KR20020059444A - 염기서열 결정법 - Google Patents

Abstract

폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법으로, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드와 상호작용하고 상기 폴리뉴클레오티드에 따라 진행되는 효소내의 구조변화의 검출에 의존한다. 구조적 변화의 검출은 상기 효소에 결합된 형광단의 변화를 측정함으로써 수행된다.

Description

염기서열 결정법{DNA SEQUENCING METHOD}

폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 능력은 과학적으로 매우 중요하다. 예를 들면, 인간 게놈 프로젝트는 인간 게놈에 암호화되어 있는 DNA의 30억개의 염기의 지도를 작성하고 서열을 결정하기 위한 대규모의 국제적 활동이다. 완성되면, 얻어진 서열의 데이타베이스는 생물의학 연구에서 유례없는 능력의 수단이 될 것이다. 상기 프로젝트의 성공적인 완성에 대한 가장 중요한 장애물은 서열방법에 사용되는 기술에 관한 것이다.

대규모 염기서열 결정에 일반적으로 사용되는 중요한 방법은 사슬 결정법이다. 이 방법은 Sanger 및 Coulson에 의해 최초 개발되었고(Sangeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997;74: 5463-5467), 폴리머라제 반응에서 발생 초기의 폴리뉴클레오티드 사슬에 결합되는 4개의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 디데옥시 유도체의 사용에 의존한다. 결합 후, 디데옥시 유도체들은 폴리머라제 반응을 종결시키고, 그 다음 생성물은 겔 전기영동으로 분리되고, 특정 디데옥시 유도체들이 사슬에 결합되는 위치를 알아내기 위해 분석된다.

비록 상기 방법이 널리 이용되고 믿을만한 결과를 생산하지만, 상기 방법은느리고 노동집약적이며 비싸다.

대체적인 서열방법이 EP-A-0471732에 제안되어져 있고, 상기 방법은 뉴클레오티드가 표적과 상보적인 발생 초기의 폴리뉴클레오티드 가닥에 결합되는 것을 검출하기 위해 분광 장치를 사용한다. 이 방법은 주형과 프라이머의 고정된 복합체에 의존하며, 이것은 오직 하나의 상이한 뉴클레오티드를 함유하는 흐름을 보여준다. 그 다음, 분광술을 사용하여 주형 전사(copy)의 폴리머라제 촉매화 성장으로부터 발생된 시간-의존 시그널을 측정한다. 기재된 분광술은, 소멸파장 내에서 분석체에서의 변화를 측정하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분광법과 형광측정법이다. 그러나, 상기 방법의 한계가 인식된다; SPR법에 대해 가장 심각한 점은, 전사가닥 크기의 성장에 따라, 시그널의 절대 크기도 소멸파장 안에서 가닥의 이동에 기인하여 성장하여, 증가물을 검출하는 것을 어렵게 한다. 형광 측정술은 발생 초기 폴리뉴클레오티드 사슬의 성장과 관련된 형광단(fluorophores)으로부터의 바탕 간섭이 증가하는 단점이 있다. 사슬이 성장함에 따라, 바탕 '잡음'이 증가하고 각 뉴클레오티드 결합을 검출하는데 필요한 시간이 길어진다. 이것은 상기 방법이 큰 뉴클레오티드의 배열에 사용되는 것을 엄격히 제한한다.

단일 단편 폴리뉴클레오티드 배열 접근법은 WO-A-9924797과 WO-A-9833939에 개요가 설명되어 있고, 이들 모두는 단일 라벨된 뉴클레오티드 분자들의 형광검출을 이용한다.

