JPH07303485A - Ｈｃｖアンチセンスｒｎａ、それを含む発現ベクター、及び該ｒｎａ又は発現ベクターを含むｈｃｖ関連疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの５′非
翻訳領域の部分配列に対するアンチセンスＲＮＡ、この
ＲＮＡを発現可能なように保有する発現ベクター、及び
このＲＮＡ又はベクターを含むＨＣＶ関連疾患治療剤。 【効果】 Ｃ型肝炎ウイルスの構造蛋白質の発現を抑制
することにより、生体内でのＨＣＶの増殖を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）ゲノムの５′非翻訳領域の部分配列に対するアン
チセンスＲＮＡ、該ＲＮＡを保有する発現ベクター、及
び該ＲＮＡ又は発現ベクターを含むＨＣＶ関連疾患治療
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ある遺伝子に対して相補的な遺伝子を用
いて該遺伝子の転写制御あるいは翻訳開始を妨害する、
いわゆるアンチセンス医薬品はアンチセンスDNA 、アン
チセンス RNAを用いた研究が幾つかなされている（総説
として Biotechniqes 6,p.958-976 (1988) 及び TIBTE
CH 10, p.152-158 (1992)）。アンチセンスＤＮＡにつ
いては、例えばHIV の RRE（Rev resposive element ）
について相補的な oligodeoxinucleotide phosphorothi
oate (S-ODN)は Rev活性を阻害し、in vitroでは治療薬
としての効果が示されている（Ge Li らJournal of Vir
ology. 67, p.6882-6888 (1993)）。アンチセンス医薬
は一般には化学合成により数十塩基のオリゴヌクレオチ
ドを作成し、それを適当な DDS（drug delivery syste
m）により体内に運び入れ、特定な遺伝子の発現を制御
することにより治療するというものである。導入する遺
伝子の安定性を高める為に幾つかの誘導体が試みられて
いるが、一般的には効果は一時的であり、頻繁に投与を
必要とする。DDS についてはリポソームを用いる方法が
試みられているものの、そのアンチセンス医薬の導入効
率や組織特異性を高める方法についてはまだ多くの問題
を抱えている。アンチセンスRNA は標的とする遺伝子の
mRNAと相補的に符合することにより翻訳過程を阻害する
が、これはアンチセンス DNAによる DNA-RNAよりもRNA-
RNA の方が結合が強いのでより特異的な阻害が期待でき
る。しかしながら、RNA は分解されやすく、取り扱いが
難しい。そこで、レトロウイルスベクターに組み込んで
細胞に導入する方法が考案された（Nishikura, K. and
J. Murray, Molecular and Cellular Biology. 7, p.63
9-649 (1987)）。レトロウイルスベクターについては感
染効率が低い、導入遺伝子が感染先の細胞の染色体への
ランダムな部位に組み込まれてしまう危険性、分裂細胞
にしか遺伝子を導入することができない等の問題点があ
り、アンチセンスRNA をレトロウイルスベクターによっ
て導入できるのは骨髄細胞等限られた細胞、組織にしか
適用することができない。また、直接体内に投与するこ
とはできず、採取した細胞にレトロウイルスベクターを
導入し、増殖させた後に体内に戻すという操作（ex viv
o 投与）が必要であり、その間に病原菌等に汚染する恐
れもあり、患者からの細胞採取から体内に戻すまで多く
の時間と労力が必要となる。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】Ｃ型肝炎ウイルス感
染者に対する有効な治療法は現在インターフェロン投与
以外にはない。しかしながら、この治療法においてはＣ
型肝炎ウイルスの二つのグループ、すなわちグループ
I、グループ II において効果に差があり、すべてのＣ
型肝炎ウイルス感染症に適用できるものではない。最
近、金井ら（Kanai, K.et al.: Lancet. 339, p.1543
(1992) ）及び吉岡ら（Yoshioka, K. et al. :Hepatolo
gy. 16, p.293-299 (1992)）は PCR法により遺伝子型を
分類し、それらがインターフェロン治療に対して異なる
反応を示すことを報告している。小原（日本臨床 51 巻
2 号 p.86-91) は慢性肝炎患者についてグループ分類と
治療効果について検討している。グループ I Ｃ型肝炎
ウイルス感染者では著効例（ALT正常値が 6ケ月以上持
続したもの）が11％しかなかったのに対して、グループ
IIＣ型肝炎ウイルス感染者は87％が著効を示し、残りの
13％も有効（一時的に ALT値が正常化したもの）であ
り、無効例は認められなかったと報告している。グルー
プ I Ｃ型肝炎ウイルス感染者では有効例 50%、無効例
39%であり、PCR 法により血液中のウイルス量を定量し
た結果、ウイルス量が低い方が有効である傾向が認めら
れた。

【０００４】そこで、高いウイルス量が血液中に排出さ
れている患者の場合にはそのウイルス量を下げるために
なんらかの処置が必要である。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】本発明は一時的にＣ型
肝炎ウイルス感染者のウイルス量を抑制することにより
インターフェロン療法等の治療がより効果的に行えるよ
うな補完的な治療法として考案されたものである。具体
的には、ウイルスベクター等の適切なベクターに、Ｃ型
肝炎ウイルスの５′端に存在する非翻訳領域(5′UTR)の
部分領域をアンチセンスRNA として組み込み、適当なプ
ロモーターの制御のもとにｉｎ ｖｉｖｏ発現させるこ
とにより、Ｃ型肝炎ウイルスの構造蛋白質の発現を抑
制、即ち該ウイルスの複製を抑制するものである。

【０００６】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲ
ノムの５′非翻訳領域の部分配列に対するアンチセンス
ＲＮＡを提供する。例えば、そのようなアンチセンスＲ
ＮＡは配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるヌ
クレオチド配列からなる群から選択される。

