KR20140027594A - 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물은 혈당을 유의적으로 낮추는 효과가 있는 동시에 제2형 당뇨병의 치료제로 주로 사용되고 있는 메트포르민(Metformin)과 거의 동등한 수준의 항당뇨 효과를 나타내고, 본 발명의 비만 예방 및 치료용 약학 조성물은 고지방식으로 급이된 실험동물에서 체중과 지방 세포 크기를 유의적으로 감소시키며 비만 치료제로 사용되고 있는 오르리스타트에 비해 동등하거나 우수한 체중 감소 효과 및 지방 감소 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 당뇨병 및 비만 영역에서 신규 적응증을 가진 화합물을 발굴하여 이를 새로운 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 약학 조성물로서 제공하는 것에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 화합물을 발굴하고 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물로서 제공하는 것에 관한 것이다.
인체 내에는 약 200억 개나 되는 지방세포가 존재하고 있으며, 이는 포유류의 생체 내에서 에너지를 축적하거나 방출하는 역할을 담당하고 있다. 지방 세포는 소모되고 남은 에너지를 중성지방 형태로 저장한 후 에너지가 고갈되었을 때 이를 다시 유리지방산과 포도당으로 분해하여 사용한다.
일반적으로 비만은 이러한 저장 및 분해 과정의 불균형으로 인하여 과도한 에너지의 축적이 일어났을 때 발생하는 것으로서 지방세포의 크기가 커지거나 그 수가 증가하는 현상에 기인하는 것으로 보고 있다.
현대인의 약 30~40% 정도가 가지고 있는 비만은 고혈압, 관상동맥질환, 제2형 당뇨병 및 여러 형태의 암을 유발할 수 있는 강한 위험 요소로서 알려져 있다. 특히 비만과 당뇨병은 유병 기작에 있어서 매우 밀접한 관련을 가지고 있다.
당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병), 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병) 및 영양실조성 당뇨병(MRDM)으로 분류는데, 우리나라 당뇨환자의 90% 이상을 차지하는 제2형 당뇨병은 고혈당을 특징으로 하는 대사 질환으로 유전적, 대사적, 환경적인 요인에 의한 췌장 베타 세포의 인슐린 분비 저하 또는 말초 조직에서의 인슐린 저항성 증가로 인해 발생되는 것으로 보고되고 있다.
이와 관련하여 비만에 따라 체지방이 증가하면 인슐린 감수성이 저하되는 증상을 보이며, 특히 복부지방의 축적은 글루코스 내성(glucose intolerance)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 제2형 당뇨병이 발생된 환자에 있어서 비만과 인슐린 저항성은 밀접한 상관관계가 있어 비만이 심할수록 인슐린 저항성도 심해지는 것으로 알려져 있다.
따라서, 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있는 인슐린 감수성 개선제, 예를 들어 치아졸리딘디온(Thiazolidinedione)계 약물과 비구아니드(Biguanide)를 비만치료제로 개발한 사례가 있다. 현재까지 알려진 대표적인 비만치료제로는 제니칼(XenicalTM, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(ReductilTM, 애보트사, 미국), 엑소리제(ExoliseTM, 아토파마, 프랑스) 등이 있다. 그러나, 이러한 약제들은 지방의 연소 및 분해를 촉진시키기보다는 식욕억제와 지방흡수 억제의 기작에 의한 항비만 효능을 가지고 있기 때문에 인슐린 저항성 문제를 근원적으로 해결하지 못하고 비만과 함께 당뇨병을 완전하게 치료할 수 없을 뿐만 아니라 심장질환, 호흡기 질환, 신경계질환 등의 부작용이 보고되고 있는 실정이다.
한편, 최근의 연구에 따르면, 당뇨병을 가진 마우스에서 JNK 신호경로를 억제시킴으로써 인슐린 저항성을 감소시키고 베타-세포 기능을 향상시켰다는 보고가 있으며, JNK 스캐폴드 단백질인 JIP1의 기능상실 돌연변이(loss-of-function mutation)에 의한 JNK 활성 증가가 인간에서의 제2형 당뇨병의 원인이라는 연구결과가 있다(J. Hirosumi et al., Nature (2002), 420, 333-336). 이와 같이 JNK가 비만과 제2형 당뇨병에서의 인슐린 저항성과 관련한 중요한 매개체임이 밝혀지고 있는데, 최근 JNK와 JIP1을 저해하는 당뇨치료제의 후보물질로서 CC105(Current Opinion in Pharmacology (2003), 3:420-425), SP600125 (Y-S Heo et al., The EMBO Journal (2004), 23:2185-2195), AV-7 (K. Yao et al., FEBS Letters (2009), 583:2208-2212) 및 BI-78D3 (J.L. Stebbins et al., PNAS October 28, (2008),105, 43:16809-16813) 등이 스크린된 바가 있다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같이 JNK의 스캐폴드 단백질인 JIP1에 의한 JNK 활성의 증가가 인간에서의 제2형 당뇨병의 원인으로 알려진 점에 주목하고 예의 연구를 거듭한 결과, JNK1-JIP1 상호작용을 저해하거나 JNK의 활성을 저해하는 물질들을 탐색 발굴하였고 동물실험을 통해 당뇨병 및 비만 영역에서 신규 적응증을 가진 화합물들을 확인하기에 이르렀다.
Current Opinion in Pharmacology (2003), 3:420-425
Y-S Heo et al., The EMBO Journal (2004), 23:2185-2195
K. Yao et al., FEBS Letters (2009), 583:2208-2212
J.L. Stebbins et al., PNAS October 28, (2008),105, 43:16809-16813
본 발명의 목적은 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 약학 조성물을 제공하는 것으로서, 보다 상세하게는 당뇨병 및 비만 영역에서 신규 적응증을 가진 화합물을 발굴하여 이를 새로운 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 약학 조성물로서 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 화합물을 발굴하고 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물로서 제공하는 것이다.
전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 비만 예방 및 치료용 약학 조성물은 엔타카폰, 목시플록사신 하이드로클로라이드, 페넬진 설페이트 또는 로페라마이드를 유효성분으로 포함한다. 엔타카폰은 하기 화학식 1, 목시플록사신 하이드로클로라이드는 하기 화학식 2, 페넬진 설페이트는 하기 화학식 3 그리고 로페라마이드는 하기 화학식 4를 갖는 화합물이다.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
화학식 4
본 발명의 일실시예의 비만 예방 및 치료용 약학 조성물은 JNK의 스캐폴드 단백질인 JIP1과 JNK와의 상호작용을 저해하거나 JNK의 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물은 목시플록사신 하이드로클로라이드를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일실시예의 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물은 JNK의 스캐폴드 단백질인 JIP1와 JNK의 상호작용을 저해하거나 JNK의 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
전술한 바와 같은 본 발명의 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
전술한 바와 같은 본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 예를 들어, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사로 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.
또한, 전술한 바와 같은 본 발명의 약학 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 본 발명의 약학 조성물에 있어서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 화학식 1 내지 화학식 4의 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 투여되는 유효성분(화학식 1 내지 화학식 4의 화합물)의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 약물의 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물을 유효성분으로서 투여하는 경우, 1일 1회 투여시 0.001 mg/kg ~ 500 ㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물은 혈당을 유의적으로 낮추는 효과가 있는 동시에 제2형 당뇨병의 치료제로 주로 사용되고 있는 메트포르민(Metformin)과 거의 동등한 수준의 항당뇨 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 비만 예방 및 치료용 약학 조성물은 고지방식으로 급이된 실험동물에서 체중을 유의적으로 감소시키고 지방세포의 크기도 감소시키는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 비만 예방 및 치료용 약학 조성물은 비만 치료제로 사용되고 있는 오르리스타트에 비해 동등하거나 우수한 체중 감소 효과 및 지방 감소 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 JNK1-JIP1의 결합을 저해하는 화합물 처리에 의한 적색 형광 패턴과 녹색 형광 패턴을 나타내는 공초점 현미경 사진이다. 도 1의 (A)에는 알려진 JNK1-JIP1의 결합 저해제로 처리된 경우 적색 형광 패턴과 녹색 형광 패턴이 중첩되지 않는 것을 나타내는 공초점 현미경 사진이며, 도 2의 (B)는 후보 화합물 라이브러리에 의해 JNK1-JIP1의 결합이 저해된 것을 나타내는 공초점 현미경 사진이다. 도 2의 (B)에서 100125-01-F08은 페넬진 설페이트이고 100125-02-F05는 알렉시딘 하이드로클로라이드를 나타낸다.
도 2는 TNF-α에 의해 자극된 3T3-L1 세포에 JNK1-JIP1 상호작용을 저해하는 물질로서 1차적으로 스크린된 후보 화합물들을 처리하여 JNK의 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다.
