KR20140080282A

KR20140080282A - Ｄ-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 과당으로부터 사이코스의 제조방법

Info

Publication number: KR20140080282A
Application number: KR1020120149908A
Authority: KR
Inventors: 김민정; 최정윤; 허진솔; 김혜정; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-06-30

Abstract

본 발명은 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques) 유래의 사이코스 3-에피머화 효소를 포함하는 사이코스 제조용 조성물, 및 상기 효소를 이용한 사이코스 제조방법에 관한 것이다.

Description

Ｄ-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 과당으로부터 사이코스의 제조방법 {Method for preparing psicose from fructose by using D-psicose 3-epimerase}

일반적으로 사이코스(psicose)는 과당(D-fructose)의 에피머로 과당과 비교할 때 감미의 강도와 종류에 있어서 거의 유사하다. 그러나 과당과 달리 체내 흡수 시 거의 대사되지 않으며, 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식품 또는 수신용 음식품 등에 사용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부지방 축적 억제를 할 수 있으므로 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.

따라서 사이코스는 다이어트 감미료로서 각광을 받고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 제조하는 기술의 개발이 필요하다.

종래의 사이코스 제조 방법은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 것이었다. 그러나 화학적 합성에 의할 경우, 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 과정 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 단점이 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 과당을 기질로 하여 효소 반응에 의하여 사이코스를 제조하는 생물학적 방법이 연구되고 있다. 그러나 기존의 기능이 밝혀진 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 효소들이 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타내는 경우가 많은데, 알칼리 조건 하에서의 반응은 비특이적 반응과 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않다. 또한 기존의 효소들은 높은 온도에서 안정성이 떨어지거나 느린 반응 속도로 인해 산업화에 적용되는 사이코스 생산의 제조원가가 상승되는 있는 문제가 있었다. 그러므로 사이코스의 생산 수율, 온도, pH 및 반응 속도 모두가 산업화에 적합한 신규한 D-사이코스 3-에피머화 효소 개발이 요구된다.

이에, 본 발명은 종래에 기능이 밝혀지지 않은 단백질로서, D-사이코스 3-에피머화 효소 활성을 가지며 고수율로 사이코스를 제조할 수 있는 신규한 효소 단백질, 이를 암호화하는 유전자 및 이를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 D-사이코스 3-에피머화 효소 활성을 가지는 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 균주를 포함하는, 과당으로부터 사이코스의 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 비 병원성인 루미노코코스 속, 크로스트리디움 속, 트레포네마 속, 파라코코스 속, 시트레이셀라 속, 시노리조비움 속에 포함되는 미생물을 대상으로, 그 기능이 밝혀지지 않은 폴리뉴클레오티드 중에서, 아그로박테리움 투메패시엔스 또는 로도박터 스페로이데스 유래의 효소와 촉매활성 잔기는 일치하지만 전체 아미노산 서열은 40~60% 정도의 상동성이 있는 케토오스 3-에피머화 효소를 스크리닝하였다. 그 결과 루미노코코스 토르크가 가지고 있는 유전자 중에서 과당을 사이코스로 전환할 수 있는 효소를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 최초로 밝힐 수 있었으며, 이에 따라 단백질의 효과적인 과발현을 위하여 최적화 한 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하고 이를 재조합 벡터에 삽입하고 발현시켜 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 갖는 효소를 확보함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 과당을 사이코스로 전환시키는 D-사이코스 3-에피머화 효소 활성을 가지는 단백질에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 균주를 포함하는, 과당으로부터 사이코스의 제조용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

바람직한 일 예로, 본 발명은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질을 제공한다. 바람직하게, 상기 단백질은 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 유래한, 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 효소 단백질은 생화학적 기능 및 유전자 염기서열의 특성이 알려지지 않았었으나, 본 발명자들이 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 갖는 효소를 스크리닝 하는 과정에서, 상기 효소가 과당의 3번째 탄소 위치에서 에피머화 반응을 일으켜 과당을 사이코스로 전환 할 수 있는 기능을 가짐을 발견하게 되었다. 따라서 바람직하게, 상기 효소 단백질은 과당의 3번 탄소 위치를 에피머화 함으로써 과당을 사이코스로 전환하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 효소 단백질은, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지되는 한, 이에 한정되지 않고 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 또는 소실된 경우 등을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 최소한 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 32 내지 34 kDa 일 수 있고, 최적 온도는 바람직하게는 pH 7에서 30분간 반응 진행 시 50 내지 65℃ 일 수 있다. 최적 pH가 6.0 내지 9.0일 수 있다.

