bijvoorbeeld VEE van Agi-35 lent, en via een communicatiebus met de meetapparatuur verbonden. De computer wordt zo geprogrammeerd dat de PCR-cyclus (voldoende snel) wordt doorlopen.

Tijdens deze test wordt het putje gevuld met een wa- 1024578 10 terige testvloeistof. Vervolgens wordt het putje aari de bovenzijde afgesloten om verdamping van de testvloeistof tegen te gaan. Met dit systeem kan een volledige PCR-cyclus met een doorlooptijd van circa drieëneenhalve minuut gerealiseerd 5 worden. Ter illustratie toon Fig. 5 hoe snel een putje op de gewenste temperatuur kan worden gebracht. De stippellijn stemt overeen met de ideale vorm van de temperatuur-kromme.

De stippellijn komt ook overeen met de door het verwarmingselement 6 gevoerde stroom. Het spreekt voor zich dat, door 10 initieel een grotere stroom door het verwarmingselement 6 te sturen, de ideale vorm van de temperatuur-kromme beter kan worden benaderd. Wel dient te worden gewaakt voor hot-spots en het daarmee samenhangende risico op inactivatie van, bijvoorbeeld, een bij een reactie gebruikt enzym.

15 Bij verdere integratie is het mogelijk om besturings- en regelelektronica die de hiervoor beschreven taken automatisch uitvoeren op de chip te integreren. De systeemrespons kan, door het toepassen van een proportioneel-integrerend-differentiërend regelsysteem verder verbeterd worden.

20 De onderhavige uitvinding beschouwt tevens de mogelijk heid dat er in de bovenste eerste laag een uitsparing voor thermische isolatie is aangebracht, naast of in plaats van de uitsparing in de onderste tweede laag.

1024578

Claims

1. Inrichting voor het uitvoeren van een reactie, welke inrichting een wafel omvat voorzien van een groep van ten minste twee putjes, met het kenmerk, dat de putjes thermisch van elkaar zijn gescheiden, en de inrichting verder 5 middelen omvat voor het wijzigen van de temperatuur van de putjes, waarbij de wafel ten minste twee lagen omvat, waarbij een eerste, bovenste laag de bodem van een putje vormt, en de thermische scheiding is verschaft door ten minste een uitsparing in een onder de eerste laag gelegen tweede laag, zodanig 10 dat - zich ten minste een uitsparing bevindt tussen twee aanliggende putjes, - de tweede laag geprojecteerd op de eerste laag ter plaatse van de bodem van een putje ten minste een deel van de bodem 15 beslaat, welk deel van de tweede laag dat in projectie ten minste een deel van de bodem beslaat mechanisch versterkend deel wordt genoemd, en de tweede laag middels ten minste één brug is verbonden.met een deel van de tweede laag dat zich buiten de projectie van de bodem van het putje op de 20 tweede laag bevindt, welk deel van de tweede laag dat in projectie zich buiten de bodem bevindt bulkdeel wordt genoemd, en de middelen voor het wijzigen van de temperatuur van de putjes zich, in projectie op de eerste laag, ter plaatse van 25 de bodem van een putje bevinden.

2. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de uitsparing de vorm heeft van een groef.

3. Inrichting volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het mechanisch versterkende deel dat zich onder een 30 putje bevindt met ten minste 3 over de omtrek van het versterkende deel verdeelde bruggen met het bulkdeel is verbonden.

4. Inrichting volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de middelen voor het wijzigen van 35 de temperatuur van de putjes zijn geïntegreerd in de tweede 1024578 laag.

5. Inrichting volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de middelen voor het wijzigen van de temperatuur middelen zijn voor het verwarmen van het putje.

6. Inrichting volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de ten minste de eerste laag een optisch transparante laag is.

7. Werkwijze voor het vervaardigen van een inrichting volgens een van de conclusies 1 tot 6, met het kenmerk, 10 dat - een wafel, welke een tweede laag zal vormen, wordt voorzien van een eerste, bovenste laag, - de wafel aan de onderste zijde in de tweede laag van een uitsparing wordt voorzien tussen twee aanliggende putjes in 15 de eerste laag.

8. Werkwijze voor het uitvoeren van een polynucleo-tide-amplificatie, met het kenmerk, dat een inrichting volgens een van de conclusies 1 tot 6 wordt toegepast, waarbij de temperatuur cyclisch wordt gevarieerd. 1024578