이들 단일 뉴클레오티드들은, 흐름 중에서 광학 트랩으로 유지되는(Jett,et al., J. Biomol. Struc. Dyn, 1989; 7:301-309) 엑소뉴클레아제 분자의 작용에 의해 주형 뉴클레오티드로부터 쪼개진다. 이들 쪼깨어진 뉴클레오티드들은 그 다음 수정 흐름 세포내에서 하류방향으로 흐르고, 레이저 여기된 후 민감한 검출 시스템에 의해 검출된다. 그러나, 상기 방법의 한계가 인식된다: 엑소뉴클레아제에 관하여 가장 심각한 것은 라벨된 뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제 효소의 진행도에 심하게 영향을 미친다는 사실이다. 본 방법의 또 다른 한계는 폴리뉴클레오티드 단편을 고정화하는데 사용되는 비오틴 비드에 뉴클레오티드가 '점착'하고, 그 결과 뉴클레오티드에서의 흐름이 상에서 벗어나게 되며; 초기 효소적 라벨화 공정의 비효율과 길이가 제한되며; 및 네개의 상이한 분자들간의 여기 '교차'에 의한 에러율등이 상당히 증가되는 것을 포함한다.

그러므로, 바람직하기는 단일 단편 수준에서 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 개선된 방법으로, 속도 및 서열화된 폴리뉴클레오티드의 단편 크기가 상당히 증가하며, 바람직하기는 자동공정으로 실시되며, 기존 방법과 관련하여 복잡성과 비용이 감소되는 방법이 요구된다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 결정에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용하는 공초점 현미경 장치의 개략도이다.

도 2는 형광공명 에너지 전이 후 얻은 트레이스를 나타내며, 각각의 피크는 특정 뉴클레오티드의 검출을 나타낸다.

본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되고 표적 뉴클레오티드에 따라 진행하는(process along) 효소내의 구조적 변화를 측정함에 의해 결정될 수 있다는 인식을 근거로 한다. 발생하는 구조적 변화의 정도는 표적 위의 개개의 뉴클레오티드가 효소와 접촉하는 것에 따라 다르다.

본 발명의 제 1면에 따르면, 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법은

(ⅰ)표적 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있고 상기폴리뉴클레오티드에 따라 진행할 수 있는 효소와, 효소 활성을 유발하기에 충분한 조건하에서 반응시키는 단계;

(ⅱ)효소가 폴리뉴클레오티드에 따라 진행함에 따른 효소내의 구조변화를 검출하는 단계로 이루어진다.

바람직한 구현예에서, 효소는 상보 가닥을 연장하는 공정 중 표적과 작용하는 폴리머라제 효소이다. 효소는 통상적으로 한정된 영역 내에서 반응을 집중시키기 위해 고형 담지에 고정화된다.

본 발명의 제 2면에 따르면, 효소는 그의 특성이 효소가 구조 변화를 겪음에 따라 변하는 일차 결합 검출가능 라벨을 포함한다. 효소는 또한, 일차 라벨과 작용할 수 있는 이차 결합 검출성 라벨을 포함하며, 여기서 상호작용 정도는 효소 내의 구조적 변화에 의존한다. 통상적으로, 일차 라벨은 에너지 수용체이고 이차 라벨은 에너지 공여체이며, 구조 변화는 두 라벨사이의 에너지 전이를 측정함으로써 검출된다.

본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 형광 공명 에너지 전이(FRET)가 표적 폴리머라제와 상호작용하고 표적 폴리머라에 따라 진행되는 효소 내의 구조변화를 검출하여, 그것에 의해 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는데 사용된다. 형광 공명 에너지 전이는, 각각 효소에 결합된 FRET 공여체와 수용체 라벨 사이에서 실시될 수 있다. 선택적으로, 라벨 중 하나는 효소에 결합되며 다른 라벨은 폴리뉴클레오티드에 결합된다.

추가의 구현예에 따르면, 검출가능하게 라벨된 효소의 사용은, 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해, 표적 폴리뉴클레오티드와 상호작용하며 상기 폴리뉴클레오티드에 따라 진행되고, 여기서 상기 라벨은 효소가 폴리뉴클레오티드에 따라 진행함에 따라 그의 검출가능한 특성이 변한다.

추가의 관점에 따르면, 고형 지지체는 표적 뉴클레오티드와 상호작용하고 표적 뉴클레오티드에 따라 진행할 수 있는 능력을 갖는 적어도 하나의 고정화 효소를 포함한다.

추가의 관점에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하는 시스템은 상기 정의와 같은 고형 지지체 및 라벨을 검출하기 위한 장치를 포함한다.