따라서, 바람직하게 본 발명에서 제공하는 효소 단백질은 다음과 같은 특성을 보유할 수 있다:

(a) 분자량이 32 내지 34 kDa;

(b) 최적 활성 온도가 50 내지 65℃; 및

(c) 최적 활성 pH가 pH7.0 내지 9.0.

본 발명의 바람직한 다른 예는, 상기 효소 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주를 제공한다.

상기 효소 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는, 서열번호 2 또는 최적화된 서열인 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 것일 수 있으나, 상기한 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 그 서열을 분석한 경우, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 상동성이 있는 염기 서열을 포함한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등에 의해 본 발명에 따른 유전자의 하나 또는 그 이상의 염기 서열을 용이하게 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 상동성을 갖는 범위 내에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 용이하게 제조할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 유전자는 그 자체로, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 목적한 유전자의 염기 서열과, 상기 유전자 염기 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열이 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 적정 염기 서열은 프로모터 및 전사 종결인자로 이루어지는 하나 이상의 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론 및 T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위 한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니며, 발현 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하다. 바람직하게는 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등을 사용할 수 있다.

상기 재조합 벡터를 형질전환 시킬 수 있는 균주는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이용할 수 있다. 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있으며, 상기 대장균은 BL21, JM109, RR1, LE392, K-12, DH5α 또는 W3110 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는, BL21(DE3) 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사 속 균, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등을 사용할 수 있다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 구현예는, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주를 포함하는, 과당으로부터 사이코스의 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 예는, 상기 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 제공한다.

바람직한 일 구현예로, 상기 사이코스의 제조 방법은, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 준비 및 정제하는 단계; 및 상기 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

바람직한 다른 일 구현예로, 상기 사이코스의 제조 방법은, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양하는 단계; 및 상기 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양 단계는 사용되는 균주의 특성에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배지로서는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등이 될 수 있다. 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 회분식 배양일 수 있다.

재조합 균주의 배양물은 일반적으로 균주, 예컨대 대장균을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 35℃ 내지 37℃에서 상기 재조합 미생물을 150 내지 250rpm에서 진 배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한 바람직하게는 효소 단백질의 발현을 유도하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용하는 유도 물질을 첨가할 수 있다. 상기 유도 물질의 첨가는 선택되는 유도 요소에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 유도 요소가 lac 오페론 또는 trc 포로모터인 경우, IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토티오피라노시드)일 수 있다. 상기 유도는 당업자에 의하여 배양의 적절한 시기에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 유도는 세포 성장이 충분히 이루어진 후 이루어지는 것일 수 있으며, 바람직하게는 지연기 (lag phase), 지수기 (exponential phase), 정체기 (stantionary phase) 및 사멸기 (death phase)로 이루어지는 세포 성장기 중 지수기 초반 내지 중반에 이루어지는 것일 수 있다.

상기 균주는 균주 배양물에 대해 원심분리, 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균주를 균질화시키고 원심 분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 분리 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다. 예컨대, 회수된 균주를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 니켈-NTA 컬럼(Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 250mM 이미다졸의 농도로 효소 단백질을 회수할 수 있다.

효소 단백질을 발현하는 재조합 균주 자체를 사이코스 전환 반응에 사용하는 경우, 재조합 균주는 원하는 농도 예를 들면, 고농도로 농축된 상태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 균주는 고농도로 과당을 포함하는 배지 중에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 배지에서 OD₆₀₀ 이 0.05 내지 50, 예를 들면 5 내지 50, 10 내지 50, 20 내지 50, 또는 20 내지 40이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 대장균을 사용함으로써 배지 중에서 고농도로 과당이 포함된 배지에서 효율적으로 과당을 사이코로스로 전환할 수 있다.

또한, 상기 과당과 반응시키는 단계는 바람직하게는 본 발명의 효소 단백질의 최적 활성화 조건 하에 이루어질 수 있다. 즉, 바람직하게는 pH 6.0 내지 9.0, 보다 바람직하게는 pH7.0 내지 9.0 에서 이루어질 수 있으며, 또한 바람직하게는 50℃ 내지 65℃의 온도 조건하에 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배지로서는 LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등을 사용할 수 있고, 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 뱃치 (batch) 형식 배양일 수 있다. 바람직하게는 상기 과당은 5 내지 60%(w/v), 보다 바람직하게는 10 내지 40%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다. 상기 범위로 과당을 사용함으로써 보다 경제적이며 효율적으로 사이코스를 생산할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 D-사이코스 3-에피머화 효소는 과당의 3번째 탄소 위치를 에피머화하여 사이코스를 생산하는 활성을 보유한 효소로써, 높은 수율로 과당으로부터 사이코스의 제조가 가능하므로 사이코스의 산업적 이용에 유용하다.