【０００７】特定のアンチセンスＲＮＡは、それぞれＲ
ＮＡ−ＡＳ１′、ＲＮＡ−ＡＳ３、ＲＮＡ−ＡＳ３′、
ＲＮＡ−ＡＳ５、ＲＮＡ−ＲＳ６及びＲＮＡ−ＡＳ１５
と称され、図１に示されるＨＣＶ５′ＵＴＲのヌクレオ
チド配列の部分配列に相補的であり、且つ逆向きの配列
を有する。図１中、ＲＮＡ−ＡＳ１′はＨＣＶ５′ＵＴ
Ｒの位置７８〜２１５に相補的な配列（ＡＳ１′と称す
る）に、ＲＮＡ−ＡＳ３はＨＣＶ５′ＵＴＲの位置１０
１〜１７０に相補的な配列（ＡＳ３と称する）に、ＲＮ
Ａ−ＡＳ３′はＨＣＶ５′ＵＴＲの位置１０１〜２４０
に相補的な配列（ＡＳ３′と称する）に、ＲＮＡ−ＡＳ
５はＨＣＶ５′ＵＴＲの位置１３１〜２００に相補的な
配列（ＡＳ５と称する）に、ＲＮＡ−ＡＳ６はＨＣＶ
５′ＵＴＲの位置１６３〜２３１に相補的な配列（ＡＳ
６と称する）に、及びＲＮＡ−ＡＳ１５はＨＣＶ５′Ｕ
ＴＲの位置１２２〜３０８に相補的な配列（ＡＳ１５と
称する）にそれぞれ逆向きの配向をもって対応してい
る。

【０００８】本発明のアンチセンスＲＮＡは、ＨＣＶの
５′ＵＴＲを含むクローン、例えばクローン２−１（Ts
ukiyama-Koharaら，Journal of Virology : 66,p.1476-
1483(1992) ）を用い、且つ、ＨＣＶ５′ＵＴＲの部分
配列に相補的な目的のヌクレオチド配列（例えば、ＡＳ
１、ＡＳ１′、ＡＳ３、ＡＳ３′、ＡＳ５、ＡＳ６、Ａ
Ｓ１５等）を得るのに適するセットのプライマーを用い
てポリメラーゼ連鎖反応（例えば、H. A. Erlich編，PC
R Technology, Stockton Press, 1989）を実施して得ら
れる増幅された該目的ヌクレオチド配列を鋳型ＤＮＡと
して、ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を介して調製
することができる。さらに、得られたアンチセンスＲＮ
Ａをゲル電気泳動等の公知の方法で精製する。これらの
調製法については、後述の実施例に詳細に説明されてお
り、これを参照されたい。

【０００９】本発明のアンチセンスＲＮＡは、ＨＣＶの
５′ＵＴＲと構造領域（例えば、コア遺伝子領域、Ｅ１
遺伝子領域、ＮＳ１遺伝子領域）を含むプラスミド［例
えば、プラスミドｐＫＩＶ（Tsukiyama-Koharaら，Jour
nal of Virology 66, p.1476-1483(1992) ］を制限酵素
処理して得られるＤＮＡを鋳型として合成したＲＮＡを
ｍＲＮＡとするｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験等において、
ＨＣＶ構造蛋白質の強い翻訳阻害を生じさせることが判
明した。すなわち、本発明のアンチセンスＲＮＡは、生
体内でのＨＣＶ構造蛋白質の発現を有意に低減すること
が可能であり、それ故、生体内でのＨＣＶの増殖を抑制
するのに有用である。

【００１０】したがって、本発明はさらに、上記アンチ
センスＲＮＡを有効成分として含有してなるＨＣＶ関連
疾患治療剤を提供する。

【００１１】本明細書中、「ＨＣＶ関連疾患」とは、Ｈ
ＣＶが原因で引き起こされる肝炎、肝硬変、肝癌等の疾
患を意味する。

【００１２】ＲＮＡは一般に生体内で分解され易いため
に、例えばリポソーム等の医薬上許容可能な物質中に封
入することによって安定的に投与することもできる。例
えば、静電荷多重膜リポソームは細胞毒性が低いことが
知られており（八木ら、BBRC196, p.1042-1048 (199
3)）、アンチセンスＲＮＡ又は後述のアンチセンス遺伝
子発現ベクターを封入することにより、遺伝子を導入す
ることも可能である。

【００１３】したがって、本発明は、リポソーム内に封
入されたアンチセンスＲＮＡを有効成分として含有して
なるＨＣＶ関連疾患治療剤にも関する。

【００１４】あるいは、操作可能なプロモーターをもつ
発現ベクターにアンチセンスＲＮＡを組み込むことによ
り、生体内で該ＲＮＡ遺伝子を発現させることが可能で
ある。ベクターとしては、ウイルスベクターが好まし
く、アデノウイルスベクターがより好ましい。アデノウ
イルスベクターは一般に効率よく非分裂細胞に感染し、
多量の遺伝子産物を産生することができ、目的遺伝子の
発現は数週間から数ヵ月と持続の長い一時的発現を提供
し、レトロウイルスと異なって積極的な染色体への組み
込みの機構を持たないため、宿主細胞の正常な遺伝子の
働きを妨害しないなどの利点をもつ。さらに、ｉｎ ｖ
ｉｖｏ投与が可能であり、内視鏡を用いるなどして直接
特定の組織、細胞に導入することが可能である。

【００１５】したがって、本発明はまた、アンチセンス
ＲＮＡを発現可能なように保有する発現ベクターを提供
する。また、該発現ベクターを有効成分として含有して
なるＨＣＶ関連疾患治療剤をも提供する。

【００１６】ここで、「発現可能なように」とは、生体
内でアンチセンスＲＮＡが発現され得ることを意味し、
そのために操作可能なプロモーターがベクター中に含ま
れる。

【００１７】発現に用いるプロモーターとしては、プロ
モーター活性の強いＣＡＧプロモーター（Niwaら， Gen
e 108, p.193-200 (1991)）、ＥＦ−１αプロモーター
（Kim ら， Gene 91, p.217-223 (1990)）、ＳＲαプロ
モーター（Takebeら， Mol.Cell. Biol. 8, p.466 (19
88)）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen Methods
Enzymol. 152, p.684-704 (1987)）、ＣＭＶ immediat
e earlyプロモーター（Seed and Aruffo, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, p.3365-3369 (1987)）、ＳＶ４０
earlyプロモーター（Rigby In Williamson (Ed.), Gene
tic Engineering, Vol. 3, Academic Press, London,
p.83-141 (1982) ）、ＳＶ４０ late プロモーター（Gh
eysen and Fiers, J. Mol. Appl. Genet. 1, p.385-394
(1982)）、アデノウイルス late プロモーター（Kaufm
an ら， Mol. Cell. Biol. 9,p.946(1989) ）、単純ヘ
ルペスＴＫプロモーター、ヒト血清アルブミンプロモー
ター、αフェトプロテインプロモーター（Gutierrez
ら， Lancet 339, p.715-721 (1992)）等の一般的に使
用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。

【００１８】本発明の発現ベクター、特に組換えウイル
スの製法については、実験医学別冊バイオマニュアルシ
リーズ４「動物細胞への遺伝子導入と発現・解析」羊土
社（1993年）に斉藤らが詳細に記載しており、これを参
照することにより目的の組換えウイルスを作製すること
が可能である。

【００１９】遺伝子を体内に導入する方法としては、組
換えウイルスを用いる場合、例えばアンチセンス遺伝子
を発現させる方法や、センダイウイルスとリポソームの
融合体（virosome）を利用する方法（中西ら、第１１３
回日本薬学会（1993））、金属微粒子上にアンチセンス
遺伝子をコーティングして高速で細胞に打ち込む、いわ
ゆる遺伝子銃（gene gun）による方法（T.M. Kleinら，
Bio/Technology 10,p.286-291 (1992)）が用いられ
る。

【００２０】また医薬の製剤化に際しては、本発明のア
ンチセンスＲＮＡ又は発現ベクターを、医薬上許容可能
な担体又は希釈剤と混合して製剤を得ることができる。
また、本発明の治療剤中には、必要により肝炎、肝硬変
及び肝癌等の公知の治療剤を含有させることも可能であ
る。

【００２１】投与量としては、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣ
Ｖの複製を抑制できる量であり特に限定されないが、好
ましくはアンチセンスＲＮＡの場合には１ pg/kg（体
重）/Day〜１g/kg/Day、好ましくは、１μg/kg/Day〜１
mg/kg/Day、組換えウイルスベクターの場合には１０⁶
〜１０⁸ PFU が適当である。

【００２２】投与方法としてはカテーテルなど物理的な
手段を用いて直接肝臓に遺伝子導入を行う方法が考えら
れるが、さらに肝臓特異的に遺伝子導入を行うためには
Ｂ．Ｇｏｕｄらの（Virology： 163, p.251-254 (198
8)）トランスフェリンに対する抗体とウイルスベクター
をカップリングさせる方法や、ウイルスエンベロープ糖
蛋白質をアシアル化する方法により肝細胞特異的に存在
するアシアロ糖蛋白質受容体との結合を利用する方法
（B. Salmonsらの総説 Human Gene Therapy ： 4,p.129
-141 (1993)）を用いてもよい。

【００２３】毒性については、例えばアデノウイルスを
ベクターとして用いる場合、すでにアデノウイルスがワ
クチンとして用いられている経緯からもワクチン株を親
株として用いる場合には細胞毒性はないと考えてよい。
アデノ関連ウイルスはヒト染色体１９ｑに組み込まれる
ことが知られているが、細胞毒性はないとされている。
リポソームを利用する方法は、すでに米国において臨床
応用されているが前述のウイルスをベクターとして用い
る方法よりもさらに細胞毒性は低いことが期待される。

【００２４】

【実施例】実施例１ アンチセンスＲＮＡの合成 1. オリゴヌクレオチドの合成 Ｃ型肝炎ウイルス（HCV)の 5′UTR の一部を含むオリゴ
ヌクレオチド16種類をβアミダイト法を用いて DNA合成
機 Cyclone^TM Plus Synthesizer （日本ミリポア社製）
により合成した。合成したオリゴヌクレオチドは以下の
配列を有する。

【００２５】

【表１】 AS15 5′-cggggtaccttccgcagaccacta- 3′ AS13 5′-ccggaattcggcgttagtatgagt- 3′ AS1′5 5′-cggggtacctctccaggcattgag- 3′ AS35 5′-cggggtacctggcaattccggtgt- 3′ AS33 5′-taggaattcgcctccaggaccccc- 3′ AS3′5 5′-ataggtaccagtcttgcgggggca- 3′ AS55 5′-cggggtaccgggttaatccaagaa- 3′ AS53 5′-ccggaattcatagtggtctgcgga- 3′ AS65 5′-tatggtaccgggggcacgcccaaa- 3′ AS63 5′-ccggaattcaattgccaggacgac- 3′ AS153 5′-gggagagccatagtggtctg- 3′2. テンプレート DNAの調製 HCVの 5′UTR を含んだプラスミドクローン２−１を用
い、以下の条件により遺伝子増幅を行った。

【００２６】

【表２】 60μl 蒸留水 10μl 10×Pfu バッファー#2 (200mM Tris-HCl (pH8.2), 100mM KCl, 60mM (NH₄ ）₂
SO₄ ,15mM MgCl₂ , 1% Triton X-100) 1 μl クローン２−１ DNA (0.1 mg／ml) 10μl プライマー A (10 pmol ／μl) 10μl プライマー B (10 pmol ／μl) 8 μl dNTP 混合液 (10 mM) 1 μl Pfu DNA ポリメラーゼ (2.5units／μl) (St
ratagene社製、カタログ＃600135） 計100 μl を 0.5 ml アシストチューブに入れ、ピペッ
ティングにより混合後、ミネラルオイル（シグマ社製、
カタログ＃Ｍ5904）を上層した後、94℃ 5分、45℃ 5
分、72℃２分保温後、94℃ 1分、45℃ 1分、72℃ 1分の
反応を30回繰り返し、最後に72℃ 7分の反応を行った。
プライマー A，プライマーB の組み合わせ及び得られた
反応物の呼称については以下の通りである。

【００２７】

【表３】 プライマー A プライマー B 反応物 AS15 AS13 AS1 AS1′5 AS13 AS1′ AS35 AS33 AS3 AS3′5 AS33 AS3′ AS55 AS53 AS5 AS65 AS63 AS6 反応物は -80℃ 10 分間放置後、室温に戻し融解してき
たミネラルオイルを除去し、エタ沈メート（和光純薬社
製）１μl 、3 Ｍ酢酸ナトリウム液（和光純薬社製）3
μl 、エタノール 220μl を加えよく混合した後、室温
で15000 回転15分間の遠心操作の後、沈殿物として回収
した。70μl TE（10mM Tris-HCl, 1mMEDTA pH 8.0）に
溶解し、45μl を以下の条件により制限酵素による切断
を行った。反応液（200mM Tris-acetate, 100mM magnes
ium acetate, 500mM potassiumacetate, 10mM DTT (pH
7.9 at 25℃) ）を 5μl 添加し、各20ユニットの制限
酵素 EcoRI, KpnIをさらに加えた後、37℃にて 6時間反
応させた。これを4% Nusieve^TM GTG Agarose（宝酒造社
製）ゲル電気泳動により分離し、目的の長さの反応物の
みをゲルから切り出し、BIO 101 社製の MERMAID^TM kit
を用いて DNAを回収した。方法はキット添付のマニュア
ルに従い、最終産物として 20 μl の DNA溶液が得られ
た。得られた DNAは制限酵素 EcoRI, KpnIにて上記条件
と同じように消化した pBluescript^R II SK(-) 50 ngと
ともに宝酒造社製DNA Ligation kitを用いてプロトコー
ルに従って連結反応を16℃ 30 分間行った。75μl の反
応液中 1μl を用いて再び前記と同様な条件にて遺伝子
増幅反応を行った。但し、プライマーA はすべてM13 Se
quencing primer M4(5′-gttttcccagtcacgac-3′)(10pm
ol／μl)（宝酒造社製）を用い、プライマーB は連結反
応に用いた反応物を得るための最初の遺伝子増幅に用い
たプライマーとそれぞれ同じものを用いた。これらの反
応から得られた産物はバクテリオファージT7のプロモー
ターの下流に最初の遺伝子増幅で得られた DNAが連結し
た形となる。これらを前記と同様な操作によりアガロー
スゲル電気泳動後、 MERMAID^TM kitを用いて目的の DNA
断片を回収した。最初の遺伝子増幅で得られた DNA，今
回の遺伝子増幅で得られた DNAそれぞれの呼称と断片の
長さ及び T7 RNA ポリメラーゼを用いたin vitro翻訳に
より得られる転写体（RNA 産物）の長さについては以下
のようになる。

【００２８】

【表４】 最初の産物 ２回目の産物 DNA の長さ RNA の長さ AS1 T7-AS1 157bp 94base AS1′ T7-AS1′ 226bp 163base AS3 T7-AS3 158bp 95base AS3′ T7-AS3′ 227bp 164base AS5 T7-AS5 158bp 95base AS6 T7-AS6 158bp 95base ２回目の産物についてはミネラルオイルを前記と同様な
操作により除去した後、フェノール／クロロホルム抽出
を行い、反応液の 1／10の容積の 5M 酢酸ナトリウム溶
液と２容積のエタノールを加えて、 -20℃ 30 分間放置
後、15000 回転15分間の遠心操作により DNAを回収し、
30μl の RNase-free の蒸留水に溶かした。RNase-free
の蒸留水は最終濃度が 0.05%となるようにジエチルピロ
カルボネート（DEPC）(Sigma社製) を蒸留水に添加後、
37℃にて一晩放置した後に 120℃45 分間オートクレー
ブすることによって調製した。得られた２回目の産物の
濃度は 20 μg ／mlでそれぞれ 7μl （0.5 pmole から
1.4 pmoleに相当）を invitro 翻訳のテンプレート DN
Aとして用いた。

【００２９】クローン２−１ DNA 5μg を10×SmaIバッ
ファー（100mM Tris-HCl (pH8.0),70mM MgCl₂ ，70mM
2-メルカプトエタノール, 200mM KCl, 0.1% BSA) 5μ
l と蒸留水を加えて、50μl として制限酵素 SmaI 20 u
nitsとともに37℃ 6時間保温して消化した後、4% Nusie
ve^TM GTGアガロースゲルで分離し、187 bpの SmaI 断片
をゲルから切り出し、 MERMAID^TM kitを用いた前述と同
様の操作により DNAを回収した。pBluescript II SK(-)
3μg を10×H バッファー(500mM Tris-HCl (pH7.5), 1
00mM MgCl₂ , 10mM Dithiothreitol, 1000mM NaCl) 5
μl と蒸留水を加えて50μl とし、20 unitsの制限酵素
HincII で消化したもの 50ng とともに宝酒造社製 DNA
Ligation kit を用いて16℃ 30 分間保温して連結反応
を行い、M13 sequencing primer M4, M13 Reverse prim
er RV それぞれ 100pmolと共に遺伝子増幅を行い、438
bpの産物が得られた。これをさらに、M13 sequencing p
rimer M4、AS153 それぞれ 100pmolとともに遺伝子増幅
し、T7-AS15 を得た。同様な操作により in vitro 翻訳
のテンプレート DNAとした。図１、表５にアンチセンス
RNA として用いた領域を示す。

【００３０】

【表５】 表５には、 in vitro 翻訳に用いるテンプレートDNA を
遺伝子増幅により作成した際に用いたプライマーの種
類、テンプレート DNAに含まれているＣ型肝炎ウイルス
の 5′UTR の領域、ベクター由来で 5′端、 3′端に付
加された領域の長さ、T7 RNAポリメラーゼにより合成さ
れる RNA産物の長さを示す。塩基番号は図１による。

【００３１】3. アンチセンス RNAの合成 アンチセンス RNAは Ambion 社製のin vitro transcrip
tion kit（MEGAscript^TMT7 kit 、カタログ＃1334）を
用いて作製した。以下に反応条件を示す。

【００３２】

【表６】 2 μl 10ｘ Transcription buffer（キット添付） 2 μl 75mM ATP Solution （キット添付） 2 μl 75mM CTP Solution （キット添付） 2 μl 75mM GTP Solution （キット添付） 2 μl 75mM UTP Solution （キット添付） 7 μl テンプレート DNA 2 μl Enzyme Mix (キット添付） 1 μl cloned T7 RNA polymerase(200 units／μl)
（Ambion社製、カタログ＃2085） 計 20 μl の反応液を 0.5 ml アシストチューブに分注
し、37℃保温器にて6時間保温した。各サンプルに対し
て 1μl の RNase-free DNase I （キット添付）を加え
て、37℃にて15分間反応させてテンプレート DNAを分解
した後、115 μl の RNase-free 蒸留水と 15 μl の A
mmonium acetate Stop Solution （キット添付）をよく
混合し、さらにフェノール／クロロホルム抽出、クロロ
ホルム抽出にて蛋白質を除去した。150 μl のイソプロ
パノールを加え、よく混合した後に -20℃ 30 分間放置
し、15000 回転 15 分間の遠心操作により RNAを沈殿さ
せた。70% エタノールにて沈殿物を洗浄した後、20μl
の RNase-free 蒸留水に溶かした。各 RNA産物の濃度と
純度を以下に示す。RNA 濃度は 260nmの吸光度 1.0を 3
5 μg / mlとして計算し、純度については 260nmと 280
nmの吸光度の比により 1.7から 2.1の間であることが純
粋な RNAであることが一般に知られている。得られた R
NAは概ね 1.8付近であり純度について問題はないもので
あった。

【００３３】

【表７】 RNA RNA 濃度 RNA 純度 (OD ₂₆₀ ／OD ₂₈₀ ) AS1-RNA 5.57 mg / ml 1.84 AS1′-RNA 6.07 mg / ml 1.84 AS3-RNA 5.62 mg / ml 1.84 AS3′-RNA 5.72 mg / ml 1.85 AS5-RNA 5.48 mg / ml 1.79 AS6-RNA 5.09 mg / ml 1.87 AS15-RNA 8.16 mg / ml 1.83 2 μl の RNAサンプルに対して 2μl の Loading buffe
r （キット添付）を加え、95℃ 3分間保温した後、1 mg
／mlエチジウムブロマイド（EtBr) 1 μl を加えて 8M
尿素／5 ％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離
し、正しい長さの RNAが合成されたことを確認した。

【００３４】実施例２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験 1. mRNAの調製 HCV の 5′UTR 、コア遺伝子領域、E1遺伝子領域、NS1
遺伝子領域（塩基番号9 番から1772番）を含むプラスミ
ド pKIV （小原ら， Journal of Virology. 66, p.1476
-1483 (1992)）は T7 プロモーターの下流に HCVの前記
遺伝子領域が挿入されており、T7 RNAポリメラーゼによ
り人工的に RNAを合成することができる。制限酵素 Sal
I にて以下の条件にてプラスミド DNA 10 μg を消化し
た。

【００３５】

【表８】 25μl 10×H バッファー (500mM Tris-HCl (pH7.5), 100mM MgCl₂ , 10mMDithio
threitol, 1000mM NaCl) 220 μl DNA 溶液 5 μl 制限酵素 SalI （6units／μl ） 計 250μl を1.5 mlアシストチューブに分注し、37℃に
て 4時間反応させた。完全に消化されて DNAが直鎖状と
なったことをアガロースゲル電気泳動にて確認した後、
13μl の 10% SDS、2.6 μl の Proteinase K (20 mg／
ml) （Stratagene社製、カタログ＃300140）を加えて制
限酵素及び DNA回収の際に微量に含まれている RNaseを
37 ℃ 1時間の反応にて分解した。フェノール／クロロ
ホルム抽出により Proteinase K を除去し、26.5μl の
5M 酢酸ナトリウム溶液、530 μlのエタノールを加え
てよく混合し、-20 ℃にて 30 分間放置後、15000 回転
15分間の遠心操作により DNAを沈殿物として回収した。
70% エタノールにて洗浄後、30μl の RNase-free 蒸留
水に溶解させた。DNA の濃度はともに0.2 mg／mlであ
り、8 μl (0.5 pmoleに相当）を DNAテンプレートとし
て前述と同様な操作によりMEGAscript^TM kitを用いて R
NAを合成した。得られた RNAは mRNA としてさらに in
vitro 翻訳（translation ）により蛋白質への翻訳を行
わせた。RNA 合成は以下の条件により行った。

【００３６】

【表９】 2 μl 10×Transcription Buffer 2 μl 75mM ATP Solution 2 μl 75mM CTP Solution 2 μl 75mM GTP Solution 2 μl 75mM UTP Solution 8 μl DNA テンプレート 2 μl Enzyme Mix 計 20 μl の反応液を 0.5 ml アシストチューブに分注
し、37℃ 6時間保温した。反応後 1μl の RNase-free
DNase I を加えて 37 ℃ 15 分間の保温によりテンプレ
ート DNAを分解した。30μl の RNase-free 蒸留水、25
μl の LiCl Solution（キット添付）を加えて、-20 ℃
30 分間放置後、4 ℃にて15000 回転 15分間の遠心操
作により RNAを沈殿物として回収した。70% エタノール
にて沈殿物を洗浄した後、20μl の RNase-free 蒸留水
に溶解させた。得られた RNAの濃度、純度は以下のよう
な結果であった。

【００３７】

【表１０】 RNA RNA 濃度 RNA 純度（OD ₂₆₀ ／OD ₂₈₀ ） mRNA-KIV 7.25 mg / ml 1.7 得られた RNAはホルムアルデヒド法による電気泳動によ
り確認した。方法を以下に示す。0.8 g のSeakem^TM GTG
agarose（宝酒造社製）に 73 mlの蒸留水を加え、加温
し、よくアガロースを溶かしてから、60℃にまで冷や
す。10×Gel Running Buffer (0.2M MOPS (pH7.0), 50m
M 酢酸ナトリウム、5mM EDTA(pH8.0)) 10 mlと37% ホル
ムアルデヒド 16.2 mlをフード内で添加し、よく混ぜ合
わせてゲル作製台に流し込み、ゲルを作製する。泳動サ
ンプルの調製は以下のようにして行った。

【００３８】

【表１１】 3.5 μl RNA 2.0 μl 10×Gel Running Buffer 3.5 μl ホルムアルデヒド 10.0μl 脱イオン化ホルムアミド 計19μl を 0.5 ml アシストチューブに分注し、68℃ 5
分間保温した後、1 mg／ml EtBr を 1μl 加え、68℃ 1
5 分間保温した後氷上に 5分間置く。2 μl の Loading
Buffer (50% glycerol, 1mM EDTA, 0.4% bromophenol
blue, 0.4% xylene cyanol) を加え、前述の 0.8% アガ
ロース／2.2Mホルムアルデヒドゲルにて50V で泳動し、
RNA が正しく合成されていることを確認した。

【００３９】2. Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験 1.で調製した mRNA を用いて in vitro 翻訳を行った。
Stratagene社製の Invitro Express^TM translation ki
t（カタログ＃200360）を用いた。反応条件は添付のプ
ロトコールに従い、以下のような手順で実験を行った。

【００４０】1.5 μg mRNA (約 2.5 pmole) を 0.5 ml
アシストチューブに分注し、RNase-free蒸留水を加えて
5μl とし、68℃30秒間保温した後、上記キットの rab
bitreticulocyte lysate をすばやく融解させ、このう
ちの 20 μl を mRNA の入ったチューブに加えて、穏や
かによく混合し、30℃ 1時間反応させた。反応終了後25
μl の 2×SDS-PAGE buffer (0.125M Tris-HCl (pH6.
8), 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-メルカプトエタノー
ル, 0.002% bromophenol blue)を加えて 5分間95℃に保
温し、15％-25 ％ SDS- ポリアクリルアミドゲルにより
分離した。泳動後のゲルは SDS入りのトランスファーバ
ッファー（48mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメ
タン、39mM グリシン、0.0375％ SDS）にて PVDF 膜
（ Immobilon^TM-P Transfer membranes ：日本ミリポア
社製）へ Sartorius社製の Sartoblot^R II-Sを用いて転
写した。転写は 300mA 30 分間で行った。ウエスタンブ
ロッティングは蛋白質の転写されたPVDF膜を 5% スキム
ミルク(Difco社製) 、2.5 ％牛血清アルブミン (BSA)の
入った T-TBSバッファー (0.05% Tween80, 20mM Tris-H
Cl (pH7.5), 500mM NaCl) 中にて 1晩 4℃に置き、非特
異的な蛋白質の吸着を阻害した後、ウサギ抗 HCVコア蛋
白質抗血清を抗体希釈液（1 ％スキムミルク、0.5 ％ B
SA、T-TBS ）にて 1000 倍に希釈した溶液中に室温で 1
時間反応させた。T-TBS にて洗浄後、ビオチン化した抗
ウサギ Ig 抗体（アマシャム社製）を 1000 倍に抗体希
釈液にて希釈した溶液中にて室温 1時間の反応を行っ
た。T-TBS による洗浄後、ストレプトアビジン標識ビオ
チン化ペルオキシダーゼ複合体（アマシャム社製）を 5
000 倍に抗体希釈液にて希釈した溶液中にて室温 15 分
間反応させた。T-TBS にてよく洗浄した後、アマシャム
社製の ECL detection kitを用いて HCVコア蛋白質の検
出を行い、22 Kd のバンドが検出された。

【００４１】実施例３ アンチセンス RNAによる翻訳阻
害実験 mRNAを in vitro にて翻訳させる際に HCV 5′UTR の領
域の一部に対するアンチセンス RNA、RNA-AS1, RNA-AS
1′, RNA-AS3, RNA-AS3′, RNA-AS5, RNA-AS6,RNA-AS15
の7 種類をそれぞれ 1.5μg mRNAに対してモル比 1：10
0 となるように加えて総量 5μl とし、実施例２の 2.
と同様にして in vitro 翻訳を行った。15-25% SDS-PAG
E にて分離後、PVDF膜に転写し、ウエスタンブロッティ
ングを行った。その結果、 RNA-AS15, RNA-AS1′を添加
したサンプルでは HCVコア蛋白質の 22Kd バンドの顕著
な消長が見られ、強い翻訳阻害が生じていた。 RNA-AS
3′でも翻訳阻害が見られた（図２）。これら以外のア
ンチセンス RNAについてはさらに以下の実験を行った。

【００４２】 ³⁵S ラベルの in vitro 翻訳実験 mRNA-KIVを用いて Amersham rabbit reticulocyte lysa
te (N150) による³⁵S-methionineラベルの in vitro 翻
訳実験を行った。

【００４３】反応液の組成は、下記に示す。

【００４４】

【表１２】 17.5μl Amino acid-depleted lysate（Amersham
N.150） 1.6 μl 2M potassium acetate solution 1.25μl 1mM amino acid mixture minus L-methi
onine 0.5 μl 1.25 pmol mRNA-KIV 2.15μl 125 pmol antisense RNA 2 μl ³⁵S-L-methionine（ICN 51001H; >1000 C
i/mmol ） 総量 25 μl にて、30℃１時間反応後、反応液２μｌを
９８μｌの 1N NaOH/2% Ｈ₂ Ｏ₂ に加えて、37℃にて10
分間反応させ、900 μl の25% ＴＣＡ（トリクロロ酢
酸）／２％カザミノ酸を添加して、氷上に３０分間静置
した。沈殿させた反応物をガラスフイルターにより濾過
して、液体シンチレーターにより、その放射活性を測定
して、翻訳阻害効果の比較とした。陰性コントロールと
してｍＲＮ−ＫＩＶを添加しないでｉｎ ｖｉｔｒｏ翻
訳を行い、その値をバックグラウンドとして各サンプル
の値から差し引いた。ｍＲＮＡ−ＫＩＶのみを添加した
際の放射活性を１として、アンチセンスＲＮＡを加えた
ことによる翻訳の阻害を相対比で示した。その結果、Ｒ
ＮＡ−ＡＳ１を除きＲＮＡ−ＡＳ１′，ＲＮＡ−ＡＳ
３，ＲＮＡ−ＡＳ３′，ＲＮＡ−ＡＳ５，ＲＮＡ−ＡＳ
６のいずれにおいても翻訳阻害効果が見られた（表１
３）。

【００４５】

【表１３】 表１３中、count は液体シンチレーションカウンターに
より測定した値で、陰性コントロールとしてｍＲＮＡ−
ＫＩＶを添加しないでin vitro翻訳を行った値をバック
グラウンドとして各サンプルの値から差し引いた値を示
し、単位はcpmである。アンチセンスＲＮＡを添加しな
かった値との相対比をさらに示した。

【００４６】実施例４ 組換えアデノウイルスの作製 組換えアデノウイルスの作製方法については、実験医学
別冊バイオマニュアルシリーズ４「動物細胞への遺伝子
導入と発現・解析」羊土社（1993年）に斉藤らが詳しい
方法について述べており、それらの方法に従って行えば
同業者であれば簡単に作製することができる。

【００４７】アンチセンスＲＮＡ−ＡＳ１５は発現させ
るためのベクターの製法について具体的に以下に述べる
が、用いるプロモーターおよびアデノウイルスの種類に
ついてはこれらに限らず、他のものを用いてもよい。

【００４８】組換えアデノウイルスＡＳ１５の作製法 クローン２−１（Tsukiyama-Kohara et al. Journal of
Virology : 66, p.1476-1483 (1992)） 0.1μg を以下
の配列を有するプライマー各１００pmolとともにPfu po
lymeraseを用いて先に述べたような反応条件により遺伝
子増幅を行い、両末端に制限酵素ＥcoＲＩによる認識部
位を導入したＤＮＡ断片を得た。

【００４９】

【表１４】 プライマー EcoAS153 5′-CGGAATTCGGGAGAGCCATAGTG-3′ プライマー EcoAS155 5′-CGGAATTCGGGGCACTCGCAAGC-3′ 得られたＤＮＡ断片は１μｇを１０×ＥcoＲＩバッファ
ー（1000mM Tris-HCl(pH7.5), 70mM MgCl₂ , 70mM 2-
メルカプトエタノール，500mM NaCl, 0.1% BSA）５μｌ
と蒸留水、制限酵素ＥcoＲＩ 10 units を加えて、５０
μｌとして３７℃２時間保温して消化した後、４％ Nus
ieve^TM ＧＴＧアガロースゲルで分離し、１９７ bp の
ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、 MERMAID^TM kitを用い
た前述と同様の操作によりＤＮＡを回収した。

【００５０】ＣＡＧプロモーターが組み込まれたベクタ
ーｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら，Gene： 108, p.193-200
(1991)）２μｇを制限酵素ＥcoＲＩにて上記と同様な条
件にて消化し、ＡＳ１５の配列を有する先のＤＮＡ断片
とともにＤＮＡ Ligationkit （宝酒造社製）を用いて
連結反応を行い、ＣＡＧプロモーターの下流にＥcoＲＩ
認識部位を介して、配列６に示すＡＳ１５の配列が挿入
されたベクターｐＣＡＧ−ＡＳ１５が作製できた。ｐＣ
ＡＧ−ＡＳ１５のＤＮＡ 5μｇを１０×Ｈバッファー５
μｌと蒸留水を加え、制限酵素ＳａｌＩ、ＨinｄIII 各
２０ unitsを加えて、５０μｌとして３７℃６時間保温
して消化した後、宝酒造社製のＤＮＡBlunting kit を
用いてプロトコールに従って、ＤＮＡの末端の平滑化を
行った。

【００５１】アデノウイルス発現コスミドカセットｐＡ
ｄｅｘｌｗ（斎藤ら、実験医学別冊バイオマニュアルシ
リーズ４「動物細胞への遺伝子導入と発現・解析」羊土
社（1993））５μｇを制限酵素ＳｗａＩ（ベーリンガー
社製）にて１０×Ｈバッファー５μｌと蒸留水を加え、
制限酵素ＳｗａＩ １２ unitsを加えて、５０μｌとし
て２５℃２時間保温して消化し、フェノール／クロロホ
ルム抽出後、ファルマシア社製のＧ−２５カラムを用い
て精製した。ＳｗａＩ消化のｐＡｄｅｘｌｗ１μｇと平
滑末端化したＤＮＡ断片０．２μｇをエタノール沈殿し
た後、５μｌのＴＥ（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH8.
0) ）に懸濁し、０．７μｌ １０×Ｌバッファー、
０．３μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ、１μｌ T4 ＤＮＡ L
igase とともに１５℃にて一晩反応を行った。０．５μ
ｌ 2M NaCl、４μｌ １０×Ｈバッファー、３４μｌ蒸
留水を加えて、７０℃１０分保温することでＤＮＡ Lig
aseを熱失活させた。制限酵素ＳｗａＩ ２０ unitsを
加え、２５℃１時間の反応後、フェノール／クロロホル
ム抽出し、Ｇ−２５カラムにて連結されたＤＮＡを回収
した。５０μｌＤＮＡ溶液をさらに６μｌ １０×Ｈバ
ッファーと２０unitsＳｗａＩを加えて再度２５℃で２
時間消化した。このうち１μｌをStratagene社製のＧＩ
ＧＡＰＡＣＫ ＸＬを用いて、プロトコールにある用法
の 1／4 のスケールでパッケージングを行い、目的のコ
スミドｐＡｄｅｘ−ＣＡＧＡＳ１５を得た。組換えアデ
ノウイルスの作製については前述の斉藤ら記載の方法に
従って行い、組換えアデノウイルスＡｄ−ＣＡＧＡＳ１
５を得た。

【００５２】

【発明の効果】本発明はアンチセンスＲＮＡを例えばリ
ポソームに封入して又はウイルベクターに組み込んで直
接炎症をおこしている肝臓に投与することにより、肝臓
で増殖しているＣ型肝炎ウイルスの構造蛋白質の発現の
制御を司っているＣ型肝炎ウイルス遺伝子の５′ＵＴＲ
（５′側に存在するＣ型肝炎ウイルスの非翻訳領域）に
対して相補的に符合させて立体障害を伴う構造遺伝子発
現制御領域の障害を誘導し、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を
阻害して、Ｃ型肝炎ウイルス量を制限することでインタ
ーフェロンによるより効果的な治療を可能にするもので
ある。

【００５３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 CUCCAGGCAU UGAGCGGGUU AAUCCAAGAA AGGACCCGGU CGUCCUGGCA AUUCCGGUGU 60 ACUCACCGGU UCCGCAGACC ACUCUGGCUC UCCCGGGAGG GGGGGUCCUG GAGGCUGCAC 120 GACACUCAUA CUAACGCC 138 配列番号：２ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 UGGCAAUUCC GGUGUACUCA CCGGUUCCGC AGACCACUAU GGCUCUCCCG GGAGGGGGGG 60 UCCUGGAGGC 70 配列番号：３ 配列の長さ：１４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 CAGUCUCGCG GGGGCACGCC CAAAUCUCCA GGCAUUGAGC GGGUUAAUCC AAGAAAGGAC 60 CCGGUCGUCC UGGCAAUUCC GGUGUACUCA CCGGUUCCGC AGACCACUAU GGCUCUCCCG 120 GGAGGGGGGG UCCUGGAGGC 140 配列番号：４ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGGUUAAUCC AAGAAAGGAC CCGGUCGUCC UGGCAAUUCC GGUGUACUCA CCGGUUCCGC 60 AGACCACUAU 70 配列番号：５ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGGGGCACGC CCAAAUCUCC AGGCAUUGAG CGGGUUAAUC CAAGAAAGGA CCCGGUCGUC 60 CUGGCAAUU 69 配列番号：６ 配列の長さ：１８６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGGGCACUCG CAAGCACCCU AUCAGGCAGU ACCACAAGGC CUUUCGCGAC CCAACACUAC 60 UCGGCUAGCA GUCUCGCGGG GGCACGCCCA AAUCUCCAGG CAUUGAGCGG GUUAAUCCAA 120 GAAAGGACCC GGUCGUCCUG GCAAUUCCGG GUACUCACCG GUUCCGCAGA CCACUAUGGC 180 UCUCCC 186

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、Ｃ型肝炎ウイルス クローン２−１
の 5′UTR の配列とアンチセンスRNA の領域を示す。ク
ローン２−１ 5′UTR の配列の上部に示したstem-loopI
I, III, IV は Brown, E.ら（Nucleic Acids Research.
20, p.5041-5045 (1992)）が報告しているＣ型肝炎ウ
イルス 5'UTRの二次構造予測による領域の分類であり、
配列下部に示したstem-loop A, B, C, D, E, Fは Tsuki
yama-Kohara, K.ら（Journal of Virology.66, p.1476-
1483 (1992)）による二次構造予測による分類である。

【図２】この図は、³⁵Ｓラベルの in vitro 翻訳実験の
結果を示す、ウサギ抗ｃｏｒｅ蛋白質ポリクローナル抗
体を用いたウエスタンブロッティングで検出されるｃｏ
ｒｅ蛋白質のバンドを示す写真である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの
   ５′非翻訳領域の部分配列に対するアンチセンスＲＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】 配列番号１、２、３、４、５及び６に示
   されるヌクレオチド配列からなる群から選択される、Ｃ
   型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの５′非翻訳領域の部
   分配列に対するアンチセンスＲＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のアンチセンスＲＮ
   Ａを発現可能なように保有する発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載のアンチセンスＲＮ
   Ａを有効成分として含有してなるＨＣＶ関連疾患治療
   剤。
5. 【請求項５】 請求項３記載の発現ベクターを有効成分
   として含有してなるＨＣＶ関連疾患治療剤。