JPH07128219A - 粒子分析方法及び粒子分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】サンプル流れ評価装置を用い、撮像部における
サンプル流れの形状を測定することにより得られた情報
から装置の最適化を図り、高精度でかつ鮮明な粒子の静
止画像が撮影できる粒子分析装置を実現すること。 【構成】レーザ１５を撮像領域内のサンプル流れに照射
し、サンプル流れによる吸収率よりサンプル形状を求
め、サンプル流れをコントロールすることにより、常に
最適条件でサンプルを流し鮮明な粒子の静止画像を撮影
することができる。また、サンプル流れに異常をきたし
た場合でも、光強度の検出信号より、原因となっている
箇所が判断でき、調整及び対策の時間を短縮できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流れている液体中の粒
子を撮像し、液体中の粒子を分析する粒子分析装置であ
り、特に尿，血液中の細胞や粒子を分析するのに適した
粒子分析装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、血液や尿等のサンプル液中の細胞
や粒子の分類及び分析は、スライドガラス上に標本を作
成し顕微鏡で観察することにより行われてきた。サンプ
ル液が尿の場合には、含まれる粒子の濃度が薄いため、
サンプル液を予め遠心分離器で遠心分離してから観察し
ていた。

【０００３】しかし、この方法では、遠心分離の工程に
おいて有形成分が破壊されたり、濃縮精度にばらつきが
生じたりすることがあった。また、この方法では標本作
成に時間がかかり、また、顕微鏡ステージを機械的に移
動させる作業が必要であり、そのために分類や分析のた
めに長時間を要したり、機械的機構が複雑になるという
問題点があった。

【０００４】標本を作成せずに、流れているサンプル液
中の粒子画像を撮像し、得られた画像から粒子を分析，
分類するものとしては、特開平3−105235号公報，特開
平5−34262 号公報が知られている。

【０００５】特開平3−105235 号公報では、フラットシ
ースフロー方式を応用した顕微鏡検査方法を採用してお
り、フローセル中サンプルを上部から下部へ流れの幅が
広くなるように偏平に流し、ストロボ光による静止画像
を撮影しその静止画像を用いて粒子を分析する方法が示
されている。

【０００６】特に、サンプルが尿の場合、含まれる粒子
の種類が多くかつ大きさも様々であり、例えば、赤血球
や白血球で１０μｍ程度，上皮細胞で数１０μｍ程度，
円柱で１００〜２００μｍである。このようなサンプル
液（尿）に含まれる粒子を同一倍率で分析することは困
難であり、測定中に倍率を切り換える必要があるが、上
記公報に記載の方法によれば、倍率切り換えの機構、及
びその倍率切り換えに伴いサンプル液流れの厚みや光源
の光量も変化させている構成を有しているので、尿のよ
うな多種の粒子を含むサンプル液の分析が可能である。

【０００７】特願平5−24626号公報では、サンプルを幅
が広く厚みの薄い扁平な流れにして流す方法が示されて
いる。

【０００８】サンプルを流路の比が１〜数倍のフローセ
ルを用いて２つの平面流(シース液)によりサンプル液を
挾み込み、サンドイッチ構造の流れを形成しそのまま撮
像部へと流れる。そこで幅の広い極めて厚みの薄い扁平
流を形成する。さらに、扁平度を向上させるためにサン
プルノズルは、吐出口が扁平状（例えば楕円）のノズル
を使用している。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】流れているサンプル液
の粒子の静止画像を撮影し解析するために、従来の方法
では次のような問題点がある。

【００１０】１．上記従来技術に開示された装置におい
ては、撮像部におけるサンプル流れの形状や状態につい
ては詳細に示されていない。実際、静止画像を撮影する
際には、撮像部におけるサンプル流れの形状は非常に重
要である。サンプル流れが撮像領域を超える幅であった
り、測定対象物の大きさと、対物レンズの焦点深度から
定められた厚さ以上の厚さがあると、分析精度の低下や
鮮明な画像を得られないという問題点がある。

【００１１】２．尿のように同一サンプルで複数の測定
モードが存在し、測定途中でサンプル流形状を変化させ
る場合、切り換え後のサンプル流れの形状及び切り換え
から安定流に至るまでの時間を正確に把握できないと、
１．同様の問題点が生じる。 ３．サンプル流れに異常をきたしている場合（脈動が生
じている場合）、その程度や原因を判断する手段が無い
ため、調整や対策に時間がかかり、結果として分析中断
の時間が長くなるという問題点がある。

