KR20180105387A - 신규한 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P) 유래 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 고수율로 생물전환시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명으로부터 제공되는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P) 유래 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 고수율로 생물전환시킬 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 신규한 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능은 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암 활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진 효능, 심혈관 장해 개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 작용, 항피로 작용, 항산화 활성, 노화억제 등이 있다.
인삼에는 배당체 성분인 40여종 이상의 진세노사이드(Ginsenoside)를 비롯하여 비(非)사포닌계의 생리활성 물질로 폴리아세틸렌(Polyacetylene), 페놀 화합물(Phenolic compounds), 산성 다당류(Acid polysaccharides), 펩타이드(Peptides), 알칼로이드(Alkaloids) 등 인체에 유용한 다양한 성분들이 함유되어 있다.
인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼에 함유된 사포닌(Saponin)을 의미하며, 인삼에는 다양한 종류의 진세노사이드 성분이 함유되어 있다. 진세노사이드는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽, 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성이 다른 것으로 알려져 있다.
인삼의 진세노사이드는 인삼 건조량의 약 5％를 차지하며, 트리터페노이드(Triterpenoid) 계열의 다마란(Dammarane) 골격에 포도당(Glucose), 아라비노즈(Arabinose), 자일로즈(Xylose), 람노즈(Rhamnose) 등이 결합되어 있는 중성 배당체이다. 비당 부분에 붙어있는 -OH의 수에 따라 2개인(3, 12번 위치) 경우 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol; PPD) 계열 사포닌, 3개인(3, 6, 12번 위치) 경우 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol; PPT) 계열 사포닌이라 한다. PPD와 PPT의 R1, R2, R3 위치의 -OH에 글루코오스(Glucose), 아라비노오스(Arabinose), 자일로오스(Xylose), 람노오스(Rhamnose) 등이 결합된다. 30종 이상의 진세노사이드가 인삼으로부터 분리 보고되었으나 실제 인삼을 추출하여 분석할 때 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 및 Rg1의 6종이 전체 사포닌의 90％ 이상을 차지하고 있으며 나머지 사포닌 성분들은 그 함량이 낮다.
진세노사이드는 인체 내에서 그대로 흡수되는 것이 아니라 인체 장내에 존재하는 박테리오데스(Bacteriodes), 락토바실러스(Lactobacillus), 푸소박테리움(Fusobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 프로베텔라(Provetella) 등의 미생물에 의하여 분해되어 그 대사체가 흡수된다. 진세노사이드 Rb1의 경우 장내 미생물에 의해 진세노사이드 Rd, 컴파운드 케이(Compound K)와 프로토파낙사디올로 순차적으로 전환된다. PPD계 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rc, Rd는 장내에서 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol(C-K)로 대사되어 흡수된다. PPT계 진세노사이드 Re, Rf, Rg1은 장내에서 Rh1, F1, Protopanaxatriol로 대사된다. PPD계 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등은 장내 미생물에 의하여 20(R)-/20(S)-ginsenoside Rg3로 전환되며, Rg3는 장내 미생물에 의하여 Rh2로 전환된다.
최근에는 이러한 인삼의 약효성분이 인체 내로 용이하게 흡수되도록 하며, 인삼에 극미량으로 존재하는 성분들을 강화시키는 방법으로서 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하거나 효소를 처리하는 방법 등이 사용되고 있다. 대한민국 등록특허공보 제10-1017378호는「발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주」에 관한 것으로서, 청국장에서 분리된 바실러스(Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼 및 홍삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 기술이 개시되어 있다.
또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1240192호는「락토바실러스 아시도필러스 Ｋ-59 균주, Ｋ-59 균주를 이용한 인슐린 분비 개선용 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법」에 관한 것으로서, 새롭게 분리 동정된 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) K-59 (KFCC11467P) 균주를 이용하여 인삼의 생체이용률이 낮은 성분인 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg1 또는 Re을 진세노사이드 Rh1, Rg3, Rh2 또는 C-K로 전환시키는 방법이 개시되어 있다.
한편, 돌외(Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino)는 칠엽담이라고도 하며, 박과(Cucurbitaceae)에 속하는 덩굴성 여러해살이 식물이다. 줄기는 덩굴수염으로 다른 식물이나 물체에 감아 올라간다. 잎은 어긋나고 새 발바닥모양의 또는 손 바닥 모양의 겹잎이다. 작은 잎은 3~7개이며 난상 피침형이고 끝이 날카롭고 잎아래는 날카로우며 거친 치아 모양의 톱니와 짧은 털이 있다. 꽃은 8~9월에 담황녹색으로 피며 잎겨드랑이에서 원추화서 또는 총상화서로 달리고, 열매는 장과이며 구형이고 검은 녹색으로 익으며 크기는 지름 6~8밀리이다. 돌외의 자생지는 한국, 일본, 중국, 스리랑카, 방글라데시, 네팔, 인도 등이며, 주로 해안가, 강가 등 습도가 높은 곳에서 자란다.
돌외에는 자생하는 국가와 지역에 따라 다양한 담마란계(Dammarane type) 사포닌이 함유되어 있으며, 이들은 지노사포닌(Gynosaponin) 또는 지페노사이드(Gypenoside)라고 명명된다. 돌외 사포닌은 지질대사 개선작용, 심혈관계질환 방어작용, 혈당강하 작용, 중추신경계 작용, 항암작용, 혈소판 응집 저해작용, 강장작용 등의 효능을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이러한 효능들은 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 유효성분인 진세노사이드(Ginsenoside)의 것과 상당히 일치한다. 이러한 사실은 양쪽 식물에 모두 담마란계 사포닌이 공통으로 함유되어 있기 때문인 것으로 인정되고 있다.
최근에는 이러한 담마란계(Dammarane type) 사포닌인 지페노사이드(Gypenoside)를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드(Ginsenoside)로 전환시키는 기술에 대한 연구가 진행되고 있다. 대한민국 등록특허공보 제10-1427882호는「플라보박테리엄 존소니에 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 Ｒｄ 및 Ｆ2의 제조방법」에 관한 것으로서, 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 인삼사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd 또는 F2를 제조하는 방법에 관한 기술을 개시하였다.
이에, 본 발명자들은 지페노사이드(Gypenoside)로부터 진세노사이드(Ginsenoside)를 고수율로 생물전환하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P)로부터 유래된 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 이용하여 돌외에 처리할 경우, 돌외 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 생물전환시킬 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고수율로 지페노사이드(Gypenoside)를 진세노사이드(Ginsenoside)로 생물전환 시킬 수 있는 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질, 이를 코딩하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고수율로 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 진세노사이드(Ginsenoside)로 생물전환 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P)로부터 유래된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 지페노사이드(Gypenoside) XVll에 처리하여 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 처리는 pH 6 내지 9에서 20 내지 40℃의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 처리는 Co2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, NH4+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온을 추가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 처리는 NH4+ 또는 Mg2+ 금속 이온을 추가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 진세노사이드(Ginsenoside)는 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 진세노사이드(Ginsenoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 진세노사이드(Ginsenoside)는 항산화, 항염 및 항주름 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 생물 전환시킬 수 있는 효과가 있다. 이를 통해 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)를 대량으로 생산할 수 있고, 이를 항산화, 항염증 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물로 이용할 수 있다.
도 1은 정제하여 얻은 진세노시다제(Ginsenosidase)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. (M; 분자량 Standard, 1; 락토바실러스 카제이 GFC 1 DNA, 2; 재조합 미생물 파쇄물, 3; 정제된 진세노시다제)
도 2는 본 발명에 따른 정제된 진세노시다제(Ginsenosidase)의 pH(A) 및 온도(B)에 따른 안정성 및 활성 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 진세노시다제(Ginsenosidase)를 이용한 생물학적 전환에 대한 TLC 분석 결과이다. (S; Standard, C; Gypenoside XVll, 1; 실시예 5-6, 2; 실시예 5-8(12hr 처리), 3; 실시예 5-8(24hr 처리), 4; 실시예 5-7(12hr 처리))
도 4는 지페노사이드(Gypenoside) XVll가 진세노시다제 처리후 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 전환된 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석 결과이다. (A; 처리 전, B; 12시간 처리후)
도 2는 본 발명에 따른 정제된 진세노시다제(Ginsenosidase)의 pH(A) 및 온도(B)에 따른 안정성 및 활성 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 진세노시다제(Ginsenosidase)를 이용한 생물학적 전환에 대한 TLC 분석 결과이다. (S; Standard, C; Gypenoside XVll, 1; 실시예 5-6, 2; 실시예 5-8(12hr 처리), 3; 실시예 5-8(24hr 처리), 4; 실시예 5-7(12hr 처리))
도 4는 지페노사이드(Gypenoside) XVll가 진세노시다제 처리후 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 전환된 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석 결과이다. (A; 처리 전, B; 12시간 처리후)
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
본 발명에서 "핵산" 이라 함은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 것을 의미한다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
본 발명에서 "유전자" 라 함은 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "프라이머" 라 함은 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명에서 "재조합 벡터" 라 함은 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 조제물을 의미한다.
본 발명에서 "상동성" 이라 함은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 두 개의 모이티 사이의 상동성이 결정될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 "지페노사이드(Gypenoside) XVll" 라 함은 돌외에서 분리되는 트리테르펜 사포닌 계열의 화합물로서, "Gynosaponin S; Gypenoside-XVII; 3β-(β-D-Glucopyranosyloxy)-12β-hydroxy-5α-dammar-24-en-20-yl 6-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside;(3beta,12beta)-3-(beta-D-Glucopyranosyloxy)-12-hydroxydammar-24-en-20-yl 6-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-glucopyranoside" 등으로 표시되며, 화학식은 다음과 같다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 신규한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 제공하는 것이다.
