JPH06508603A - ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に対する新規インテグリン特異性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ　Ｔａｔ　ンパク　に・　る　インテグ鵞ン。

本発明は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ）からの認可番号ＣＡ４２５０？、ＣＡ２８８９６、ＣＡＯ８６８６、ＣＡ３ ２４１２およびＣＡ３０１９９の下での一部政府助成を受けて行われた。米国政 府は本発明において確実な権利を有し得る。

凡且旦！五 本発明は一般に、旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質に関するものであり、さらに特に、Ｈ ＩＶ　Ｔａｔタンパク質に結合可能なインテグリン細胞表面レセプターに関する ものである。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）は、“Ｔａｔ”と呼ばれる調節タンパク質 をコードするが、これはウィルスの長い末端反復配列から発現される遺伝子をト ランスアクティベート（ｔｒａｎｓａｅｔｉｖａｔｅ）する。Ｔａｔは、７２個 あるいは８６個のアミノ酸のタンパク質のどちらかとして存在するが、それが分 化的スプライシングを介して１つあるいは両方をコードするエキソンから発現さ れるかどうかに依存している。両方とも機能性トランスアクティベーターであり 、アミン末端に酸性ドメイン、塩基性領域（９個の連続する残基のうち６個のア ルギニンおよび２個のリジン）および高システィン領域（１６個の残基のうち７ 個）を含有する。塩基性ドメインは、Ｔａｔタンパク質の標的である核／核小体 と反応し、その同系のＲＮＡ配列であるＴＡＲと結合し得ることが示された。高 システィンドメインはトランスアクティベージ曹ンに対しては重要であるにもが かわらず、その機能は特定されておらず、金属を介してタンパク質を二量体化す ると考えられている。

第二のエキソンにコードされる１４個のアミノ酸配列は、その最も注目すべき特 徴として、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のトリペプチド（ＲＧＤ）を 有する。ＲＧＤ配列は、インテグリンが介在する細胞外マトリックスタンパク質 との細胞接着（ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ）に必要とされる。細胞外マトリッ クスタンパク質としては、ＲｕｏｓｌａｈｔｊおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｎ ａｔｕｒｅ３０９：３０−３３．　（１９８４）およびＲｕｏｓｌａｈｔｉおよ びＰ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：４９１−４９７．　（１９ｇ？）に報告されるような 、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびフィブリノーゲンがある。

Ｔａｔは外因性因子として機能し得ることが最近実証された。

細胞外Ｔａｔは、細胞により内在化され、核へ輸送され、旧Ｖプロモーターをト ランスアクティベートする能力を保有する。

これはＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、　Ｃｅ１ｌ　５５：１１８９−１１９３ 　（１９８ｇ）で議論されている。さらに、Ｔａｔは、ＨＩＶ−１に急性感染さ れた細胞あるいはＴａｔでトランスフェクトされた細胞から放出され得る。

類似の放出および取り込みのプロセスは、他のレトロウィルスのトランスアクテ ィベータータンパク質、すなわちＨＴＬＶ−１のＴａｘで見られる。さらに、Ｔ ａｔは、細胞増殖を調節し、抗原で活性化されたＴ細胞の増殖の抑制およびカポ ジ肉腫（ＫＳ）由来細胞の増殖の特異的刺激の両方に作用する。これは、Ｅｎｓ ｏｌ　Ｉら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４５：８４−８６　（１９９０）で報告されて いる。それゆえ、Ｔａｔｌ！、ウィルスの複製の活性化以上のメカニズムでＨＩ Ｖの発病の一因となり得る。しかし、これらのメカニズムの詳細は十分理解はさ れていない。例えば、細胞外ＴａｔがどのようにＫＳ細胞の成長を刺激するのか 、あるいはそれがどのように内在化されるのかは知られていない。

細胞間相互の、細胞外マトリックスとの、モしてＴａｔタンパク質のような可溶 性タンパク質と細胞との相互作用の基礎となる１つのメカニズムは、細胞表面レ セプターが細胞表面上の、あるいは細胞外マトリックス内の同族リガンドへ結合 することである。多くの場合では、そのようなレセプターはインテグリンとして 知られるタンパク質の種類に属する。

インテグリンは、細胞表面糖タンパク質の大きな一部であって、細胞と細胞の、 および細胞とマトリックスの接着を仲介する。例えば、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉおよ びＰ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、上述（１９８７）に記載されている。接着レ セプターの一部の既知のメンバーはすべて、相互に非共有結合的に結合する１つ のαおよび１つのβサブユニットから成るヘテロダイマーである。過去数年の間 に、哺乳動物細胞からの６つのインテグリンβサブユニットおよびショウジヨウ バエ（肚坦並■口）からの１つのインテグリンβサブユニットの一次構造が、ｃ ＤＮＡから推定された。それゆえ、１１個の異なるαサブユニットがさらに記載 されている。

細胞外マトリックスへの細胞の接着は、ＲｕｏｓｌａｈｔｉおよびＰ　１ｅｒｓ ｃｈｂａｃｈｅｒ、上述（１９８７）の総説にあるように、多くの場合、細胞表 面レセプターがマトリックスタンパク質内のＲＧＤを含有する配列に結合するこ とによって仲介される。ＲＧＤ配列は、少な（ともフィブロネクチン、ビトロネ クチン、フィブリノーゲン、フォンビルプラント（ｖｏｎＷ目１ｅｂｒａｎｄ） 因子、トロンポスボンジン、オステオボンチン、そしておそらく種々のコラーゲ ン、ラミニンおよびテナシン（ｔｅｎａｓｃｉｉ）における、細胞接着部位であ る。それらの細胞接着部位が類似しているにもかかわらず、これらのタンパク質 は、個々に特異的なレセプターとのそれらの相互作用により認識され得る。

ＨｒＶ感染の維持および伝播においてＴａＬタンパク質は重要であるため、正常 細胞および旧Ｖ感染細胞に対してこのタンパク質の効果をコントロールする必要 性がある。本発明はこの必要性を満足させ、その上関連する利益を提供する。

及豆旦！迫 本発明は、旧Ｖ　Ｔａｔ結合結合インリグリン細胞表面レセプターインテグリン ”）を発現する細胞に旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質が結合することを阻害する方法に 関する。その方法は、ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質がインテグリンと結合すること をブロックすることにより行われ、ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質とインテグリン結 合部位との反応性を有する試薬とを結合させることにより、あるいはインテグリ ンの旧Ｖ　Ｔａｔ結合部位との反応性を有する試薬とインテグリンとを結合させ ることにより行われる。例えば、インテグリンはヒトα９β５あるいはラットα Ｖβ８であり得る。

試薬は、抗体、あるいは、インテグリンあるいはＨＩＴ　Ｔａｔタンパク質のい ずれかの活性断片であり得る。

本発明はさらに請求の範囲に記載の方法において使用され得る旧Ｖ丁ａｔタンパ ク質の断片を提供する。例えば、インテグリン結合部位を含有するそのような断 片は、ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の塩基性ドメインを含有する。細胞接着に対す る第二の結合部位は、Ｔａｔタンパク質のＲＧＤ含有領域であり得る。それゆえ 、本発明の断片はまた、ＨＩＭ　Ｔａｔタンパク質のＲＧＤ含有ドメインを含有 し得る。

ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質、Ｔａｔ結合結合インリグリンいはそのいずれかの反 応性断片をコードする単離された核酸もまた提供される。本発明はさらに、その ようなポリペプチドあるいは断片をコードする核酸を有するベクター、そしてこ れらのベクターを含有する宿主細胞に関する。

試料中のＴａｔ結合結合インリグリンガンドを検出する方法もまた提供される。

そのような方法は、　Ｔａｔ結合結合インリグリン料とを接触させること、およ びインテグリンの試料への結合を決定することを包含する。インテグリンの試料 への結合は、インテグリン反応性リガンドの存在を示す。その方法は、旧Ｖ　Ｔ ａｔタンパク質、そのようなタンパク質の活性断片あるいはＨＩＴ　Ｔａｔ疑似 ペプチド（＊１ｍｅｔ１ｃｍ）を検出、あるいは精製するのに使用され得る。

さらに、本発明は、インテグリンを過剰に発現させることにより、本発明のイン テグリンを発現する細胞への旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質の結合を増加させる方法に 関する。

区直立皿星星返亙 図１は、Ｔａｔタンパク質およびＴａｔ由来ペプチドの構造を示す。エキソン１ における高システィンドメインおよび塩基性ドメイン、そしてエキソン２におけ るＲＧＤ配列を示す。

図２は、Ｔａｔペプチドへの細胞接着の結果を示す。図２Ａは、ラットＬ８細胞 の結果を示す；図２Ｂは、ヒ）　ＳＫ−ＬＭＳ細胞の結果を示す。マイクロタイ ター皿のウェルは、種々の濃度のＴａｔｌ−８６（ロ）　、Ｔａｔ　４５−８６ 　（・）あるいはＴａｔ　５７−８６　（ム）でコーティングされている。Ｌ８ 細胞（１ウェル当り〜１ｏ５細胞）を、各ウェルに加え、３７℃で１時間インキ ュベートした。付着した細胞（ａｔｔａｃｈｅｄ　ｃｅｌｌ）を固定し、クリス タルバイオレットで染色した。色素を溶出し、６００　ｎｍでの吸光度をＥｌｆ 　ｆｓＡリーダーテ測定した。Ｓに−ＬＭＳ細胞を塩基性ドメインであるＴａｔ ４５−５７（△）から成る１２個のアミノ酸ペプチドを含有する同一ペプチドに 付着するかを試験した。