도 1은 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 상기 벡터로 형질전환된 균주로부터 효소 단백질을 정제한 후SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질의 온도에 따른 활성(과당 기질로부터 사이코스의 전환율)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질의 pH에 따른 활성(과당 기질로부터 사이코스의 전환율)을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시 예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주의 제조

발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques) 로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.

합성된 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pET21a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a/사이코스 3-에피머화 효소(pET-RTPE)를 제조하였다 (도 1). 상기 재조합 벡터를 heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다.

형질 전환된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종, 37℃의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 1mM의 IPTG를 첨가하여 목적 효소의 과 발현을 유도하였다. 이때 과 발현 유도시점부터 배양조건은 16℃, 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.

이후 원심분리기 4000rpm에서 20분간 원심 분리하여 균체만을 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다.

실시예 2. D- 사이코스 3- 에피머화 효소 정제 및 특성 확인

2-1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 정제

상기 실시예 1에서 회수된 균체를 lysis buffer(50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 10 mM imidazol)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 파쇄액을 13000rpm에서 20분 동안 원심 분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni- NTA컬럼(Ni-NTA Superflow. Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0에 20 mM imidazol과 250 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려 주었다. 마지막 과정인 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 250 mM imidazol을 흘려 줌으로써 목적 단백질을 정제하였다. 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50mM PIPES pH7.0)으로 전환한 다음 실험에 사용하였다. 또한 부분 정제된 D-사이코스 3-에피머화 효소는 SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 33.2 kDa인 것을 확인하였다 (도 2).

2-2. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성 분석

pH 및 온도변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 과당 기질을 반응시키고 활성을 확인하였다. 먼저 온도 30-80℃까지 측정해본 결과, 상기 효소는 50 내지 65℃ 범위에서 높은 전환율을 나타냈으며, 특히 60℃에서 최대 전환율을 보임을 알 수 있었다 (도 3).

또한 pH 변화에 따른 활성을 알아보기 위해, 60℃에서 50mM sodium acetate pH4-6, 50 mM sodium citrate pH5-7, 50mM PIPES pH7, 50 mM Tris-HCl pH7-9, 50 mM glycine NaOH pH9-10의 완충용액을 각각 사용하여, 최대 활성을 나타내는 pH를 살펴본 결과, pH7.0-9.0 범위, 그 중 pH7.0에서 활성이 특히 높게 나타났다. 또한 pH7.0에 해당되는 완충용액 중에서도 PIPES 완충용액에서 활성이 최대로 나타나 해당 완충용액에서 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다 (도 4).

이 때 활성측정은 50 mM 과당, 효소 0.5 mg/ml으로 각각의 pH 와 온도 범위에서 이루어졌으며, 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 중지시켰다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Method for preparing psicose from fructose by using D-psicose-3-epimerase <130> DPP20128679KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Ruminococcus torques <400> 1 Met Lys Met Lys Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Tyr Trp Gly Thr Lys Trp 1 5 10 15 Gln Cys Asp Tyr Leu Lys Thr Leu Lys Arg Val Ser Asp Ile Gly Phe 20 25 30 Asp Ile Leu Glu Met Gly Ala Pro His Leu Leu Glu Met Ser Asp Tyr 35 40 45 Glu Leu Ser Glu Leu Arg Arg Ala Ala Lys Asp Met Asp Met Val Leu 50 55 60 Thr Ala Asn Ile Gly Pro Ala Lys Asp Lys Asp Leu Ala Ser Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asp Ile Arg Lys Ala Gly Val Asn Tyr Leu Ile Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Ala Met Glu Lys Val Gly Ser Lys Ser Leu Val Gly Ala Met Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Cys Gln Phe Glu Ile Thr Asp Lys Glu Ala Ala Trp Glu 115 120 125 Arg Ser Ile Glu Gly Met Lys Glu Val Ala Glu Ala Ala Glu Ser Leu 130 135 140 Gly Ile Glu Cys Cys Gln Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Thr Tyr Ile 145 150 155 160 Ile Thr Asp Cys Arg Glu Gly Leu Glu Tyr Cys Arg Arg Val Gly Ser 165 170 175 Glu Asn Val Asn Leu Leu Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu 180 185 190 Asp Asn Ile Pro Glu Ala Ile Arg Leu Ala Gly Arg Lys Leu Gly His 195 200 205 Leu His Val Gly Glu Ser Asn Arg Lys Leu Pro Gly Met Gly Ser Leu 210 215 220 Pro Trp Arg Asp Ile Gly Arg Ala Leu Arg Asp Ile Gly Tyr Glu Lys 225 230 235 240 Gly Val Val Met Glu Pro Phe Leu Leu Gln Gly Gly Glu Val Ala Arg 245 250 255 Asp Cys Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Asn Ala Asp Glu Lys Met 260 265 270 Leu Asp Arg Tyr Ile Lys Glu Ser Leu Thr Phe Leu Lys His Glu Phe 275 280 285 Thr Phe 290 <210> 2 <211> 873 <212> DNA <213> Ruminococcus torques <400> 2 atgaaaatga aattcggtac cctgtactct tactggggta ccaaatggca gtgcgactac 60 ctgaaaaccc tgaaacgtgt ttctgacatc ggtttcgaca tcctggaaat gggtgcgccg 120 cacctgctgg aaatgtctga ctacgaactg tctgaactgc gtcgtgcggc gaaagacatg 180 gacatggttc tgaccgcgaa catcggtccg gcgaaagaca aagacctggc gtctccggac 240 ccggacatcc gtaaagcggg tgttaactac ctgatcgaca tcctgaaagc gatggaaaaa 300 gttggttcta aatctctggt tggtgcgatg tactcttact ggccgtgcca gttcgaaatc 360 accgacaaag aagcggcgtg ggaacgttct atcgaaggta tgaaagaagt tgcggaagcg 420 gcggaatctc tgggtatcga atgctgccag gaagttctga accgttacga aacctacatc 480 atcaccgact gccgtgaagg tctggaatac tgccgtcgtg ttggttctga aaacgttaac 540 ctgctgctgg acaccttcca catgaacatc gaagaagaca acatcccgga agcgatccgt 600 ctggcgggtc gtaaactggg tcacctgcac gttggtgaat ctaaccgtaa actgccgggt 660 atgggttctc tgccgtggcg tgacatcggt cgtgcgctgc gtgacatcgg ttacgaaaaa 720 ggtgttgtta tggaaccgtt cctgctgcag ggtggtgaag ttgcgcgtga ctgcaaagtt 780 tggcgtgacc tgtctggtaa cgcggacgaa aaaatgctgg accgttacat caaagaatct 840 ctgaccttcc tgaaacacga attcaccttc tga 873 <210> 3 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized gene sequence <400> 3 atgaagatga aatttggaac attatattct tattggggaa caaaatggca atgtgattat 60 ttgaaaacat taaaacgagt ttcagacatc ggatttgaca ttttggaaat gggtgctcct 120 cacttgttgg aaatgtcaga ttatgaactt tcagaattga ggcgcgcggc gaaagatatg 180 gatatggtat tgacggcaaa tatcggaccg gcaaaagata aagatcttgc ttctcctgat 240 ccggatatac gaaaagcggg agtaaactat ttgatcgata tattaaaagc aatggaaaaa 300 gtaggatcta aatcacttgt tggagcaatg tattcttatt ggccgtgtca atttgaaata 360 acggataagg aagctgcctg ggagagaagc atcgagggga tgaaagaggt tgcagaagct 420 gcggaatcat tgggaatcga atgctgtcag gaagttttga atcgatatga aacttatatt 480 atcacagatt gcagggaagg attggaatac tgcaggagag tcggaagtga aaacgttaat 540 ctccttcttg atacatttca tatgaatatc gaagaagata atattccgga ggctatccgg 600 cttgcaggaa gaaaattggg ccatctgcat gtgggagaat caaacagaaa gcttccggga 660 atgggatccc ttccttggag agatatcgga cgggcgctaa gagatatcgg atatgagaaa 720 ggcgtcgtta tggaaccgtt tcttcttcaa ggaggagagg tcgctcggga ctgtaaagtg 780 tggagagatt taagtgggaa tgcagatgag aaaatgctgg atcgctatat aaaagaatct 840 ttaacatttt tgaaacatga atttacgttt tga 873

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 균주를 포함하는, 과당으로부터 사이코스의 제조용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 과당의 3번 탄소 위치를 에피머화하여 사이코스로 전환하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques) 로부터 유래된 효소 단백질인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열 지도를 가지는 재조합 벡터인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 다음의 특징을 가지는 것인 조성물 :
(a) 분자량이 32 내지 34 kDa;
(b) 최적 활성 온도가 50 내지 65℃; 및
(c) 최적 활성 pH가 pH7.0 내지 9.0.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 반응은 50 내지 65℃ 에서 이루어지는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 반응은 pH7.0 내지 9.0 에서 이루어지는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 과당은 5 내지 60%(w/v)의 농도인 방법.