도 3은 루시퍼라아제 리포터 어세이 결과 그래프로서, 후보 화합물 처리에 따라 음성 대조군에 비해 루시퍼라아제 흡광도가 감소하는 정도가 도시되어 있다.
도 4는 급성 항당뇨 실험을 위해 정상 모델(ICR)과 당뇨질환모델(db/db)에 메트포르민과 목시플록사신 하이드로클로라이드를 투여한 후 GTT(Glucose tolerance test)를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 엔타카폰을 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 목시플록사신 하이드로클로라이드를 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이며, 도 5c는 전체적으로 체중 증가량을 비교한 막대그래프이다.
도 6은 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군에서의 혈당 검사결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군에서의 GTT 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군에서의 ITT 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 백색지방을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 촬영한 현미경 사진으로서, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군의 지방 세포의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 10은 부고환 지방 사진으로서, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군의 부고환 지방의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 11a는 페넬진 설페이트를 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이고, 도 11b는 로페라마이드를 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이며, 도 11c는 전체적으로 체중 증가량을 비교한 막대그래프이다.
도 12는 각 그룹별 간조직을 헤마톡실린 및 에오신 염색 후 촬영한 현미경 사진(A)과, 각 그룹별 간조직을 오일 레드 O 염색 후 촬영한 현미경 사진(B)이다(TS100, Nicon; 400배).
도 13은 백색지방을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 촬영한 현미경 사진으로서, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 각각 투여한 군의 지방 세포의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 14는 부고환 지방 사진으로서, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 각각 투여한 군의 부고환 지방의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 2는 TNF-α에 의해 자극된 3T3-L1 세포에 JNK1-JIP1 상호작용을 저해하는 물질로서 1차적으로 스크린된 후보 화합물들을 처리하여 JNK의 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다.
도 3은 루시퍼라아제 리포터 어세이 결과 그래프로서, 후보 화합물 처리에 따라 음성 대조군에 비해 루시퍼라아제 흡광도가 감소하는 정도가 도시되어 있다.
도 4는 급성 항당뇨 실험을 위해 정상 모델(ICR)과 당뇨질환모델(db/db)에 메트포르민과 목시플록사신 하이드로클로라이드를 투여한 후 GTT(Glucose tolerance test)를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 엔타카폰을 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 목시플록사신 하이드로클로라이드를 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이며, 도 5c는 전체적으로 체중 증가량을 비교한 막대그래프이다.
도 6은 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군에서의 혈당 검사결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군에서의 GTT 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군에서의 ITT 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 백색지방을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 촬영한 현미경 사진으로서, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군의 지방 세포의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 10은 부고환 지방 사진으로서, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여한 군의 부고환 지방의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 11a는 페넬진 설페이트를 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이고, 도 11b는 로페라마이드를 투여했을 경우 체중 감소를 나타내는 그래프이며, 도 11c는 전체적으로 체중 증가량을 비교한 막대그래프이다.
도 12는 각 그룹별 간조직을 헤마톡실린 및 에오신 염색 후 촬영한 현미경 사진(A)과, 각 그룹별 간조직을 오일 레드 O 염색 후 촬영한 현미경 사진(B)이다(TS100, Nicon; 400배).
도 13은 백색지방을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 촬영한 현미경 사진으로서, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 각각 투여한 군의 지방 세포의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
도 14는 부고환 지방 사진으로서, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 각각 투여한 군의 부고환 지방의 크기가 감소한 것을 보여주고 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 후보 화합물 탐색
실시예 1-1: 후보화합물 1차 탐색
우선, 대한민국 공개특허 제10-2010-0052355호(2010. 05. 19.자 공개) 및 대한민국 등록특허 제10-1028875호 (2011. 04. 12.자 공고)에 기술된 실험방법에 따라 JNK1-JIP1 상호작용을 저해하는 화합물을 1차적으로 스크린하였다.
JIP1 (MAPK8IP1, BC068470) 및 JNK1 (MAPK8, NM_002750.2)의 유전자를 형광 단백질(FP)과 융합된 형태로 발현시킬 수 있는 발현 패널을 구축하였다. JIP1 (MAPK8IP1, BC068470) 및 JNK1 (MAPK8, NM_002750.2)의 유전자를 PCR로 증폭하였고, COG(=CMV-ORF-EGFP) 벡터(pcDNA3.1(+); Invitrogen에서 구입하여 GFP를 자체 클로닝한 벡터) 또는 N1-EGFP, N3-EGFP(Clonetech으로부터 구입) 벡터에 JIP1 (MAPK8IP1, BC068470) 및 JNK1 (MAPK8, NM_002750.2)의 유전자를 삽입하여 클로닝하였다.
JNK1은 PCR로 증폭한 후, pEGFP-N1에 XhoI-BamHI 제한효소를 이용하여 클로닝하였고, JNK1과 상호작용하는 JIP1은 여러 다른 유전자와 함께 발현 운반체에 클로닝하였다. 우선, JIP1은 포유동물 발현 벡터인 pEGFP-N1 벡터, 또는 pEGFP-C3 벡터에 클로닝하였고, 이와 같이 클로닝된 발현 벡터에 CSK(다사티닙 타겟 단백질)도 함께 클로닝하였다.
또한, 형광 단백질 (EGFP)과 다른 형광을 띠는 mRFP 유전자의 경우, 발현 벡터에 이미 삽입되어 있는 EGFP 유전자를 떼어내고 mRFP를 다시 클로닝하였다. 그리고, JIP1 전체 단백질 중에 일부분의 단백질만 발현시키기 위하여 JIP1 부분 도메인(partial domain) 클로닝도 함께 진행하였다.
pEGFP-N1-JNK1이 발현된 동물 세포, C3-CSK-mRFP-JIP1이 발현된 동물 세포, 그리고 pEGFP-N1-JNK1와 C3-CSK-mRFP-JIP1가 함께 발현된 동물 세포 내로 스트렙타비딘-자성나노입자와 비오틴-다사티닙을 전달하고 자기장을 인가하여 단백질-단백질 상호작용 (JNK1-JIP1 상호작용)을 확인하였다. pEGFP-N1-JNK1만이 발현된 동물 세포에서는 비오틴-다사티닙이 전달되어도 JIP1의 부재로 인하여 결합이 이루어지지 않으므로 결합에 의한 형광 패턴을 확인할 수 없었다. C3-CSK-mRFP-JIP1만 발현된 동물 세포의 경우, 전달된 비오틴-다사티닙이 다사티닙의 표적 단백질인 CSK와 결합하므로 적색 형광 패턴을 확인할 수 있었다. 마지막으로, pEGFP-N1-JNK1와 C3-CSK-mRFP-JIP1가 함께 발현된 동물 세포에서는 비오틴-다사티닙이 다사티닙의 표적 단백질인 CSK와 결합하여 적색 형광 패턴을 보였고, JIP1 단백질은 JNK1과 결합함으로써 녹색 형광 패턴도 확인할 수 있었다.
그리고 나서, 대한민국 공개특허 제10-2010-0052355호(2010. 05. 19.자 공개) 및 대한민국 등록특허 제10-1028875호 (2011. 04. 12.자 공고)에 기술된 실험방법에 따라, 비오틴-다사티닙과 CSK 단백질을 이용하여 JNK1-JIP1의 결합을 저해하는 화합물을 1차적으로 스크린하였다. 스크린 대상이 되는 화합물 라이브러리로는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려지고 입수가능한 화합물 라이브러리를 사용하였는데, 예를 들어 LOPAC1280TM(Sigma-aldrich), Enzo의 FDA 승인 약물 라이브러리 등을 사용하였다. 화합물 라이브러리 처리에 의해 적색 형광 패턴과 녹색 형광 패턴이 중첩되는지 여부를 확인하였고 JNK1-JIP1의 결합을 저해하는 화합물 처리에 의한 결과는 도 1에 도시되어 있다.
실시예 1-2: 후보 화합물들에 대한 추가적인 시험관내 어세이
상기 실시예 1-1과 같은 과정을 통해 탐색된 후보 화합물들에 대해 추가적인 시험관내 어세이 실험(웨스턴 블롯팅 및 루시퍼라아제 리포터 어세이)을 수행하였다. 각 후보 화합물의 작용에 따른 JNK1 단백질의 양의 변화를 확인하였고, 중성지방 측정 실험을 통하여 지방세포로 분화를 유도한 3T3-L1 지방세포에서 각 후보 화합물에 의해 변화되는 중성지방의 양을 측정하는 실험을 진행하였다.