【００１２】本発明の目的は、流れている粒子の静止画
像を撮影する粒子分析装置において、撮像部におけるサ
ンプル流形状の評価方法及び高精度で鮮明な静止画像の
撮れる粒子分析装置を提供するものである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明の粒子分析装置では半導体レーザをサンプ
ル流れに照射し、サンプル流れによる吸収率を測定する
ことにより、サンプル流れを評価する。尿のように測定
途中でサンプル形状を変化させる流れの場合、流れの
幅，厚さの両方向を同時に制御することは困難であるた
め、サンプルノズルにガイドを設けサンプル流れの幅方
向は規定するものとする。また、フローセルは、サンプ
ル流れの厚さ方向だけを縮流する構造をしたフローセル
を使用する。サンプルはレーザ波長に対し吸収がある色
素を純水に溶かしとものとする。また、濃度ムラが発生
しないように十分に撹拌する必要がある。

【００１４】サンプル幅の測定は、レーザ光束を撮像領
域の中央、つまり光軸上に照射しサンプルを流さない状
態でのレーザ光束の光強度の出力信号（吸収率０）とレ
ーザ光束を遮光した時の光強度の出力信号（吸収率１０
０）を確認した後、サンプルを流すと、ある一定レベル
（吸収率０と吸収率１００の間）の光強度の出力信号が
得られる。この状態でレーザ光束をサンプル流れの幅方
向に光強度の出力信号が吸収率０のレベルに達するまで
左右に移動させる。この時の移動量を測定し、サンプル
幅とする。

【００１５】サンプル流れ厚さは、サンプル断面形状が
判明している場合（例えば矩形，楕円放物線）は先に求
めたサンプル幅及びサンプル流量，流速より、サンプル
厚さ，あるいはサンプル厚さの最大値を計算する。ま
た、サンプル断面形状が判明していない場合は、予め光
軸方向に対し厚さの判っている２個のフローセルを用意
しフローセル中をサンプル液で満たし、それぞれの場合
の光強度の出力信号を求める。この値と、ランバートの
法則（光の吸収において、入射光の強度と透過光の強度
の比の対数は吸収物質の厚さに比例する。）を利用し
て、上記と同様にレーザ光束をサンプル流れの幅方向に
一定量ずつ移動させ、それぞれの位置で厚さを求め、最
終的にサンプル断面形状を求める。

【００１６】測定モード切り換えに伴いサンプル形状を
変化させた場合も上記と同様の方法で撮像部におけるサ
ンプル流れの断面形状を求めるものとする。また、モー
ド切り換え時から安定流を得るまでの時間の測定はサン
プル断面形状を求めた後にレーザ光束をサンプル流れの
ある位置（例えばサンプル流れの中央）に固定し、その
位置での光強度の出力信号レベルに達するまでの時間を
測定することにより求める。

【００１７】サンプル流れに脈動が生じている場合、光
強度の出力信号は生弦波のような周期的な変動を示す。
従って、この出力信号の最大値，最小値と無脈流時のサ
ンプル流れの厚さ及びランバートの法則により、サンプ
ル流れの厚さの変動幅を求める。また、求めた変動幅と
許容値を比較することによりサンプル流れの状態を評価
する。変動幅が許容値を超える場合は、出力信号データ
を周波数分析し、得られた周波数成分と、サンプル液，
シース液の送りの系やその他装置内駆動部での周波数成
分とが同期する個所を探すことにより、脈流を発生させ
る原因を突き止め、調整または対策を行う。

【００１８】

【作用】サンプル流れの形状を評価することを目的と
し、サンプル流れにレーザ光束を照射し、サンプル流れ
による吸収率よりサンプル形状を求めることにより次の
ような作用がある。

【００１９】撮像領域内で、光軸方向に対するサンプル
流れの幅，厚さ及びサンプル断面形状が判ることによ
り、撮像領域での測定体積が正確に判り高精度の粒子分
析を行うことができる。また、撮像領域より上流でのサ
ンプル形状を求めることによりノズル吐出口から撮像部
までのサンプル流れの形態が判るためサンプル厚さのコ
ントロールも可能となる。従って、常に最適条件で撮影
ができ、鮮明な静止画像を得ることができる。

【００２０】測定モード切り換えに伴うサンプル流形状
の変化においても、上記同様高精度な分析を行うことが
できる。また、切り換えから安定流になるまでの時間も
正確に判るため無駄の無い分析を行うことができる。更
にサンプル流変化による流れの位置の変化の評価も行う
ことができる。

【００２１】サンプル流れに脈動が乗じている場合にお
いても、得られた測定データを解析することによって、
原因となる箇所を判断することができ、調整または対策
の時間を短縮することができる。

【００２２】撮像部でのサンプル流形状より、使用して
いるサンプルノズルの形状の評価を行うことができる。
また、厚さ方向に変動の無い流れを確認出来ていれば、
サンプル液の撹拌ムラや、濃度ムラの測定も行うことが
できる。

【００２３】以上の作用により流れている粒子の静止画
像を撮影する粒子分析装置において、サンプル流れの形
状を評価することにより、高精度で鮮明な静止画像の撮
れる粒子分析装置を提供することができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面を用いて説明す
る。

【００２５】図１は、本発明の粒子分析装置の全体構成
図である。顕微鏡光源であるフラッシュランプ１を出た
光は顕微鏡光軸９上を進み、フィールドレンズ２で集め
られコンデンサレンズ３を通ってフローセル４内のサン
プル流れ１３上に集光される。顕微鏡対物レンズ５によ
り粒子画像は結像位置６に像を形成する。この結像位置
の像は、投影レンズ７によりＴＶカメラ８の撮像画面上
に投影され、表示装置１１に静止画像として表示され
る。

【００２６】フラッシュランプ１の発光のタイミング
は、粒子検出系の検出信号に従って制御される。連続発
振しているレーザ１５からの光束は、コリメータレンズ
１６で平行光束に変換され、シリンドリカルレンズ１７
で光束の１方向のみ集束させる。レーザ集束位置はフロ
ーセル内サンプル流れの上流であり、反射鏡１８および
微小反射鏡１９をへて照射される。測定対象であるサン
プル粒子がレーザ光束をよぎると、レーザ光は光散乱さ
れ、この散乱光は粒子像撮影につかう顕微鏡対物レンズ
５で集められ、ハーフミラー２０で反射させ光検出器２
２で電気信号に変換され粒子検出信号を得る。

【００２７】レーザ１５は常時点灯しており、常にサン
プル中の粒子が検出領域を通過するのを観察している。
粒子が通過し散乱光による粒子検出信号が所定の信号レ
ベル以上有れば、フラッシュランプ１をランプ制御回路
２３とランプ駆動回路２４により粒子の画像が画像取り
込み視野の定められた位置に止まるようなタイミングで
発光する。

【００２８】ＴＶカメラの出力信号は画像メモリ２５に
記憶され、静止画像は表示装置１１上に表示される。

【００２９】図２はサンプル流れ評価装置の構成図であ
る。レーザ１５よりでたレーザ光束はコリメータレンズ
１６で平行光束にする。平行光束は集光レンズ３０を通
ってフローセル４内のサンプル流れ１３上に集光され、
この光は光検出器２２で電気信号に変換され、得られた
電気信号はオシロスコープ４０に表示される。ここで、
コリメート時のレーザ光束の形状は楕円形をしている。
例えば波長λ＝６７０ｎｍ，コリメート時の長軸方向が
２.１mm，短軸方向が１.３mmのレーザを使用し、焦点距
離ｆ＝５０mmの集光レンズで集光するとサンプル流れ１
３上でのレーザのスポット６０のサイズは、長軸方向で
３１.４μｍ，短軸方向で１９.５μｍとなる（レーザの
スポットサイズ＝１.２２ ｘλｆ／Ｄ Ｄ：レーザのビ
ーム径より）。

【００３０】図３はフローセルの拡大図，図４は図３を
光軸方向から見た図である。サンプル送液口３５からサ
ンプル液が送られ、ノズル４５の先端から撮像部へと送
られる。サンプル液はシース液４７で包まれる流れを形
成し縮流部５０で厚さ方向に縮流される。

【００３１】サンプル流れの幅を測定する場合レーザ光
束は撮像領域５５の中央に配置する。まずサンプル液１
３を流さない時に検出される信号は図５（ａ）のように
なる。次にレーザを遮光すると図５(ｂ）のようにな
る。サンプルを流すと図５(ｃ）となる。サンプルを流
した状態でレーザ光束を幅方向に左右にそれぞれ移動し
ていくと、それぞれ出力信号が図５（ｃ）から５（ａ）
に変化する位置がある。この２点間の距離を測定しサン
プル幅を求める。サンプル厚さは、例えばサンプル流れ
の断面形状が図６のように矩形であると、測定したサン
プル幅，サンプル流量及び流速より容易に計算できる。
例えばサンプル幅２００μｍ，サンプル流速２００mm／
ｓ，サンプル流量０.２μｌ／ｓ とすると、サンプル厚
さは５μｍとなる。

【００３２】図７は脈動が生じている場合に検出される
出力信号である。Ｅ２に対するＥ１，Ｅ４，Ｅ５のそれ
ぞれの電位差を求め、ランバートの法則と無脈動時のサ
ンプル厚さを利用して、厚さの変動幅を求める。

【００３３】

【発明の効果】

（１）撮像領域内のサンプル流れの形状を測定すること
により、撮像領域での測定体積が正確に判り高精度の粒
子分析を行うことができる。また、サンプル厚さのコン
トロールも可能となるため、常に最適条件で撮影がで
き、鮮明な静止画像を得ることができる。さらに測定モ
ード切り換えに伴うサンプル流形状の変化においても、
上記同様高精度な分析を行うことができ、切り換えから
安定流になるまでの時間も正確に判るため無駄の無い分
析を行うことができる。

【００３４】（２）サンプル流れに脈動が乗じている場
合においても、得られた測定データを解析することによ
って、原因となる箇所を判断することができ、調整また
は対策の時間を短縮することができる。

【００３５】以上本発明によれば、流れている粒子の静
止画像を撮影する粒子分析装置においてサンプル流れの
形状を測定することにより、高精度の粒子分析を行える
とともに、鮮明な静止画像を撮影できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】粒子検出装置の全体構成図である。

【図２】サンプル流れ評価装置の構成図である。

【図３】フローセル近傍の拡大図である。

【図４】図３を光軸方向から見た図である。

【図５】検出信号のパターンを示す図である。

【図６】サンプル断面形状の例を示す図である。

【図７】脈動発生時の検出信号パターン例を示す図であ
る。

【符号の説明】

１…フラッシュランプ、２…フィールドレンズ、３…コ
ンデンサレンズ、４…フローセル、５…対物レンズ、６
…結像位置、７…投影レンズ、８…ＴＶカメラ、９…光
軸、１１…表示装置、１３…サンプル流れ、１５…レー
ザ、１６…コリメータレンズ、１７…シリンドリカルレ
ンズ、１８…反射鏡、１９…微小反射鏡、２０…ハーフ
ミラー、２２…光検出器、３０…集光レンズ、３５…サ
ンプル送液口、４０…オシロスコープ、４５…ノズル点
制御回路、４７…シース液、５０…縮流部、５５…撮像
領域、６０…レーザスポット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小島 康明 茨城県勝田市大字市毛882番地 株式会社 日立製作所計測器事業部内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フローセルにサンプルを供給し、前記フロ
   ーセルにサンプル液の外層として流れるシース液を供給
   し、粒子の通過を検出し、パルスランプを光源とし粒子
   を撮像し、得られた画像を解析し粒子の分析をする粒子
   分析方法において、レーザ光束を利用しサンプル流れの
   形状を求めることを特徴とする粒子分析方法。
2. 【請求項２】請求項１において、前記サンプル流れの形
   状を求める際に、レーザ波長に対し吸収がある色素を純
   水に溶かしたものをサンプル液として前記フローセルに
   流すことを特徴とする粒子分析方法。
3. 【請求項３】請求項１記載のレーザ光束とサンプル流形
   状を利用し、サンプル流の幅並びに厚さを測定すること
   を特徴とする粒子検出方法。
4. 【請求項４】請求項１において、前記レーザ光束は可視
   光レーザを使用することを特徴とする粒子分析方法。
5. 【請求項５】フローセルにサンプルを供給し、前記フロ
   ーセルにサンプル液の外層として流れるシース液を供給
   し、粒子の通過を検出し、パルスランプを光源とし粒子
   を撮像し、得られた画像を解析し粒子の分析をする粒子
   分析装置において、前記サンプル流形状を求めるための
   サンプル流評価装置を備えることを特徴とする粒子分析
   装置。