図３は、抗−α、β３ＶＮＲ抗体を用いてＴａｔに対する細胞付着（ｃｅｌｌ　 ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の阻害に関する研究の結果を示す。マイクロタイター皿 のウェルを５μｇ／ｍｌの濃度のフィブロネクチン、ビトロネクチンあるいはＴ ａｔペプチド４５−８６のいずれかでコーティングした。ＳＫ−ＬＭＳあるいは Ｌ８細胞（１ウェル当り〜１０５細胞）を抗−ανβ３　（ＶＮＲ）あるいは抗 −α５β＋　（ＰＮＲ）インテグリン抗体の存在下、各ウェルに加えた。付着し た細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。色素を溶出し、吸光度を ＥＲＩＳＡリーダーで測定した。

図４は、Ｔａｔペプチドのアフィニティークロマトグラフィーを示す。表面をヨ ウ素で標識したＬ８細胞の抽出物をセファロースに結合したＴａｔペプチド４５ −８６で分画した。洗浄後、カラムを１■ｇ／ａｔのＴａｔペプチドあるいは２ ００μｇ／■■の全長Ｔａｔタンパク質のいずれかで溶出した。画分を非還元条 件下で５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル（７，５笈）電気泳動により分析した。

図５は、Ｔａｔペプチドでアフィニティ精製された物質の免疫沈降の結果を示す 。表面をヨウ素で標識したＳＫ−ＬＭＳ細胞の抽出物を図４のようにセファロー スに結合したＴａｔ４５−８８で分画した。ＧＲＧＤＳＰ、丁ａｔ５７−８６お よびＴａｔ４５−５７　（塩基性１２量体）での順次溶出した後、各溶出液のピ ーク画分をＣ９、β１、β３あるいはβ５サブユニツト細胞質ドメインに対する 抗体で免疫沈降し、非還元条件下、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（７，４％ ）電気泳動により分析した。流出部分（非結合）、ＧＲＧＤＳＰ溶出液およびＴ ａｔ４５−５７溶出液（塩基性１２量体）の免疫沈降を示す。

図６は、ＧＲＧＤＳＰＫ−セファロース上でアフィニティ精製した物質の免疫沈 降の結果を示す。表面をヨウ素で標識したＳＫ−ＬＭＳ細胞の抽出物をＧＲＧＤ ＳＰＫ−セファロース上で分画した。ＧＲＧＤＳＰ　（１ｍｇ／ｍｌ）で溶出し た後、流出部分（非結合）および溶出液（結合）をＣ９、β１、β３あるいはβ ５サブユニツト細胞質ドメインに対する抗体で免疫沈降し、非還元条件下、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（７５％）電気泳動により分析した。

図７は、ＴａｔカラムからのＥＤＴＡあるいはＮａＣ１を用いるインテグリンの 溶出を示す。表面をヨウ素で標識したＬ８あるいはＳＫ−ＬＭＳ細胞の抽出物を セファロースに結合したＴａｔ４Ｓ−８６で分画した。１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　 （１００ｓ＋Ｍ　ＮａＣ１中；Ｌ／−ン２，６）、２５０　ｍＭＮａＣｌ　（レ ーン３．７）およびＴａｔ　４５−８６　（１ｍｇ／ｍｌ；レーン４．８）を眉 いてカラムを順次溶出し、続いてポリクローナル抗−ビトロネクチンレセプター 抗体との免疫沈降を行い、非還元条件下、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（７ ，５％）電気泳動による分析をした結果を示す。レーンｌおよび５は、流出部分 の物質の免疫沈降である。

図８は、ＳＫ−ＬＭＳ細胞のビトロ、ネクチンおよびＴａｔペプチドへの結合の 阻害の結果を示す。ＳＫ−ＬＭＳ細胞をＴａｔ４５−８６あるいはビトロネクチ ン（ＶＮ）でコーティングされたマイクロタイターウェルに、阻害抗体の存在ま たは非存在下、加えた。Ｐ３Ｇ２は、α９β５とビトロネクチンとの相互作用を 阻害することがすでに示されているモノクローナル抗体である。ＬＭ６０９は、 α、β３とビトロネクチンとの相互作用を阻害する。抗−ＶＮＲは、ＧＲＧＤＳ ＰＫ−セファロースカラムを用いて胎盤抽出物から精製されたαＶβ３インテグ リンに対して生じたポリクローナル抗体である。

図９は、Ｔａｔ）ランスアクティベージ冒ンに対する抗体およびペプチドの効果 を示す。ＬＴＲ−ＣＡＴをＬ８細胞にトランスフエクトシ、抗−α９β３ポリク ロ一ナル抗体（抗−ＶＮＲ）　、ウサギ抗−α５βＩ（抗−ＦＮＲ）、正常ウサ ギ血清ある（１はＴａｔ塩基性ペプチドの存在下、外因性ＧＳＴ−Ｔａｔ融合タ ンノくり質によりトランスアクティベートした。レーン１％ＬＴＲ−ＣＡＴ単独 ；　レーン２、ＬＴＲ−ＣＡＴ＋　ＧＳＴ−Ｔａｔ融合タン）＜り質；　レーン ３、ＬＴＲ−ＣＡＴ＋ＧＳＴタンパク質；Ｌ／−７４−８、ＬＴＲ−ＣＡＴ＋　 ＧＳＴ−Ｔａｔ融合タンノイク質；そしてレーン４．３００μｇ塩基性ペプチド ；　レーン５．８０μｌ抗−α９β３；レーン６．１１μｍ抗−αＶβ３；レー ン７．８０μｍ抗−α５β１血清；レーン８、正常ウサギ血清。

λ災曳１皿亙笠皿 本発明は、本明細書中で“インテグリン”と（１う、ＨＩＶＴａｔタンパク質に 結合するインテグリン細胞表面レセプター１ご関する。ヒト細胞において、その ようなインテグリンｌｔ公知のα９β５であるのに対し、う・ノド細胞は、本明 細書中でβ８と命名する以前から未同定のβサブユニ・ノドおよび公知のサブユ ニットα９を含有し得る。α７サブユニ・ノドは、インタグリンαサブユニ、７ 　トの最も応用自在のものである。３つ、おそら（は４つの異なるβサブユニ１ ．トと結合すること（ま知られていた。それゆえ、本発明のう・、＋−β８サブ ユニ・１ト（よ、少なくとも１つの付加的βサブユニットをこのグループに加え 得る。ヒトβ５サブユニツトは以前からα、と結合することは知られていたが、 ヒトα９β５のＴａｔ結合活性は以前は知られていなかった。

本発明は特に、旧ＶＴａｔタンパク質およびＴａｔタンパク質が結合するインテ グリンの間の新規な相互作用に関する。Ｂｒａｋｅら、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、　１１１：１２７５−１２８１　（１９９０）に記載されているように、 以前の報告はＴａｔのう・ｙ）Ｌ８細胞への結合は、ＲＧＤ依存性メカニズムが 示唆されていたがｓ　Ｔａｔタンパク質の塩基性領域がこの相互作用を仲介する ことが、細胞接着およびアフィニティークロマトグラフィーデータから見い出さ れた。

Ｔａｔカラムで精製されたタンパク質の免疫沈降によって、Ｔａｔ結合結合タン パクインテグリンα９β５の構成成分として同定された。この結果は、Ｔａｔへ の細胞接着がα９β３インテグリンに対するポリクローナル抗体によりブロック され得ることを示すデータと一致した。このインテグリンに対する抗体は、α９ β５およびα９β３に共有されるα７サブユニツトに結合し、両へテロダイマー の機能を阻害することが予想される。

α１β５インテグリンはＲＧＤ配列を介してビトロネクチンに結合することが示 されている。本発明に関する研究において、ｒａｔタンパク質はＲＧＤ配列を含 有するにもかかわらず、インテグリン認識配列がＴａｔの塩基性ドメインである ことが示された。

この結論はｓ　Ｔａｔ由来ペプチドが、細胞付着を支える能力およりロマトグラ フィーのα、β５インテグリンと結合する能力との間で完全な相関性が見い出さ れたことに基づ（。これに対して、ＲＧＤ配列の存在の有無は、いずれのタイプ のアッセイにおいても影響を与えなかった。明らかにＲＧＤ配列は配列中にイン テグリン結合に適合していない形で存在するが、それは図６に示される短いＲＧ Ｄ含有ペプチドと最大結合活性を有するα９β３インテグリンでさえも、　ＲＧ Ｄ含有含有Ｔａジペプチドまり結合しなかったことによる。