(1) 웨스턴 블롯팅
공지된 기술에 따라 TNF-α(20 ng/ml)를 5분 처리하는 조건 하에서 3T3-L1 세포를 자극하였고 실시예 1-1에서 JNK1-JIP1 상호작용을 저해하는 물질로서 1차적으로 스크린된 후보 화합물들을 처리하여 JNK의 발현 정도를 확인하였다(Z. Gao et al., JBC(2003), 278, 24944-24950; B. Baan et al., Molecular Endocrinology (2006) 참조). 그리고, 공지된 JNK 저해제인 SP600125 화합물(Y-S Heo et al., The EMBO Journal (2004), 23:2185-2195; K. Assi et al., Immunology (2006) 118, 112-121)을 양성 대조군으로서 10 nM 사용하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 3번 후보 화합물(페넬진 설페이트)과 4번 후보 화합물(아세뷰톨롤 하이드로클로라이드)을 처리한 그룹에서 JNK 단백질의 양이 양성 대조군 화합물 만큼 감소하는 경향을 나타내었다. 예를 들어, 1번 후보 화합물은 메토카르바몰, 2번 후보 화합물은 니페디핀, 3번 후보 화합물은 페넬진 설페이트, 4번 후보 화합물은 아세뷰톨롤 하이드로클로라이드, 5번 후보 화합물은 호모살레이트, 6번 후보 화합물은 에닐코나졸 (enilconazole), 7번 후보 화합물은 하이드로퀴논, 8번 후보 화합물은 니트로푸란토인, 9번 후보 화합물은 나이아신아마이드, 10번 후보 화합물은 호마트로핀 브로마이드이다.
그리고, 상기와 같은 방법으로 반복실험을 진행하여 가장 큰 JNK 저해효과를 보이는 화합물들을 선정하였으며 이들 화합물들에 대해 추가의 시험관내 실험을 진행하였다.
(2) 중성지방 측정
또한, 전술한 바와 같은 방법으로 선정된 JNK 저해 후보 화합물들을 지방세포에 처리하였을 때 중성지방(Triglyceride)의 감소 여부를 정량적으로 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
우선, 3T3-L1 세포에 인슐린을 처리하여 분화를 유도한 후에 실시예 1-1에서 JNK1-JIP1 상호작용을 저해하는 물질로서 1차적으로 스크린된 후보 화합물들을 각각 처리하였다. 그리고 나서, EDTA 방법으로 세포를 떼어낸 후에 NP-40 방법으로 세포를 파쇄하여 Triglyzyme-V(신양화학약품주식회사, E-CG51)를 처리한 후 흡광도 520nm에서 중성지방을 측정하였다(J. Microbiol. Biothechnol, 2008, 18(1), 80-89 참조).
그 결과, JNK 저해제로 알려진 SP600125를 지방세포에 처리하면 분화만 시킨 지방세포에 비해 중성지방의 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었고 일부 후보 화합물들의 경우에도 중성지방 수치가 유의적으로 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 JNK1-JIP1 상호작용 저해 후보 화합물 중 일부는 비만에도 효과가 있을 것으로 예상되었다.
(3) 루시퍼라아제 리포터 어세이(Luciferase reporter assay)
AP-1은 JNK의 다운스트림 유전자로서 JNK는 AP-1의 활성을 조절한다. 따라서, 전술한 바와 같이 선정된 후보 화합물들이 JNK를 저해한다면 AP-1의 활성에도 영향을 미치게 된다. 이러한 사실에 기초하여 공지의 기술에 따라 루시퍼라아제 리포터 어세이를 AP1-Luc 벡터(Agilent)와 루시퍼라아제 어세이 키트(Luciferase assay kit)(Promega)를 사용하여 수행하였다(J. Lee et al, Cell. Mol. Life Sci. 2010, 67:467-481). 흡광도 측정은 프로메가(Promega)의 글로맥스(Glomax) 장비를 이용하여 수행하였다.
흡광도 측정 결과는 AP1+TNF-α(음성 대조군)를 100%로 하여 환산하였고 환산한 그래프가 도 3에 도시되어 있다. 도 3에는 후보 화합물 처리에 따라 음성 대조군에 비해 루시퍼라아제 흡광도가 감소하는 정도가 도시되어 있다. 그 결과, 항비만 및/또는 항당뇨 후보물질을 처리한 실험군에서 총 8개 화합물이 음성 대조군과 비교하였을 때 AP1의 활성이 약 20~35% 감소하는 것으로 확인되었다.
도 3의 (A)에 표시된 P13-A04는 세르트랄린 하이드로클로라이드(Sertraline hydrochloride), P02-H08은 엔타카폰(Entacapone), P04-A04는 목시플록사신 하이드로클로라이드(Moxifloxacin hydrochloride), P04-E03은 발프론산(Valproic acid)이며, 도 3의 (B)에 표시된 P04-F07은 클로로퀴논 디포스페이트(Chloroquine diphosphate), P14-G02는 JLK 6, 100125-01-F08은 페넬진 설페이트, P01-B07은 로페라마이드(Loperamide)이다.
이 중에서 상기 (1)번 웨스턴 블롯팅 실험 결과, 상기 (2)번 중성지방 측정 결과를 종합하여 화합물 4종(엔타카폰, 목시플록사신 하이드로클로라이드, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드)을 선별하였고, 이에 대해 후술하는 바와 같은 동물실험을 수행하였다.
실시예 2: 급성 항당뇨 효능 실험
본 동물실험에는 ICR(정상 쥐)(㈜나라바이오텍에서 구입)와 C57BLKS/JLepr(당뇨모델 마우스, db/db 마우스)(㈜중앙실험동물에서 구입) 수컷을 사용하였고, 항당뇨 및/또는 항비만 효능 후보물질로는 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 사용하였고 양성대조군 약물로는 메트포르민(Metformin)을 사용하였다.
본 실시예에서는 정상 마우스 모델과 유전적으로 당뇨의 가능성이 있는 모델에 대한 급성 항당뇨 효능(단회 투여)을 대표적인 당뇨병 진단 검사 방법인 GTT(Glucose Tolerance Test)와 ITT(Insulin Tolerance Test) 방법을 사용하여 항당뇨 및/또는 항비만 효능 후보물질로 선정한 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드에 대해 평가하였다.
마우스의 사육 환경 조건은 22~24℃, 상대습도 50~30%로 설정하였고, 사육상자당 3마리씩 사육하였다. 오전 8시~오후 8시까지 150~300 룩스(Lux)의 조명을 주었고, 하루에 12시간 점등, 12시간 소등하였다. 사료는 일반식이(18% 단백질, 2018, Harlan Laboratories Inc, USA 제조)를 사용하여 자유섭취시켰고, ITT 실험 진행 전 4시간 이상 절식시켰고, GTT 실험 진행 12시간 전부터 절식시켰다.
GTT 실험, ITT 실험 1시간 전에 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 경구투여용 일회용 주사기를 이용하여 강제 경구투여하였고, GTT 실험군은 GTT 실험을 위하여 실험 0시간째에 글루코스(1.5 g/kg)를 강제 경구투여하였다. ITT 실험군은 실험 0시간째에 인슐린 0.5 U/kg을 투여한 후에 각각 혈액 내 글루코스 레벨 검사를 위하여 0분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분 간격으로 꼬리 정맥에서 채혈하였고 아큐첵 액티브(Accu-Chek active)(Roche)를 이용하여 혈당 수준을 측정하였다.
한편, 양성대조군 약물로는 현재 당뇨 치료제로 사용되고 있는 메트포르민으로 선정하였으며, 250 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 항당뇨 및/또는 항비만 효능 후보물질로 선정한 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드는 각각 15mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg의 투여량 별로 실험군을 나누었고, 각 실험군당 6수의 마우스를 사용하였다. 이와 같은 급성 항당뇨 효능 실험군 구성을 요약하면 다음의 표 1과 같다.
| 그룹 | 투여량 | GTT (개체수) ICR/ db 마우스 |
IST (개체수) db 마우스 |
| 대조군 ICR | D.W 10 mL/kg (비히클) | 6 / 3 | - |
| 대조군 db | D.W 10 mL/kg (비히클) | 6 / 3 | 3 |
| 메트포르민 | 메트포르민 250 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
| MD29_15 | 엔타카폰 15 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
| MD29_50 | 엔타카폰 50 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
| MD29_100 | 엔타카폰 100 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
| MD31_15 | 목시플록사신 하이드로클로라이드 15 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
| MD31_50 | 목시플록사신 하이드로클로라이드 50 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
| MD31_100 | 목시플록사신 하이드로클로라이드 100 mg/kg | 6 / 3 | 3 |
모든 시험결과는 평균치와 표준편차를 사용하여 나타내었으며, 각 군간의 비교를 위해 ANOVA 통계 프로그램(software StatView: version 4.51, Abacus Concepts, Berkeley, CA)을 사용하였고 대조군(ICR 대조군, db 대조군) 및 양성대조군(메트포르민)과 전체군 간의 차이를 비교하여 5% 유의수준(P < 0.05)에서 유의성을 검증하였다. 개체수가 3~6수이므로 통계학적 유의성 판정을 하여 별표(*)로 표기하였다.
