JPS63283584A - 細胞電気刺激方法 - Google Patents
細胞電気刺激方法Info
- Publication number
- JPS63283584A JPS63283584A JP62118478A JP11847887A JPS63283584A JP S63283584 A JPS63283584 A JP S63283584A JP 62118478 A JP62118478 A JP 62118478A JP 11847887 A JP11847887 A JP 11847887A JP S63283584 A JPS63283584 A JP S63283584A
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- JP
- Japan
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- voltage
- cells
- cell
- pulse
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は溶媒に懸濁させた細胞に電気刺激を与えて細胞
どおしを融合させるための細胞電気刺激方法に関するも
のである。
どおしを融合させるための細胞電気刺激方法に関するも
のである。
（従来の技術）
細胞どおしを融合させる方法の１つとして電気刺激を利
用して行なう方法がある。細胞電気刺激方法では、細胞
を適当な密度で懸濁させた細胞懸濁液を対向した一対の
電極の間に入れ、電極から細胞に電気刺激を与える。電
気刺激の条件とじては、まずＩＭＨｚ程度で１００〜４
００Ｖ／ａｍ程度の高周波電界を印加し、そ・の後、一
定パルス幅の高電圧直流パルス電界を１〜数回印加する
。
用して行なう方法がある。細胞電気刺激方法では、細胞
を適当な密度で懸濁させた細胞懸濁液を対向した一対の
電極の間に入れ、電極から細胞に電気刺激を与える。電
気刺激の条件とじては、まずＩＭＨｚ程度で１００〜４
００Ｖ／ａｍ程度の高周波電界を印加し、そ・の後、一
定パルス幅の高電圧直流パルス電界を１〜数回印加する
。
初めに高周波電界を印加するのは誘電電気泳動の原理に
従って細胞どおしを接触させるためであり、その後高電
圧直流パルス電界を印加するのは細胞膜に乱れを生じさ
せて細胞膜の透過性を高くし、細胞とおしを融合させる
ためである。
従って細胞どおしを接触させるためであり、その後高電
圧直流パルス電界を印加するのは細胞膜に乱れを生じさ
せて細胞膜の透過性を高くし、細胞とおしを融合させる
ためである。
細胞に高電圧直流パルス電界を印加すると細胞膜の乱れ
が生じ、いくらの電界を印加すれば細胞膜の透過性が出
るかについては理論的な考察が行なわれており、必要な
電界強度Ｅ（ＫＶ／Ｃｍ）を算出することができる。す
なわち、 Ｅ、＝ ２Ｖｍ・ｃｏｓｅ／ ３ ｒ である。ここで、Ｖ＋ｓは細胞膜に作用する電位差。
が生じ、いくらの電界を印加すれば細胞膜の透過性が出
るかについては理論的な考察が行なわれており、必要な
電界強度Ｅ（ＫＶ／Ｃｍ）を算出することができる。す
なわち、 Ｅ、＝ ２Ｖｍ・ｃｏｓｅ／ ３ ｒ である。ここで、Ｖ＋ｓは細胞膜に作用する電位差。
ｒは細胞の半径、θは電界の方向と細胞表面上の点のな
す角度であり、Ｖ＋ｎが１ｖ程度になるように電界強度
Ｅを印加すると細胞膜の透過性が出る。
す角度であり、Ｖ＋ｎが１ｖ程度になるように電界強度
Ｅを印加すると細胞膜の透過性が出る。
（発明が解決しようとする問題点）
電気刺激によって細胞融合の効率を高めるためには、高
電圧直流パルス電界を印加する時点で細胞どおしが強く
接触している必要がある。高周波電界によって細胞とお
しの接触を強めようとすればその電圧を高くしなければ
ならないが、周波数が高いため電圧を高めて電力を上げ
ることは非常に難かしい。
電圧直流パルス電界を印加する時点で細胞どおしが強く
接触している必要がある。高周波電界によって細胞とお
しの接触を強めようとすればその電圧を高くしなければ
ならないが、周波数が高いため電圧を高めて電力を上げ
ることは非常に難かしい。
細胞どおしの接触を高めるために遠心力を利用して細胞
とおしを密着させる方法も検討されているが、機械的操
作が入るために再現性に欠ける問題がある。
とおしを密着させる方法も検討されているが、機械的操
作が入るために再現性に欠ける問題がある。
本発明は高周波電界の電圧を高めることなく、また遠心
力のような機械的操作を必要とせずに細胞どおしの接触
を高め、細胞の融合効率を高めることを目的とするもの
である。
力のような機械的操作を必要とせずに細胞どおしの接触
を高め、細胞の融合効率を高めることを目的とするもの
である。
（問題点を解決するための手段）
本発明では細胞を溶媒に懸濁させた細胞懸濁液を対をな
す電極間におき、電極から細胞に高周波電界、低電圧直
流パルス電界、高電圧直流パルス電界、低電圧直流パル
ス電界及び高周波電界をこの順に印加する。
す電極間におき、電極から細胞に高周波電界、低電圧直
流パルス電界、高電圧直流パルス電界、低電圧直流パル
ス電界及び高周波電界をこの順に印加する。
（実施例）
第１図は本発明を実施する装置の一例を示すものであり
、第２図は第１図の装置を用いて細胞に印加する電界を
示す波形図である。
、第２図は第１図の装置を用いて細胞に印加する電界を
示す波形図である。
第１図において、５は細胞融合を行なうチャンバであり
、対向した一対の平行電極５ａと５ｂが備えられており
、これらの平行電極５ａ、５とチャンバ本体の絶縁物と
で細胞懸濁液を収容する空間を形成している。
、対向した一対の平行電極５ａと５ｂが備えられており
、これらの平行電極５ａ、５とチャンバ本体の絶縁物と
で細胞懸濁液を収容する空間を形成している。
チャンバ５の空間の平行電極５ａ、５ｂ間に細胞懸濁液
７が入れられる。細胞懸濁液７は例えば２種類の細胞Ａ
とＢとを適当な濃度で懸濁したものである。細胞懸濁液
７の溶媒としては、グルコースなどの糖で浸透圧を調整
し数ｍＭのＣａＣｆ１：やＭｇＣＱＣを加えたものを使
用することができる。
７が入れられる。細胞懸濁液７は例えば２種類の細胞Ａ
とＢとを適当な濃度で懸濁したものである。細胞懸濁液
７の溶媒としては、グルコースなどの糖で浸透圧を調整
し数ｍＭのＣａＣｆ１：やＭｇＣＱＣを加えたものを使
用することができる。
チャンバ５の一方の電極５ａは切換えスイッチ６に接続
され、切換えスイッチ６の３個の接点ａ。
され、切換えスイッチ６の３個の接点ａ。
ｂ、ｃにはそれぞれ高周波発生部１、低電圧パルス発生
部２及び高電圧パルス発生部３が接続されている。高周
波発生部１、低電圧パルス発生部２及び高電圧パルス発
生部３はそれぞれチャンバ５の他方の電極５ｂに接続さ
れており、切換えスイッチ６を切り換えることにより、
高周波発生部１、低電圧パルス発生部２又は高電圧パル
ス発生部３のいずれかが電極５ａと５ｂに接続されて電
極間５ａ、５ｂ間の細胞懸濁液７に電界を印加すること
ができるようになっている。
部２及び高電圧パルス発生部３が接続されている。高周
波発生部１、低電圧パルス発生部２及び高電圧パルス発
生部３はそれぞれチャンバ５の他方の電極５ｂに接続さ
れており、切換えスイッチ６を切り換えることにより、
高周波発生部１、低電圧パルス発生部２又は高電圧パル
ス発生部３のいずれかが電極５ａと５ｂに接続されて電
極間５ａ、５ｂ間の細胞懸濁液７に電界を印加すること
ができるようになっている。
４は制御部であり、切換えスイッチ６を切り換え、また
、高周波発生部１、低電圧パルス発生部２及び高電圧パ
ルス発生部３の出力を調整する。
、高周波発生部１、低電圧パルス発生部２及び高電圧パ
ルス発生部３の出力を調整する。
高周波発生部ｌは周波数がＩＭＨｚで電界強度が１００
〜４００Ｖ／ａｍの高周波を出力することができる。高
電圧パルス発生部３は従来行なわれていた細胞融合にお
ける高電圧直流パルスを発生するものであり、例えば１
〜数Ｋ Ｖ ／ ｃ ｍの電界強度の直流パルス電界を
印加することができる。
〜４００Ｖ／ａｍの高周波を出力することができる。高
電圧パルス発生部３は従来行なわれていた細胞融合にお
ける高電圧直流パルスを発生するものであり、例えば１
〜数Ｋ Ｖ ／ ｃ ｍの電界強度の直流パルス電界を
印加することができる。
低電圧パルス発生部２は高電圧パルス発生部３のｌ／数
程度の電界強度の直流パルス電界を印加することができ
る。
程度の電界強度の直流パルス電界を印加することができ
る。
次に、一実施例の動作について説明する。
まず切換えスイッチ６を図のように接点ａに切り換えて
おき、高周波発生部１から電極５ａ、５ｂ間の細胞にＩ
Ｍ Ｈｚで１００〜４００Ｖ／ｃｍの電界強度の高周
波電界を印加する。電界強度の大きさは細胞の大きさに
依存し、細胞が小さいほど大きな電界強度が必要となる
。それは、電界強度の強さが細胞の分極作用の強弱を決
め、細胞が小さいと細胞の表面電荷が小さくなるため、
大きな細胞に比べて大きな電界強度が必要となる。高周
波電界の印加は第２図ではｔ＋（１０秒程度）の期間で
あり、電界強度Ｖａｃ＋ （４００Ｖ／ ｃ ｍ程度
）である。
おき、高周波発生部１から電極５ａ、５ｂ間の細胞にＩ
Ｍ Ｈｚで１００〜４００Ｖ／ｃｍの電界強度の高周
波電界を印加する。電界強度の大きさは細胞の大きさに
依存し、細胞が小さいほど大きな電界強度が必要となる
。それは、電界強度の強さが細胞の分極作用の強弱を決
め、細胞が小さいと細胞の表面電荷が小さくなるため、
大きな細胞に比べて大きな電界強度が必要となる。高周
波電界の印加は第２図ではｔ＋（１０秒程度）の期間で
あり、電界強度Ｖａｃ＋ （４００Ｖ／ ｃ ｍ程度
）である。
高周波電界を印加する理由は、細胞にだけ分極を起させ
、溶媒の電気分解を防ぐためである。
、溶媒の電気分解を防ぐためである。
高周波電界の印加によって第２図の上部に示されている
ように細胞ＡとＢが接触する。
ように細胞ＡとＢが接触する。
次に、制御部４からの信号によって切換えスイッチ６を
接点すに切り換え、低電圧パルス発生部２から第２図に
期間ｔ２で示されるように低電圧直流パルス電界を印加
する。低電圧直流パルスは電界強度Ｖｄｃ＋、パルス幅
Ｐｗｌ、パルス間隔ｔ４、繰返し回数ｎ１である。この
直流パルスによる分極作用によって、すでに接触してい
る細胞どおしが第２図の上部に示されるように一層密着
し、細胞どおしの接合部が点から面に拡大される。
接点すに切り換え、低電圧パルス発生部２から第２図に
期間ｔ２で示されるように低電圧直流パルス電界を印加
する。低電圧直流パルスは電界強度Ｖｄｃ＋、パルス幅
Ｐｗｌ、パルス間隔ｔ４、繰返し回数ｎ１である。この
直流パルスによる分極作用によって、すでに接触してい
る細胞どおしが第２図の上部に示されるように一層密着
し、細胞どおしの接合部が点から面に拡大される。
このときの低電圧直流パルスの電界強度Ｖｄｃ＋は、細
胞に損傷を与えない程度で、単に細胞に分極を起させて
細胞とおしを密着させる目的であるので、次に印加され
る融合のための高電圧直流パルスの電圧よりも小さく設
定しておく。
胞に損傷を与えない程度で、単に細胞に分極を起させて
細胞とおしを密着させる目的であるので、次に印加され
る融合のための高電圧直流パルスの電圧よりも小さく設
定しておく。
次に、制御部４からの信号によって切換えスイッチ６を
接点Ｃに切り換え、高電圧パルス発生部３から融合のた
めの高電圧直流パルス電界を印加する。この高電圧直流
パルスは、第２図に示されるように、その電界強度Ｖｄ
ｃｚ、パルス幅ＰＶ２、間隔ｔ５．繰返し回数ｎ２であ
る。
接点Ｃに切り換え、高電圧パルス発生部３から融合のた
めの高電圧直流パルス電界を印加する。この高電圧直流
パルスは、第２図に示されるように、その電界強度Ｖｄ
ｃｚ、パルス幅ＰＶ２、間隔ｔ５．繰返し回数ｎ２であ
る。
高電圧直流パルス電界の例としては、例えば動物細胞で
は電界強度Ｖｄｃｓは３ＫＶ／ｃｍ、パルス幅Ｐｗ２は
１０〜２０μ秒、パルス間隔ｔ５は１秒、繰返し回数ｎ
：は２〜３回である。また例えば植物細胞では電界強度
Ｖｄｃ：はＩＫＶ／ａｍ、パルス幅Ｐｖ２は２０〜３０
μ秒、パルス間隔ｔ５は１秒、繰返し回数ｎ：は２〜３
回である。
は電界強度Ｖｄｃｓは３ＫＶ／ｃｍ、パルス幅Ｐｗ２は
１０〜２０μ秒、パルス間隔ｔ５は１秒、繰返し回数ｎ
：は２〜３回である。また例えば植物細胞では電界強度
Ｖｄｃ：はＩＫＶ／ａｍ、パルス幅Ｐｖ２は２０〜３０
μ秒、パルス間隔ｔ５は１秒、繰返し回数ｎ：は２〜３
回である。
高電圧直流パルス電界の印加により、第２図の上部に示
されるように、細胞とおしが融合する。
されるように、細胞とおしが融合する。
その後、切換えスイッチ６を接点すに切り換えて、低電
圧直流パルス電界を第２図に示されるように電界強度Ｖ
ｄｃｓ、パルス幅Ｐｗ３、間隔ｔ６、繰返し回数ｎ３で
印加し、さらに切換えスイッチ６を接点ａに切り換えて
、第２図に示されるように高周波電界を電界強度Ｖａｃ
：＝、期間ｔ３だけ印加する。これにより、細胞融合が
完了する。
圧直流パルス電界を第２図に示されるように電界強度Ｖ
ｄｃｓ、パルス幅Ｐｗ３、間隔ｔ６、繰返し回数ｎ３で
印加し、さらに切換えスイッチ６を接点ａに切り換えて
、第２図に示されるように高周波電界を電界強度Ｖａｃ
：＝、期間ｔ３だけ印加する。これにより、細胞融合が
完了する。
高電圧直流パルスの前後で印加する高周波電界と低電圧
直流パルスの印加条件はあまり厳密なものでなくてもよ
く、例えば高電圧直流パルスの前後で同程度のものとす
ることができる。
直流パルスの印加条件はあまり厳密なものでなくてもよ
く、例えば高電圧直流パルスの前後で同程度のものとす
ることができる。
なお、細胞懸濁液の細胞密度を高くすれば高周波電界を
印加せずにいきなり低電圧直流パルス電界を印加して細
胞どおしを接触させ密着させることができる。
印加せずにいきなり低電圧直流パルス電界を印加して細
胞どおしを接触させ密着させることができる。
（発明の効果）
本発明では細胞膜の透過性を高めて細胞融合を起させる
ための高電圧直流パルス電界の印加の前後に、細胞どお
しの接触を高めるために低電圧直流パルス電界を印加す
るようにしたので、高周波電界の印加後直ちに高電圧直
流パルス電界を印加する従来の方法に比べて細胞の融合
効率が高くなる。
ための高電圧直流パルス電界の印加の前後に、細胞どお
しの接触を高めるために低電圧直流パルス電界を印加す
るようにしたので、高周波電界の印加後直ちに高電圧直
流パルス電界を印加する従来の方法に比べて細胞の融合
効率が高くなる。
もし従来の方法で融合効率を高めようとすれば、高周波
発生部の出力を大きくしなければならないが、そのよう
な方法は実現が難しい、したがって本発明では高周波発
生部の出力を高くしなくてもすむので、装置が簡略化で
きる。
発生部の出力を大きくしなければならないが、そのよう
な方法は実現が難しい、したがって本発明では高周波発
生部の出力を高くしなくてもすむので、装置が簡略化で
きる。
本発明では、高周波電界の印加だけでは達成できない分
極作用を引き起すことができるので、この点でも融合効
率を高めることができる。
極作用を引き起すことができるので、この点でも融合効
率を高めることができる。
また、高電圧直流パルス電界の印加の前に低電圧直流パ
ルス電界を印加して細胞膜を刺激しておくので、高電圧
直流パルス電界の強さが軽減され、細胞の生存率を高め
ることができる。
ルス電界を印加して細胞膜を刺激しておくので、高電圧
直流パルス電界の強さが軽減され、細胞の生存率を高め
ることができる。
第１図は本発明を実施する装置の一例を示すブロック図
、第２図は一実施例を融合状態とともに示す波形図であ
る。 ｌ・・・・・・高周波発生部、 ２・・・・・・低電圧パルス発生部、 ３・・・・・・高電圧パルス発生部、 ４・・・・・・制御部、 ５・・・・・・チャンバ、 ５ａ、５ｂ・・・・・・電極、 ６・・・・・・切換えスイッチ。 ７・・・・・・細胞懸濁液。
、第２図は一実施例を融合状態とともに示す波形図であ
る。 ｌ・・・・・・高周波発生部、 ２・・・・・・低電圧パルス発生部、 ３・・・・・・高電圧パルス発生部、 ４・・・・・・制御部、 ５・・・・・・チャンバ、 ５ａ、５ｂ・・・・・・電極、 ６・・・・・・切換えスイッチ。 ７・・・・・・細胞懸濁液。
Claims (1)
- （１）細胞を溶媒に懸濁させた細胞懸濁液を対をなす電
極間におき、前記電極から細胞に高周波電界、低電圧直
流パルス電界、高電圧直流パルス電界、低電圧直流パル
ス電界及び高周波電界をこの順に印加する細胞電気刺激
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62118478A JPS63283584A (ja) | 1987-05-13 | 1987-05-13 | 細胞電気刺激方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62118478A JPS63283584A (ja) | 1987-05-13 | 1987-05-13 | 細胞電気刺激方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63283584A true JPS63283584A (ja) | 1988-11-21 |
Family
ID=14737666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62118478A Pending JPS63283584A (ja) | 1987-05-13 | 1987-05-13 | 細胞電気刺激方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63283584A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5736370A (en) * | 1995-10-25 | 1998-04-07 | Zhao; Xi | Computer system for controlling values of operational parameters during an operation |
| JP2005517180A (ja) * | 2002-02-05 | 2005-06-09 | ザ ユニヴァーシティー コート オブ ザ ユニヴァーシティー オブ グラスゴー | 細胞検定を実施するための装置 |
-
1987
- 1987-05-13 JP JP62118478A patent/JPS63283584A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5736370A (en) * | 1995-10-25 | 1998-04-07 | Zhao; Xi | Computer system for controlling values of operational parameters during an operation |
| US5989901A (en) * | 1995-10-25 | 1999-11-23 | Zhao; Xi | Computer system for controlling value of operational parameters during an operation |
| JP2005517180A (ja) * | 2002-02-05 | 2005-06-09 | ザ ユニヴァーシティー コート オブ ザ ユニヴァーシティー オブ グラスゴー | 細胞検定を実施するための装置 |
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