はとんどのインテグリンは、その活性に二価の陽イオンを必要とし、ＥＤＴＡの 存在下それらのリガンドから解離する。塩基性ドメインの利用に加えて、αＶβ ５およびＴｉｔとの間の相互作用は、それが１０１Ｍ　ＥＤＴＡの存在下では安 定であり、それゆえ二価陽イオン依存性ではないという通常でない特徴を有する 。しかし、α９β５インテグリンとＴａｔとの相互作用は、高ＮａＣｌ濃度によ り阻害された。この塩感受性はインテグリン間では通常のことではないが、それ は前例のないことではない。

例えば、α３β１インテグリンはまた、Ｅｌｉｃｅｓら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　ｌ■ ｏｆ、　１１２：１６９−１８１　（１９９１）で議論されるように、塩に不安 定で、ＲＧＤ非依存的にコラーゲンおよびラミニンに結合することを示している 。α３β１はまたこれらのタンパク質的の塩基性領域に結合し得る。

興味深いことには、α３β１はまたＲＧＤに依存的な方法でフィブロネクチンに 結合することが見い出され、α３β１インテグリンは２つの機能的に異なるリガ ンド結合部位を有し得ルことを示唆した。α４β１インテグリンは、２つの異な るリガンド結合部位、１つは内皮細胞リガンドであるＶ−ＣＡＭ、および他方は フィブロネクチンの選択的にスプライスされたセグメントに対する結合部位を有 している。これは、Ｅｌｉｃｅｓら、ｃｉＪｉ６０：５７７−５８４　（１９９ Ｇ）で報告されている。ビトロネクチンとＬ８およびＳＫ−ＬＭＳ細胞との相互 作用を阻害するモノクローナル抗体でＴａｔとの結合を阻害できないことは、α ９β５が塩基性細胞外タンパク質に対する第二のリガンド結合部位を有し得るこ とを示唆するが、まだ同定されていない。インテグリンＩｌｂ／ＩＩＩａはまた 、α９β５の塩基性ペプチド結合のある性質を共有し得る。ＲＧＤおよび塩基性 セグメントの両方を含有するペプチドは、Ｓａｖａｇｅら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｔ　２６５：１１７６６−１１７７２　（１９９０）ｌこ報告されるように、 ＲＧＤだけを含有するペプチドより強く　■ｂ／ｌ１ｌａに結合する。

ラットＬ８およびヒトＳ！［−ＬＭＳ細胞は共に、Ｔａｔおよび塩基性ドメイン を含有するＴａｔ由来ペプチドでコーティングされた表面上にプレートされたと き、丸いままであった。この挙動は、α、β５を発現する細胞はビトロネクチン に付着するが、拡散しないという知見と一致する。Ｗａｙｎｅｒら、　Ｊ、　Ｃ ｅｌ上」土（社）工１１３：９１９−９２９　（１９９１）での報告によれば、 ビトロネクチン上の拡散はα９β３の存在に依存する。

う７）Ｌ８の初期の研究に基づいて、Ｔａｔは、本明細書中でβ８と定義するβ サブユニットおよび既知のα、を含有するインテグリンを結合することがわかっ た。ヒト細胞について更に研究した結果、Ｔａｔタンパク質は既知のヒトインテ グリン、α９β５と結合することがわかった。しかし、う・ットインテグリンは またα９β５であり得る。それはアフイニテイクロマトグラフィー実験において ヒトα９β５インテグリンと同一の挙動をし、５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で同様に移動 したことによる。ヒトβ５サブユニ・ノドの細胞質性ペプチドに対して調製され た抗体は、多くのラット細胞系に対して弱く反応した。抗体とう・ノドβ５サブ ユニツトとの反応性が低いことは、それゆえ、Ｌ８インテグリンの免疫沈降の欠 失が観察されたことを説明し得る。

Ｌ８細胞からのＴａｔ結合結合インリグリンサブユニツトはまた、選択的にスプ ライスされたβ５変種あるいは全く異なるβサブユニットのどちらかであり得る 。

ラットβＢサブユニットは既知のβサブユニ・１トと区別できる。まず、直接比 較すると、β８サブユニ・２トの見かけの分子量が、多くの以前に特性化された βサブユニ・ットより小さ％Ｘ０さらに、α９サブユニ・２トは、β１、β３あ るｔ）はβ５サブユニツトと会合することが示され、そしてまたβ６と結合し得 るにもかかわらず、これらの既知の各サブユニ・ノドの細胞質性尾部に対する抗 体は、Ｔａｔ結合レセプターを免疫沈降しな力）つた。

そのβサブユニットが、選択的スプライシングによって、あるいはタンパク質分 解プロセシングによって、すでに特性化したβサブユニットと異なるという可能 性は除外され得な−１゜しかし、Ｌ８細胞が、機能的ではあるが、Ｔａｔに結合 しな（１β３サブユニツトを有することは明らかである。α９サブユニ・ノドは 、最も多いインテグリンαサブユニブトであり、３つ、おそらくは４つの異なっ たβサブユニットと結合することが知られている。今、少なくとも１つの付加的 βサブユニットがこのグループに付加され得ることは明らかである。

ラットα、β８インテグリンは同様にその結合特異性において既知のインテグリ ンと区別される。例えば、Ｔａｔタンパク質はα４β１標的配列と有意に相同的 な配列を全く含有しないが、α４β１インテグリンはＲＧＤ配列を含有しない配 列に結合する。

βサブユニットの重要な特性は、α、サブユニットと結合し、ＨＩＶ　Ｔａｔタ ンパク質に結合する本発明のインテグリンを形成することである。本発明のイン テグリンの特異性は、それが無傷のＴａｔタンパク質あるいはｌ１ＧＤ含有領域 を欠く切形体に結合し得、そしてそれゆえ、Ｔａｔタンパク質の活性をコントロ ールするのに使用され得るという点にある。

Ｔａｔ結合結合インリグリン成分は、非還元５ＤＳ−ゲル電気泳動ニオイて、約 ７５−９５　ｋＤの分子量範囲で二本のバンドを与え、同一のβサブユニットの ２つの形あるいは２つの異なったサブユニ２トを表す。本発明は両方を包含する と考えられる。

全長のＴａｔタンパク質は次のアミノ酸配列を含有する：ＭＥＰＶＤＰＲＬ　Ｅ ＰＩＦＫ　ＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦ　Ｉ（ＣＱＶＣＦ　ｆＴ ＫＡＬＧ　Ｉｓ　ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱＮＳＱＴＨＱＡＳＬＳＫＱＰＴ ＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥ、　Ｔａｔタンパク質の塩基性ドメインは本発明のイ ンテグリンに対して優先的に結合する部位であることが見い出された。この塩基 性領域は９個のアミノ酸残基を含有し、そのうち６個はアルギニンであり、２個 はリジンである。塩基性領域のアミノ酸配列は旧Ｖ　ＢＸＢＺ株におけるＲ■Ｒ ＲＱＲＲＲである。

Ｔａｔタンパク質の結合におけるＲＧＤの役割を決定する研究において、ＲＧＤ をＫＧＨに置換した変種ペプチドは、結合活性が少し減少する程度で依然として Ｔａｔタンパク質に結合可能であることがわかった。上述（１９９０）のＢｒａ ｋｅらは、Ｔａｔタンパク質への細胞付着が、短いＲＧＤ含有ペプチドにより阻 害されることを見い出したのに対して、そのようなペプチドはアフィニティクロ マトグラフィーにおいてＴａｔタンパク質のインテグリンへの結合に関して有意 な効果を有さなかった。この結果は、ＲＧＤをＫＧＥで置換するという後の研究 によって支持された。それゆえ、ＲＧＤ含有領域はＴａｔタンパク質の第二の結 合部位であると考えられる。この第二の結合部位は、旧Ｖ　ＨＸＢＺ株において アミノ酸配列：　ＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥを含有する。

Ｔａｔ結合結合インリグリン合する他のりガントは、塩基性ドメインおよび近接 のＲＧＤ配列を含有し得る。塩基性配列は、ＲＧＤ含有領域よりもむしろこれら のインテグリンの第一の結合部位であると思われるが、少なくともあるＲＧＤ特 異特異性インリグリンＲＧＤ含有配列に加えて塩基性領域を認識する。この結論 は、ＲＧＤおよび塩基性セグメントの両方を含有するペプチドが、ＩＩＧＤだけ を含有するペプチドよりα１１ｂ／β３インテグリンに強く結合したという研究 によって一部支持され、これはＳａｖａｇｅら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２６５：１１７６６−１１７７２　（１９９０）に記載されている。

従って、本発明はまた、Ｔａｔ結合結合インリグリンして特異的な単離された断 片を提供し、特に、例えばヒトβ５およびラットβ８のようなβサブユニットに 特異的である。そのような断片は、天然型Ｔａｔタンパク質あるいはＴａｔタン パク質領域のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドから得られる領域であり得 る。これらの断片は、他の既知のβ３の断片と区別されるのに必然的に十分な長 さであり、それゆえ、Ｔａｔ結合結合インリグリンサブユニ・ノド、特に例えば ヒトβ５およびラットβ９に“特異的”あるいは“特有”である。β８に特異的 なそのような断片は、本明細書中に開示される、そして当該分野で公知の方法を 用いて決定され得る。これらの断片はまた、Ｔａｔ結合機能を保有し、それゆえ 例えば、Ｔａｔ結合結合インリグリンａｔタンパク質への結合の阻害剤として、 あるいは本発明のＴａｔ結合結合インリグリン出する指示薬として使用され得る 。

当業者はそのような断片に対する他の使用を決定し得る。

“実質的に精製された”あるいは“単離された”という用語は、物質、ポリペプ チドあるいは核酸のいずれであれ、天然のあるいは自然の環境に普通に伴う汚染 物が実質的にないという意味である。旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質の反応性断片とは 、ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の部分アミノ酸配列を実質的に有するポリペプチド をいい、Ｔａｔ結合結合インリグリン反応性を実質的に維持するようにインテグ リン結合部位を保有する。同様に、Ｔａｔ結合結合インリグリン応性断片とは、 Ｔａｔ結合機能を保有するインテグリンの部分アミノ酸配列を実質的に有するボ リペプチドをいう。それゆえ、その機能を実質的に壊すことがな（、ラットβ８ あるいはヒトβもの必須配列を保有するアミノ酸配列の改変は、これらのβサブ ユニットの定義に包含される。β１、β２およびβ３のような、βあるいはβ５ の配列と５０％以下の相同性を有するアミノ酸配列は、実質的に同一配列ではな く、それゆ丸、これらβサブユニットの定義に入らない。いったん本明細書中に 記載のアミノ酸配列が与えられたならば、付加、欠失あるいは置換が行われ得、 βサブユニットの機能に関するそれらの効果を決定するために試験され得る。さ らに、当業者は、ある橿のアミノ酸がインテグリン結合機能を変更するために改 変され得ることを認識するであるう。

本発明はまた、本発明のインテグリン、特にラットβ８およびヒトβ５のサブユ ニットに対する特異性を有する試薬を提供する。当業者は、本発明のβサブユニ ットと特異的に反応する、抗体のような試薬を容易に作り得る。そのような試薬 は、これらのβサブユニットを他の分子から免疫学的に区別するために使用され 得る。そのような抗体を生じさせる種々の方法は、十分確立され、例えば、Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅ、　Ｈａｒ ｌｏｔおよびり、　Ｌａｎｅ、　ｐｐ、１３９−２８３　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ■ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８８）に記載され、文献とし て本明細書中に援用する。

本発明はさらに、本発明のβ含有インテグリンにより認識される結合部位あるい は領域を有するＴａｔタンパク質あるいはその反応性断片をコードする単離され た核酸を提供する。同様に、Ｔａｔ結合結合インリグリンいはその反応性断片を コードする単離された核酸もまた提供される。例えば、Ｍａｎｆａｔｉｓら　− 、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ’ｎ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒ ｂｏｒ　（１９８９）に記載の標準的方法に従って、これらの核酸配列は、同定 、単離され得、次いで適切な発現ベクター中にクローン化され得る。次に、その ベクターは、宿主内に挿入され得、その後Ｔａｔ組換えタンパク質、Ｔａｔ結合 結合インリグリンいは各々の反応性断片を発現することができる。それゆえ、本 発明はまた、そのような配列をコードする核酸を含有するベクターおよびこれら のベクターを含有する宿主に関する。

本発明はさらに、診断目的のためのプローブとして使用され得る核酸に関する。

そのような核酸プローブは、Ｔａｔ結合結合インリグリンいはＴａｔタンパク質 に特異的なヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るが、非Ｔａｔ 結合インテグリンあるいはＴａｔタンパク質、特に他の細胞表面レセプターある いは非Ｔａｔタンパク質をそれぞれコードする核酸とはハイブリダイズしない。

核酸はまた、Ｔａｔ結合結合インリグリンいはＴａｔタンパク質の、コードある いは非コードのＤＮＡのどちらかに特異的にハイブリダイズするように提供され る。そのような核酸は、標準型核酸合成機のような当該分野の公知の方法により 同定され、調製され得る。

本発明により提供されるＴａｔタンパク質の丁ａｔ結合インテグリンへの結合を 阻害する方法において、Ｔａｔ結合結合インリグリンえばα９β８あるいはα、 β５、丁ａｔタンパク質への結合は、種々の方法によってブロックされ得る。例 えば、β８あるいはβ５含有インテグリンの結合は、βサブユニ・ノドあるいは β含有インテグリンを結合させる試薬によりプロ・ツクされ得る。

そのような試薬の例は、例えば、Ｔａｔタンパク質の塩基性領域を含有するペプ チドおよびポリペプチドあるいは、βサブユニットあるいはβ含有インテグリン と特異的に反応する抗体を包含する。それゆえ、Ｔａｔ結合結合インリグリンＴ ａｔタンノくり質の結合は、インテグリンのＴａｔ結合部位を認識するアミノ酸 配列を有するＴａｔ由来ペプチドとインテグリンを結合させることによりブロッ クされ得る。他の方法として、Ｔａｔタンノくり質あるいはその反応性断片を、 インテグリンとＴａｔタンノ（り質との結合を阻害する部位において、Ｔａｔタ ンノくり質に特異的な試薬、例えば、抗−Ｔａｔ抗体あるいはインテグリンの反 応性断片と結合させることによりプロ・、キングが行われ得る。

Ｔａｔ結合結合インリグリンるＶａｔタンノイク質の結合をプロ・ツクする能力 は、　）ＩＩＶが介在する症状をコントロールするのに使用され得る。それゆえ 、カポジ肉種の成長因子としての、そして細胞により内在化されるときの旧■プ ロモーターのトランスアクティベーターとしてのＴａｔタン１ｆり質の活性慝阻 害され、あるいはコントロールされ得る。

Ｔａｔ結合結合インリグリンａｔタンパク質への結合は、細胞接着を仲介し得る ので、この結合を妨げることは、インタグ１ノンの内因性りがノドへの細胞の接 着を妨げ得る。インタグ１ノンの他の活性は、本発明のＴａｔ疑似化合物の使用 により同様に阻害され得る。別の方法として、細胞接着は、細胞によるこれらの インテグリンの発現を増加させることにより促進され得る。内因性リガンドある いはリガンドの活性は、本発明の化合物で模倣され得る。

Ｔａｔタンパク質のＴａｔ結合結合インリグリン現する細胞への結合をコントロ ールする方法として、その結合は、Ｔａｔ結合結合インリグリンのような細胞中 で過剰発現される方法により強められ得る。そのようなインテグリンの過剰発現 を促進する方法は、例えば、インテグリンをコードする核酸を細胞のゲノム内に 導入することにより当業者に公知の方法で行われ得る。

本発明はさらに、Ｔａｔ結合結合インリグリン合するリガンドを検出する方法を 提供する。その方法は、インテグリンあるいはその結合断片と、Ｔａｔ結合結合 インリグリン合することが既知のあるいは結合すると考えられるリガンドを含有 する溶液とを接触させることを包含する。そのようなインテグリンと結合するリ ガンドを次いで検出する。これらの方法を行うのに有用なアッセイは、当業者に はよく知られており、例えば、Ｈａｕｔａｎｅｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａｐ 、２６４：１４３７−１４４２　（１９８９）およびＳｍ１ｔｈら、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。２６５：１１００８−１１０１３　（１９９０）に記載さ れ、それらは共に文献として本明細書中に援用される。

これらの方法は、本発明のインテグリン上のＴａｔ結合部位によって結合される 付加的な化合物を同定あるいはスクリーンするのに使用され得る。そのような化 合物は、天然に発生するリガンドであり得、例えば、Ｔａｔ結合部位の誘導体あ るいはインテグリンＴａｔ結合部位により結合され得る他の化合物であり得る。

Ｔａｔタンパク質あるいは他のＴａｔ結合結合インリグリン結合リガンド望の結 合活性を模倣するために設計された合成化合物もまた包含される。所望の結合機 能を有するそのような化合物は、それらがＴａｔタンパク質のインテグリン結合 部位により結合され得る限り、ペプチド、ペプチド誘導体あるいは疑似化合物、 あるいは他の化合物であり得る。

以下の実施例を用いて本発明を説明するが、これらは本発明を制限するものでは ない。

裏１１Ｌ上 １ヱｉヱ豆底 無傷のＴａｔタンパク質をｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）　保ｆｆｌ　アミ ノ酸を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａ　（Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ）の固相自動ペプチド合成機を用いて段階的に合成した。カップリング溶媒 としてｎ−メチルピロリドンを用いて、アミノ酸をヒドロキシベンゾトリアゾー ル（ＨＯＢｔ）エステルとして加えたｏ　Ｏ，５ｇＩＩｌｏｌのＢｏｃ−Ｇｌｕ （ＯＢｚｌ）−０−フェニルアセタミドメチル樹脂（０，７２＋＊ｍｏｌで置換 された０、６９　ｇ）と各アミノ酸に対する最少量の２個のカップリング剤とで 合成を開始した。平均反復カップリング効率は、ニンヒドリン定量法により９９ 、３２％であった。システィンのスルフヒドリル（ＳＲ）基をｐ−メチルベンジ ル基で保護し、適切なスカベンジャーを用いて低濃度／高濃度のフッ化水素（■ Ｆ）で開裂した後、十分な還元体を生じた。同様の化学的手法を用いて、使用さ れる他のペプチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ＋ｓモデル４３０Ａ合 成機で合成した。