체내의 포도당 대사의 능력을 확인하는 당부하 검사인 GTT (Glucose tolerance test)를 수행한 결과, 정상 모델(ICR)과 당뇨질환모델(db/db)에서 메트포르민의 당부하 검사 효능이 월등함을 보여주었다(도 4 참조). 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 정상모델(ICR)에서 목시플록사신 하이드로클로라이드 50 mg/kg을 투여한 경우 대조군에 비하여 유의성 있는 차이를 보였으며, 당뇨질환모델(db/db)에서도 목시플록사신 하이드로클로라이드 50 mg/kg, 100 mg/kg을 투여한 경우 대조군에 비해 유의성 있는 차이를 보였다.
실시예 3: 5주간 투여를 통한 항당뇨 및/또는 항비만 효능 실험
실시예 3-1: 실험방법
실험동물, 실험재료 및 사육조건은 실시예 2와 동일하게 하였다. 본 실시예에서는 정상 쥐와 당뇨 모델 쥐에 약 5주간 (34일) 매일 오후 15:00~16:00에 꾸준히 항당뇨 및/또는 항비만 효능 후보 화합물을 투여하여 매일 식이 섭취량과 체중증가를 체크하였다. 체중과 식이량은 처음 약물 투여 직전에 측정하였고, 이후에 일주일 간격으로 체중과 식이량을 측정하였다. 혈당은 매주 꼬리 정맥에서 채혈 후 아큐첵 액티브(Accu-Check Active)(Roche)를 이용하여 측정하였다. 약물투약 실험 종료 후에는 GTT와 ITT를 진행하였고, 혈중 생화학 검사 및 조직학적 분석을 수행하였다.
혈중 생화학 검사에서는 트리글리세라이드, 총콜레스테롤, 총단백질, 저밀도 지단백 콜레스테롤, 고밀도 지단백 콜레스테롤, 알라닌 아미노기 전이효소, 아스파테이트 아미노기 전이효소, 혈액요소질소, 락트산탈수소효소, 알부민, 크레아티닌 등을 검사하였다. 또한, 실험 동물을 희생하여 주요 장기를 분리한 후, 정소, 비장, 췌장, 폐, 신장, 심장, 뇌, 간 등의 장기의 무게를 측정하였고, 피하 지방, 복막 지방, 장간막 지방 및 부고환 지방의 무게를 측정하였다.
조직학적 검사를 위하여 주요 장기와 지방을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록에 심어서 5 ㎛로 섹션하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 하였다. 당뇨 유발로 인하여 간에 지방이 쌓인 정도를 확인하기 위하여, 간의 경우 지방과 인지질 부분을 염색하는 오일 레드 O (Oil red O) 염색법을 통해 조직을 확인하였다. 조직 샘플 제작 후 글리세린 젤 마운팅 미디어(glycerine Jell mounting Media)로 마운팅하였고 커버 글라스를 덮어 현미경(Nicon, TS100)으로 관찰하였으며 현미경에 내장되어 있는 디지털 카메라로 조직을 촬영하였다.
한편, 모든 통계처리는 평균치와 표준편차를 사용하여 나타내었으며, ANOVA 통계 프로그램(software StatView: version 4.51, Abacus Concepts, Berkeley, CA)을 사용하였다. 정상군(ICR 마우스), db 대조군(미처리), db 비히클 및 양성대조군(메트포르민)과 전체군 간의 차이를 비교하여 5% 유의수준(P < 0.05)에서 유의성을 검증하였다. 통계학적 유의성 판정을 하여 기호(*, **, #)로 표기하였다. 물(음용수)을 10ml/kg으로 약물을 투여하는 시간에 강제 투여한 db 마우스는 db 비히클로 표기하고 강제 투여하지 않은 db 마우스는 db 대조군으로 표기하였다.
실시예 3-2: 측정결과
(1) 체중 증가량 측정 결과
우선, 체중 증가량을 측정한 결과, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 투여한 군의 경우 30일 이후부터는 db 대조군 마우스에 비해 체중이 감소하는 것으로 나타났다. 각 그룹별 몸무게 변화를 정리하면 하기 표 2와 같다.
또한, 위 결과에 기초하여 체중 증가량 및 증가율을 계산하여 그래프를 만들었다(도 5a, 도 5b 및 도 5c 참조). 도 5a 및 5b에 도시된 바와 같이, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 각각 투여했을 경우 양성 대조군인 메트포르민을 투여했을 경우 보다 더 많은 체중 감소가 나타났다(* 별표 표시 참조). 그리고, 도 5c에 도시된 바와 같이, 전체적으로 체중 증가량을 비교한 막대그래프를 살펴보면 확연하게 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드의 투약군에서 체중이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 혈당검사, GTT 및 ITT 결과
34일간의 약물 투여 기간 동안 매주 혈당 검사를 진행하였으며, 약물 투여 종료 후 GTT와 ITT 검사를 진행하였다.
매주 진행한 혈당 검사 결과 목시플록사신 하이드로클로라이드를 매일 100 mg/kg으로 투여한 군에서 메트포르민과 비슷한 정도로 혈당이 떨어진 것을 확인할 수 있었다. 각 그룹별 혈당 검사 결과를 정리하면 하기 표 3과 같고, 도 6에는 이에 기초한 혈당 검사결과 그래프가 도시되어 있다.
도 7에 도시된 바와 같이, GTT 실험 결과에 따르면 목시플록사신 하이드로클로라이드를 50 mg/kg 투여한 군부터 30분, 60분에서 혈당 레벨 상승률이 줄어드는 것을 확인할 수 있었고 이는 양성 대조군인 메트포르민과 유사한 효과를 보이는 것이었다. 또한, 도 8에 도시된 바와 같이, ITT 실험 결과에 따르면, 목시플록사신 하이드로클로라이드를 50 mg/kg 투여한 군부터 30분, 60분에서 혈당 레벨 상승률이 줄어드는 것을 확인할 수 있었고 이는 양성 대조군인 메트포르민과 유사한 효과를 보이는 것이었다. 따라서, 목시플록사신 하이드로클로라이드를 50~100 mg/kg 투약하였을 때 메트포르민과 유사한 효과가 나타난다고 볼 수 있었다.
(3) 간 기능 검사 결과
간 기능 검사와 관련된 혈액 생화학 검사로서 총 단백질(Total Protein; TP), AST, ALT 검사를 진행하였다(하기 표 4 참조).
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 간 무게 | TP | AST | ALT | |||
| D.W(-) | 메트포르민 | MD29 | MD31 | (mg) | (g/dL) | (U/L) | (U/L) | |
| 정상군 | + | - | - | - | 1243.60±20.75 | 6.04±0.10 | 124.20±19.37 | 51.60±15.31 |
| db 대조군 | - | - | - | - | 2495.00±103.45 | 6.78±0.26* | 147.00±15.07 | 131.80±17.60* |
| db 비히클 | + | - | - | - | 2442.40±62.09 | 6.70±0.22* | 139.00±4.42 | 144.60±12.29* |
| 메트포르민 | - | 250 | - | - | 2222.20±27.36 | 6.46±0.09 | 118.60±11.08 | 105.40±13047 |
| MD29_L | - | - | 15 | - | 2322.60±114.01 | 6.42±0.10 | 142.20±10.63 | 147.00±12.13 |
| MD29_M | - | - | 50 | - | 2214.00±115.67 | 6.54±0.14 | 158.40±10.32 | 138.40±11.47 |
| MD29_H | - | - | 100 | - | 1957.40±172.72 | 6.22±0.24 | 129.60±20.85 | 98.40±18.03** |
| MD31_L | - | - | - | 15 | 2479.00±211.30 | 6.34±0.22 | 144.40±18.9 | 109.20±20.51 |
| MD31_M | - | - | - | 50 | 2452.60±68.91 | 6.54±0.19 | 159.20±10.44 | 113.20±8.67 |
| MD31_H | - | - | - | 100 | 2039.40±42.45 | 6.52±0.20 | 150.60±10.47 | 90.00±12.38** |
상기 표 4에 나타난 바와 같이, db 대조군과 db 비히클은 정상 쥐에 비해 당뇨가 유발되어 간의 무게, 총 단백질양, AST 수치 및 ALT 수치가 정상 쥐에 비해 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 엔타카폰(MD29), 목시플록사신 하이드로클로라이드(MD31)를 100 mg/kg으로 투여한 경우에는 db 대조군과 달리 AST 수치, ALT 수치 및 간의 무게가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 특히, 엔타카폰(MD29), 목시플록사신 하이드로클로라이드(MD31)를 50 mg/kg 이상 투여했을 때 메트포르민을 투여한 그룹과 비슷한 정도로 간의 무게나 AST 수치가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
(4) 신장 기능 검사 결과
신장 기능 검사와 관련된 혈액 생화학 검사는 혈액 요소 질소(Blood Urea Nitrogen; BUN), 크레아티닌(Creatinine) 검사가 있다. 혈액 요소 질소 검사는 단백질이 분해되어 생성된 암모니아가 간에서 요소로 분해되며 이를 신장에서 소변을 통하여 배출하기 때문에, 요소 중에 있는 질소의 양을 측정하여 간 기능과 신장 기능의 이상 여부를 결정할 수 있다. 간 기능이 떨어지면 암모니아에서 요소로 분해되는 양이 줄어들어 BUN 수치가 낮아지고, 신장의 기능이 떨어지면 혈중의 요소가 소변을 통해 체외로 잘 배출이 되지 않으므로 BUN 수치가 비정상적으로 증가하게 된다.
크레아티닌 검사란 단백질이 분해됨으로써 생성되는 크레아티닌의 양을 측정하는 것으로서 혈중에 크레아티닌 양이 많으면 신장기능이 저하되어 크레아티닌이 소변을 통해 배출되지 못한다. 따라서, 크레아티닌의 양을 측정함으로써 신장기능을 확인할 수 있다.
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 신장(x2) 무게 | 신장 비대증 | BUN | 크레아티닌 | |||
| D.W(-) | 메트포르민 | MD29 | MD31 | (mg) | (mg/mm) | mg/dL | mg/dL | |
| 정상군 | + | - | - | - | 365.20±2.44 | 22.94±0.15 | 24.62±2.22 | 0.44±0.02 |
| db 대조군 | - | - | - | - | 503.80±8.29* | 32.12±0.64* | 31.44±3.58 | 0.58±0.02* |
| db 비히클 | + | - | - | - | 502.60±14.70* | 31.99±0.95* | 29.44±2.87 | 0.60±0.03* |
| 메트포르민 | - | 250 | - | - | 411.60±25.41# | 25.73±1.74# | 22.92±1.53 | 0.52±0.02# |
| MD29_L | - | - | 15 | - | 427.20±13.12# | 26.51±0.69# | 25.424.01 | 0.50±0.03# |
| MD29_M | - | - | 50 | - | 407.00±12.47# | 26.48±0.61# | 23.94±0.86 | 0.48±0.02# |
| MD29_H | - | - | 100 | - | 432.20±18.09# | 28.08±1.26 | 27.80±2.68 | 0.52±0.02# |
| MD31_L | - | - | - | 15 | 448.40±15.01# | 28.63±1.23 | 22.60±1.83 | 0.50±0.04# |
| MD31_M | - | - | - | 50 | 437.80±12.31# | 27.91±0.78# | 23.60±1.25 | 0.50±0.00# |
| MD31_H | - | - | - | 100 | 446.00±19.51# | 29.52±1.27# | 26.84±2.14 | 0.52±0.02# |
상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 크레아티닌 검사 결과에서 당뇨가 유도된 db 대조군의 경우 일반 쥐에 비해 크레아티닌 수치가 높고, 메트포르민, 엔타카폰(MD29), 목시플록사신 하이드로클로라이드(MD31)를 각각 투약했을 경우 당뇨 유발 쥐에 비해 정상 쥐에 가깝게 크레아티닌 수치가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만아니라, 신장의 무게와 신장 비대증 또한 당뇨 유발 쥐에 비해 약물을 투약했을 경우 유의성 있게 줄어드는 것을 확인하였다(표 5 참조).
(5) 그 외 혈액 생화학 검사 및 지방 조직 검사 결과
CHO(콜레스테롤)는 T-CHO라고도 하는데, 혈액 내 총 콜레스테롤 양을 측정하였다(하기 표 6 참조). 목시플록사신 하이드로클로라이드를 100 mg/kg으로 투약시 정상군 수준으로 콜레스테롤 양이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
TG(=Triglyceride, 중성지방)는 체내에 남아도는 에너지가 중성지방 형태로 축적된 것으로서, 콜레스테롤과 함께 관상동맥질환의 원인이 된다. 하기 표 6의 결과에 따르면, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드 투약군에서 양성대조군인 메트포르민에 비해 중성지방 수치가 1.5~2배 이상 차이가 나는 것을 확인하였으며, db 대조군에 비해서 약 250% 이상 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
LDL(=Low-density lipoprotein cholesterol, 저밀도 지단백 콜레스테롤)은 저밀도 지단백 콜레스테롤이며, 혈관벽에 침착되어 혈관을 딱딱하게 하고 동맥경화를 유발시키기 때문에 나쁜 콜레스테롤이라고도 불린다. 하기 표 6의 결과를 보면, 목시플록사신 하이드로클로라이드 100 mg/kg 투약군은 정상군에 비해 2배 정도 LDL 수치가 적은 것으로 확인할 수 있었으며, 메트포르민 투약군에 비해서도 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 투약한 실험군에서 LDL 수치가 현저히 낮은 것으로 확인할 수 있었다. 또한, HDL 측정 결과와 비교해 봤을 때도 다른 대조군에 비해 HDL이 더 높은 것을 알 수 있으므로 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드가 동맥경화 예방에도 도움이 될 것으로 판단된다.
GLU(=Glucose, 혈당)은 혈액내 포도당량을 측정한 것이다. 하기 표 6의 결과를 보면 양성 대조군인 메트포르민을 투여한 군이 db 대조군에 비해 혈당이 약 160 mg/1L 이상 낮으며, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드 처리군에서는 메트포르민 만큼의 혈당 강하에는 미치지 못하지만 db 대조군에 비해 40~150 mg/1L 이상 혈당을 떨어뜨리는 것으로 확인되었다. 특히, 목시플록사신 하이드로클로라이드를 100 mg/kg 투여할 경우 메트포르민과 비슷한 수준으로 당을 떨어뜨리는 것으로 확인되었는데, 메트포르민 보다 2배 이상 적은 양을 투약하고도 메트포르민과 비슷한 수준으로 혈당을 낮출 수 있는 것으로 보아 목시플록사신 하이드로클로라이드는 새로운 당뇨병 치료제로서 적용가능하다.
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | LDH | T.CHO | TG | HDL | LDL | GLU | |||
| D.W(-) | 메트포르민 | MD29 | MD31 | U/L | mg/dL | mg/dL | mg/dL | mg/dL | mg/dL | |
| 정상군 | + | - | - | - | 235.80 ±030.01 |
120.00 ±2.70 |
12.00 ±2.61 |
85.00 ±3.27 |
10.20 ±1.16 |
146.20 ±5.72 |
| db 대조군 | - | - | - | - | 264.20 ±22.83 |
172.80* ±17.09 |
147.60* ±27.10 |
112.80 ±5.84 |
12.40 ±3.12 |
627.44* ±16.62 |
| db 비히클 | + | - | - | - | 254.20 ±26.32 |
157.80* ±3.43 |
142.20* ±33.94 |
109.40 ±3.33 |
10.40 ±0.51 |
611.78* ±9.12 |
| 메트포르민 | - | 250 | - | - | 185.80 ±14.70 |
162.20 ±3.64 |
98.20 ±37.31 |
105.20 ±2.92 |
12.40 ±0.75 |
443.22** ±11.04 |
| MD29_L | - | - | 15 | - | 275.40 ±8.96 |
166.20 ±20.29 |
50.60** ±13.65 |
112.60 ±9.38 |
7.40# ±1.03 |
551.36** ±16.68 |
| MD29_M | - | - | 50 | - | 264.20 ±42.09 |
135.60 ±7.16 |
51.40** ±15.26 |
96.80 ±0.92 |
8.40 ±2.18 |
568.32** ±14.72 |
| MD29_H | - | - | 100 | - | 230.20 ±30.77 |
137.00 ±12.19 |
53.00** ±9.35 |
96.60 ±10.03 |
6.80# ±1.36 |
550.86** ±12.53 |
| MD31_L | - | - | - | 15 | 222.00 ±48.13 |
164.40 ±14.27 |
81.20** ±16.02 |
104.80 ±1.93 |
9.20 ±1.85 |
572.60** ±10.34 |
| MD31_M | - | - | - | 50 | 265.60 ±37.63 |
132.60 ±14.69 |
27.80**# ±6.74 |
86.20 ±10.82 |
7.60# ±1.29 |
529.14** ±12.24 |
| MD31_H | - | - | - | 100 | 255.40 ±26.79 |
119.80**# ±10.14 |
64.60** ±17.59 |
91.40 ±5.34 |
5.60**# ±1.08 |
476.30** ±9.12 |
한편, HbA1c(Hemoglobin A1c, 당화혈색소)는 혈액에 존재하는 적혈구 내의 혈색소가 포도당과 결합하면서 형성하는 것으로서, 적혈구의 수명이 약 120일 정도이므로 약 3개월간의 혈중 포도당 농도를 확인할 수 있는 실험방법이다. 따라서, 당뇨를 가지고 있는 경우 혈당이 제대로 조절되지 않아 당화혈색소의 수치가 상승하게 된다. 하기 표 7의 HbA1c 측정 결과에 의하면, ICR 마우스에 비해 당뇨를 유전적으로 유발시킨 db/db 마우스에서 HbA1c가 상승하는 것을 볼 수 있으며, 메트포르민을 투약하였을 때, db 비히클에 비해 약 4% 정도 HbA1c 수치가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 목시플록사신 하이드로클로라이드를 100 mg/kg으로 투여했을 경우, db 대조군에 비해 약 3% 정도 HbA1c 수치가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(하기 표 7 참조). 이러한 결과로 볼 때, 목시플록사신 하이드로클로라이드는 장기적으로도 혈당을 낮춘다고 볼 수 있다.
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 피하지방 | 복막지방 | 장간막 지방 | 부고환 지방 | HbA1c | |||
| D.W(-) | 메트포르민 | MD29 | MD31 | mg | mg | mg | mg | % | |
| 정상군 | + | - | - | - | 510.00 ±24.08 | 163.80 ±9.50 |
230.80 ±10.06 |
485.20 ±4.96 |
4.4667 ±0.1173788 |
| db 대조군 | - | - | - | - | 5343.20* ±238.16 |
1430.20* ±44.81 |
1504.80* ±48.32 |
2376.20* ±49.57 |
11.233* ±0.3073181 |
| db 비히클 | + | - | - | - | 4806.40* ±121.25 |
1435.80* ±24.52 |
1512.20* ±58.72 |
2456.60* ±113.06 |
11.633* ±0.2123938 |
| 메트포르민 | - | 250 | - | - | 4865.20 ±159.77 |
1407.00 ±68.44 |
1494.20 ±40.88 |
2186.80** ±28.65 |
7.7667** ±0.4896711 |
| MD29_L | - | - | 15 | - | 4086.60**# ±228.25 |
1227.80**# ±34.45 |
1441.80 ±73.08 |
2230.00 ±126.64 |
10.767 ±0.220101 |
| MD29_M | - | - | 50 | - | 4816.80. ±360.04 |
1199.00**# ±69.84 |
1495.40 ±68.58 |
2241.20 ±70.35 |
10.883 ±0.1077549 |
| MD29_H | - | - | 100 | - | 3659.00**# ±267.57 |
1328.00** ±13.54 |
1429.00 ±192.43 |
2059.20** ±141.34 |
10.383** ±0.1956471 |
| MD31_L | - | - | - | 15 | 4134.20**# ±243.27 |
1297.00 ±69.65 |
1512.20 ±57.93 |
2352.80 ±20.12 |
10.45** ±0.373943 |
| MD31_M | - | - | - | 50 | 4264.80 ±110.75 |
1388.20** ±55.31 |
1410.40 ±44.92 |
2369.80 ±103.66 |
10.033** ±0.2905933 |
| MD31_H | - | - | - | 100 | 3940.20**# ±166.35 |
1256.00** ±45.29 |
1308.40 ±46.86 |
2236.20 ±47.44 |
8.4833**# ±05381553 |
지방 조직은 색깔에 따라 백색지방(White Fat), 갈색지방(Brown Fat)으로 나뉘고, 부위에 따라 피하 지방, 복막 지방, 장간막 지방(내장지방) 및 부고환 지방으로 나뉜다. 해부 후 각 지방을 적출하여 전자 저울에서 무게를 측정하였으며(상기 표 7 참조), 이중 백색지방을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 200배에서 현미경(TS100, Nicon) 관찰을 하여 지방 세포의 크기를 비교하였다(도 9 참조). 도 9에서는 지방 세포의 크기를 비교하기 위해 파란색 화살표로 길이를 표시하였다.
상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 처리한 경우 지방의 무게가 감소하는 것을 알 수 있었으며, 도 9에 도시된 바와 같이, 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드를 처리한 경우 현저히 지방 세포의 크기가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
(6) 부고환 지방 크기의 감소
투약 실험 후 해부시에 각 실험의 그룹별로 동물의 사진을 촬영하였다. 유전적으로 당뇨를 유발시킨 db 대조군 쥐의 경우 당뇨와 비만이 유발되어 정상 쥐에 비해 1.5~2배 정도 큰 것을 볼 수 있으며, 양성 대조군인 메트포르민(250 mg/kg)을 포함하여 엔타카폰(MD29)(100 mg/kg), 목시플록사신 하이드로클로라이드(MD31)(100 mg/kg)를 34일간 투약했을 경우 db 대조군이나 db 비히클에 비해 체중이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 특히, 도 10에 도시된 바와 같이, 유전적으로 당뇨를 유발시킨 db 마우스에 약물을 투여하지 않은 비히클(VEH)에 비해 엔타카폰(29_H)과 목시플록사신 하이드로클로라이드(31_H)를 투약했을 경우, 부고환의 지방이 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 엔타카폰 및 목시플록사신 하이드로클로라이드는 지방을 줄여줌으로써 당뇨의 주된 원인이 되는 비만에도 효과가 있는 것으로 판단된다.
실시예 4: 항비만 효능 실험
실시예 4-1: 실험방법
실험동물, 실험재료 및 사육조건은 실시예 3-1과 유사하게 하였다. 단, 본 실시예에서는 정상 C57BL/6 마우스에 고지방 식이를 하여 유도한 비만유도모델 DIO(Diets induced obesity)를 이용하여 항비만 효능 실험을 수행하였고, 양성 대조군 약물로서 오르리스타트(Orlistat)(대한민국 등록특허 제10-0824704호 참조)를 사용하였다.
식이 사료는 저지방 식이, 고지방 식이 모두 자유 섭취시켰으며, 실험종료 당일 6시간 이상 절식 후 해부를 진행하였다. 오르리스타트 및 항비만 효능 후보 화합물은 8주간 매일 오후 15:00~16:00에 56일간 강제로 경구투여하였다. 체중과 식이량은 처음 약물 투여 직전에 측정하였고, 이후에 일주일 간격으로 체중과 식이량을 측정하였다. 혈당은 매주 꼬리 정맥에서 채혈 후 아큐첵 액티브(Accu-Check Active)(Roche)를 이용하여 측정하였다. 약물투약 실험 종료 후에는 혈중 생화학 검사 및 조직학적 분석을 수행하였다. 이와 같은 항비만 효능 실험군 구성을 요약하면 다음의 표 8과 같다.
| 그룹 | 투여량 | 개체수 |
| 정상군 | D.W 10 ml/kg | 6 |
| DIO 대조군 | 미처리 | 6 |
| DIO 비히클(음성대조군) | D.W 10 ml/kg | 6 |
| 오르리스타트(양성대조군) | 10 mg/kg | 6 |
| MD19 저농도 | 15 mg/kg | 6 |
| MD19 고농도 | 50 mg/kg | 6 |
| MD28 저농도 | 15 mg/kg | 6 |
| MD28 고농도 | 50 mg/kg | 6 |
혈중 생화학 검사에서는 트리글리세라이드, 총콜레스테롤, 총단백질, 저밀도 지단백 콜레스테롤, 고밀도 지단백 콜레스테롤, 알라닌 아미노기전이효소, 아스파테이트 아미노기 전이효소, 혈액요소질소, 락트산탈수소효소, 알부민, 크레아티닌 등을 검사하였다. 또한, 실험 동물을 희생하여 주요 장기를 분리한 후, 정소, 비장, 췌장, 폐, 신장, 심장, 뇌, 간 등의 장기의 무게를 측정하였고, 피하 지방, 복막 지방, 장간막 지방 및 부고환 지방의 무게를 측정하였다.
조직학적 검사를 위하여 주요 장기와 지방을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록에 심어서 5 ㎛로 섹션하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 하였다. 간에 지방이 쌓인 정도를 확인하기 위하여, 간의 경우 지방과 인지질 부분을 염색하는 오일 레드 O (Oil red O) 염색법을 통해 조직을 확인하였다. 조직 샘플 제작 후 글리세린 젤 마운팅 미디어(glycerine Jell mounting Media)로 마운팅하였고 커버 글라스를 덮어 현미경(Nicon, TS100)으로 관찰하였으며 현미경에 내장되어 있는 디지털 카메라로 조직을 촬영하였다.
한편, 모든 통계처리는 평균치와 표준편차를 사용하여 나타내었으며, ANOVA 통계 프로그램(software StatView: version 4.51, Abacus Concepts, Berkeley, CA)을 사용하였다. 정상군, DIO 대조군(미처리), DIO 비히클 및 양성대조군(오르리스타트)과 전체군 간의 차이를 비교하여 5% 유의수준(P < 0.05)에서 유의성을 검증하였다. 통계학적 유의성 판정을 하여 기호(*, **, #)로 표기하였다. 물(음용수)을 10ml/kg으로 약물을 투여하는 시간에 강제 투여한 DIO 마우스는 DIO 비히클로 표기하고 강제 투여하지 않은 DIO 마우스는 DIO 대조군으로 표기하였다.
실시예 4-2: 측정결과
(1) 체중 증가량 측정 결과
정상군(Lean)의 경우 음성대조군에 비하여 7~8g 이상의 체중 차이가 나는 상태에서 시험이 종료되었고, 56일간 페넬진 설페이트 및 로페라마이드 투여를 진행하였을 때 음성대조군과 대비하여 페넬진 설페이트 및 로페라마이드 고농도군에서 각각 5.7g, 7.0g의 차이를 보였다. 페넬진 설페이트 및 로페라마이드의 저농도군 및 고농도군에서 농도별로 변화를 보였으며, 용량 의존적으로 체중증가량이 정체되거나 감소하는 것을 보여주었다.
각 그룹의 체중을 체증 증가량(gain weight)(g)으로 표시하여 그룹 간의 차이를 비교하였다. 정상군과 음성대조군 간의 유의적인 체중 차이가 확인되었고, 페넬진 설페이트 저고농도군 및 로페라마이드 저고농도군에서도 유의적인 차이를 보였으며, 로페라마이드 고농도군에서는 양성대조군인 오르리스타트에 비해서도 유의적인 차이를 보였다. 각 그룹별 몸무게 변화를 정리하면 하기 표 9와 같다.
또한, 위 결과에 기초하여 체중 증가량 및 증가율을 계산하여 그래프를 만들었다(도 11a, 도 11b 및 도 11c 참조). 도 11a 및 11b에 도시된 바와 같이, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 각각 투여했을 경우 양성 대조군인 오르리스타트를 투여했을 경우 보다 더 많은 체중 감소가 나타났다(# 표시 참조). 그리고, 도 11c에 도시된 바와 같이, 전체적으로 체중 증가량을 비교한 막대그래프를 살펴보면 고지방 식이를 했을 때 저지방 식이에 비해 6~7g 정도 체중이 증가한 것을 알 수 있으며, 오르리스타트(10 mg/kg), 페넬진 설페이트(50 mg/kg) 및 로페라마이드(50 mg/kg)를 투약하였을 때 비슷한 정도로 체중이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 간 기능 검사 및 간 조직 검사 결과
간 기능 검사와 관련된 혈액 생화학 검사로서 총 단백질(Total Protein; TP), AST, ALT 검사를 진행하였다(하기 표 10 참조).
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 간 무게 | TP | AST | ALT | |||
| D.W(-) | 오르리스타트 | MD19 | MD28 | (mg) | (g/dL) | (U/L) | (U/L) | |
| 정상군 | + | - | - | - | 999.25±24.39 | 5.80±0.08 | 116.80±12.27 | 45.20±5.03 |
| DIO 대조군 | - | - | - | - | 1356.00±81.16* | 5.77±0.04 | 144.17±21.99 | 53.67±3.93 |
| DIO 비히클 | + | - | - | - | 1388.00±109.98* | 5.92±0.11 | 144.33±14.12 | 56.33±6.56 |
| 오르리스타트 | - | 10 | - | - | 1148.60±65.49** | 5.90±0.07 | 142.83±10.82 | 54.17±7.22 |
| MD19_L | - | - | 15 | - | 1009.00±41.91** | 5.92±0.06 | 116.83±10.47 | 51.83±9.95 |
| MD19_H | - | - | 50 | - | 954.40±20.91**# | 5.77±0.04 | 97.50±7.36**# | 54.63±7.58 |
| MD28_L | - | - | - | 15 | 972.40±33.97** | 5.58±0.07 **# |
133.00±7.21 | 56.50±8.82 |
| MD28_H | - | - | - | 50 | 939.80±21.12**# | 5.73±0.07 | 125.00±18.12 | 43.83±5.80 |
상기 표 10에 표시된 바와 같이, 간의 무게를 측정한 결과 고지방식이로 비만이 유도된 DIO 대조군은 간의 크기가 정상에 비해 약 3g 이상 무게가 나갔으며, 항비만 효능 후보 화합물들과 오르리스타트를 각각 투약한 그룹에서는 다시 간이 정상군과 비슷한 수준의 무게로 줄어든 것을 확인할 수 있었다. AST 수치의 경우 페넬진 설페이트 (50 mg/kg) 투여군에서 감소하는 경향을 보였다(표 10 참조).
간조직 검사 결과, 양성 대조군인 오르리스타트와, 항비만 효능 후보 물질인 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 투여했을 경우 DIO 대조군에 비해 상기 약물 투여군에서 지방이 줄어드는 경향을 확인할 수 있었다(도 12 참조).
(3) 신장 기능 검사 결과
하기 표 11에서 확인되는 바와 같이, 크레아티닌 검사 결과에서 비만이 유도된 DIO 대조군의 경우 일반 쥐에 비해 크레아티닌 수치가 높았고, 오르리스타트, 페넬진 설페이트(MD19), 로페라마이드(MD28)를 각각 투약했을 경우 비만 유발 쥐에 비해 정상 쥐에 가깝게 크레아티닌 수치가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 신장(x2) 무게 | 신장 비대증 | BUN | 크레아티닌 | |||
| D.W(-) | 오르리스타트 | MD19 | MD28 | (mg) | (mg/mm) | mg/dL | mg/dL | |
| 정상군 | + | - | - | - | 393.00±21.06 | 24.77±1.38 | 25.58±0.44 | 0.46±0.02 |
| DIO 대조군 | - | - | - | - | 414.60±19.59 | 25.87±1.25 | 26.67±0.84 | 0.53±0.02* |
| DIO 비히클 | + | - | - | - | 415.60±23.78 | 26.05±1.57 | 26.25±1.38 | 0.52±0.02 |
| 오르리스타트 | - | 10 | - | - | 415.40±15.57 | 25.98±0.96 | 22.15±1.61 | 0.47±0.02 |
| MD19_L | - | - | 15 | - | 375.20±11.43 | 23.58±0.75 | 24.12±1.90 | 0.47±0.02 |
| MD19_H | - | - | 50 | - | 368.40±8.04 | 23.17±0.52 | 23.15±1.07 | 0.48±0.02 |
| MD28_L | - | - | - | 15 | 376.80±15.91 | 23.64±1.00 | 26.23±2.66 | 0.47±0.02 |
| MD28_H | - | - | - | 50 | 374.00±21.22 | 23.60±1.37 | 23.57±1.55 | 0.50±0.03 |
(4) 심장 기능 검사 결과
심장 기능을 위한 검사에서는 간 기능 생화학 검사에서 시행하였던 AST 검사를 주요 지표로 삼았으며, 심장의 무게를 통하여 심장 비대증을 확인하였다. 조직검사를 통하여 심장 조직의 섬유화 여부를 확인하는 방법으로 분석을 하였다(A. Lim et al., BMC Pharmacology (2010), 10:14).
하기 표 12에 표시된 바와 같이, 고지방 식이 결과, 비만이 유도되어 심장이 정상군에 비해 커지고 비대증도 커짐을 확인할 수 있으며, 오르리스타트와 항비만 효능 후보 화합물인 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 투여하였을 경우, 심장의 무게가 정상군에 가깝게 회복되는 것으로 나타났다. AST 수치의 경우 페넬진 설페이트 (50 mg/kg) 투여군에서 감소하는 경향을 보였다(표 12 참조).
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 심장 무게 | 심장비대증 | AST | |||
| D.W(-) | 오르리스타트 | MD19 | MD28 | (mg) | (mg/mm) | (U/L) | |
| 정상군 | + | - | - | - | 139.75±4.46 | 8.81±0.31 | 116.80±12.27 |
| DIO 대조군 | - | - | - | - | 156.60±3.67* | 9.77±0.22* | 144.17±21.99 |
| DIO 비히클 | + | - | - | - | 157.40±6.54* | 9.86±0.42* | 144.33±14.12 |
| 오르리스타트 | - | 10 | - | - | 138.60±3.96** | 8.67±0.24** | 142.83±10.82 |
| MD19_L | - | - | 15 | - | 141.40±4.67** | 8.88±0.29** | 116.83±10.47 |
| MD19_H | - | - | 50 | - | 143.80±3.33** | 9.04±0.20 | 97.50±7.36**# |
| MD28_L | - | - | - | 15 | 138.40±1.60** | 8.68±0.11** | 133.00±7.21 |
| MD28_H | - | - | - | 50 | 141.40±3.06** | 8.92±0.21** | 125.00±18.12 |
(5) 그 외 혈액 생화학 검사 및 지방 조직 검사 결과
CHO(콜레스테롤)는 T-CHO라고도 하는데, 혈액 내 총 콜레스테롤 양을 측정하였다(하기 표 13 참조). 로페라마이드를 15mg/kg, 50mg/kg으로 투약시 정상군 수준으로 콜레스테롤 양이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 이러한 결과로부터 로페라마이드가 양성 대조군으로 사용한 오르리스타트 보다 낮은 투여량으로 콜레스테롤을 낮출 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
TG(=Triglyceride, 중성지방)는 체내에 남아도는 에너지가 중성지방 형태로 축적된 것으로서, 콜레스테롤과 함께 관상동맥질환의 원인이 된다. 하기 표 13의 결과에 따르면, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드 투약군에서 DIO 비히클에 비해 중성지방 수치가 2배 이상 줄어든 것을 확인할 수 있었고, 양성 대조군인 오르리스타트 투여시 줄어든 중성지방 수치와 비슷한 것을 확인할 수 있었다.
LDL(=Low-density lipoprotein cholesterol, 저밀도 지단백 콜레스테롤)은 저밀도 지단백 콜레스테롤이며, 혈관벽에 침착되어 혈관을 딱딱하게 하고 동맥경화를 유발시키기 때문에 나쁜 콜레스테롤이라고도 불린다. 하기 표 13의 결과를 보면, 로페라마이드 50 mg/kg 투약군은 정상군에 비해서도 약 30%정도 LDL수치가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 투약한 실험군은 오르리스타트 투약군과 비교하였을 때 LDL 수치가 비슷하거나 낮은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 페넬진 설페이트 및 로페라마이드는 동맥경화 예방에 도움이 될 것으로 판단된다.
GLU(=Glucose, 혈당)은 혈액내 포도당량을 측정한 것이다. 하기 표 13의 결과를 보면 DIO 대조군과 DIO 비히클은 고지방 식이로 인하여 정상군에 비해 혈당이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 로페라마이드를 투약하였을 때 DIO 비히클에 비해 혈당이 약 20 mg/lL 이상 낮았고 양성 대조군인 오르리스타트에 비해서도 혈당이 낮았다.
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | LDH | T.CHO | TG | HDL | LDL | GLU | |||
| D.W(-) | 오르리스타트 | MD19 | MD28 | (U/L) | (mg/dL) | (mg/dL) | (mg/dL) | (mg/dL) | (mg/dL) | |
| 정상군 | + | - | - | - | 246.00 ±36.35 |
173.40 ±29.21 |
21.80 ±8.28 |
95.20 ±13.88 |
13.20 ±2.71 |
143.82 ±7.56 |
| DIO 대조군 | - | - | - | - | 321.50 ±17.44 |
197.83 ±17.52 |
51.33 ±14.54* |
103.50 ±11.60 |
12.50 ±0.96 |
182.42 ±7.31* |
| DIO 비히클 | + | - | - | - | 370.67 ±51.53 |
203.00 ±9.97 |
47.33 ±11.08* |
110.83 ±1.76 |
12.00 ±1.21 |
175.00 ±6.94* |
| 오르리스타트 | - | 10 | - | - | 355.17 ±45.28 |
179.67 ±5.50 |
16.83 ±5.40** |
104.83 ±1.85 |
12.00 ±1.10 |
168.40 ±1.91 |
| MD19_L | - | - | 15 | - | 305.50 ±58.48 |
189.83 ±3.33 |
11.83 ±3.19** |
103.83 ±3.02 |
11.00 ±0.52 |
170.63 ±4.86 |
| MD19_H | - | - | 50 | - | 312.33 ±45.69 |
170.00 ±8.52 |
16.17 ±2.30** |
98.00 ±1.91 |
10.33 ±1.02 |
163.17 ±4.37 |
| MD28_L | - | - | - | 15 | 336.17 ±.38.43 |
141.17 ±22.23** |
20.00 ±3.76** |
90.33 ±9.53 |
7.17 ±1.35**# |
153.25 ±3.08**# |
| MD28_H | - | - | - | 50 | 303.67 ±45.40 |
140.83 ±25.08** |
14.50 ±3.19** |
91.17 ±9.45 |
9.17 ±2.32 |
148.72 ±3.14**# |
지방 조직은 색깔에 따라 백색지방(White Fat), 갈색지방(Brown Fat)으로 나뉘고, 부위에 따라 피하 지방, 복막 지방, 장간막 지방(내장지방) 및 부고환 지방으로 나뉜다. 해부 후 각 지방을 적출하여 전자 저울에서 무게를 측정하였으며(하기 표 14 참조), 이중 백색지방을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 200배에서 현미경(TS100, Nicon) 관찰을 하여 지방 세포의 크기를 비교하였다(도 13 참조). 도 13에서는 지방 세포의 크기를 비교하기 위해 파란색 화살표로 길이를 표시하였다.
| 그룹 | 투여량(mg/kg) | 피하 지방 | 복막 지방 | 장간막 지방 | 부고환 지방 | |||
| D.W(-) | 오르리스타트 | MD19 | MD28 | (mg) | (mg) | (mg) | (mg) | |
| 정상군 | + | - | - | - | 364.00 ±23.93 |
167.75 ±7.19 |
179.25 ±20.74 |
771.25 ±101.02 |
| DIO 대조군 | - | - | - | - | 2397.40 ±309.02 |
1009.00 ±33.62 |
594.40 ±48.71 |
2083.40 ±87.41 |
| DIO 비히클 | + | - | - | - | 2214.20 ±151.87 |
968.40 ±94.09 |
584.60 ±21.60 |
2043.00 ±194.81 |
| 오르리스타트 | - | 10 | - | - | 1473.20 ±226.14 |
740.80 ±59.42 |
411.40 ±43.14 |
1619.20 ±90.66 |
| MD19_L | - | - | 15 | - | 1807.20 ±114.20 |
918.20 ±61.59 |
468.00 ±83.57 |
2034.20 ±152.81 |
| MD19_H | - | - | 50 | - | 1282.40 ±89.79 |
702.40 ±34.14 |
331.40 ±35.94 |
1421.80 ±104.79 |
| MD28_L | - | - | - | 15 | 1766.60 ±137.16 |
938.40 ±74.90 |
523.80 ±61.33 |
1910.20 ±96.69 |
| MD28_H | - | - | - | 50 | 613.00 ±159.13 |
385.40 ±94.04 |
227.40 ±26.24 |
921.20 ±123.06 |
상기 표 14에서 확인되는 바와 같이, 고지방 식이로 비만을 유발시킨 DIO 대조군 및 DIO 비히클에 비해 페넬진 설페이트 및 로페라마이드를 투약한 실험군에서 현저히 지방 세포의 크기가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 특히, 로페라마이드(50 mg/kg) 투여군의 경우 정상군의 지방세포와 비슷한 크기로 지방세포의 크기가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 13 참조).
(6) 부고환 지방 크기의 감소
투약 실험 후 해부시에 각 실험의 그룹별로 동물의 사진을 촬영하였다. 고지방 식이 요법으로 비만을 유도한 DIO 쥐의 경우 비만이 유발되어 정상군에 비해 1.5~2배 정도 큰 것을 볼 수 있었으며, 양성 대조군인 오르리스타트(10 mg/kg)를 포함하여 페넬진 설페이트(MD19)(50 mg/kg), 로페라마이드(MD28)(50 mg/kg)를 56일간 투약했을 경우 DIO 대조군이나 DIO 비히클에 비해 육안으로도 체중이 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
특히, 고지방 식이로 비만을 유도한 그룹(Disease) 중에서 약물을 투여하지 않은 비히클(VEH)에 비해 약물을 투여한 그룹의 지방이 줄어든 것을 확인할 수 있었으며, 약물을 투여하지 않은 비히클(VEH)과 양성 대조군인 오르리스타트(Orli)에 비해 페넬진 설페이트(19_H)와 로페라마이드(28_H)를 투약했을 경우, 부고환의 지방이 훨씬 더 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 14 참조).
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (6)
- 엔타카폰, 목시플록사신 하이드로클로라이드, 페넬진 설페이트 또는 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
JNK의 스캐폴드 단백질인 JIP1과 JNK와의 상호작용을 저해하거나 JNK의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 또는 엘릭시르제(elixirs)의 경구 투여용 제형으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학 조성물. - 목시플록사신 하이드로클로라이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서,
JNK의 스캐폴드 단백질인 JIP1과 JNK와의 상호작용을 저해하거나 JNK의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 또는 엘릭시르제(elixirs)의 경구 투여용 제형으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20120723 |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |