KR20140074407A - Method for extracting nucleic acid using carbon nanotubes coating magnetite particles - Google Patents
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Abstract
본 발명은 양전하-음전하의 결합 원리를 이용하여 핵산의 추출시간 감소와 회수율을 향상시키는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산 추출방법을 개시한다. 이를 위하여, 본 발명은 핵산을 포함하는 시료와 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브가 포함된 CNT 분산액을 혼합하고, 이를 반응시키는 단계와, 상기 시료와 CNT 분산액의 혼합물에 자기장을 적용하여 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브와 핵산의 결합체를 분리하는 단계, 및 상기 결합체에 DNA 용출 시약을 첨가하여 핵산을 회수하는 단계를 포함하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 전통적인 유기용매 추출방법과 달리 페놀을 이용하지 않기 때문에 인체에 해롭지 않고, 환경오염 등의 문제가 최소화되며, 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득률이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 다량으로 확보할 수 있다.Disclosed is a nucleic acid extraction method using carbon nanotubes coated with magnetite particles, which improves the extraction time and recovery rate of nucleic acid by using the principle of positive charge-negative charge coupling. In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a CNT dispersion, comprising the steps of: mixing a sample containing a nucleic acid and a CNT dispersion containing carbon nanotubes coated with magnetite particles and reacting the mixture; and applying a magnetic field to the mixture of the sample and the CNT dispersion, There is provided a method of extracting nucleic acid using a carbon nanotube coated with a magnetite particle comprising the steps of: separating a coated carbon nanotube and a nucleic acid binding substance; and recovering the nucleic acid by adding a DNA eluting reagent to the binding substance. According to the present invention, unlike the conventional organic solvent extraction method, since phenol is not used, the problems such as environmental pollution are minimized, harmful to the human body is minimized, and the binding property to the target DNA and the yield of DNA are high, It can be secured in a large amount.
Description
본 발명은 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산 추출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 양전하-음전하의 결합 원리를 이용하여 핵산의 추출시간 감소와 회수율을 향상시키는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산 추출방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a nucleic acid extraction method using carbon nanotubes coated with magnetite particles, and more particularly, to a carbon nanotube-coated carbon nanotube that improves nucleic acid extraction time and recovery rate by using the principle of positive charge- To a nucleic acid extraction method using a tube.
나노기술은 원자 또는 분자들을 적절히 결합시킴으로써 기존 물질의 특성 개선은 물론 신물질, 신소자 창출에 더욱 적합하여 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지, 환경 등 매우 다양하다.Nanotechnology is suitable for the creation of new materials and new devices, as well as improving the properties of existing materials by appropriately bonding atoms or molecules, and its applications range from electronics, materials, communication, machinery, medicine, agriculture, energy and environment.
이상과 같이 나노기술은 다양하게 발전하고 있으며 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다. As described above, nanotechnology is developing in various ways and classified into three major fields.
첫째, 나노 소재로 미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노소자인데 나노 크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노-바이오라 불리는 나노기술을 생명공학에 응용하는 기술에 관한 것이다.First, it relates to a technique for synthesizing new materials and materials of a minute size with a nanomaterial. Secondly, the present invention relates to a technique for fabricating a device exhibiting a certain function by combining or arranging nano-sized materials. Third, it relates to the application of nanotechnology, called nano-bio, to biotechnology.
특히, 나노-바이오 분야에서 나노입자들은 암세포 특이적 살상, 면역반응의 부스팅(boosting), 세포 융합, 유전자 또는 약물 전달, 진단 등에 이용되고 있다. 이러한 나노입자들이 전술한 용도에 이용되기 위해서는 상응하는 활성성분을 부착할 수 있는 부분을 구비해야할 뿐만 아니라 생체 내 즉, 수용성 환경에서 운반 및 분산되어야 한다. 이러한 조건을 만족시키기 위하여 현재까지 다양한 기술들이 개발되어져 왔다.Particularly, in the nano-bio field, nanoparticles are used for cancer cell-specific killing, boosting of immune response, cell fusion, gene or drug delivery, and diagnosis. Such nanoparticles need not only have a portion capable of attaching the corresponding active ingredient, but also be transported and dispersed in vivo, that is, in an aqueous environment, in order to be used for the above-mentioned uses. Various techniques have been developed so far to satisfy these conditions.
예를 들면, 대한민국 등록특허 제10-0538767호는 γ-Fe2O3 및 테트라에톡시실란[TEOS; Si(OC2H4)4]을 사용하여 제조되는 실리카가 코팅된 성질자성 나노입자의 제조방법을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 발명은 DNA를 선택적으로 분리하기 위한 기술이 아니라 단백질을 분리 정제하기 위한 것이다. For example, Korean Patent Registration No. 10-0538767 discloses a method for producing a ferroelectric film using γ-Fe 2 O 3 and tetraethoxysilane [TEOS; Si (OC 2 H 4 ) 4 ], which is a method of producing silica-coated magnetic nano-particles. However, this invention is not a technique for selectively separating DNA but for separating and purifying proteins.
또한, 미국특허공보 US 6,638,494호는 산화철과 같은 금속을 포함한 자성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노입자의 표면에 특정한 카르복실산을 부착하여 중력 또는 자기장에서 나노입자가 응집 및 침전되는 것을 방지하는 방법을 개시하고 있다. 이때, 특정한 카르복실산으로는 말레산, 타르타르산, 글루카르산과 같은 지방족 디카르복실산 또는 시트르산, 시클로헥산,트리카르복실산과 같은 지방족 폴리디카르복실산이 이용되었다.U.S. Patent No. 6,638,494 relates to a magnetic nanoparticle including a metal such as iron oxide, and a method of attaching a specific carboxylic acid to the surface of the nanoparticle to prevent aggregation and precipitation of the nanoparticle in gravity or magnetic field Lt; / RTI > At this time, as specific carboxylic acids, aliphatic dicarboxylic acids such as maleic acid, tartaric acid, and glucaric acid or aliphatic polydicarboxylic acids such as citric acid, cyclohexane, and tricarboxylic acid have been used.
그러나 상기 방법은 나노입자를 수용액에서 합성하는데 이 경우 나노입자의 크기 조절이 어렵고, 합성된 나노입자가 크기가 불균일하다는 문제점이 있다. 또한, 상기 나노입자의 표면은 단분자 계면안정제로 코팅되어 있어 나노입자와의 결합력이 크지 않기 때문에 수용액에서 안정성이 떨어진다는 문제점이 있다. However, in the above method, the nanoparticles are synthesized in an aqueous solution. In this case, it is difficult to control the size of the nanoparticles and the size of the synthesized nanoparticles is uneven. In addition, since the surface of the nanoparticles is coated with a monomolecular interface stabilizer, there is a problem that stability in an aqueous solution is inferior because the bonding force with the nanoparticles is not large.
이에 따라, DNA, RNA 등을 선택적으로 분리할 수 있으며 고 순도로 정제가 가능한 기술의 개발이 요구되고 있다.
Accordingly, development of a technology capable of selectively separating DNA, RNA, and the like and purification with high purity has been demanded.
따라서 본 발명의 목적은 원심분리기를 이용하지 않고도 세포 내의 핵산을 고 순도와 고 용량으로 분리하여 정제할 수 있는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법을 제공하는데 있다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a nucleic acid extraction method using carbon nanotubes coated with magnetite particles, which can separate and purify nucleic acids in cells with high purity and high capacity without using a centrifuge.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산을 포함하는 시료와 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브가 포함된 CNT 분산액을 혼합하고, 이를 반응시키는 단계와, 상기 시료와 CNT 분산액의 혼합물에 자기장을 적용하여 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브와 핵산의 결합체를 분리하는 단계, 및 상기 결합체에 DNA 용출 시약을 첨가하여 핵산을 회수하는 단계를 포함하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법을 제공한다.
In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for producing a CNT dispersion, comprising the steps of mixing a sample containing a nucleic acid and a CNT dispersion containing carbon nanotubes coated with magnetite particles, Applying a magnetic field to the carbon nanotube-coated carbon nanotubes to separate the carbon nanotubes coated with the magnetite particles and a nucleic acid-binding substance, and adding a DNA eluting reagent to the binding substance to recover the nucleic acid. And a nucleic acid extraction method.