爽施に■ ＴａｔＡ　ンパク　の インテグリンあるいはＴａｔに結合可能な他の細胞表面分子を同定するために、 実施例Ｖ１１に従ってアフィニティクロマトグラフィーを８６個のアミノ酸のＴ ａｔタンパク質おＪ：びＴａｔ由来ペプチドを用いて行った。Ｌ８ラット筋芽細 胞（ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ−１７６９）をこの実験に選択した。なぜなら、上述（ １９９０）のＢｒａｋｅらのように、それらがＴａｔおよびビトロネクチンには 結合するが、ラミニン、コラーゲンあるいはフィブロネクチンには結合しないこ とがすでに示されたからである。非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、１ ５０　ｋＤの１本のバンドおよび７５−９５　ｋＤの二本のバンドが同定され、 それらはセファロースカラムに連結された全長Ｔａｔタンパク質に結合し、そし てタンパク質の塩基性領域およびＲＧＤ領域を含有するが高システィン領域を欠 くＴａｔペプチド（アミノ酸残基４５−８６位）１■ｇ／ｗ＋１で溶出した。フ ィブロネクチンの細胞接着部位、ＧＲＧＤＳＰ、を表す第二のペプチドは、Ｔａ ｔ結合タンパク質を溶出するには効果的ではなかっ他の実験において、４５−８ ６位の残基を有するセファロースに連結したペプチドは、同じタンパク質を結合 した。同一のバンドは、切形のペプチド（残基４５−８６位）あるいは全長Ｔａ ｔタンパク質で溶出し、ペプチドおよびタンパク質が類似の結合部位を有するこ とを実証した。約１２０　ｋＤの付加的なバンドが全長Ｔａｔタンパク質カシカ ラム溶出したが、より短いＴａｔペプチドからは溶出しなかった。このバンドは さらに同定していないが、それは第二の結合インテグリンのサブユニットを表し 得る。

ＲＧＤ配列の役割をさらに調べるために、４５−８６位の残基を含有するペプチ ドをＫＧＢ配列を用いて合成し、ＲＧＤの代わりに用いた。同じタンパク質がＫ ＧＢ変種ペプチドに結合し、この変種ペプチドでＴａｔカラムから溶出した。こ のことはＴａｔ結合におけるＲＧＤの役割が一次的な役割ではないことを示す。

これらの細胞がＴａｔに結合しなかったＲＧＤ結合タンパク質を含有するかどう かを決定するために、ＧＲＧＤＳＰ−セファロースを用いるアフィニティクロマ トグラフィーをＴａｔペプチドカラムからの非結合物質を用いて行った。１５０ 　ｋＤのＴａｔ結合タンパク質と同様の電気泳動度を有するバンドが、Ｔａｔカ ラムから得られる８５および９５　ｋＤのバンドとは異なるバンドとともに、Ｇ ＲＧＤＳＰ−セファロースカラムから溶出した。これらのバンドはαＶβ３イン テグリンのサブユニットとして同定された。　−Ｔａｔに結合可能なインテグリ ンあるいは他の細胞表面分子を同定するために、アフィニティクロマトグラフィ ーを８６個アミノ酸のＴａｔタンパク質およびＴａｔペプチドを用いて行った。

図２の細胞付着実験で示されるように、Ｔａｔの塩基性ドメインを含有するペプ チドのすべては、ラットＬ８およびヒト平滑筋肉腫ＳＫ−ＬＭＳ　（ＡＴＣＣ番 号■ＴＢ８８）細胞と同様の結果を与えた。

Ｔａｔ４５−８６ペプチドに結合し、このペプチドあるいは全長Ｔａｔで溶出さ れたヨウ素で標識したＬ８細胞抽出物からのタンパク質を図４に示した。Ｔａｔ 塩基性領域を含有するペプチドのすべての実験において、１５０　ｋＤのバンド および約９０ｋＤの二本のバンドがカラムから溶出した。ＲＧＤ配列をＫＧＥへ 変化させても、あるいは第二エキソンを全部欠失させても、カラムから溶出され るタンパク質の同一性を識別できる効果はなかった。塩基性ドメインを含有する １２個のアミノ酸でさえこれらのバンドを結合し、溶出するのに十分であった（ 図５参照）。しかし、塩基性ドメインを欠くペプチドは、十分量のヨウ素標識細 胞表面タンパク質と結合しなかっ、たし、溶出もしなかった。

図５は、Ｔａｔ４５−１１６ペプチドカラムから溶出したタンパク質の免疫沈降 を示す。カラムをペプチドＧＲＧＤＳＰ、続いてＴａｔ５７−８６ペプチド、最 後にＴａｔの塩基性ドメインを含有する１２個のアミノ酸ペプチドで連続して流 した。特異的インテグリンサブユニットと抗体との免疫沈降後、指示ペプチドで カラムから溶出される物質を示す。ペプチドＧＲＧＩ）ＳＰで溶出される少量の 物質はβ１抗体およびβ３抗体と免疫沈降し得た。しかし、合せず、非結合画分 中に検出された。これは、ペプチドＧＲＧＤＳＰおよび塩基性ドメインを欠く他 のペプチドがｓ　Ｔａｔペプチドカラムからタンパク質を溶出するにはあまり効 果がなかったことを示唆している。対照的に、塩基性ペプチドで溶出される物質 の大部分は、抗−β５サブユニツト抗体で検出可能であった（図５）。β５サブ ユニツトの不均一性は、クロマトグラフィーのため細胞をトリプシン処理して集 めることから生じる部分的タンパク質分解によるものと考えられる。標識された 物質は、Ｔａｔ５７−８６ペプチドで溶出された画分から免疫沈降され得なかっ た（図示せず）。これらの結果は、抗−ＶＮＲ血清による細胞付着の阻害（図３ ）とともに、α９β５インテグリンがＴａｔタンパク質に結合し、この結合がＴ ａｔの塩基性ドメインで起こることを示す。

塩基性ペプチドで得られた結果とは対照的に、セファロースに連結したペプチド ＧＲＧＤＳＰＫとのアフィニテイクロマトグラフィーは、著しく異なるパターン を示した（図６）。Ｔａ、ｔ−セファロースに結合するインテグリンの大部分が α９β５であったのに対して、α９β３が実質的にＧＲＧＤＳＰＫ結合画分に濃 縮された唯一のインテグリンであった（図６）。α、β５のあるものは結合画分 中に見られたにもかかわらず、このインテグリンの大部分は非結合画分中にある 。これは、Ｆｒｅｅｄら、　ＥＭＢＯＪ。

８：２９５５−２９６５　（＋９８９）に記載されているように、αＶβ５がペ プチドＧＲＧＤＳＰＫに対して比較的親和性が弱いことを実証した報告と一致し ている。同時にこれらのデータは、これらの細胞はペプチドＧＲＧＤＳＰＫと結 合可能な機能的なα、β３インテグリンを有するが、Ｔａｔ中のＲＧＤ配列はイ ンテグリンの結合に都合の悪い環境の中にある、ということを示唆している。

α７β５インテグリンは、Ｔａｔの塩基性ドメインには結合するが、ＲＧＤ配列 には結合しないので、インテグリンとそのリガンドとの相互作用は通常ではない ように思われる。さらにこれを試験するために、Ｔａｔとインテグリンとの会合 に対するＥＤＴＡ感受性を決定した。インテグリンが、それらのリガンドを結合 させる二価陽イオンを典型的に必要とし、リガンドアフィニティカラムからＥＤ ＴＡで溶出され得ることは公知である。しかし、α９β５とＴａｔとの間の相互 作用は、アフィニティクロマトグラフィー実験において１０−Ｍ　ＥＤＴＡによ る溶出には非感受性であった（図７）。１０　ＷＭ　ＥＤＴＡを含有する溶液中 のＮａＣ１濃度を１５０　ｍＭから１００　ｍＭに低くした結果、溶出が二価陽 イオンのキレート化によって起こり、溶液の塩濃度の全体の増加によっては起こ らないということを保証した。１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２５０　ｍＭ　ＮａＣ ｌあるいはＴａｔ４６−８６ペプチドで溶出されたピーク画分の免疫沈降の結果 は、レセプターがＴａｔカラムから高濃度の塩あるいはペプチドで溶出するが、 通常インテグリンの機能に必要とされる二価陽イオンをキレート化しても、この 異常なインテグリンーリガンド相互作用を破壊するには効果的ではなかったとい うことを示した。

Ｔａｔとα９β５との間の相互作用が以前定義されたインテグリンーリガンド結 合ではなかったので、主要なα、β５リガンドであるビトロネクチンとα９β５ 上の同じ部位にＴａｔが結合したかどうか決定するために実験を行った。モノク ローナル抗体Ｐ３Ｇ２　（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ）が、（ ｒｖβ５に結合し、ビトロネクチンとの相互作用を阻害することはすでに知られ ている。