본 발명은 종래의 기술에 비해 몇몇 장점을 제공한다. 일단 폴리머라제 효소가 폴리뉴클레오티드 연장의 순환을 시작하면, 가닥으로부터 떨어지기 전에 수천개의 뉴클레오티드들이 폴리머라제화되기 쉽다. 추가로, 어느 특정 폴리머라제 시스템은 주형분자를 둘러싸는 '슬라이딩 클래프'(폴리머라제 III)를 통해, 또는 주형을 부분적으로 둘러싸는 분자 후크(예를 들면 T7:티레오독신 복합체)를 통해 그들 자신을 주형 폴리뉴클레오티드에 고정시키거나 또는 맬 수 있다.

본 발명은 또한, 초당 백개의 염기쌍의 속도로, 한차례에 수십 킬로베이스(kb) 이상을 서열화할 수 있다. 이것은 DNA의 단일 단편에서 서열화한 결과이다. DNA의 단일 단편을 서열화하는 장점은 서열화 속도가 이용하는 효소 시스템에 의해 결정되고, 간접, 전체적인(summated) 반응에 의존하지 않으며, 그러므로 더 민감하게 반응한다. 빠른 속도 만큼 중요한 것은 DNA의 큰 단편을 서열화하는 능력이다. 이것은 서브클로닝의 양과 서열화 정보의 메가베이스를 조립하는데요구되는 중복서열의 수를 상당히 감소시킬 것이다. 단일 단편 접근의 추가의 장점은 현 서열화 노력을 어렵게하는, 아크릴아미드와 같은 위험 폐기물의 처분과 관련된 문제를 제거한다는 것이다.

폴리뉴클레오티드를 서열화하는 본 방법은 효소와 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 구조 변화의 분석을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 "뉴클레오티드"라는 용어는 광의로 해석될 것이며, 기타 유사 혼성 핵산 분자, 예를 들면 펩티드 핵산(PNA)을 포함할 뿐만 아니라 변형 DNA와 RNA를 포함하여 DNA와 RNA를 포함한다.

효소는 폴리머라제 효소일 수 있고, 구조 변화는 폴리머라제가 표적 뉴클레오티드와 상보적인 발생 초기의 가닥에 뉴클레오티드를 결합시킬 때 일어난다. 구조 변화가 각각의 다른 뉴클레오티드, A, T, G 또는 C에 대해 다르며, 그러므로 변화의 측정으로 어떤 뉴클레오티드가 결합했는지를 확인할 수 있다는 것이 발견되었다.

선택적으로, 효소는 폴리머라제와 상호작용에 포함되는 어느 것, 예를 들면 헬리카제 효소, 프라이마제와 전효소이다. 효소가 폴리뉴클레오티드에 따라 진행할때, 그의 구조는 효소와 접촉되는 표적의 뉴클레오티드에 따라 변할 것이다.

효소에서의 구조 변화를 검출하는 한 방법은 안정한 에너지 공여체 표지와 안정한 에너지 수용체 표지사이의 공명 에너지 전이를 측정하는 것이다. 한 예에서, 공여체와 수용체는 각각 효소와 결합하고, 표적 폴리뉴클레오티드와의 상호작용에 의해 발생되는 효소내의 구조 변화는 표지들의 상대적 위치를 변경시킨다. 위치의 차이는 발생한 에너지 전이를 반영하며 효소와 접촉된 특정 뉴클레오티드의 특성을 반영한다. 선택적으로, 한 표지가 효소 위에 위치하고 나머지는 표적의 뉴클레오티드에 또는 표적과 상보적인 가닥에 결합되는 뉴클레오티드에 위치한다.