본 발명에 의한 핵산의 추출방법은 종래의 실리카 기반의 핵산 추출방법에 비해 핵산이 결합되는 탄소나노튜브의 표면적이 넓어져서 핵산 회수율이 증가된다.The nucleic acid extraction method according to the present invention increases the surface area of the carbon nanotubes to which the nucleic acid is bound, thereby increasing the nucleic acid recovery rate as compared with the conventional silica-based nucleic acid extraction method.
또한, 본 발명은 일반 탄소나노튜브나 음전하를 띤 탄소나노튜브가 아닌 양전하를 띤 탄소나노튜브를 사용하기 때문에 탄소나노튜브의 양전하가 핵산의 음전하와 정전기적 인력에 의해 결합이 진행되므로, 핵산과의 결합력이 강화되어 비극성 탄성나노튜브나 음전하를 띤 탄소나노튜브를 사용하는 경우보다 핵산 회수율이 증가된다.In addition, since the present invention uses positive carbon nanotubes rather than general carbon nanotubes or negatively charged carbon nanotubes, the positive charge of the carbon nanotubes is bound by the negative charge of the nucleic acid and the electrostatic attraction, The nucleic acid recovery rate is increased as compared with the case of using a non-polarized carbon nanotube or a non-polarized carbon nanotube.
아울러, 본 발명은 탄소나노튜브는 그 표면이 아민 그룹으로 개질되어 있기 때문에 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득률이 높다.In addition, since carbon nanotubes of the present invention are modified with amine groups on the surface thereof, the binding properties to the target DNA and the yield of DNA are high.
더욱이, 본 발명은 전통적인 유기용매 추출방법과 달리 페놀을 이용하지 않기 때문에 인체에 해롭지 않고, 환경오염 등의 문제가 최소화된다.Furthermore, unlike conventional organic solvent extraction methods, the present invention does not use phenol, so it is not harmful to the human body and minimizes environmental pollution.
아울러, 본 발명에 의한 핵산 추출방법은 혈액, 타액 등 액체시료나 고체시료를 소량 사용함으로써, 경제적이고 간편하게 핵산을 수득할 수 있는 효과를 가진다.
In addition, the nucleic acid extracting method according to the present invention has an effect of economically and easily obtaining a nucleic acid by using a small amount of a liquid sample or a solid sample such as blood, saliva and the like.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 마그네타이트가 코팅된 탄소나노튜브에 대한 투사전자현미경의 이미지이다.
도 3은 양전하로 치환된 CNT와 본 발명의 Fe3O4@CNT에 대한 XRD 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
FIG. 1 is a flowchart for explaining a nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention.
2 is an image of a projection electron microscope for a magnetite-coated carbon nanotube of the present invention.
3 is a graph showing the results of XRD analysis of CNTs substituted with positive charge and Fe 3 O 4 @CNT of the present invention.
이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들에 의한 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산 추출방법(이하, '핵산 추출방법'이라 약칭함)을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, a nucleic acid extracting method using carbon nanotubes coated with magnetite particles according to preferred embodiments of the present invention (hereinafter referred to as "nucleic acid extracting method") will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출방법을 설명하기 위한 순서도이다.FIG. 1 is a flowchart for explaining a nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 핵산 추출방법은 핵산을 포함하는 시료와 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브(이하, 'Fe3O4@CNT'라고 약칭함)가 포함된 CNT 분산액을 혼합하여 반응시키는 반응단계(S100)와, 상기 시료와 CNT 분산액의 혼합물에 자기장을 이용하여 침전물을 분리하는 반응잔여물 분리단계(S200), 및 상기 세척된 침전물에 DNA 용출 시약을 첨가하여 핵산을 회수하는 회수단계(S500)를 포함하며, 선택적으로 상기 침전물에 세척 버퍼를 첨가하여 세척하는 세척단계(S300)와, 상기 세척된 침전물을 건조하는 건조단계(S400)를 더 포함할 수 있다.
1, a nucleic acid extracting method according to the present invention comprises mixing a CNT dispersion containing a sample containing a nucleic acid and a carbon nanotube (hereinafter abbreviated as 'Fe 3 O 4 @CNT') coated with magnetite particles A reaction residue separation step (S200) of separating the precipitate using a magnetic field in the mixture of the sample and the CNT dispersion (S200); and a step of adding a DNA elution reagent to the washed precipitate to recover the nucleic acid (S300) for washing the precipitate by adding a washing buffer to the precipitate, and a drying step (S400) for drying the washed precipitate.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 반응단계(S100)는 핵산을 포함한 시료에 Fe3O4@CNT를 첨가하여 반응시키는 단계로서, 상기 반응을 통해 Fe3O4@CNT의 표면에 핵산을 결합시킴으로써 상기 시료의 핵산을 추출한다. Referring to FIG. 1, the reaction step (S100) according to the present invention is a step of reacting Fe 3 O 4 @CNT with a sample containing a nucleic acid and reacting the surface of Fe 3 O 4 @CNT with a nucleic acid And then the nucleic acid of the sample is extracted.
이러한 Fe3O4@CNT는 핵산과 양전하-음전하의 결합이 진행되므로, 핵산과의 결합력이 강화되어 음전하를 띤 CNT나 비극성 CNT와 비교하여 시료로부터 핵산 회수률이 증가된다. 그리고 CNT 표면에 분산되는 마그네타이트 입자는 세포 내의 DNA를 선택적으로 추출하는 역할을 수행한다. This Fe 3 O 4 @CNT enhances the binding force with the nucleic acid since the binding between the nucleic acid and the positive charge-negative charge proceeds, thereby increasing the nucleic acid recovery rate from the sample as compared with the negative charge CNT or the non-polar CNT. The magnetite particles dispersed on the surface of the CNT selectively extract DNA from the cells.
또한, 기존 비극성 CNT와 핵산의 결합 원리는 CNT 표면과 핵산의 염기와의 π-π 결합으로써, CNT와 핵산을 결합시키기 위하여 수 시간의 반응 시간이 필요하였다. 하지만, 양전하를 띤 CNT의 경우는 CNT의 표면에 양전하를 도입함으로써 약 5분 이내에 CNT와 핵산의 결합이 가능하다. In addition, the coupling principle between the nonpolar CNT and the nucleic acid is a π-π bond between the surface of the CNT and the base of the nucleic acid, and a reaction time of several hours is required to bond the CNT with the nucleic acid. However, in the case of positively charged CNTs, it is possible to combine CNTs and nucleic acids within about 5 minutes by introducing a positive charge on the surface of the CNTs.
아울러, 음전하를 띤 CNT는 핵산과의 원활한 결합을 위해 NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2이 포함된 염 용액 등의 다양한 시약이 필요하지만, 양전하를 띤 CNT를 사용하면 염 용액 등의 시약 없이도 핵산과 원활하게 결합될 수 있다. In addition, negative charge CNTs require a variety of reagents such as NaCl, MgCl 2 , KCl, and a salt solution containing CaCl 2 for smooth coupling with nucleic acids. However, when positively charged CNTs are used, As shown in FIG.
이러한 반응단계(S100)에서는 추출하고자 하는 대상이 되는 시료 50 내지 200 중량부에 Fe3O4@CNT 1 내지 7 중량부를 첨가한다. 이때, 상기 Fe3O4@CNT는 가루형태로 첨가하여도 무방하지만, 정확한 사용량을 용이하게 측정할 수 있도록 가루형태의 Fe3O4@CNT를 용액과 혼합하여 분산액 상태로 첨가할 수 있다.In this reaction step (S100), 1 to 7 parts by weight of Fe 3 O 4 @CNT is added to 50 to 200 parts by weight of the sample to be extracted. In this case, the Fe 3 O 4 @CNT mubang may be added in powder form, but a mixture with the powder in the form of Fe 3 O 4 @CNT solution to easily determine the exact amount added to the dispersion state.