상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 돌외 사포닌을 인삼 사포닌화 시키는 당 가수분해 효소를 의미하며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 의미한다. 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 생물전환하는 진세노시다제(Ginsenosidase)의 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 상동성이란 야생형(Wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.
이때, 본 발명에 따른 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P)(이하 'GFC 1'로 약칭함)로부터 유래된 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P)로부터 유래한 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질(서열번호 1)를 분리 및 정제하였다. 이 효소는 글리코시드 하이드로다제 3족(Glycoside hydrolase family 3)에 속하는 효소이고 아미노산 서열은 487개의 잔기를 가지고 있다.
또한, 본 발명은 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
이때, 상기 핵산은 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 코딩하는 핵산은 진세노시다제(Ginsenosidase)의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산인 한 이에 제한되지 않으나, 실질적으로 진세노시다제(Ginsenosidase)의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 상동성은 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 pMAL-c5X 벡터인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 지페노사이드(Gypenoside) XVll에 처리하여 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 진세노사이드(Ginsenoside)는 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 지페노사이드(Gypenoside) XVll에 처리하여 TLC로 분석한 결과, 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질이 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 생물전환하는 것을 확인하였다.
구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 진세노사이드(Ginsenoside) F2로 전환시키고, 시간이 지남에 따라 진세노사이드(Ginsenoside) F2를 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 생물전환시키는 것이다.
또한, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 지페노사이드(Gypenoside) XVll에 처리하여 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조할 경우, 상기 처리는 pH 6 내지 9에서 20 내지 40℃의 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
만일, 상기와 같은 pH 및 온도 조건의 범위를 벗어날 경우에는 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질의 활성 및 안정성이 저하되기 때문에 바람직하지 않다. 즉, 당 가수분해 활성이 저해되어 돌외 사포닌에서 인삼 사포닌으로 전환되지 않아 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질의 기능을 상실하게 된다.
또한, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 지페노사이드(Gypenoside) XVll에 처리하여 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조할 경우, 상기 처리는 Co2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, NH4+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온을 추가하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 NH4 + 또는 Mg2 + 금속 이온을 추가하는 것이 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로의 변환율이 가장 높기 때문에 바람직하다.
이를 통해 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)를 대량으로 생산하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 진세노사이드(Ginsenoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 수득된 진세노사이드(Ginsenoside)는 항산화, 항염 및 항주름 효과를 갖는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 미생물의 획득
스크리닝을 통하여, 인삼의 꽃으로부터 지페노사이드(Gypenoside)를 진세노사이드(Ginsenoside)로 전환시킬 수 있는 균주를 분리 및 동정하였으며, 그 중 하나를 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1(수탁번호: KCTC18333P)로 명명하였다. 상기 균주가 지페노사이드(Gypenoside) XVll를 진세노사이드(Ginsenoside) F2로 가수분해하고, 더 나아가 최종적으로는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 가수분해할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 진세노시다제(Ginsenosidase)의 제조
상기 GFC 1 균주의 DNA 서열을 National Center for Biotechnology Information's ORF FINDER로 분석하였다. 예상되는 ORF에 대해 BLAST를 사용하여 진세노시다제(Ginsenosidase)로 추정되는 ORF를 찾아내고, 하기 표 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하였고, PCR의 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 30초 [Denaturation], 60℃에서 30초 [Annealing], 72℃에서 30초 [Extension]로 하여 총 30 사이클을 반복하였다. 이 효소는 글리코시드 하이드로다제 3족(Glycoside hydrolase family 3)에 속하는 효소이고 아미노산 서열은 487개의 잔기를 가지고 있었다.
| 프라이머 | 서열 (5'-3') | 서열번호 |
| 정방향 프라이머 (Gin primer F) |
CGG ATC CAT GTA CAG TAA AGA ATC AAT CAC AG | 3 |
| 역방향 프라이머 (Gin primer R) |
CGA ATC CTT CTA ATG TTT TAC CGT TACT TTC A | 4 |
실시예 3: 재조합 진세노시다제(Ginsenosidase)의 분자 클로닝, 발현 및 정제
상기 실시예 2에서 증폭된 단편을 pMAL-c5X 발현 벡터(입수처: New England Biolabs)에 클로닝을 한 뒤, 재조합 pMAL-c5X를 E.coli BL21(DE3) 세포에 도입하여 형질전환된 균주를 제작하였다. 진세노시다제(Ginsenosidase)를 대량생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 배지가 들어있는 삼각 플라스크에 접종하여 600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 27℃의 진탕 배양기에서 100 rpm으로 종균 배양을 실시하였다. 50mM IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 처리하여 진세노시다제(Ginsenosidase)의 대량 발현을 유도하였다. 균주가 정체기(Stationary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 5000rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 20mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기(Sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물을 다시 9000rpm으로 30분 동안 원심분리하여, 최종적으로 진세노시다제를 생산에 사용할 수 있는 상등액으로부터 획득하였다. 글루타티온 수지(Glutathione Resin)를 이용하여 분리 정제하고 프로테아제에 의해 절단하여 얻은 진세노시다제(Ginsenosidase)를 락토바실러스 카제이 GFC 1 DNA 및 재조합 미생물 파쇄물과 함께 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 약 71.1 kDa의 분자량을 나타내었다(도 1).
또한, 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질의 아미노산 서열을 확인하기 위하여 16S rRNA 유전자의 비율을 분석하였으며, Solgent에 시퀀싱을 의뢰하였다(대전, 대한민국). 16S rRNA 유전자 전장 서열을 SeqMan 소프트웨어(DNASTAR)를 사용하여 수집하였고, NCBI 데이터베이스에서 블라스팅 하여 분류학적으로 연관성 있는 16S rRNA 유전자 서열을 GenBank로부터 수득하였다. 확보된 Nucleotide sequence를 이용하여 Transition 후 아미노산 서열을 확인하였다.
그 결과, 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질의 아미노산 개수는 487개이며, 상기 아미노산 서열을 서열번호 1로 표시하였다.
실시예 4: pH 및 온도에 따른 재조합 진세노시다제(Ginsenosidase) 안정도 측정
pH가 상기 실시예 3의 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 기질은 pNPG(4-Nitrophenyl β-D-glucuronide; Sigma)를 사용하였고, pH는 하기와 같은 버퍼를 사용하여 pH2~10으로 조절하였다.
KCl-HCl(pH2), 글라이신-HCl(pH3), 아세트산 나트륨(pH4 및 pH5), 인산 나트륨 (pH6 및 pH7), Tris-HCl(pH8 및 pH9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH10)
pH가 효소 안정성에 미치는 효과를 측정하기 위하여 30℃의 온도에서 24시간 동안 상기 언급된 각 버퍼에서 효소를 배양한 후, 50mM 칼륨(Potassium) 버퍼 내에서 pNPG를 분석함으로써 pH 변동에 따른 효소 안정성을 측정하였다. 표준 분석 방법에 의해 잔기 활성을 분석하여 최적 pH에서 수득된 활성 확률로서 그 결과를 도 2-A에 나타내었다.
그 결과, 도 2-A에서 확인할 수 있듯이 재조합된 진세노시다제의 안정성 및 활성이 pH 6 내지 9의 범위에서 우수하였고, 보다 바람직하게는 pH 7.0에서 가장 우수한 것을 확인하였다.
또한, 온도가 상기 실시예 3의 진세노시다제 단백질 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. pH 안정도 측정과 마찬가지로 pNPG(4-Nitrophenyl β-D-glucuronide; Sigma)를 기질로 사용하였고, pH는 pH 7.0로 조절하였으며, 20 내지 80℃의 범위에서 30분 동안 인산 칼륨 버퍼 50mM 내 효소 당량을 배양함으로써 온도 안정성 분석을 수행하였다. 표준 분석 방법에 의해 측정된 잔존 활성을 확인함으로써 온도 안정성 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 2-B에 나타내었다.
그 결과, 도 2-B에서 확인할 수 있듯이 재조합된 진세노시다제의 활성 및 열 안정성은 20 내지 40℃의 범위에서 우수하였고, 보다 바람직하게는 28 내지 35℃의 범위에서 우수한 것을 확인하였다.
실시예 5: 금속 처리에 따른 지페노사이드(Gypenoside)에서 진세노시다제(Ginsenosidase)로의 생물전환능 평가
건조된 돌외 전초 5Kg을 유기용매 50% 에탄올로 24시간 동안 환류 추출하여 감압 여과한 후 그 여액을 40℃이하의 수조에서 감압 농축하였고, 이를 2회 반복하여 실시하였다. 농축된 농축물은 농축물 총량의 10배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤, 분획을 실시하였다. 분획은 1차적으로 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate) 용매를 사용하여 비배당체(Aglycon)를 분리시켰다. 남은 물층에 n-부탄올을 사용하여 고순도의 지페노사이드(Gypenoside)가 함유된 분획물을 얻은 후 이를 동결 건조시켜 최종 분말상태의 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더를 제조하였다.