この結果を図８に示されるようにＳＫ−ＬＭＳ細胞を用いて再現した。しかし、 モノクローナル抗体は、細胞のＴａｔへの結合を阻害しなかった。図３に示され るように、ポリクローナル抗−α９β３抗体は、Ｔａｔおよびビトロネクチンの 、ｓＫ−ＬＭＳ細胞との相互作用をともに阻害した。α９β３　（ＬＭ６０９） を認識するモノクローナルは、どちらかの基質への細胞の結合を阻害しなかった 。その結果は、α９β５がビトロネクチンおよびＴａｔの両方へのＳＫ−ＬＭＳ 細胞の付着を仲介し、レセプターの異なった領域が各リガンドへの結合に利用さ れ得ることを示唆している。

Ｌ五匠ユ■ Ｔａｔ　ムタンパク　の６ Ｌ８細胞中のＴａｔ結合タンパク質の同一性を決定するために、免疫沈降を、ポ リクローナル抗体と、αＶ、β１、β５およびβ６の細胞質性ドメインとで行っ た。α９細胞質性ドメインに対する抗体は、Ｔａｔペプチドカラムから溶出され た３つのバンドすべてを沈降した。しかし、α９サブユニツト、β１、β３、β ５およびβ６と会合することが既知の、あるいは推定される種々のインテグリン βサブユニ、トに対する試薬のどれも複合体を沈降しなかった。げっ歯類の細胞 系および組織との対照実験は、試薬が、関連するインテグリンと反応できること を実証した。これらの結果は、Ｔａｔカラムから溶出されるタンパク質が、α９ サブユニツトおよびおそらくは１つあるいは２つの未知のβサブユニットから成 るインテグリンであることを示す。

Ｔａｔｈラムからの非結合画分をＧＲＧＤＳＰＩニーセファロースカラムで再ク ロマトグラフした。ＧＲＧＤＳＰ−セファロースカラムで精製された物質はα、 およびβ３サブユニツトの両方に対する抗体により免疫沈降した。これらの細胞 は、Ｔａｔカラムに結合しなかった機能性ビトロネクチンレセプター（α９β３ ）を合成する。

１施」Ｌ■ 極ＪＬＬＬ乙Ｌ」コ一 本明細書中文献として援用したＲｕｏｓｌａｈｔｉら、■ロ、上旺Ｊｏ１．８２ 　Ｐｔ　Ａ：８０３−１１３１　（１９８２）に記載されたものと基本的に同じ 方法で、細胞付着アッセイを行った。マイクロタイタープレート（９６ウエル） を、全長ペプチド（Ｔａｔ−８６）、残基４５−８６のより短いＴａｔペプチド （Ｔａｔ−４１）あるいは残基５６−８６の第二の切形Ｔａｔペプチド（Ｔａｔ −３０）を基質として、０．２５％グルタルアルデヒドの存在下、１時間コーテ ィングした。プレートを洗浄し、次いで１Ｍエタノールアミンおよび２．５Ｂ／ ■ｌウシ血清アルブミンで処理した。Ｌ８ラット細胞を、上述のＢｒａｋｅらの ように、０．５１ｇ／霞１トリプシンでそれらの基質から分離し、ｏ、５ｍｇ／ 諷ｌ大豆トリプシンインヒビターで３回洗浄し、１０６細胞／■ｌの濃度でＤＭ ＥＭ中で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を阻害性抗体の存在下あるいは非 存在下、各ウェルに加えた。

１時間のインキュベージロンの後、付着細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定 し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。染料を染色された細胞から１ ００１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４，２）を含有する５０％エタノール１００ μｌで溶出した。付着を６００　ｎｍの吸光度を読み取ることにより定量した。

この研究で得られたおよその０．Ｄ、値を表１に要約する。

Ｔａｔ−８６０，９２ Ｔａｔ−４１０，９３ Ｔａｔ−３００，０６ Ｔａｔへの細胞接着がインテグリンにより仲介されたことを確認するために、種 々の抗体を用いてＴａｔへの細胞接着を阻害した。基質として１００μｍビトロ ネクチンあるいは残基４５−８６位のＴａｔペプチド（Ｔａｔ−４１）のいずれ かを用いて上記の方法を行った。さらに、ｌウェル当り約１０５個のＬ８細胞を 、抗−ビトロネクチンレセプター（抗−ＶＮＲ）抗体あるいは抗−フィブロネク チンレセプター（抗−ＦＮＲ）抗体の存在下、各ウェルに加えた。

抗体は対照として使用しなかった。付着細胞を固定し、クリスタルバイオレット で染色した。染料を溶出し、Ｏ，Ｄ、をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。この実 験で得たおよその０．Ｄ、値を表２に要約する。

対照　１．０３ 抗−ＦＮＲＯ，８８ 抗−ＶＮＲＯ，１４ ビトロネクチン： 対照　０．９４ 抗−ＦＮＲＯ，１＋７ 抗−ＶＮＲＯ，１４ ビトロネクチンレセプターに対する抗−ＶＮＲポリクローナル抗体は、ビトロネ クチンおよびＴａｔペプチドの両方へのこれらの細胞の接着を阻害した。抗−Ｆ ＮＲ抗体は、どちらの基質へのこれらの細胞の接着を効果的に妨げなかった。こ れらの結果は、ビトロネクチンレセプターに関連するレセプターは細胞のＴａｔ への接着の原因となることを示す。

いろいろなＴａｔ由来ペプチド（図１）との細胞付着アッセイを行って、細胞の Ｔａｔタンパク質との相互作用のメカニズムを調べた。上述のＢｒａｋｅらの研 究において、Ｌ８ラット骨格筋細胞めにそれらを選んだ。Ｌ８細胞はＴａｔタン パク質に容易に付着したが、これはこの初期の研究と一致する（図２Ａ）。Ｌ８ 細胞はまたＴａｔ４５−８６ペプチドに付着したが、このペプチドはＲＧＤ配列 および塩基性ドメインを含有するが、高システィンドメインを含有しない。残基 ５７位をアルギニンからリジンに変え、塩基性領域を削除した、より短いペプチ ド（残基５７−８６位）が細胞付着配列ＲＧＤを含有していたにもかかわらず、 細胞がより短いペプチドに付着しなかったことは予想しなかった結果である（図 ２Ａ）。同様の結果がヒト平滑筋肉種細胞系のＳＫ−ＬＭＳで得られたく図ＺＢ ）。細胞は塩基性領域を含有するペプチドだけに結合した。ＲＧＤ配列がＫＧＨ に変化したペプチドあるいはＲＧＤ配列が全く削除されたペプチドは、まだ細胞 付着をすることができ、塩基性領域が保有されていることが示された。事実、唯 一の塩基性ドメインおよび３つの隣りのアミノ酸を含有するペプチド（残基４５ −５７位）は、全長Ｔａｔと同様モル濃度レベルで細胞付着できた。これらの結 果は、細胞のＴａｔへの付着かヘパリンにより阻害されたという結果とともに、 Ｔａｔの塩基性領域がトランスアクティベージロンの機能に加えて、細胞接着に 必要とされ、ＴａｔのＲＧＤ含有領域目身が細胞接着できないことを示唆してい る。

支１史ユ 々のαおよび　サブユニ・ノドに・　るαｖ１　β３およびβ５の細胞質性尾部 に対するポリクローナル抗体は、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉ ｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に連結した合成ペプチドでウサギを免疫して 作成した。使用したペプチドは、５ｕｚｕｋｉら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃ ａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８３：８６１４−８６１８　（１９８６）ニ記載（Ｄ 　ａ　ｖ　（Ｄ　Ｃ末端１７）　ＫＲＶＲＰＰＱＥＥＱＥＲＥＱＬＱＰＨＥＮＧ ＥＧＮＳＥＴ、　ＦＩｔｚｇｅｒａｌｄ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６ ２：３９３６−３９３９　（１９８７）に記載のβ３のＣ末端のＫＦＥＥＥＲＡ ＲＡＨＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ、および５ｕｚｕｋｉ ら、　ｒｏｅ、ａｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｃ、　ＵＳ８７：　５３５４−５３５８　 （１９９０）１．：記載のβ５のＣ末端のＫＫＰＩＳＴＨＴＶＤＦＴＦＮＫＳＹ ＮＧＴＩ／Ｄであり、すべて本明細書中に文献として援用されている。すべての ペプチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａ（Ｆｏｓｔｅ ｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）により合成した。いくつかのこれらの抗体の調製につい ては、Ｆｒｅｅｄら、　ＥＭＢＯＪ、　８：２９５５−２９６５　（１９８９） にさらに詳細に記載されている。抗−β１サブユニット抗血清はまたＧｉａｎｃ ｏｔｔｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｌ、　Ｃｅ１ｌ　６０：８４９−８５９　（１ ９９０）に記載されている。抗体の各々は、免疫プロッティングにおける適切な インテグリンサブユニットと結合すること、および種々の表面標識細胞系からの これらのサブユニットを含有するインテグリンを沈降することが示された。

α９β３およびα５β１のインテグリンに対して調製されたポリクローナル抗体 は、Ａｒｇｒａｖｅｓら、Ｌ−工立Ｕ一旦ｉｏ１．１０５：１１８３−１１９０ 　（１９ｇ？）および５ｕｚｕｋｉら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、Ｓ ｃｉ、　ＵＳ八へ３：８６１４−８６１８　（１９Ｈ）に記載されている。モノ クローナル抗体（ＬＭ６０９）は、Ｄａｖｉｄ　Ｃｈｅｒｅｓｈ博士に頂いたも のであり、Ｃｈｅｒｅｓｈおよび５ｐｉｒｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ 、　２６２：１７７０３−１７７１１　（１９Ｂ？）、あるいはＢｒ１ｓｔｏｌ 　Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｌｂｂの薬学研究所（Ｐ２Ｏ３）から頂いたものであり、 Ｗａｙｎｅｒら、　Ｊ、　Ｃｅｌ上３１□　１３３：９１９−９２９　（１９９ １）に記載されている。

Ｔａｔへの接着がインテグリンにより仲介されたかどうかを決定するために、種 々の抗体を使用してＴａｔへの細胞接着を阻害した。ビトロネクチンレセプター （α７β３インテグリン）に対するポリクローナル抗体は、ビトロネクチンおよ びＴａｔ４５−８６ベブチドの両者へのＬ８およびＳＫ−ＬＭＳ細胞の接着を阻 害した（図３）。抗−フィブロネクチンレセプター（α５β１インテグリン）抗 体は、いずれの基質へのこれらの細胞の接着を阻害しなかった。対照実験は、抗 −α９β３抗血清が細胞のフィブロネクチンへの付着を阻害しなかったが、他方 、抗−α５β１抗血清は阻害したことを示した（図３）。それゆえ、α９β３イ ンテグリンに関連するレセプターは、細胞をＴａｔへ接着させ得るように思われ る。

実施１−■ °　アッセイ 免疫されたウサギ血清５μｌおよびプロティンＡ−セファロース５０ｕＩの存在 下で物質を１時間インキュベートすることにより免疫沈降を行った。レセプター −抗体−プロチインＡ複合体を沈降させ、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ ，１５０μＭ　ＮａＣ１，５０μＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４で３回洗浄した。

次いで、複合体を電気泳動用試料緩衝液で煮沸し、７．５％５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲルにかけた。

裏Ｗヱｌ アフィニテ　クロマトグラフィー Ｔａｔ結合タンパク質を表面ヨウ素標識細胞から単離したが、本質的にＰｙｔｅ ｌａら、巳Ｂυ−８２：５７６６−５７７０　（１９８５）およびＰｙｔｅｌａ ら、　Ｃｅ１１４０：１９１−１９８　（１９８５）に記載された方法で行った が、文献として本明細書中に援用されている。細胞接着アッセイと同様、細胞を １００μｇ／■ｌのトリプシン（シグマ）で培養プレートから剥離し、５００μ ｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター（シグマ）で３回洗浄した。細胞を表面 ヨウ素標識し、１５０μｍオクチルグルコシド、１　ｍＭ　ＣａＣｌ２．１　ｍ Ｍ　ＭｇＣｌ２．１μｇ／ｍｌ　アプロチニン、１μｇ／ｇ＋１０イベブチン、 ０．４μｇ／■ｌペプスタチン、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１および５０　ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ％ｐＨ７，４を含有する緩衝液で抽出した。抽出物を１５．０００　Ｘ　 ｇで澄明とし、それヲ臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア ）に連結した種々のペプチドを含有するカラムを通過させた。

２時間のインキ二ベーションの後、カラムを５０　ｍＭオクチルグルコシドを含 有する数倍量の抽出緩衝液で洗浄した。次に、結合したレセプターをカラムの洗 浄に使用した緩衝液で１ｌｇ／ｍｌ濃度の適切なペプチドを用いて溶出した。溶 出液の一部を電気泳動試料緩衝液中で煮沸し、７．５％５ＯＳ−ポリアクリルア ミドゲルで流すか、あるいは免疫沈降に使用した。

夾施に吐■ ポ１クローナル　の ポリクローナル抗体は、当該分野で公知のあらゆる方法により調製し得、免疫原 として適切なタンパク質あるいはそれらから誘導される合成ペプチドを用い得る 。さらに、本発明のインテグリン、Ｔａｔタンパク質あるいはこれらと等価の化 合物を免疫原として使用し得る。例えば、Ａｒｇｒａｖｅｓら、　Ｊ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５：１１６３−１１７３に記載される方法を使用し得る。

例えば、すくなくとも１個のりジン残基を含有する合成ペプチドをスカシ貝ヘモ シアニン（ＫＬＩ＋）に次のように連結した：５．６　ｍｌのＫｌ、Ｈ（ＩＪン 酸緩衝化した生理食塩水中１０■ｇ／閣ｌ）と０．５嘗ｌの霞−マレイミドベン ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ジメチルホルムアミド中２５ 　ｍｇ／ｍｌ）とを室温で３０分間攪拌することにより行った。混合液をろ過し 、ペプチド２５　ｍｇを加え、室温で３時間攪拌した。リン酸緩衝化した生理食 塩水に対して透析した後、連結ペプチドを含有する混合液をフロイントの完全ア ジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ″Ｓ　ＣＯ■ｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）中で乳 化、混合し、ニューシーラント白色雌ウサギに注射する。１ケ月後、動物に不完 全アジュバント中で乳化した混合液を再注射した。２回目の注射をして、約２週 間後に採血する。血液を凝固させ、得られた血清をポリクローナル抗体の原料と して使用する。

支配Ｌ］ トランスアクティベージ１ン　アッセイ細胞を１０　ｃ■の皿（１０６細胞／皿 ）に蒔いた。翌日、細胞をＤＥＡＥデキストラン沈澱により５μｇのＬＴＲ−Ｃ ＡＴおよび／あるいは５μｇのＬＴＲ−Ｔａｔプラスミドを用いてトランスフェ クトした。これはＤａｖｉｄら、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ　ｏ　、　ｐ、３８８（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　１９１１６） に述べられ、本明細書中に文献として援用されている。トランスフェクションし て２日後、細胞を８０μｇあるいは８μｌのウサギ抗−ヒトビトロネクチンレセ プター（抗−α、β３）、抗−フィブロネクチンレセプタ−（抗−α５β１）あ るいは正常ウサギ血清と共に３■ｌの完全ＤＭＥＭ中で３０分間インキュベート し、その後グルタチオントランスフェラーゼ−Ｔａｔ融合タンパク質を含有する Ｅ、　ｃｏｌｔ抽出物０．５μｌを添加した。

Ｔａｔタンパク質の塩基性ペプチド（３００μｇ）もまたＴａｔ　）ランスアク ティベージ３ンの阻害アッセイに用いた。１６時間後、細胞を集め、凍結および 解凍を３サイクル行うことにより細胞を破壊し、細胞溶解物を集め、次いで、Ｃ ＡＴアッセイに使用したが、これは本明細書中に文献として援用しているＧｏｒ ｉ＋ａｎらｌＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２：１０４４−１０５１　（ １９８２）に記載されている。

αＶβ５がＴａｔ内在化に対するレセプターとして徐立つかどうかを決定するた めに、塩基性Ｔａｔペプチドおよびα９β３に対する抗体が、細胞外Ｔａｔによ るトランスアクティベージ讐ンに与える効果を検討した。α５β１への抗体を対 照として用いた。

図９に示されるように（レーン１−３）　、Ｌ８細胞に加えた組換えＧＳＴ−Ｔ ａｔ融合タンパク質は、これらの同一細胞内にトランスフェクトされたＬＴＲリ ポータ−遺伝子を効率的かつ特異的にトランスアクティベートすることができた 。しかし、ＣＡＴ活性は、細胞接着を阻害するのに十分な濃度の抗−αＶβ３抗 体の存在下でも減少せず（レーン５）、また３００μｇの塩基性ペプチドの存在 下でも阻害しなかった（レーン４）。これらの結果は、Ｌ８細胞内への機能性Ｔ ａｔタンパク質の侵入がαＶβ５インテグリンとの相互作用には依存しないこと を示唆し、これはＭａｎｎおよびＦｒａｎｋｅｌ、　ＥＭＢＯＪ、　１０：１７ ３３−１７３９（１９９１）に記載されているように、Ｔａｔ内在化がレセプタ ーで仲介されなかったという初期の本発明は好ましい実施態様について記載して いるが、種々の改変が本発明の精神からはずれることなく行われ得ることが理解 されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ制限される 。

へ０ブチト°’Ｊ／ｌ　（ｐｇ／ｍ１）ＦｉＧ、２Ａ へ０デチド、ｊ　７ｉ　（ｐｇ／ｍ１）ＦＩＧ、２Ｂ Ｔａｔ４シー８６　Ｔａｔｌ−８６ □友沁 −・・・　―−・・ □錦 □４ ＦＩＧ、　４ αＶβ１β３β５αＶβ１β３β５αＶβ１β３β５ＦＩＧ、　５ 畦め右　−を智 劇■−−喝一一一−ｌ■■■■−１１ へβ１β３β５Ｑｙβ１β３β５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）７、前記以外の特許出 願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４６１２−３５５０オークランド、 トウエンティセカンド　フロア−。

レイクサイド　ドライブ　３００ 名称　ザ　リージェンツ　ォブ　ザ　ユニバーシティオブ　カリフォルニア １＆亘且亘 １、　旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質の、　ＨＩＶ　Ｔａｔ結合結合インリグリン現す る細胞への結合を阻害する方法であって、該■■ｖτａｔタンパク質の該インテ グリンへの結合をブロックすることを包含し、該ブロックが非ＲＧＤ結合領域を 含有する結合部位で起こる、方法。

２、　前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の前記インテグリンへの結合が、ＨＩＶ　 Ｔａｔタンパク質が該ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質のインテグリン結合部位と反応 性を有する試薬と結合することによりブロックされる、請求項１に記載の方法。

３、　前記試薬が抗体である、請求項２に記載の方法。

４、　前記試薬が前記インテグリンの反応性断片である、請求項２に記載の方法 。

５、　前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の前記インテグリンへの結合が、該インテ グリンと該インチ、グリノに対して特異性を有すル試薬とがＦＩＩＶ　Ｔａｔタ ンパク質結合部位で結合することによりブロックされる、請求項１に記載の方法 。

６、　試薬が前記旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質の反応性断片である、請求項５に記載 の方法。

７、　前記試薬が旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質残基４５−８６位のアミノ酸配列ある いはその反応性断片を実質的に有する、請求項６に記載の方法。

８、　前記反応性断片が前記旧Ｖ　Ｔａｔタンパク質の塩基性領域を特徴する請 求項７記載の方法。

９、　前記塩基性領域がアミノ酸配列Ｒ１［ＫＲＲＱＲＲＲを実質的に有する、 請求項８に記載の方法。

１０、ＨＩＶ　Ｔａｔ結合結合インリグリン結合反応性を有するＨｆＶ　Ｔａｔ タンパク質の単離された断片であって、該断片がアミノ酸配列ＲＫＩ［ＲＲＱＲ ＲＲＸＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥを有し、Ｘが０から１５個までのアミノ酸 である、単離された断片。

１８、Ｔａｔ結合結合インリグリンサブユニット応性断片をコードする単離され た核酸。

１９、前記インテグリンサブユニットがβサブユニットである、請求項１８に記 載の単離された核酸。

２０、前記βサブユニットがβ５である、請求項１９に記載の単離された核酸。

２１、請求項１９に記載の核酸を含有するベクター。

２２、請求項２１に記載のベクターを含有する宿主。

２３、結合部位でＴａｔ結合結合インリグリンいはその反応性断片との特異的反 応性を有し、Ｔａｔタンパク質と該インテグリンとの結合を阻害する試薬。

２４、前記試薬が抗体である、請求項２３に記載の試薬。

２５、前記Ｔａｔ結合結合インリグリン、β５である、請求項２３に記載の試薬 。

２６、前記断片が前記インテグリンのβサブユニットである、請求項２３に記載 の試薬。

２７、前記βサブユニットがβ５である、請求項２６に記載の試薬。

２８、非旧Ｖ　Ｔａｔ結合結合インリグリンードするｍ　酸Ｅハイブリダイスし ないで、Ｈ１ｖＴａｔ結合インテグリンあるいはその反応性断片をコードする核 酸と特異的にハイブリダイズする核酸プローブ。

２９、試料中の旧Ｖ　Ｔａｔ結合結合インリグリン合するリガンドを検出する方 法であって、 （ａ）該インテグリンを該試料と接触させること、および （ｂ）該インテグリンの該試料への結合を決定し、結合が該リガンドの存在を示 すこと、を包含する方法。

３０、前記リガンドがＨＩＶ丁ａｔタンパク質あるいはその反応性断片である、 請求項２９に記載の方法。

Ｈ，前記リガンドが疑似ペプチドである、請求項２ｇに記載の方法。

３２、　８ＩＶ　Ｔａｔタンパク質の旧Ｖ　Ｔａｔ結合結合インリグリン現する 細胞への結合を増加させる方法であって、前記インテグリンを該細胞中で過剰発 現させることを包含する、方法。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１２ Ｃ１２Ｑ　１／７０　７８２３−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｈ８３１０−２Ｊ ／／Ｃ０７Ｋ　９９：００ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＯ，ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ ＦＩ （７２）発明者　ルオスラーティ、エルキ　アイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２０６７ランチヨ　サンタ　フェ、ピー、 オー。

ボックス　１０５４ （７２）発明者　ボーゲル、ブルース　イー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１２２サン　ディエゴ、ナンバー　７２ ．デコロストリート　４１７８ （７２）発明者　ウォシースタール、フロッシー　ワイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１３０サン　ディエゴ、モンテレイ　サ イプレス　ウェイ　１２７３７

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の、ＨＩＶ　Ｔａｔ結合インテグリンを発現する 細胞への結合を阻害する方法であって、該ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の該インテ グリンヘの結合をブロックすることを包含し、該ブロックが非ＲＧＤ結合領域を 含有する結合部位で起こる、方法。
2. ２．前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の前記インテグリンヘの結合が、ＨＩＶ　Ｔ ａｔタンパク質が該ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質のインテグリン結合部位と反応性 を有する試薬と結合することによりプロックされる、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記試薬が抗体である、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記試薬が前記インテグリンの反応性断片である、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の前記インテグリンヘの結合が、該インテグ リンと該インテグリンに対して特異性を有する試薬とがＨＩＶ　Ｔａｔタンパク 質結合部位で結合することによりブロックされる、請求項１に記載の方法。
6. ６．試薬が前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の反応性断片である、請求項５に記載 の方法。
7. ７．前記試薬がＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質残基４５−８６位のアミノ酸配列ある いはその反応性断片を実質的に有する、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記反応性断片が前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の塩基性領域を含有する、 請求項７記載の方法。
9. ９．前記塩基性領域がアミノ酸配列　ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ　を実質的に有する、 請求項８に記載の方法。
10. １０．ＨＩＶ　Ｔａｔ結合インテグリンとの結合反応性を有するＨＩＶ　Ｔａｔ タンパク質の単離された断片であって、該断片が非ＲＧＤ結合領域を含有する、 単離された断片。
11. １１．前記断片が前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の塩基性ドメインを含有する、 請求項１０に記載の単離された断片。
12. １２．前記塩基性ドメインがアミノ酸配列　ＲＸＸＲＲＱＲＲＲ　を実質的に有 する、請求項１１に記載の単離された断片。
13. １３．前記断片が前記ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質のＲＧＤ含有ドメインをさらに 含有する、請求項１１に記載の単離された断片。
14. １４．前記断片がアミノ酸配列　ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧ ＰＫＥを実質的に含有し、Ｘが０から１５個までのアミノ酸である、請求項１３ に記載の単離された断片。
15. １５．前記インテグリンがαｖβ５である、請求項１０に記載の単離された断片 。
16. １６．塩基性ドメインを有するＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質の反応性断片をコード する単離された核酸。
17. １７．前記塩基性ドメインがアミノ酸配列　ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ　を実質的に有 する、請求項１６に記載の単離された核酸。
18. １８．Ｔａｔ結合インテグリンサブユニットあるいはその反応性断片をコードす る単離された核酸。
19. １９．前記インテグリンサブユニットがβサブユニットである、請求項１８に記 載の単離された核酸。
20. ２０．前記βサブユニットがβ５である、請求項１９に記載の単離された核酸。
21. ２１．請求項１９に記載の核酸を含有するベクター。
22. ２２．請求項２１に記載のベクターを含有する宿主。
23. ２３．結合部位でＴａｔ結合インテグリンあるいはその断片との特異的反応性を 有し、Ｔａｔタンパク質と該インテグリンとの結合を阻害する試薬。
24. ２４．前記試薬が抗体である、請求項２３に記載の試薬。
25. ２５．前記Ｔａｔ結合インテグリンがαｖβ５である、請求項２３に記載の試薬 。
26. ２６．前記断片が前記インテグリンのβサブユニットである、請求項２３に記載 の試薬。
27. ２７．前記βサブユニットがβ５である、請求項２６に記載の試薬。
28. ２８．非ＨＩＶ　Ｔａｔ結合インテグリンあるいはその反応性断片をコードする 核酸にハイブリダイスしないで、ＨＩＶ　Ｔａｔ結合インテグリンをコードする 核酸と特異的にハイプリダイズする核酸プローブ。
29. ２９．試料中のＨＩＶ　Ｔａｔ結合インテグリンに結合するリガンドを検出する 方法であって、 （ａ）該インテグリンを該試料と接触させること、および （ｂ）該インテグリンの該試料への結合を決定し、結合が該リガンドの存在を示 すこと、を包含する方法。
30. ３０．前記リガンドがＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質あるいはその反応性断片である 、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記リガンドが疑似ペプチドである、請求項２９に記載の方法。
32. ３２．ＨＩＶ　Ｔａｔタンパク質のＨＩＶ　Ｔａｔ結合インテグリンを発現する 細胞への結合を増加させる方法であって、前記インテグリンを該細胞中で過剰発 現させることを包含する、方法。