여기서, Fe3O4@CNT 분산액은 1 중량%의 Fe3O4@CNT와 99 중량%의 용액으로 구성된 1% 분산액을 사용할 수 있다. 예를 들면, Fe3O4@CNT 분산액은 시료 5 내지 20㎎을 기준으로 100 내지 700㎕가 첨가된다. 그리고 상기 용액으로는 주로 물을 사용할 수 있으며, 계면활성제를 추가로 더 첨가할 수 있다. Here, as the Fe 3 O 4 @CNT dispersion, a 1% dispersion of 1 wt% Fe 3 O 4 @CNT and 99 wt% solution can be used. For example, the Fe 3 O 4 @CNT dispersion is added in an amount of 100 to 700 μl based on 5 to 20 mg of the sample. As the solution, water may be mainly used, and a surfactant may further be added.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 Fe3O4@CNT는 양전하를 띤 CNT의 기능을 포함하고 있을 뿐만 아니라 CNT 표면에 분산된 마그네타이트 입자에 의해 세포 내의 DNA를 선택적으로 추출하는 기능도 포함하고 있다.As described above, Fe 3 O 4 @CNT according to the present invention not only includes the function of positively charged CNTs but also includes a function of selectively extracting the DNA in cells by the magnetite particles dispersed on the CNT surface .
또한, 본 발명의 Fe3O4@CNT는 시료에 대해 양전하를 띤 CNT의 약 3배수(무게비)가 사용된다. 이는 마그네타이트 입자로 인하여 증량 증가량이 약 60% 정도이기 때문에 양전하를 띤 CNT 사용 시와 동일한 양전하량을 갖도록 양전하를 띤 CNT 사용시보다 3배수를 사용한다.The Fe 3 O 4 @CNT of the present invention uses about three times (weight ratio) of the positively charged CNT to the sample. This is due to the increased amount of increase of magnetite particles, which is about 60%. Therefore, when using positive charged CNTs, use three times as much as that of positive charged CNTs.
상기 핵산을 포함한 시료는 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포 등의 모든 세포를 대상으로 할 수 있다. 본 핵산 추출방법에 이용하는 시료로서는 세포를 포함하는 생체유래 시료가 적합하지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 생체에 유래하지 않는 시료에도 본 핵산 추출방법을 적용하는 것이 가능하다.The sample containing the nucleic acid may be an animal cell, a plant cell, or a microbial cell. As the sample used in the nucleic acid extraction method, a sample derived from a living body including cells is suitable, but the present invention is not limited thereto, and the nucleic acid extraction method can be applied to a sample not derived from a living body.
상기 생체유래 시료로는 동물 및 식물의 생체 구성성분을 적절하게 이용할 수 있다. 인간을 포함하는 동물유래의 시료로는, 예를 들어, 혈액, 조직액, 림프액, 뇌척수액, 고름, 점액, 콧물, 객담, 소변, 대변, 복수 등의 체액류, 피부, 폐, 간, 점액, 각종 장기, 뼈 등의 조직과 비강, 기관지, 피부, 각종 장기 등을 세정한 후의 세정액을 들 수 있다. 그리고 인간의 경우는 투석 배액도 시료로 할 수 있다. As a bio-derived sample, biological components of animals and plants can be suitably used. Examples of animal-derived samples including humans include body fluids such as blood, tissue fluid, lymph fluid, cerebrospinal fluid, pus, mucus, runny nose, sputum, urine, feces and ascites, skin, lungs, liver, Organ, bone, and the like, and a cleaning liquid after cleaning the nasal cavity, bronchus, skin, various organs, and the like. In the case of humans, dialysis drainage can also be used as a sample.
또한, 본 핵산의 추출방법의 표적으로 하는 핵산은 시료에 포함되는 세포 고유의 핵산에 한정되지 않고, 세포에 감염된 바이러스의 핵산이나, 세포가 탐식한 미생물 등의 핵산에도 적용할 수 있다. 따라서, 감염증 환자의 탐식세포(백혈구 등)를 포함하는 생체유래 시료도 본 헥신 추출방법의 시료로 적합하다.In addition, the nucleic acid as a target of the nucleic acid extraction method is not limited to the nucleic acid inherent to the cells contained in the sample but can also be applied to a nucleic acid such as a nucleic acid of a virus infected with the cell or a microorganism to which the cell is pumped. Therefore, a sample derived from a living body including a phagocytic cell (leukocyte, etc.) in an infectious disease patient is also suitable as a sample of the present hexin extraction method.
이때, 세포벽이나 세포막을 가지는 생물유래 시료를 사용하기 위해서는 상기 시료를 세포 분해 시약으로 전처리하는 전처리단계(미도시)가 수행되어야 한다. 다시 말해, 생물유래 물질을 사용하는 경우, 시료로는 세포 분해 시약과 생물유래 물질의 반응물인 세포 분해 산물을 사용한다. At this time, in order to use a biological sample having a cell wall or a cell membrane, a pretreatment step (not shown) for pretreating the sample with a cytolytic reagent should be performed. In other words, when a biologically derived substance is used, a cell degradation product, which is a reaction product of a cell lysis reagent and a biologically-derived substance, is used as a sample.
일 실시 양태로서, 전처리 과정에서는 쇠고기 조직 10㎎에 라이시스 버퍼(lysis buffer) 150 내지 250㎕ 및 프로테이나아제 케이(proteinase K) 1% 용액 7 내지 13㎕을 혼합하고, 이를 50 내지 70℃에서 약 1시간 동안 반응하여 쇠고기 조직에 대한 세포 분해 산물을 제조한다.In one embodiment, in the pretreatment step, 10 mg of beef tissue is mixed with 150 to 250 μl of a lysis buffer and 7 to 13 μl of a 1% proteinase K solution, For about 1 hour to produce cell degradation products for beef tissue.
다른 실시 양태로서, 전처리 과정에서는 쇠고기 조직 10㎎에 새늘바이오사의 라이시스 버퍼인 DirGene? 150 내지 250㎕을 혼합하고, 이를 상온에서 약 5 내지 10분 동안 반응하여 쇠고기 조직에 대한 세포 분해 산물을 제조한다.
In another embodiment, in the pretreatment step, 10 mg of beef tissue is added to a DirGene ? 150 to 250 쨉 l of the mixture are mixed and reacted at room temperature for about 5 to 10 minutes to prepare a cell degradation product for beef tissue.
한편, 본 발명의 반응단계(S100)에 사용되는 Fe3O4@CNT는 CNT를 자성입자 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 제 1 단계와, 상기 1차 생성물을 수산화나트륨(NaOH) 수용액에 적가하여 2차 생성물을 생성하는 제 2 단계, 및 상기 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하여 건조시키는 제 3 단계를 통해 제조할 수 있다.Meanwhile, the Fe 3 O 4 @CNT used in the reaction step (S100) of the present invention comprises a first step of adding CNT to an aqueous solution of magnetic particles and stirring to produce a first product, and a second step of mixing the first product with sodium hydroxide ) Aqueous solution to produce a secondary product, and a third step of recovering and drying the precipitate after centrifuging the secondary product.
필요에 따라, 본 발명은 상기 제 1 단계 이전에 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액의 생성단계를 더 포함할 수 있다.If necessary, the present invention may further comprise a step of producing an aqueous solution of magnetic particles containing the magnetite particles before the first step.
상기 마그네타이트 입자는 입자 자체가 자기장을 가지고 있지는 않지만 자기장에 노출되었을 때는 자기쌍극자를 형성하는 물질이다.The magnetite particles are substances that do not have a magnetic field but form a magnetic dipole when they are exposed to a magnetic field.
이러한 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액은 염화수소(HCl)에 염화제일철 사수화물(FeCl2·4H2O) 및 염화제이철 육수화물(FeCl3·6H2O)의 혼합물을 첨가하여 생성한다. 이때, HCl로는 0.5 내지 2M, 바람직하게는 1M의 HCl 수용액을 사용할 수 있다.The magnetic particle aqueous solution containing such magnetite particles is produced by adding hydrogen chloride (HCl) to a mixture of ferrous chloride heptahydrate (FeCl 2 .4H 2 O) and ferric chloride hexahydrate (FeCl 3 .6H 2 O). At this time, 0.5 to 2 M, preferably 1 M, aqueous HCl solution may be used as HCl.
보다 구체적으로, 먼저 상온에서 Fe2+와 Fe3+의 몰비(Fe2+/Fe3+)가 1/2 내지 1, 바람직하게는 1/2이 되도록 염화제일철 사수화물과 염화제이철 육수화물을 혼합한 후 초음파 파쇄기로 교반시켜 새로운 강자성체 철산화물인 Fe3O4(또는 FeOFe2O3) (이하, '강자성체 철산화물'이라 약칭함)을 생성한다. 이때, 상기 초음파 파쇄기는 마그네타이트 나노입자(약 10 ㎚)의 생성을 유도하고, 생성된 마그네타이트 나노입자를 분산시키는 역할을 수행한다.More specifically, at first, at a room temperature, Fe 2+ and The ferrous chloride heptahydrate and the ferric chloride hexahydrate are mixed so that the molar ratio of Fe 3+ (Fe 2+ / Fe 3+ ) is 1/2 to 1, preferably 1/2, and the mixture is stirred with an ultrasonic crusher to form a new ferromagnetic iron oxide To produce Fe 3 O 4 (or FeOFe 2 O 3 ) (hereinafter abbreviated as 'ferromagnetic iron oxide') as a cargo. At this time, the ultrasonic wave crusher induces generation of magnetite nanoparticles (about 10 nm) and disperses the generated magnetite nanoparticles.
여기서, Fe2+와 Fe3+의 몰비가 1/2 미만이거나 Fe2+와 Fe3+의 몰비가 1을 초과하면 강자성체 철산화물 생성 효율이 떨어지며 염화제일철 사수화물과 염화제이철 육수화물등과 같은 반응물이 불순물로 남아 있게 된다. Here, Fe 2+ and Fe 3+ molar ratio is less than 1/2 or Fe 2+ and If the molar ratio of Fe 3+ is more than 1, the production efficiency of the ferromagnetic iron oxide is lowered, and reactants such as ferrous chloride heptahydrate and ferric chloride hexahydrate remain as impurities.
보다 구체적으로, 본 단계에서는 1M HCl 수용액 100 ㎖를 기준으로 HCl 수용액에 15.9 ㎎ 염화제일철 사수화물과 43.8 ㎎ 염화제이철 육수화물을 첨가하고, 이를 혼합하여 마그네타이트 자성입자제조를 위한 전처리 수용액을 생성한다.
More specifically, in this step, 15.9 mg of ferrous chloride tetrahydrate and 43.8 mg of ferric chloride hexahydrate are added to an aqueous solution of HCl based on 100 ml of 1 M HCl aqueous solution, and mixed to prepare a pretreatment aqueous solution for producing magnetite magnetic particles.
이어서, 본 발명의 제 1 단계는 아민 그룹으로 치환된 CNT를 마그네타이트 자성입자 제조를 위한 전처리 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 단계로, 자성입자 전처리 수용액에서 생성된 자성나노입자가 CNT의 표면에 균일하게 분산 고정화시키는 과정을 수행한다. 여기서, 상기 아민 그룹은 세포 내 DNA를 CNT에 결합시키기 위한 것으로, 아민 그룹의 양전하가 세포 내 DNA의 음전하와 이온 결합됨으로써 CNT-DNA 복합체가 형성된다. The first step of the present invention is a step of adding CNT substituted with an amine group to a pretreatment aqueous solution for producing magnetite magnetic particles and stirring to produce a first product, wherein the magnetic nanoparticles produced in the magnetic particle pretreatment aqueous solution are CNT To be uniformly dispersed and immobilized on the surface of the substrate. Herein, the amine group is for binding intracellular DNA to CNT, and a positive charge of an amine group is ion-bonded to a negative charge of intracellular DNA to form a CNT-DNA complex.
한편, 상기 아민 그룹으로 치환된 CNT로는 표면이 아미노기로 개질된 CNT를 사용할 수도 있다.Meanwhile, as the CNT substituted with the amine group, CNT whose surface is modified with an amino group may be used.
표면이 아미노기로 개질된 CNT는 비극성 CNT에 황산(H2SO4) 및 질산(HNO3)으로 형성된 혼합산을 첨가하여 카르복실기로 치환된 CNT를 생성하는 1차 CNT 생성단계, 및 상기 카르복실기로 치환된 CNT에 다이아민류 및 용매를 첨가하여 아미노기로 치환된 CNT를 생성하는 2차 CNT 생성단계를 통해 제조할 수 있다. 이때, 황산은 촉매역할을 수행하고, 질산이 산화제로 작용한다. CNTs whose surface has been modified with an amino group include a first CNT producing step of producing CNTs substituted with a carboxyl group by adding a mixed acid formed of non-polar CNTs with sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and nitric acid (HNO 3 ) And CNTs substituted with amino groups by adding diamines and a solvent to the CNTs. At this time, sulfuric acid acts as a catalyst, and nitric acid acts as an oxidizing agent.
보다 구체적으로, 상기 1차 CNT 생성단계는 비극성의 CNT 2g과 97% 황산 50㎖ 및 70% 질산 50㎖를 환류장치에 투입하는 과정과, 상기 환류장치의 혼합물을 80℃에서 지속적으로 교반해주면서 48시간 동안 반응시키는 과정과, 용매로서 증류수를 상기 환류장치에 넣어 반응을 종결시킨 후 상기 혼합물을 필터로 걸러주는 과정, 및 상기 혼합물의 pH가 중성이 될 때까지 필터로 거른 후 건조시켜 카르복실기로 치환된 CNT(CNT-COOH)를 생성하는 과정을 포함한다.More specifically, in the step of generating the primary CNT, 2 g of non-polar CNT, 50 ml of 97% sulfuric acid and 50 ml of 70% nitric acid are charged into a reflux apparatus, and the mixture of the reflux apparatus is continuously stirred at 80 ° C. A step of adding distilled water as a solvent to the reaction apparatus to terminate the reaction, filtering the mixture with a filter, filtering the mixture until the pH of the mixture becomes neutral, and then drying it to convert it to a carboxyl group CNT (CNT-COOH).
그리고 상기 2차 CNT 생성단계는 상기 카르복실기로 치환된 CNT(CNT-COOH) 300mg과 다이아민류로 사용되는 헥사메틸렌다이아민(1,6-Hexanediamine) 1㎖ 및 용매로 사용되는 증류수 150㎖를 둥근 플라스크에 넣어 준 후 고무마개로 입구를 막은 다음 주사기를 이용하여 1N HCL을 떨어뜨려 pH가 5가 되도록 조정하는 과정과, 카르복실기로 치환된 CNT와 헥사메틸렌다이아민 및 증류수의 혼합물을 6시간 동안 교반해주는 과정, 및 상기 혼합물을 필터링 및 세척을 통해 pH를 중성으로 맞춰준 후 건조시켜 아미노기로 치환된 CNT(CNT-NH2)를 생성하는 과정을 포함한다. In the second CNT generation step, 300 mg of CNT (CNT-COOH) substituted with the carboxyl group, 1 ml of hexamethylene diamine (1,6-hexanediamine) used as a diamine and 150 ml of distilled water used as a solvent were added to a round flask , The inlet was closed with a rubber stopper, the pH was adjusted to 5 by dropping 1N HCL using a syringe, and a step of stirring a mixture of CNT substituted with a carboxyl group, hexamethylene diamine and distilled water for 6 hours , And adjusting the pH of the mixture to neutral by filtering and washing, followed by drying to produce an amino group-substituted CNT (CNT-NH 2 ).
아울러, 아민 그룹으로 치환된 CNT로는 In addition, with CNTs substituted with amine groups
그 다음, 본 발명의 제 2 단계는 제 1 단계를 통해 CNT의 표면에 균일하게 분산된 마그네타이트 입자를 CNT의 표면에 부착시키기 위한 단계로, 이를 위해 제 1 단계를 통해 생성된 1차 생성물을 NaOH 수용액에 한 방울씩 적가하는 과정을 수행한다. Next, the second step of the present invention is a step for attaching the magnetite particles uniformly dispersed on the surface of the CNT to the surface of the CNT through the first step. To this end, the primary product produced through the first step is dissolved in NaOH Dropwise to the aqueous solution.
이때, 상기 NaOH 수용액은 0.1 내지 5M, 바람직하게는 1.5M의 NaOH 수용액을 사용할 수 있다. 여기서, NaOH 수용액의 농도가 0.1 M 미만이면 시간이 오래 걸리는 문제가 발생될 수 있고, NaOH 수용액의 농도가 5M을 초과하면 자성체 입자가 커지는 문제가 발생될 수 있다.At this time, the NaOH aqueous solution may be 0.1 to 5M, preferably 1.5M NaOH aqueous solution. If the concentration of NaOH aqueous solution is less than 0.1 M, it may take a long time. If the concentration of NaOH aqueous solution exceeds 5 M, the magnetic particles may become large.
보다 구체적으로, 본 단계에서는 1.5 M NaOH 수용액 100 ㎖를 기준으로 상기 NaOH 수용액에 약 100 ㎖의 1차 생성물을 한 방울씩 적가한다. 이를 위해, NaOH 수용액이 먼저 교반기에 투입되며, 상기 1차 생성물은 한 방울 씩 교반기에 투입되면서 NaOH 수용액과 1차 생성물이 교반되어 최종적으로 2차 생성물이 생성된다.
More specifically, in this step, about 100 ml of the primary product is added dropwise to the NaOH aqueous solution based on 100 ml of 1.5 M NaOH aqueous solution. To this end, the NaOH aqueous solution is first added to the agitator, and the primary product is added dropwise to the agitator while the NaOH aqueous solution and the primary product are stirred to finally produce the secondary product.
마지막으로, 본 발명의 제 3 단계는 제 2 단계를 통해 생성된 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하고, 회수된 침전물을 건조시키는 단계로, 상기 원심분리는 7,000 내지 9,000 rpm으로 수행하고, 상기 침전물의 건조는 약 40℃에서 약 24시간 동안 수행할 수 있다. 필요에 따라, 본 단계에서는 원심분리를 통해 회수한 침전물을 에탄올 등을 이용하여 세척한 후 건조시킬 수도 있다.Finally, the third step of the present invention comprises centrifuging the secondary product produced through the second step, recovering the precipitate, and drying the recovered precipitate, wherein the centrifugation is performed at 7,000 to 9,000 rpm , And drying of the precipitate can be carried out at about 40 캜 for about 24 hours. If necessary, the precipitate recovered through centrifugation in this step may be washed with ethanol or the like and then dried.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출용 탄소나노튜브는 상기 제 1 단계 내지 제 3 단계를 통해 제조되며, 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액과, 아민 그룹으로 치환된 탄소나노튜브, 및 NaOH 수용액이 사용된다.
As described above, the carbon nanotubes for nucleic acid extraction according to the present invention are prepared through the first to third steps, and include an aqueous solution of magnetic particles containing magnetite particles, carbon nanotubes substituted with amine groups, and NaOH An aqueous solution is used.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 반응잔여물 분리단계(S200)는 전처리단계와 반응단계(S100)를 통해 시료로부터 분해된 단백질, 탄수화물, 지방 등의 반응잔여물을 제거하기 위한 단계로서, 시료와 Fe3O4@CNT(또는 Fe3O4@CNT 분산액)의 혼합물에 자기장을 적용하여 Fe3O4@CNT와 핵산의 결합체를 분리하는 과정을 수행한다.Referring to FIG. 1, a reaction residue separation step (S200) according to the present invention is a step for removing reaction residues such as protein, carbohydrate, and fat decomposed from a sample through a pretreatment step and a reaction step (S100) A magnetic field is applied to a mixture of the sample and Fe 3 O 4 @CNT (or Fe 3 O 4 @CNT dispersion) to separate the complex of Fe 3 O 4 @CNT and the nucleic acid.
구체적으로, 시료와 Fe3O4@CNT(또는 Fe3O4@CNT 분산액)의 혼합물에 자석을 투입하면, 상기 결합체가 자석에 부착된다. 이와 같이, 상기 결합체가 자석에 부착되면, 자석을 시료와 Fe3O4@CNT(또는 Fe3O4@CNT 분산액)의 혼합물의 잔여물로부터 이탈시켜 결합체를 분리하며, 나머지 반응잔여물을 제거한다.Specifically, when a magnet is put into a mixture of a sample and Fe 3 O 4 @CNT (or Fe 3 O 4 @CNT dispersion), the above bonded body is attached to the magnet. Thus, when the bonded body is attached to the magnet, the magnet is separated from the residue of the sample and the mixture of Fe 3 O 4 @CNT (or Fe 3 O 4 @CNT dispersion) to separate the combined body, and the remaining reaction residue is removed do.
이러한 반응잔여물 분리단계(S200)를 통해 반응잔여물을 제거하지 않은 상태로 세척 버퍼를 첨가하면, 단백질 등이 세척 버퍼와 반응하여 침전될 수 있으며, 침전된 단백질 등은 세척단계에서도 제거되지 않는다. 다시 말해, 반응잔여물 분리단계를 수행하면, 회수단계에서 사용되는 DNA 용출 시약과 반응하여 핵산의 회수를 방해하는 요소들을 미리 제거할 수 있게 된다.If the washing buffer is added without removing the reaction residue through the reaction residue separation step (S200), proteins and the like may react with the washing buffer to precipitate, and the precipitated proteins and the like are not removed in the washing step . In other words, when the reaction residue separation step is performed, the elements that react with the DNA eluting reagent used in the recovery step to prevent the nucleic acid recovery can be removed in advance.
필요에 따라, 상기 반응잔여물 분리단계(S200)에서는 반응잔여물이 제거된 결합체를 원심분리하여 이물질을 추가로 제거하는 과정이 수행될 수도 있다. If necessary, in the reaction residue separation step (S200), the reaction mixture may be centrifuged to remove the foreign substance.
이때, 원심분리는 10,000 내지 14,000 rpm, 바람직하게는 12,000 rpm으로 8 내지 12 분, 바람직하게는 10 분 동안 수행된다.
At this time, centrifugation is carried out at 10,000 to 14,000 rpm, preferably 12,000 rpm, for 8 to 12 minutes, preferably 10 minutes.
도 1을 참조하면, 본 발명은 세척단계(S300)를 더 포함할 수 있다.Referring to FIG. 1, the present invention may further include a cleaning step (S300).
상기 세척단계(S300)는 반응잔여물 분리단계(S200)를 통해 분리된 결합체(침전물)에 세척 버퍼를 첨가하여 세포 분해 버퍼 등의 이물질을 세척하는 단계이다. 이때, 세척 버퍼로는 에탄올이나 EDTA 등을 사용할 수 있다. 여기서, 에탄올로는 70% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.The washing step S300 is a step of washing the foreign substances such as the cell decomposition buffer by adding a washing buffer to the separated complex (precipitate) separated through the reaction residue separation step S200. At this time, ethanol or EDTA can be used as the washing buffer. Here, it is preferable to use 70% ethanol as ethanol.
특정 양태로서, 본 발명에 따른 세척단계(S300)는 반응단계(S100)를 통해 생성된 혼합물에 세척 버퍼를 첨가하는 단계와, 상기 세척 버퍼가 첨가된 혼합물을 원심분리하는 단계, 및 상기 원심분리를 통해 구분된 상층액을 제거하는 단계로 이루어질 수 있다. In a specific embodiment, the washing step (S300) according to the present invention comprises the steps of adding washing buffer to the mixture produced through reaction step (SlOO), centrifuging the mixture to which the washing buffer has been added, And removing the supernatant liquid separated through the supernatant.
상기 원심분리는 원심분리기를 통해 10,000 내지 14,000 rpm, 바람직하게는 12,000 rpm으로 8 내지 12 분, 바람직하게는 10 분 동안 수행된다. 또한, 상기 원심분리를 통해 상층액과 침전물이 구분되면 침전물 배출장치를 사용하여 침전물을 분리하거나 상기 상층액을 제거하여 침전물을 분리한다.
The centrifugation is carried out through a centrifuge at 10,000 to 14,000 rpm, preferably 12,000 rpm, for 8 to 12 minutes, preferably 10 minutes. Further, when the supernatant is separated from the supernatant through the centrifugation, the precipitate is separated using a sediment discharging device or the supernatant is removed to separate the precipitate.
도 1을 참조하면, 본 발명은 건조단계(S400)를 더 포함할 수 있다.Referring to FIG. 1, the present invention may further include a drying step (S400).
상기 건조단계(S400)는 세척단계(S300)를 통해 분리된 결합체(침전물)에 잔존하는 세척 버퍼를 제거하기 위한 단계로서, 상기 결합체(침전물)에 잔존하는 휘발성 물질로 구성된 세척 버퍼가 모두 증발되어 제거될 수 있도록 결합체(침전물)를 가열건조기에 투입하여 건조시킨다. 예를 들면, 결합체(침전물)는 가열건조기의 내부에서 50 내지 70℃로 20 내지 40분 동안 건조된다.
The drying step (S400) is a step for removing the washing buffer remaining in the combined body (precipitate) separated through the washing step (S300), wherein the washing buffer composed of volatile substances remaining in the combined body (precipitate) The mixture (precipitate) is put into a heat drier to be dried so that it can be removed. For example, the assembly (precipitate) is dried for 20 to 40 minutes at 50 to 70 DEG C inside the heat drier.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 회수단계(S500)는 반응잔여물 분리단계(S200)를 통해 분리된 결합체(침전물)나 건조단계(S400)를 통해 건조된 결합체(침전물)에 DNA 용출 시약(DNA elution buffer)을 첨가하여 핵산을 회수하는 단계이다. 이때, DNA 용출 시약으로는 0.1M Tris-HCl 또는 PBS 등을 사용할 수 있다.Referring to FIG. 1, the recovering step (S500) according to the present invention includes a step of removing a reagent (a precipitate) from the separated complex (precipitate) separated through the reaction residue separation step (S200) (DNA elution buffer) is added to recover the nucleic acid. At this time, 0.1 M Tris-HCl or PBS can be used as a DNA elution reagent.
특정 양태로서, 본 발명에 따른 회수단계(S500)는 반응잔여물 분리단계(S200)를 통해 분리된 결합체(침전물)나 건조단계(S400)를 통해 건조된 결합체(침전물)에 DNA 용출 시약을 첨가하는 단계와, 상기 DNA 용출 시약이 첨가된 혼합물을 볼텍싱(vortexing)하는 단계와, 상기 볼텍싱을 수행한 혼합물을 원심분리하는 단계, 및 상기 원심분리를 통해 구분된 상층액을 회수하는 단계로 이루어질 수 있다. In a specific embodiment, the recovering step (S500) according to the present invention comprises adding a DNA eluting reagent to a binder (precipitate) separated through a reaction residue separation step (S200) or a dried complex (precipitate) through a drying step (S400) , Vortexing the mixture to which the DNA eluting reagent has been added, centrifuging the mixture subjected to vortexing, and recovering the separated supernatant through centrifugation Lt; / RTI >
상기 원심분리는 10,000 내지 14,000 rpm, 바람직하게는 12,000 rpm으로 40 내지 90 초, 바람직하게는 60 초 동안 수행되며, 상기 볼텍싱은 8 내지 15 초 동안 수행된다.
The centrifugation is performed at 10,000 to 14,000 rpm, preferably at 12,000 rpm for 40 to 90 seconds, preferably 60 seconds, and vortexing is performed for 8 to 15 seconds.
이하의 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples and comparative examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[실시예 1] [Example 1]
마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브 제조Manufacture of carbon nanotubes coated with magnetite particles
삼각플라스크(250 ㎖)에 염화제일철 사수화물 15.9 ㎎와 염화제이철 육수화물 43.8 ㎎을 투입하고, 이를 혼합하여 강자성체 철산화물 생성하였다. 15.9 mg of ferrous chloride heptahydrate and 43.8 mg of ferric chloride hexahydrate were added to an Erlenmeyer flask (250 ml) and mixed to produce a ferromagnetic iron oxide.
이어서, 상기 강자성체 철산화물에 1M HCl 100 ㎖를 혼합하여 염화철 혼합용액을 만들어 전처리 수용액을 생성하였다.Next, 100 ml of 1M HCl was mixed with the ferromagnetic iron oxide to prepare a mixed solution of iron chloride to form a pretreatment aqueous solution.
그 다음, 30 mg의 아미노기로 개질된 CNT를 혼합한 후, 이를 1시간 동안 초음파 파쇄기로 혼합하여 1차 생성물을 생성하였다.Then, CNT modified with 30 mg of amino group was mixed and then mixed with an ultrasonic crusher for 1 hour to produce a primary product.
그 다음, 1.5M NaOH 수용액 100㎖에 상기 1차 생성물 100 ㎖를 한 방울씩 적가하면서 NaOH 수용액과 1차 생성물의 혼합물을 교반시켜 2차 생성물을 생성하였다.Then, 100 ml of the above primary product was added dropwise to 100 ml of a 1.5 M aqueous NaOH solution while stirring the mixture of the aqueous NaOH solution and the primary product to produce a secondary product.
마지막으로, 상기 2차 생성물을 30분 동안 상온에서 보관한 후 8,000 rpm으로 원심분리하고, 상기 원심분리를 통해 침전된 침전물을 수득하여 40℃에서 24시간 동안 건조시켜 Fe3O4@CNT를 제조하였다. Finally, the secondary product was stored at room temperature for 30 minutes, centrifuged at 8,000 rpm, and precipitated through centrifugation to obtain Fe 3 O 4 @CNT by drying at 40 ° C for 24 hours Respectively.
이때, 전술한 모든 과정은 산소를 제거한 질소 조건하에서 시행되었다. At this time, all of the above procedures were carried out under nitrogen-free conditions.
이와 같이 제조된 Fe3O4@CNT는 투사전자현미경을 이용하여 그 이미지를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. The thus prepared Fe 3 O 4 @CNT was observed by a projection electron microscope. The results are shown in Fig.
도 2를 살펴보면, 마그네타이트 나노입자는 명확하게 CNT의 외부 표면에서 관찰되었다. 특히, 마그네타이트 나노입자의 대부분은 무작위로 CNT의 외부 표면에 부착된 것으로 관찰되었다. 또한, 마그네타이트 나노입자의 평균 크기는 10 ㎚로 추정되었으며, 마그네타이트 나노입자의 분포는 불균일한 것으로 관찰되었다.
Referring to FIG. 2, the magnetite nanoparticles were clearly observed on the outer surface of the CNTs. In particular, it was observed that most of the magnetite nanoparticles were randomly attached to the outer surface of CNTs. In addition, the average size of the magnetite nanoparticles was estimated to be 10 nm, and the distribution of the magnetite nanoparticles was observed to be nonuniform.
[실시예 2][Example 2]
상기 실시예 1을 통해 제조한 Fe3O4@CNT 10㎎과 10㎖의 증류수를 초음파 파쇄기에 넣고 상기 초음파 파쇄기를 구동시켜 Fe3O4@CNT가 분산된 Fe3O4@CNT 분산액을 제조하였다.10 mg of Fe 3 O 4 @CNT prepared in Example 1 and 10 ml of distilled water were placed in an ultrasonic crusher and the ultrasonic crusher was driven to prepare a Fe 3 O 4 @CNT dispersion in which Fe 3 O 4 @CNT was dispersed Respectively.
이어서, Fe3O4@CNT 분산액을 3가지로 분리한 후 각각 pH 4, pH 5, pH 6으로 조절하였다.
Next, the Fe 3 O 4 @CNT dispersion was separated into three fractions and then adjusted to pH 4, pH 5 and pH 6, respectively.
[비교예 1][Comparative Example 1]
상기 Fe3O4@CNT의 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 양전하로 치환된 CNT를 0.25% 분산액에 넣고 CNTs 분산액을 제조하였다.
To evaluate the degree of DNA binding of Fe 3 O 4 @CNT, a CNTs dispersion was prepared by adding positively charged CNTs to 0.25% dispersion.
[실험예 1][Experimental Example 1]
비교예 1의 CNTs와 실시예 1의 Fe3O4@CNT의 결정 구조를 확인하기 위해 X-선 회절(XRD) 분석을 실시하였다. 도 3은 양전하로 치환된 CNTs와 본 발명의 Fe3O4@CNT에 대한 XRD 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. X-ray diffraction (XRD) analysis was performed to confirm the crystal structure of CNTs of Comparative Example 1 and Fe 3 O 4 @CNT of Example 1. 3 is a graph showing the results of XRD analysis of CNTs substituted with positive charge and Fe 3 O 4 @ CNT of the present invention.
도 3을 참조하면, CNTs의 회절 패턴은 2θ = 25.99와 42.94 및 53.628에서 각각 관찰되었으며, Fe3O4@CNT의 회절 패턴은 2θ = 30.5, 36.5, 43 등등에서 각각 관찰되었다.Referring to FIG. 3, the diffraction patterns of CNTs were observed at 2θ = 25.99, 42.94 and 53.628, respectively, and diffraction patterns of Fe 3 O 4 @CNT were observed at 2θ = 30.5, 36.5, 43 and so on, respectively.
이와 같이 관찰된 회절 패턴은 Fe3O4(JCPDS NO. 019-0629)의 표준 스펙트럼과 일치하여 Fe3O4가 합성되었음을 반증하고 있다.The diffraction pattern thus observed is consistent with the standard spectrum of Fe 3 O 4 (JCPDS No. 019-0629), demonstrating that Fe 3 O 4 was synthesized.
또한, Scherrer의 방정식에 따라 마그네타이트 입자의 평균 직경을 계산하기 위해 가장 큰 피크(311)를 선택하면, 마그네타이트 입자의 평균 크기는 약 10.6ㅁ 1.31 ㎚인 것으로 분석되었다.
Also, when the
[실험예 2][Experimental Example 2]
1. 1.7㎕ Effendorf tube에 동물 조직(쇠고기) 10㎎에 용해 버퍼(lysis buffer) 200㎕와 Protenase K(10mg/㎖) 10㎕를 넣은 후 60℃에서 1시간 방치하여 세포 파쇄물(lysate)을 수득하였다. 1. Add 10 μl of lysis buffer and 10 μl of Protenase K (10 mg / ml) to 10 mg of animal tissue (beef) in an Effendorf tube and incubate at 60 ° C for 1 hour to obtain a cell lysate Respectively.
2. 상기 세포 파쇄물에 1% Fe3O4@CNT 분산액 800㎕를 추가한 후 vortex로 10초간 섞어준 다음, 세포 파쇄물과 Fe3O4@CNT 분산액의 혼합물에 자석을 넣어 Fe3O4@CNT 입자를 상기 혼합물에서 분리하였다. 이때, 상기 Fe3O4@CNT 입자는 육안 분별이 되지 않는 Fe3O4@CNT와 DNA의 결합체를 의미한다.2.1% in the cell lysate Fe 3 O 4 @CNT dispersion was added the following after 800㎕ gave
3. 자석에 붙어있는 Fe3O4@CNT 입자를 50㎕의 DNA elution buffer가 들어있는 1.7ml Effendorf tube에 담근 후 5분간 방치하였다. 3. The Fe 3 O 4 @CNT particles attached to the magnet were immersed in a 1.7 ml Effendorf tube containing 50 μl of DNA elution buffer and left for 5 minutes.
4. 자석에 붙어있는 Fe3O4@CNT 입자를 Effendorf tube에서 빼낸 후 tube 내에 남아있는 용액의 DNA 농도를 나노드롭(Nano Drop)으로 정량하였다.4. The Fe 3 O 4 @CNT particles attached to the magnet were removed from the Effendorf tube and the DNA concentration of the solution remaining in the tube was quantified as Nano Drop.
5. 전술한 과정을 10회 반복 시행하여 세포내 DNA 추출 능력을 비교하였다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.
5. The above procedure was repeated ten times to compare intracellular DNA extraction ability. The results are shown in Table 1.
[비교실험예 1][Comparative Experimental Example 1]
실험예 2와 동일한 조건에서 실험을 실시하되, Fe3O4@CNT 분산액 800㎕ 대신 CNTs 분산액 200㎕을 사용하였다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.Experiments were carried out under the same conditions as Experimental Example 2 except that 200 CN of CNTs dispersion was used instead of 800 Fe of Fe 3 O 4 @ CNT dispersion. The results are shown in Table 1.
이때, CNT와 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 CNTs의 분산액 농도는 Fe3O4@CNT의 TGA 분석을 통하여 Fe3O4나노입자를 제외한 CNT의 질량을 계산하여 정하였다.
At this time, in order to evaluate the degree of DNA binding, CNTs were determined by calculating the mass of CNTs except Fe 3 O 4 nanoparticles through TGA analysis of Fe 3 O 4 @ CNT.
[비교실험예 2][Comparative Experimental Example 2]
1. 1.7㎕ Effendorf tube에 동물 조직(쇠고기) 10㎎에 용해 버퍼(lysis buffer) 200㎕와 Protenase K(10mg/㎖) 10㎕를 넣은 후 60℃에서 1시간 방치하여 세포 파쇄물(lysate)을 수득하였다. 1. Add 10 μl of lysis buffer and 10 μl of Protenase K (10 mg / ml) to 10 mg of animal tissue (beef) in an Effendorf tube and incubate at 60 ° C for 1 hour to obtain a cell lysate Respectively.
2. 상기 세포 파쇄물에 1% Fe3O4@CNT 분산액 800㎕를 추가한 후 vortex로 10초간 섞어주었다. 상기 세포 파쇄물과 Fe3O4@CNT 분산액의 혼합물을 셀룰로스 스핀 칼럼(cell㎕ose spin column)으로 옮긴 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리한 다음 1차 용출액을 배출시켰다. 2. Add 800 μl of 1% Fe 3 O 4 @CNT dispersion to the cell lysate, and mix with vortex for 10 seconds. The mixture of the cell lysate and the Fe 3 O 4 @CNT dispersion was transferred to a cellulose spin column, centrifuged at 12,000 rpm for 2 minutes, and the first eluate was discharged.
3. 상기 1차 용출액이 배출된 셀룰로스 스핀 칼럼을 새로운 검체 용기(collection tube)로 옮긴 후 DNA elution buffer 50㎕를 넣었다. 3. The cellulosic spin column from which the primary effluent was discharged was transferred to a new collection tube and 50 μl of DNA elution buffer was added.
4. 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 2차 용출액을 취득하였다. 4. Secondary eluate was obtained by centrifugation at 12,000 rpm for 2 minutes.
5. 취득한 2차 용출액의 DNA 농도를 나노드롭(Nano Drop)으로 정량하였다.5. The DNA concentration of the obtained secondary eluate was quantified as nano drop.
6. 전술한 과정을 10회 반복 시행하여 각 pH에 따른 Fe3O4@CNT의 세포내 DNA 추출 능력을 평가한다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.
6. Repeat the
[비교실험예 3][Comparative Experimental Example 3]
비교실험예 2와 동일한 조건에서 실험을 실시하되, Fe3O4@CNT 분산액 800㎕ 대신 CNTs 분산액 200㎕을 사용하였다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.Experiments were carried out under the same conditions as Comparative Experiment Example 2 except that 200 CN of CNTs dispersion was used instead of 800 Fe of Fe 3 O 4 @ CNT dispersion. The results are shown in Table 1.
이때, CNT와 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 CNTs의 분산액 농도는 Fe3O4@CNT의 TGA 분석을 통하여 Fe3O4나노입자를 제외한 CNT의 질량을 계산하여 정하였다.
At this time, in order to evaluate the degree of DNA binding, CNTs were determined by calculating the mass of CNTs except Fe 3 O 4 nanoparticles through TGA analysis of Fe 3 O 4 @ CNT.
[표 1][Table 1]
[비교실험예 4][Comparative Experimental Example 4]
1. Fe3O4@CNT 분산액 800㎕에 plasmid DNA(50ng/㎕) 50㎕를 넣은 후에 상온에서 10분간 방치하였다. 1. 50 μl of plasmid DNA (50 ng / μl) was added to 800 μl of Fe 3 O 4 @CNT dispersion, and then left at room temperature for 10 minutes.
2. 상기 용액을 셀룰로스 스핀 칼럼(cell㎕ose spin column)으로 옮긴 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리한 후 외부로 액상 물질을 외부로 배출시켜 1차 용출액을 취득하였다.2. The above solution was transferred to a cellulose spin column, centrifuged at 12,000 rpm for 2 minutes, and the liquid material was externally discharged to obtain a first eluate.
3. 상기 1차 용출액이 배출된 셀룰로스 스핀 칼럼을 새로운 검체 용기(collection tube)로 옮긴 후 DNA elution buffer 50㎕를 투입하였다. 3. The cellulosic spin column from which the primary effluent was discharged was transferred to a new collection tube, and 50 μl of DNA elution buffer was added.
4. 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 2차 용출액을 취득하였다. 이때, 취득한 1차 용출액과 2차 용출액의 DNA 농도를 나노드롭(Nano Drop)으로 정량하였다. 4. Secondary eluate was obtained by centrifugation at 12,000 rpm for 2 minutes. At this time, the DNA concentration of the obtained first eluate and the second eluate was quantified by nano drop.
5. 전술한 과정을 10회 반복 시행하여 각 pH에 따른 Fe3O4@CNT의 DNA 결합 능력을 평가하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.5. The above procedure was repeated 10 times to evaluate the DNA binding ability of Fe 3 O 4 @CNT according to each pH. The results are shown in Table 2.
[표 2] [Table 2]
표 2를 살펴보면, 버려지는 1차 용출액의 DNA는 plasmid DNA(50ng/㎕) 50㎕를 기준으로 8%, 11%, 20.4%인 것으로 관찰되었다. 특히, pH가 4와 5인 경우 Fe3O4@CNT와 결합되지 않는 DNA는 11%이하인 것으로 파악되었다.As shown in Table 2, the DNA of the first eluate discarded was observed to be 8%, 11%, and 20.4% based on 50 μl of plasmid DNA (50 ng / μl). Especially, at pH 4 and 5, DNA not binding to Fe 3 O 4 @CNT was found to be less than 11%.
아울러, 2차 용출액으로부터 수득되는 DNA는 82%, 77.2%, 54.6%인 것으로 관찰되었다. 특히, pH가 4와 5인 경우 Fe3O4@CNT를 통해 수득되는 DNA는 75% 이상인 것을 확인할 수 있었다.
In addition, it was observed that the DNA obtained from the second eluate was 82%, 77.2%, and 54.6%. In particular, when the pH was 4 and 5, it was confirmed that the DNA obtained through Fe 3 O 4 @CNT was 75% or more.
[비교실험예 5][Comparative Experimental Example 5]
비교실험예 4와 동일한 조건에서 실험을 실시하되, Fe3O4@CNT 분산액 800㎕ 대신 CNTs 분산액 200㎕을 사용하였다. 그 결과는 표 3으로 나타내었다.
Experiments were carried out under the same conditions as Comparative Experiment Example 4 except that 200 CN of CNTs dispersion was used instead of 800 Fe of Fe 3 O 4 @ CNT dispersion. The results are shown in Table 3.
[표 3][Table 3]
전술한 실험예 1은 본 발명에 따른 핵산 추출방법을 나타내는 실험이고, 비교실험예 1, 3은 특허출원 제10-2011-0025042호에 개시된 핵산 추출법을 나타내는 실험이며, 비교실험예 2는 Fe3O4@CNT 분산액을 기존의 핵산 추출법에 사용한 결과를 확인하기 위한 실험이다. Comparative Experimental Examples 1 and 3 are experiments showing nucleic acid extraction methods disclosed in Patent Application No. 10-2011-0025042, Comparative Experimental Example 2 is an experiment showing nucleic acid extraction methods according to the present invention, and Fe 3 O 4 @CNT dispersion in a conventional nucleic acid extraction method.
이러한 실험 결과, 기존에 개시된 핵산 추출법에서는 원심분리가 반드시 필요한 과정이었으나, 본 발명에서는 원심분리 과정을 거치지 않고 자석을 사용함으로써 핵산을 정제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명에 따른 핵산 추출방법은 원심분리를 이용하지 않고도 원심분리를 이용하는 경우에 근접한 핵산 추출 수율을 확보할 수 있다는 것을 확인하였다.
As a result of these experiments, centrifugation was indispensable in the previously disclosed nucleic acid extraction method. However, in the present invention, it was confirmed that the nucleic acid can be purified by using a magnet without centrifugation. Particularly, it has been confirmed that the nucleic acid extraction method according to the present invention can secure a nucleic acid extraction yield close to the case of using centrifugation without using centrifugation.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the present invention as defined by the following claims. It can be understood that it is possible.
Claims (5)
(ⅱ) 상기 시료와 CNT 분산액의 혼합물에 자기장을 적용하여 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브와 핵산의 결합체를 분리하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 결합체에 DNA 용출 시약을 첨가하여 핵산을 회수하는 단계를 포함하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법.(I) mixing a sample containing a nucleic acid and a CNT dispersion containing carbon nanotubes coated with magnetite particles, and reacting the mixture;
(Ii) applying a magnetic field to the mixture of the sample and the CNT dispersion to separate a complex of the carbon nanotube coated with the magnetite particles and the nucleic acid; And
(Iii) adding a DNA eluting reagent to the binding substance to recover the nucleic acid, wherein the nucleic acid is extracted using the carbon nanotube coated with the magnetite particle.
상기 결합체에 세척 버퍼를 첨가하여 세척하는 단계; 및
상기 세척된 결합체를 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법.The method according to claim 1, wherein between step (ii) and step (iii)
Washing the combined body by adding a washing buffer; And
And drying the washed complex. The method for extracting nucleic acid using the carbon nanotube coated with the magnetite particles according to claim 1,
아민 그룹으로 치환된 탄소나노튜브를 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 단계;
상기 1차 생성물을 1.5M NaOH 수용액에 적가하여 2차 생성물을 생성하는 단계; 및
상기 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하여 건조시키는 단계를 통해 개질된 탄소나노튜브인 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법.The method of claim 1, wherein the carbon nanotubes coated with the magnetite particles
Adding carbon nanotubes substituted with amine groups to an aqueous solution of magnetic particles containing magnetite particles and stirring to produce a primary product;
Adding the primary product to an aqueous 1.5M NaOH solution to produce a secondary product; And
Wherein the carbon nanotube is a carbon nanotube modified by centrifuging the secondary product and recovering and drying the precipitate.
상기 결합체에 DNA 용출 시약을 첨가하는 단계와,
상기 결합체와 DNA 용출 시약의 혼합물을 볼텍싱하는 단계,
상기 볼텍싱을 수행한 혼합물을 원심분리하는 단계, 및
상기 원심분리를 통해 구분된 상층액을 회수하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법.2. The method of claim 1, wherein step (iii)
Adding a DNA eluting reagent to the conjugate,
Vortexing a mixture of said complex and DNA eluting reagent,
Centrifuging the vortexed mixture, and
And recovering the supernatant separated through the centrifugal separation. The method of extracting nucleic acids using the carbon nanotubes coated with magnetite particles according to claim 1,
세포 분해 시약에 의해 세포벽이나 세포막이 분해된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브를 사용한 핵산의 추출방법.The method according to claim 1, wherein the sample
Wherein the cell wall and the cell membrane are decomposed by a cell disintegration reagent.
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|---|---|---|---|---|
| US11865480B2 (en) | 2019-05-07 | 2024-01-09 | Electronics and Telecommunications Research Institute Cancer Rop Co., Ltd. | Nucleic acid purification device and nucleic acid purification method |
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2012
- 2012-10-31 KR KR1020120122754A patent/KR20140074407A/en not_active Ceased
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