형광 공명 에너지 전이(FRET)의 사용은 본 발명의 바람직한 구현예이다. 이 기술은 2 내지 8 nm 규모에서 거리를 측정할 수 있고 공여체 형광단과 수용체 형광단 사이의 거리-의존 에너지 전이에 의존한다. 본 기술은 뛰어난 정적 공동 집적 능력 뿐만 아니라 분자간 및 분자내 FRET에 대한 두개의 형광단 사이의 거리 또는 배위의 동적 변화에 대한 정보를 제공한다. 에너지의 첫번째 측정은 단일 공여체 및 단일 수용체(단일 FRET 쌍)사이의 전이이므로(Ha,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 96:893), 촉매반응 동안 평형 단백질 구조 변동과 효소-기질 상호작용을 조사하고(Ha,et al., 1999 Supra), 및 용액 내의 개개의 확산 분자들의 배치 상태와 서브-개채군들을 확인하기 위해 리간드 수용체 공동집적의 연구에 사용되고 있다(Schutz, et al., Biophys. J., 1998; 74:2223). 이들 모든 변수들은 본 발명의 범위내에서 적용가능하다고 생각된다.

본 발명은 또한, 오직 단일 표지만을 요구하는 측정방법을 이용하여 실시될수 있다. 단일 분자 수준에서 효소의 국지환경의 변화를 측정할 수 있는 어느 시스템이 본 발명의 허용할 수 있는 구현예이다. 뉴클레오티드 진행성 효소 및/또는 그의 기질(들)에 결합된 단일 형광 프로브의 다양한 특성이, 뉴클레오티드 결합 사건에 특이한 효소 시스템/분자 환경 내에 또는 밀접하게 변하는 자료를 제공하기 위해, 본 발명의 문맥에서 설명될 수 있다. 이와 같은 변수들은, 분자간 상호작용, 효소적 활동도, 반응 속도, 구조 동력, 분자 운동의 자유, 및 활성 및 화학적 및 정전기적 환경의 변경을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 단일 형광단의 흡수 및 방출 전이 쌍극자는 분극 여기광을 이용하거나 또는 방출분극을 분석하거나, 또는 두개 모두에 의해 결정될 수 있다. 단단히 결합되거나 또는 회전상으로 확산되는 매달린 표지의 쌍극자 배열의 일시적 변화가 거대분자계 또는 그의 서브유니트의 각 운동을 보고할 수 있고(Warshaw,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95:8034), 따라서 본 발명에 적용될 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 표지는 당업자들에게 명백할 것이다. 바람직하기는, 표지는 Xue,et al., Nature, 1995; 373:681에 기재되어 있는 것과 같은, 형광 표지이다. 대체적으로, 그린 형광 단백질(Lu,et al., Science, 1998; 282:1877) 등의 형광 효소가 사용될 수 있다.

그러나, 본 발명의 바람직한 구현예에는 테트라메틸로다민(TMR)과 같은 폴리뉴클레오티드 진행효소에 공유결합으로 및 부위-특이적으로 결합되는 작은 형광분자들의 이용이 포함된다.

본 발명에 형광 표지가 사용된다면, 그들의 검출은 여기 파장에 반복적으로 노출됨에 의해 일어나는 광표백에 의해 영향을 받을 것이다. 이 문제를 피할 수 있는 하나의 방법은 많은 서열 반응을 실시하지만, 한번에 극소수의 형광 시그널을 검출하는 것이다. 이 반복 공정을 이용함으로써, 시그널의 정확한 서열을 결정할 수 있고 폴리뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들면, 다수의 효소들을 고형 지지체에 고정시키고 그들을 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴에 의해, 서열화 반응이 거의 동시에 개시될 것이다. 형광의 여기 및 검출은, 광표백이 분명해질 때까지 잠시 전체 반응의 일부로 국지화될 수 있다. 이 때, 여기 및 검출은 서열화를 계속하기 위해 반응의 다른 부분으로 전이될 수 있다. 모든 반응이 상대적으로 하나의 상이므로, 정확한 서열이 최소의 서열 조합으로 얻어진다.

표지는 공유결합 또는 다른 결합에 의해 효소에 결합될 것이다. 표지를 효소에 결합시키기 위해 여러 전략이 사용될 수 있다. 전략에는 특이 및 직교 염료 표지화 단백질에 대해 시스테인과 케톤 핸들을 도입시키기 위해, 특정부위 돌연변이유발 및 인공 아미노산 돌연변이유발(Anthony-Cahil,et al., Trends Biochem. Sci., 1989; 14:400)을 이용하는 것을 포함한다(Cornish,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91:2910).

폴리뉴클레오티드 진행효소를 태그하는데 사용되는 또 다른 구현예는 공지의 분자 클로닝 방법을 통해 그린 형광 단백질(GFP)을 진행효소(예를 들면 폴리머라제)에 융합시키는 것이다(Pierce, D.W.et al., Nature, 1997; 388:338). 이 기술을 구조적 변화(Miyawaki,et al., Nature, 1997; 388:882) 및 국지적 pH변화(Llopis,et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 1998; 95:6803)를 측정하는데 적용할 수 있다는 것이 설명되었다.

효소를 고정화시키는데 이용할 수 있는 적당한 지지체는 당업자들에게 명백할 것이다. 실리콘, 유리 및 세라믹 재료들이 사용될 수 있다. 지지체는 일반적으로 평평한 표면이다. 효소 고정화는 공유결합 또는 기타 수단으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 공유결합으로 연결된 분자들이 적절히 제조된 효소들에 결합될 수 있다. 결합 방법은 당업자들에게 알려져 있다.

고형 지지체에 하나 이상의 효소가 고정화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 다수의 효소들이 결합한다. 이것은 많은 독립된 반응들을 모니터할 수 있게 하며, 상기와 같은 광표백 문제들을 극복할 수 있게 한다.

효소 내의 구조 변화를 측정하는데 많은 다양한 기술들이 사용될 수 있다. 공명에너지 전이를 표면 플라즈몬 공명(SPR) 또는 형광 표면 플라즈몬 공명술로 측정할 수 있다.

그러나, '표지' 또는 에너지 변환기와 상호작용을 통해 방사중의 변화를 측정하는 기타 방법들이 고려될 수 있으며, 예를 들면, 총내부반사형광(TIRF), 감쇄 총반사(ATR), 방해(frustrated) 총반사(FTR), 브르스터각 반사측정기, 분산총내부반사(STIR), 형광 수명 영상 현미경 검사법 및 분광법(FLIMS), 형광 분극 비등방성(anisotrophy) (FPA), 형광분광법, 또는 소멸파 타원측정기 등이 있다.

본 발명은 다음의 실시예에서, 첨부된 도면을 참조로 더욱 설명될 것이다.

실시예

본 실시예는 도 1에 나타낸 바와 같이, 공초점 형광장치를 사용한다.

도 1을 참조로 하여, 본 장치는 X,Y 및 Z 축에서 고해상도로 스캔할 수 있는 스캔 테이블(1), 완충액 내에 고정화된(9) 폴리머라제 분자(3)에 걸쳐 프라이머-주형 폴리뉴클레오티드 복합체(4)와 뉴클레오티드를 도입하기 위한 입구(8)을 갖는 미세 유체흐름 세포 시스템의 일부인 유리 커버슬립(2), 및 폐기물용 출구(7)로 이루어진다. 공여체 여기를 위한 레이저 광원(6)으로부터의 입사광은 오일에 담긴 피사체(5)를 통해 전달된다.

단백질 접합

본 실험에서, 테트라메틸로다민(TMR, 공여체)과 Cy5(수용체)가 FRET 쌍으로 사용되었다. 이것은 그들의 잘 분산되는 방출파장(>100 nm)과 큰 포스터 반경 때문이다.

뉴잉글런드 바이오랩(New England Biolabs, 10 000 U/ml공급)의 T7 DNA 폴리머라제를 사용하였다. T7 50 ㎕를 비바스핀 500(Vivaspin)에서 pH4에서 아세트산 나트륨 완충액 200 mM의 4 x 500 ㎕에 대해 완충액-교환하여, T7 DNA 폴리머라제가 공급되는 저장완충액에서 DTT를 제거하였다. 그 다음, 완충-교환된 T7 DNA폴리머라제 50 ㎕를 pH 4 에서 아세트산 완충액 100 ㎕과 수용액 중의 포화된 2-2-디피리딜-디설파이드 50 ㎕에 첨가하였다. 그 다음, 이 반응을 110분 동안 방치하고 343 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 최종적으로, 샘플을 상기와 같이(500 ㎕ 4번) pH 8에서 Tris 200 mM로 완충액-교환시켰다.

염료 부착은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 변성에 의해 입증 되었다. Cy5숙신이미딜 에스테르(Molecular Probes)를 동일한 표지화 조건하에서 TMR-T7 DNA 폴리머라제와 접착시키고 상기와 같이 정화시키고 특징지었다.

폴리머라제 고정화

N-[(3-트리메톡시실릴)프로필] 에틸렌디아민 트리아세트산으로 유리 커버슬립을 유도하였다. 그 다음, 커버슬립을 완충액이 유도된 유리 표면에 걸쳐 연속적으로 흐르도록 허용되는 유체-세포 배열로 점착시켰다. 그 다음, 표지된 폴리머라제를 완충액에 첨가하고 커버슬립 위로 흐르도록 하여 단백질을 유리 표면에 고정시켰다.

그 다음, 단백질을 유리-물 접촉면에 저밀도로 고정화시켜 한번에 오직 한 분자만이 레이저 여기 부피하에 있도록 하였다. 레이저광(514 nm Ar 이온 레이저, 15 ㎼, 원형 분극)을 스캐닝-단계 공초점 현미경의 에피-조명장치의 침유 표적체를 사용하여 0.4 ㎛ 스팟으로 초점을 맞추었다. 동일한 표적체에 의해 형광 방출을 수집하였고 이색-빔 분열기(630 nm에서 long pass)로 두개로 나누고, 두개의 아발란체 광다이오드(APD) 계수기로 동시에 검출하였다.

585 nm 밴드 통과 필터를 공여체 검출기 앞에 놓고, 650 nm 긴 통과 필터를 수용체 검출기 앞에 놓았다. 형광검출 동안 스펙트럼 범위가 이색 빔 분열기의 차단 파장으로부터 충분히 제거되므로, 공여체와 수용체 모두의 검출 효능이 편광에 의존하는 것을 무시할 수 있다.

고도 근거리 구멍(high near field aperture:NA) 표적체에 의한 편광 혼합은 무시할 수 있다고 알려져 있다(Haet al., Supra).

공여체와 수용체의 방출 시간을 얻기 위해, 사용된 수용체 시그널의 조사 조건은 Ha,et al., Appl. Phys. Lett., 1997; 70:782 과 같았다. 이 공정은 이중 표지된 단백질들의 스크린을 돕는다: 수용체의 직접 여기없이, 오직 FRET를 겪은 단백질들만이 수용체 시그널을 나타낼 수 있었다. 일단 단백질이 레이저 스팟하에 스크린되고, 찾아지고 및 위치되면, 공여체와 수용체 시간 트레이스가 얻어졌다. 수집시간은 표적 단백질의 모든 형광 표지가 광표백될 때까지 지속되었다.

반응 개시

표준 포스포라미디트 화학을 사용하여 두개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. SED ID NO.1으로 정의된 올리고뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드로 사용하고, SEQ ID NO.2로 정의된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하였다. 두개의 올리고뉴클레오티드를 혼성조건하에서 반응시켜 표적-프라이머 복합체를 형성하였다.

CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG SEQ ID NO.1

CTCTCCCTTCTCTCGTC SEQ ID NO.2

0.4 mM 농도로 존재하는 모두 4개의 뉴클레오티드(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)의 흐름 세포에 프라이미드 DNA를 삽입하여 반응을 개시하였다. 흐름세포를 변형 펠티어 장치에 의해 25 ℃에서 유지시켰다.

산소-배기 시스템[글루코스 옥시다제 50 ㎍/㎖, 카탈라제 10 ㎍/㎖, 글루코스 18%(wt/wt), β-메르캅토에탄올 1%(wt/wt)]을 사용하여 형광 수명을 연장시켰다 (Funatsu,et al., Natire, 1995; 374:555-559).

FRET 데이타 분석

초기 연구로 깜박거림, 광표백 및 삼중상태 스파이크의 원인을 결정하였고(HAet al., Chem. Phy., 1999; 247:107-118), 이들 모두는 구조변화의 결과로 형광단 사이의 거리로 인한, FRET 효율의 기초적 변화와 간섭될 수 있다. Ha, et al., 1999(Supra)에 기재된 바와 같이 공여체와 수용체 시간 트레이스로부터의 바탕 신호를 뺀 후, 다섯개 지점의 평균을 갖는 미디안 필터를 사용하여 삼중상태 스파이크를 제거하였다. 그 다음, 공여체 블린킹 효과 때문에 모든 검출기에서 계산되는 동시의 어두움을 나타내는 자료지점을 시간 트레이스로부터 무시하였다. 수용체 광표백 후, 공여체 시그널의 회복량은 분자들의 양자 수득률 및 그들의 총 검출 효율과 관련된다.

에너지 전이 효율 시간 트레이스를 얻었다. 표적 가닥 SEQ ID NO.1의 폴리머화 동안 FRET 효율의 시간 트레이스를 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 서열은 ID NO. 1의 서열의 보체에 해당한다(우측에서 좌측으로 읽음, 프라이머 서열에 혼성되는 일부를 마이너스)

Claims (21)

1. 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법으로,

   (ⅰ)표적 폴리뉴클레오티드를 상기 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드에 따라 진행할 수 있는 효소와, 효소 활성을 유발하기에 충분한 조건하에서 반응시키는 단계; 및

   (ⅱ)상기 효소가 상기 폴리뉴클레오티드에 따라 진행함에 따른 효소내의 구조변화를 검출하는 단계로 이루어지는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 효소가 폴리머라제 효소인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 효소가 헬리카제 효소 또는 프라이마제 효소인 방법.
4. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 효소가 고형 지지체에 고정되는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 고형 지지체에 고정된 다수의 효소를 포함하는 방법.
6. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 효소가 일차 결합 검출가능 표지를 포함하며, 그의 특성은 효소가 구조 변화를 겪음에 따라 변화하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 효소가 상기 일차 표지와 상호작용할 수 있는 이차 결합 검출가능 표지를 포함하며, 여기서 상호작용 정도는 효소내의 구조 변화에 의존하는 방법.
8. 제 6항에 있어서, 이차 검출가능 표지가 효소와 접촉되게 된 뉴클레오티드에 결합되는 방법.
9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 일차 표지는 에너지 수용체이고 상기 이차 표지는 에너지 공여체거나, 또는 그 반대이고, 단계 (ⅱ)는 두 표지들 사이의 에너지 전이를 측정함으로써 수행되는 방법.
10. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (ⅱ)가 공초점 현미경을 사용하여 수행되는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 단계 (ⅱ)가 형광 영상화에 의해 수행되는 방법.
12. 제 6항에 있어서, 단계 (ⅱ)가 일차 표지의 변경된 특성에 기인한 편광 효과를 측정함에 의해 수행되는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 단계(ⅱ)가 형광 편광 비등방성에 의해 수행되는 방법.
14. 표적 폴리머라제와 상호작용하고 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 진행하는 효소 내의 구조적 변화를 검출하고, 그것에 의해 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위한 형광 공명 에너지 전이의 용도.
15. 제 14항에 있어서, 효소가 폴리머라제 효소인 용도.
16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 효소가 고형 지지체에 고정화된 용도.
17. 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위한 표적 폴리뉴클레오티드와 상호작용하고 표적 폴리뉴클레오티드에 따라 진행할 수 있는 검출가능하게 표지된 효소의 용도로, 상기 표지는 효소가 폴리뉴클레오티드에 따라 진행함에 따라 그의 검출가능한 특성이 변하는 것인 용도.
18. 표적 폴리뉴클레오티드와 상호작용하며 표적 폴리뉴클레오티드에 따라 진행할 수 있는 적어도 하나의 고정된 효소를 포함하는 고형 지지체로, 상기 효소는 하나 이상의 검출가능한 표지로 표지되는 고형 지지체.
19. 제 18항에 있어서, 상기 효소가 폴리머라제인 고형 지지체.
20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 표지가 형광단인 고형 지지체.
21. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 하나의 항에 따른 고형 지지체와, 표지를 검출하기 위한 장치로 이루어진, 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 시스템.