상기 실시예 3의 방법으로 정제된 진세노시다제(Ginsenosidase)를 얻기 전 균주가 정체기(Stationary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 5000rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 20mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기로 파쇄한 뒤, 9000rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액 즉, 진세노시다제(Ginsenosidase)를 얻었으며, 이중 1ml을 취하여 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더 10mg/ml에 처리하고, 성분 변화를 표 2에 나타내었다.
| Converted ginsenosides (mg/ml) | ||||
| Gypenoside XVll | Ginsenoside F2 | Ginsenoside C-K | Total | |
| Ginsenosidase 처리 전 |
10 | - | - | 10 |
| Ginsenosidase 처리 후 |
8.80 | 0.74 | - | 9.54 |
또한, 지페노사이드로부터 진세노사이드로의 생물전환을 향상시키기 위하여 진세노시다제(Ginsenosidase) 10mg/ml와 함께 Co2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, K+, Na+, NH4+ 및 Mg2+과 같은 금속이온을 최종농도가 10uM이 되도록 각각 처리하였다. 처리 후 12시간 뒤의 변화를 TLC 분석을 통해 확인한 결과는 다음 표 3과 같다.
| Metal ions | Production of Ginsenoside F2 | Production of Ginsenoside C-K |
| 실시예 5-1 (Co2+) | (+) | - |
| 실시예 5-2 (Fe3+) | (+) | - |
| 실시예 5-3 (Cu2 +) | (+) | - |
| 실시예 5-4 (Zn2+) | (+) | - |
| 실시예 5-5 (K+) | - | - |
| 실시예 5-6 (Na+) | - | - |
| 실시예 5-7 (NH4+) | ++ | + |
| 실시예 5-8 (Mg2+) | + | ++ |
표 3로부터, 진세노시다제를 단독으로 처리한 것에 비하여, 금속이온 처리시 지페노사이드로부터 진세노사이드로의 생물전환능을 살펴본 결과, K+ 및 Na+를 제외한 Co2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, NH4+ 및 Mg2+ 금속이온을 처리한 실시예 5-1~5-4 및 5-7~5-8의 경우 지페노사이드(Gypenoside) XVll가 진세노사이드(Ginsenoside)로 변환이 향상되었음을 확인하였다. 특히, 실시예 5-7은 진세노사이드(Ginsenoside) F2의 변환이 많이 증가되었고, 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로의 변환도 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 5-8의 경우에는 지페노사이드(Gypenoside) XVll에서 진세노사이드(Ginsenoside) F2로의 변환이 증가되었고, 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)의 변환이 많이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
참고로, 진세노시다제를 단독으로 처리한 것을 기준으로 하여, 지페노사이드로부터 진세노사이드로의 전환율이 30~50% 증가한 것은"++", 5~30% 증가한 것은 "+", 0~5% 증가한 것은 "-"로 표시하였다.
실시예 6: 크로마토그래피(Chromatography)를 통한 Gypenoside XVll 변환 분석
상기 실시예 5-6~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더로부터 각각 제조된 시료 1g에 수포화 부탄올을 5g 첨가하여 혼합한 다음, 부탄올 혼합액의 상등액을 취하여 감압농축을 하였다. 이때, 농축하기 전 부탄올 혼합액에 대한 TLC 분석을 실시하였다(도 3). 계속해서 감압 농축하여 수득된 농축물을 Methanol(HPLC grade)에 용해시킨 후 0.2 ㎛ Membrane filter에 여과하여 HPLC 분석용 시료로 이용하였다. HPLC 분석은 C18 column(250x4.6㎜, ID 5㎛)을 사용하여 UV 203㎚에서 검출하였다. 이동상은 Acetonitrile(Solvent A)과 Water(Solvent B)를 이용하여 Gradient를 주었고, 1.6 ㎖/min 유속으로 분리하였으며, 이동상의 Gradient 조건은 다음 표 4와 같다.
| 시간(min) | Moblie phase | |
| Acetonitrile (solvent A) | Water (solvent B) | |
| 0-5 | 15 | 85 |
| 5-25 | 21 | 79 |
| 25-70 | 58 | 42 |
| 70-82 | 90 | 10 |
| 82-100 | 15 | 85 |
상기 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더의 지페노사이드(Gypenoside) XVll 성분 변화에 대한 결과는 하기 표 5 및 도 4와 같다.
| Converted ginsenosides (mg/ml) | ||||
| Gypenoside XVll | Ginsenoside F2 | Ginsenoside C-K | Total | |
| 지페노사이드 함유 고 분획물 파우더 |
1000 | - | - | 1000 |
| 실시예 5-7의 생성물 |
132 | 542 | 51 | 725 |
| 실시예 5-8의 생성물 |
0 | 690 | 114 | 804 |
그 결과, 상기 표 5 및 도 4에서 확인할 수 있듯이 실시예 5-7의 생성물은 대부분의 지페노사이드(Gypenoside) XVll가 진세노사이드(Ginsenoside) F2로 변환되었고 일부만 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 변환된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 5-8의 생성물의 경우에는 모든 지페노사이드(Gypenoside) XVll가 진세노사이드(Ginsenoside) F2로 변환되었고, 진세노사이드(Ginsenoside) F2가 실시예 5-7의 생성물 보다는 많은 양의 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)로 변환된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 항산화 효능 검증 시험 : DPPH radical 소거 활성
상기 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더의 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성을 통해 항산화 효능 검증을 시험하였다.
자유라디칼은 일반적으로 외부자극에 대한 활성산소가 과잉 생산되어 피부 보습층을 파괴하여 피부를 건조하게하고, 외부 자극에 민감한 면역 반응을 보이는 병리적 인자로 작용하게 된다. 본 발명에 따른 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더의 항산화능은 DPPH 실험을 통해 자유라디컬 소거능 확인이 가능하다.
먼저, 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드 함유 고 분획물 파우더의 시료들을 준비한 후, 이들 시료를 최종 농도가 50ppm이 되도록 처리하여 100μM DPPH(1,1-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 100ul와 혼합하고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96well plate에 담아 DPPH 양을 520nm에서 측정하였다. 그리고 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 1에 의해 시료의 자유라디칼 소거량 (Free radical scavenging activity, %)을 계산하였다. 이때, 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 아스코르빈산(Ascorbic acid) 20uM(최종농도)을 Positve control(양성대조군)으로 설정하였다. DPPH 자유 라디칼 소거능 측정법에 의한 항산화 정도는 수학식 1로 나타내었으며 항산화 효능 결과는 표 6에 나타내었다.
[수학식 1]
자유라디칼소거능(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)]
| 시료 | DPPH radical scavenging (%) |
| Positve control | 76.74±0.34 |
| 지페노사이드 함유 고 분획물 파우더 | 52.1±0.68 |
| 실시예 5-7의 생성물 | 85.3±0.13 |
| 실시예 5-8의 생성물 | 69.1±0.67 |
그 결과, 상기 표 6에서 확인할 수 있듯이 진세노시다제(Ginsenosidase) 처리 전인 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더 대비 진세노시다제(Ginsenosidase) 처리 후의 실시예 5-7~5-8의 생성물에서 높은 항산화 활성을 나타내었다.
실시예 8: 항염증 효능 검증 시험 : Nitric oxide(NO) 생성 저해 활성
상기 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더의 항염증 활성도를 측정하기 위해서 염증 유도반응에 의해 생성되는 Nitric oxide(NO)의 농도를 측정하는 실험을 실시하였다. 염증유발 물질인 LPS(Lipopolysaccharide)로 자극시키면 활성화된 Pathway를 통해 NOS(NO 합성효소)가 NO를 생성한다. 생성된 NO는 세포배양액에 중에 NO2-의 형태로 존재하며 함량은 NO kit(Nitric oxide detection kit, iNtRON 21021, Korea)를 이용하여 측정하였다.
먼저, 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더를 각각 물(DW)로 용해하여 희석하였다. 마우스의 대식세포인 Raw 264.7를 5X105 cells/ml 농도로 96 well plate에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양시켰다. 그 다음에 상기 세포 RAW 264.7에 LPS (sigma) 1.5㎍/mL를 처리하고, 다시 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더를 최종 농도 50ppm에 되도록 처리하여 24시간 동안 배양시켰다.
다음으로 배양액의 상층액과 그리스 시약(griess reagent; Sigma)을 동량으로 반응시킨 후, ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하고, 산화질소 생성율을 백분율로 환산하였다. NO2-는 Nitrite를 표준용액으로 하여 측정하였다. 항염 효과가 있는 것으로 알려진 Dexamethasone 20uM(최종농도)을 Positve control(양성대조군)로 설정하고, Negative control(음성대조군)로서 사용한 물은 처리한 시료와 동일한 양으로 처리한 후 NO2- 생성 농도를 비교하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
| 시료 | NO Production(μM) |
| Positve control | 17±0.15 |
| Negative control | 62±0.21 |
| 지페노사이드 함유 고 분획물 파우더 | 39±0.24 |
| 실시예 5-7의 생성물 | 11±0.36 |
| 실시예 5-8의 생성물 | 8±1.01 |
그 결과, 상기 표 7에서 확인할 수 있듯이 실시예 5-7~5-8의 생성물은 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더에 비해 적은 양의 NO 생성물을 만들며 이는 그만큼 NO 생성 저해 효과가 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예 9: 주름개선 효능 검증 시험 : MMP-1 억제 활성
상기 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더의 MMP-1(Matrix Metallo peptidase-1) 억제 활성을 측정하였다.
인체 섬유아세포(HDF)를 6-well plate의 각 웰(well)에 18X105 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 인산염 완충액(Phosphate buffered saline, PBS)을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 피부노화를 유발하기 위하여 자외선을 조사하였다. 이때, 자외선은 자외선 A 램프(Sankyo Denki FL8BL lamp, Sankyo Denki Co., Japan)를 이용하여 1초당 27mW/㎠의 에너지 양으로 총 50mJ/㎠를 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산염 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에 실시예 5-7~5-8의 생성물 및 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더를 최종농도 50ppm이 되도록 처리하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 피부노화 여부를 확인하기 위하여 피부 세포 간 기질 구성성분인 타입 I 프로콜라겐(type I procollagen)의 분해효소인 MMP-1의 발현정도를 MMP-1 ELISA 키트(MMP-1 human, ELISA system, Biotrak Assay, Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. MMP-1의 농도는 총 세포 배양액 1㎖ 당 단백질 ㎎으로 나타냈으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다. 이때 사용된 Positive control(양성대조군)은 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 사용하였고, Negative control(음성대조군)은 물을 사용하였다.
| 시료 | MMP-1 inhibition (%) |
| Positive control | 76.0±0.66 |
| Negative control | 27.0±0.57 |
| 지페노사이드 함유 고 분획물 파우더 | 29.0±0.84 |
| 실시예 5-7 | 71.0±1.75 |
| 실시예 5-8 | 80.5±0.59 |
그 결과, 상기 표 8에서 확인할 수 있듯이 인간 섬유아세포에 자외선을 조사하는 경우(자외선 단독 처리군) 지페노사이드(Gypenoside) 함유 고 분획물 파우더 대비 실시예 5-7~5-8에서 MMP-1의 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 5-8을 처리한 경우 월등히 높은 MMP-1의 발현 감소를 나타내어 피부 주름개선 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GFC CO., LTD.
<120> NOVEL GINSENOSIDASE PROTEIN AND USE THEREOF
<130> P17012
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 487
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ginsenosidase
<400> 1
Met Tyr Ser Lys Glu Ser Ile Thr Gly Phe Pro Lys Asp Phe Leu Trp
1 5 10 15
Gly Gly Ala Thr Ala Ala Asn Gln Ile Glu Gly Ala Trp Gln Val Asp
20 25 30
Gly Lys Gly Leu Thr Thr Ala Glu Val Val Arg Lys Ala Glu Asp Arg
35 40 45
Arg His Gly Ser Met Gly Asp Val Asn Ala Asp Thr Leu Gln Glu Ala
50 55 60
Ile Ala Asp His Ser Asp Val His Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Val Asp
65 70 75 80
Phe Tyr His His Tyr Lys Glu Asp Ile Ala Leu Phe Ala Glu Met Gly
85 90 95
Phe Lys Val Phe Arg Leu Ser Ile Ala Trp Ser Arg Ile Phe Pro Thr
100 105 110
Gly Leu Glu Glu Asn Pro Asn Glu Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Asp Arg
115 120 125
Val Phe Asp Glu Leu Asp Arg Tyr His Ile Glu Pro Leu Val Thr Leu
130 135 140
Ser His Tyr Glu Met Pro Ile Glu Leu Thr Lys Arg Tyr Asn Gly Trp
145 150 155 160
Leu Asp Arg Glu Val Ile Lys Ala Phe Asn His Tyr Thr Glu Thr Val
165 170 175
Phe Lys Arg Tyr Lys Asp Arg Val Lys Tyr Trp Leu Thr Phe Asn Glu
180 185 190
Ile Asn Thr Ser Ala Trp Gly Phe His Glu Thr Gly Ala Met Asp Gly
195 200 205
Asp Leu Ser Thr Gln Glu Gln Leu Gln Val Arg Tyr Gln Ala Val His
210 215 220
His Gln Phe Val Ala Ser Ala Ile Ala Thr Lys Gln Leu Lys Glu Ile
225 230 235 240
Ala Pro Asn Ala Lys Ile Gly Ser Met Leu Ala Arg Met Gln Thr Tyr
245 250 255
Pro Ala Thr Ala Asn Pro Val Asp Val Gln Ala Ala Gln Val Glu Asp
260 265 270
Gln Lys Asn Leu Phe Tyr Thr Asp Val Gln Ala Arg Gly Glu Tyr Pro
275 280 285
Glu Tyr Met Asn Arg Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Ile Val Ile Asn Met
290 295 300
Ser Ala Asp Asp Glu Lys Ile Leu Lys Gln Tyr Pro Val Asp Phe Ile
305 310 315 320
Ser Phe Ser Tyr Tyr Met Thr Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Asp Gly Ile Gly Asn Met Ser Leu Gly Gly Arg Asn Pro Tyr Leu Lys
340 345 350
Glu Ser Glu Trp Gly Trp Gln Ile Asp Pro Ile Gly Leu Arg Val Ser
355 360 365
Leu Asn Val Leu Trp Asp Arg Tyr Arg Lys Pro Leu Phe Ile Val Glu
370 375 380
Asn Gly Leu Gly Ala Val Asp Glu Leu Thr Ala Asp Tyr Lys Val His
385 390 395 400
Asp Asp Tyr Arg Ile Asp Tyr Leu Arg Leu His Ile Glu Gln Met Lys
405 410 415
Glu Ala Val Ile Asp Gly Val Asp Leu Met Gly Tyr Thr Met Trp Ala
420 425 430
Pro Leu Asp Ile Ile Ser Phe Ser Thr Ser Glu Met Ser Lys Arg Tyr
435 440 445
Gly Leu Ile Tyr Val Asp Gln Asp Asp Ala Gly Asn Gly Thr Leu Lys
450 455 460
Arg Tyr Lys Lys Asp Ser Phe Phe Trp Tyr Gln Lys Val Ile Glu Ser
465 470 475 480
Asn Gly Lys Thr Leu Glu ***
485
<210> 2
<211> 1461
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ginsenosidase
<400> 2
atgtacagta aagaatcaat cacaggcttt ccaaaggact ttttatgggg tggcgcaact 60
gctgctaatc aaattgaagg ggcgtggcaa gtagatggga agggcttaac aacagctgaa 120
gtcgtacgta aagctgaaga ccgacgtcac ggttcaatgg gagatgttaa cgcagatacc 180
ttacaagaag ctatcgccga tcattcggat gtacattatc caaaacgtcg tggagttgat 240
ttttatcatc actacaaaga agatattgca ctatttgcag aaatgggttt taaagtattt 300
cgactttcaa tcgcttggtc acgtattttt ccaactggtt tagaagaaaa tccaaatgag 360
gctgggttag ctttttatga ccgagtattt gatgaactag atagatacca tattgaacca 420
ctcgtgactc tttcacatta tgagatgcca attgaactaa cgaagcgtta caatggttgg 480
ttggaccgtg aggtcatcaa ggcattcaat cactatacag aaactgtttt taaaagatac 540
aaggaccgag ttaagtactg gttgacattc aatgaaatta atactagtgc ttggggattt 600
catgaaactg gcgctatgga tggtgattta agtacgcaag aacagttgca agtgcgctat 660
caggcagttc atcatcaatt tgttgccagc gctattgcga caaagcaatt aaaggaaatt 720
gcgcccaacg ccaaaattgg ttcaatgtta gctcgcatgc aaacgtatcc agcaacagca 780
aacccggttg atgtgcaagc agcacaagtt gaagatcaga aaaatttgtt ttatacggat 840
gtccaagcac gaggtgaata tccagaatac atgaatcgat atttcaatga aaatggtatc 900
gttattaata tgtctgctga tgatgaaaaa attttgaaac agtatccggt tgattttatt 960
agtttcagtt attatatgac caacgtgaca ggagtagatg gtgttgaaga cgggattggt 1020
aatatgagtt tgggtggtcg taatccctat ttgaaggaat cagaatgggg atggcaaatc 1080
gacccaatcg gcttgcgagt ttctctgaat gtcctgtggg atcgttaccg taaaccatta 1140
tttattgttg aaaatggctt aggagcagtt gacgaattaa cagcagatta caaagtacac 1200
gatgattatc gtattgacta ccttcgtttg cacattgagc aaatgaaaga ggctgtgatt 1260
gatggcgttg acttaatggg ctacacaatg tgggcaccac tagatattat tagttttagt 1320
acttctgaga tgagtaagcg ttatggcttg atttacgtag atcaagatga cgcaggaaat 1380
ggcacattaa agcgttacaa aaaggattcg ttcttctggt atcaaaaagt tattgaaagt 1440
aacggtaaaa cattagaata a 1461
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gin primer F
<400> 3
cggatccatg tacagtaaag aatcaatcac ag 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gin primer R
<400> 4
cgaatccttc taatgtttta ccgttacttt ca 32
Claims (12)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) GFC 1 균주(수탁번호: KCTC18333P)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질.
- 제1항의 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 코딩하는 핵산.
- 제3항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제3항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
- 제1항의 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질을 지페노사이드(Gypenoside) XVll에 처리하여 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 처리는 pH 6 내지 9에서 20 내지 40℃의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 처리는 Co2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, NH4+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온을 추가하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 처리는 NH4+ 또는 Mg2+ 금속 이온을 추가하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 진세노사이드(Ginsenoside)는 진세노사이드(Ginsenoside) F2 또는 진세노사이드(Ginsenoside) Compound K(C-K)인 것을 특징으로 하는 진세노사이드(Ginsenoside)를 제조하는 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 진세노사이드(Ginsenoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 진세노사이드(Ginsenoside)는 항산화, 항염 및 항주름 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
Priority Applications (1)
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| KR1020170032402A KR20180105387A (ko) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 신규한 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR20180105387A true KR20180105387A (ko) | 2018-09-28 |
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ID=63721263
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| KR1020170032402A Ceased KR20180105387A (ko) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 신규한 진세노시다제(Ginsenosidase) 단백질 및 이의 용도 |
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| KR (1) | KR20180105387A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112592912A (zh) * | 2021-01-07 | 2021-04-02 | 云南与诺生物工程有限责任公司 | 糖苷酶及其编码基因和它们的应用 |
-
2017
- 2017-03-15 KR KR1020170032402A patent/KR20180105387A/ko not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112592912A (zh) * | 2021-01-07 | 2021-04-02 | 云南与诺生物工程有限责任公司 | 糖苷酶及其编码基因和它们的应用 |
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Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20170315 |
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20180605 Patent event code: PE09021S01D |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
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Patent event date: 20190103 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20180605 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |