JP2014168403A - 細胞培養容器 - Google Patents

Abstract

【課題】遠心力を付与した場合に内部の培養液が外方へ流出しない細胞培養容器を提供する。
【解決手段】細胞培養容器１０は細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能な内底面１１ａと、上方開口１１ｂとを有する容器本体１１と、容器本体１１の上方開口１１ｂを覆う蓋体１２とを備えている。容器本体１１の上端１１ｄにはリング状の高摩擦部材１８が設けられ、蓋体１２の裏面１２ｃには高摩擦部材１８に当接するリング状の高摩擦部材１９が設けられ、高摩擦部材１８、１９同士が当接して容器本体１１に対する蓋体１２の摺動が防止される。このことにより細胞培養容器１０に対して遠心力を付与した際、容器本体１２内の培養液が外方へ流出することはない。
【選択図】図１

Description

本発明は、厚さ方向に複数の細胞が積層された多層構造を有する生体組織の製造に適した細胞培養容器に関する。

コラーゲン等の培養担体上で細胞を培養させて製造される生体組織は細胞密度が低いため、医療目的の移植用組織として適したものではない。移植に適した、細胞密度が高い細胞シートなどの組織を製造する技術はテッシュエンジニアリングの分野において重要な技術であるといえる。しかしながら、従来の高細胞密度の生体組織の製造法には幾つかの問題点が存在する。

細胞を培養支持体上に播種し、細胞シートを形成することは一般に広く行われている。細胞シートの剥離を容易にする目的で、細胞接着面に温度応答性高分子化合物の層を設け、細胞の剥離を促進させる技術も開発されており、異物をほとんど含まない細胞シートの回収が可能である。しかしながらこの方法により形成される細胞シートは単層または３層以下の細胞層から構成されることが通常である。このため、多層化を行うには、細胞シートを複数重ね合わせることが必要である。細胞シートは極めて薄く、取り扱いが困難であるため、複数重ね合わせることは容易でなく手間がかかる。

そこで、移植に適した生体組織を得るため、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する細胞培養容器が開発されている。生体組織を作製する場合、まず細胞を含有する培養液を細胞培養容器に注入する。次に細胞培養容器を遠心分離器に設置して内底面方向への遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行ない、細胞間を接着させて組織を形成することにより内底面に生体組織を堆積させている（特許文献１〜３参照）。

特開２０１０−１６１９５２号公報 特開２０１０−１６１９５３号公報 特開２０１０−１６１９５４号公報

上述のように移植に適した生体組織を得るための細胞培養容器が開発されている。またこのような細胞培養容器は遠心分離機に設置され、細胞培養容器に対して遠心力が付与されて細胞培養が行なわれる。

しかしながら、細胞培養容器を遠心分離機に設置して、細胞培養容器に対して遠心力を付与する場合、遠心力を付与する工程中に細胞培養容器内から培養液が外部へ流出してしまうことがある。

本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、遠心力を付与する工程中に内部の培養液が外部へ流出することを防止することができる細胞培養容器を提供することを目的とする。

本発明は、細胞を含有する培養液を収納し、内底面方向へ遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行ない、細胞間を接着させて組織を形成して内底面に生体組織を堆積させる細胞培養容器において、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有するとともに、上方開口を有する容器本体と、容器本体の上方開口を覆う蓋体とを備え、容器本体の上端および蓋体の裏面は互いに当接し、容器本体の上端および蓋体の裏面のいずれか一方に、容器本体の上端と蓋体の裏面との間の摩擦係数を高める高摩擦部材を設けたことを特徴とする細胞培養容器である。

本発明は、容器本体および蓋体は合成樹脂製となっており、高摩擦部材はシリコーンゴムからなるものであってもよい。

本発明は、高摩擦部材は環状に形成されて、密封パッキン部材として機能するものであってもよい。

本発明は、容器本体に容器本体固定手段が設けられ、蓋体に容器本体固定手段に係合する蓋体固定手段が設けられていてもよい。

本発明は、容器本体固定手段および蓋体固定手段の一方は内ねじからなり、他方は外ねじからなるものであってもよい。

本発明は、蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込むガイド溝からなるものであってもよい。

本発明は、ガイド溝には突起を係止する幅細部が設けられているものであってもよい。

本発明は、蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込む溝からなるものであってもよい。

本発明は、蓋体固定手段は揺動突起からなり、容器本体固定手段は揺動突起に係合する容器本体の下端からなるものであってもよい。

本発明は、容器本体固定手段と蓋体固定手段は、互いに係合して容器本体内の培養液の放出を防止するとともに、容器本体内部と外部雰囲気とを連通可能とするものであってもよい。

以上のように本発明によれば、細胞培養容器内に培養液を注入した後、細胞培養容器に対して遠心力を付与した場合、細胞培養容器内から培養液が外方へ流出することを防止することができる。

図１（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明による細胞培養容器の第１の実施の形態を示す断面図。 図２は本発明による細胞培養容器の第１の実施の形態を示す斜視図。 図３（ａ）（ｂ）（ｃ）は細胞培養容器を用いた細胞培養の作用を示す図。 図４（ａ）（ｂ）は遠心分離機を示す図。 図５は本発明による細胞培養容器の第１の実施の形態における変形例を示す図。 図６（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明による細胞培養容器の第２の実施の形態を示す図。 図７（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明による細胞培養容器の第２の実施の形態における変形例を示す図。 図８（ａ）（ｂ）は本発明による細胞培養容器の第３の実施の形態を示す図。 図９は本発明による細胞培養容器の第３の実施の形態における変形例を示す図。 図１０は本発明による細胞培養容器の第４の実施の形態を示す図。

発明の実施の形態

第１の実施の形態
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。

図１乃至図４は本発明による細胞培養容器１０の第１の実施の形態を示す図である。

細胞培養容器１０は、図１（ａ）（ｂ）（ｃ）および図２に示すように、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面１１ａを有するとともに上方開口１１ｂを有する容器本体１１と、容器本体１１の上方開口１１ｂを覆う蓋体１２とを備えている。

ここで図１（ａ）は細胞培養容器１０を示す断面図であり、図１（ｂ）は蓋体１２の裏面を示す図であり、図１（ｃ）は容器本体１１を示す上面図である。

このような細胞培養容器１０は、内底面１１ａと内側面１１ｃにより囲まれた空間に細胞２を含有する培養液１を収納することができ、内底面１１ａ方向へ遠心力を作用させながら、細胞２間接着が形成される条件下で細胞培養を行なうものであり、細胞２間を接着させて組織を形成して内底面１１ａに生体組織を堆積させるものである（図３（ａ）（ｂ）（ｃ）参照）。

この場合、細胞含有培養液１（図３（ａ）（ｂ）（ｃ）参照）を収容する容器部分の内表面のうち少なくとも内底面１１ａが細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であればよいが、特に、細胞含有培養液を収容する容器部分の内表面のうち、細胞と接触する表面の全て（例えば容器の内底面１１ａおよび内側面１１ｃ）が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であることが好ましい。

本発明に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。

これらの細胞は、予め通常の方法で培養させ、培養物をトリプシン処理等で処理し、培養液中に懸濁させた状態で培養容器に収容される。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用することが好ましい。

本発明において、細胞非接着性である表面としては、親水性の表面、具体的には２０℃の静的水接触角が４５°以下である表面が挙げられる。このような表面は、炭素酸素結合を有する有機化合物の皮膜を基材の表面上に形成することにより得ることができる。あるいは基材自体を親水性を有する材料で構成してもよい。

親水性被膜を表面上に形成するための基材の材料は特に限定されず、具体的には、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。好適には、ポリスチレンが用いられる。

細胞非接着性表面は、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される、静的水接触角が４５°以下である親水性膜により形成することができる。

炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。

親水性膜の主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等の親水性有機化合物が挙げられる。これらが相互に物理的または化学的に架橋し、基材と物理的または化学的に結合することにより親水性膜となる。

親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、基板表面の親水性膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。

基材表面への親水性膜の形成方法としては、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に親水性膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基板表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。

本発明で用いられる培養容器の内底面をはじめとする内表面の細胞接触領域は、細胞非接着性であることが、組織の剥離の容易性という観点から好ましいが、細胞培養時には細胞接着性であるが剥離の際に細胞非接着性に変化することが可能である表面であってもよい。このような表面は、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種の刺激応答性高分子が共有結合し基材の表面に固定化することにより形成することができる。刺激応答性高分子としては、刺激の付与が容易である温度応答性ポリマーが好ましいがこれには限定されない。

次に細胞培養容器１０について図１（ａ）（ｂ）（ｃ）および図２により更に説明する。細胞培養容器１０は上述のように、内底面１１ａと上方開口１１ｂとを有する容器本体１１と、容器本体１１の上方開口１１ｂを覆う蓋体１２とを備え、このうち容器本体１１は円筒状をなすシャーレ型の容器本体となっている。

図１（ａ）（ｂ）（ｃ）および図２に示すように、蓋体１２は上板１２ａと側壁１２ｂとを有し、上板１２ａの裏側は蓋体１２の裏面１２ｃとなっている。そして容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆った場合に、容器本体１１の上端１１ｄと蓋体１２の裏面１２ｃとが当接する。この場合、容器本体１１の上端１１ｄには、摩擦係数を高める高摩擦部材１８が環状に設けられおり、蓋体１２の裏面１２ｃにも高摩擦部材１９が環状に設けられている。

そして容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆った場合、容器本体１１の上端１１ｄの高摩擦部材１８と蓋体１２の裏面の高摩擦部材１９とが互いに当接して、容器本体１１に対して蓋体１２が摺動することなく固定される。

この場合、容器本体１１および蓋体１２は、いずれもポリスチレン等の合成樹脂からなり、容器本体１１の高摩擦部材１８および蓋体１２の高摩擦部材１９はいずれもシリコーンゴム等の高摩擦部材からなっている。シリコーンゴムは、柔軟性に富み、かつ剥離や吸着可能な程度の弱粘着性を有するため、容器本体１１と蓋体１２の間の摩擦力を高めるとともに両者の密着性も向上させることができる。また容器本体１１の高摩擦部材１８および蓋体１２の高摩擦部材１９は、いずれもリング状に形成されている（図１（ｂ）（ｃ）参照）。

この場合、リング状の高摩擦部材１８とリング状の高摩擦部材１９とが互いに当接して、高摩擦部材１８、１９は密封パッキン部材として機能する。

容器本体１１内に上方開口１１ｂから細胞２を含有する培養液１を収納し、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆い、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により密閉する。この場合、容器本体１１のリング状の高摩擦部材１８と蓋体１２のリング状の高摩擦部材１９とが当接するため、蓋体１２が容器本体１１に対して摺動することはなく、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により確実に密閉することができる。

このことにより、後述する遠心分離工程中でも容器本体１１内の培養液１が外方へ流出することはない。この場合、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により完全に密封することもできるため、容器本体１１内部は外部雰囲気と遮断される。

しかしながら、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により完全に密封することなく、容器本体１１内の培養液１の外方への流出を防止しつつ、容器本体１１内と外部雰囲気とを連通させて細胞培養により低下する容器本体１１内の二酸化炭素を外部雰囲気から補なってもよい。

例えば、高摩擦部材１８、１９を断続的に形成し、高摩擦部材１８、１９間において気体を通過させるようにしてもよい。この場合も、高摩擦部材１８、１９同士が当接するため、蓋体１２の摺動を未然に防止することができる。

また、容器本体１１の上端１１ｄに高摩擦部材１８を設け、蓋体１２の裏面１２ｃに高摩擦部材１９を設けた例を示したが、これに限らず、容器本体１１の上端１１ｄのみに高摩擦部材１８を設け、蓋体１２の裏面１２ｃには必ずしも高摩擦部材を設ける必要はない。同様に容器本体１１の上端１１ｄに高摩擦部材を設けることなく、蓋体１２の裏面１２ｃのみに高摩擦部材１９を設けてもよい。このように容器本体１１の上端１１ｄおよび蓋体１２の裏面１２ｃのいずれか一方に高摩擦部材１８、１９を設けた場合も、蓋体１２の容器本体１１に対する摺動を防止することができる。

次にこのような構成からなる本実施の形態の作用について説明する。

まず図３（ａ）に示すように、容器本体１１内に上方開口１１ｂから細胞２を含有する培養液１を注入する。

次に容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆う。この場合、容器本体１１の上端１１ｄおよび蓋体１２の裏面１２ｃの少なくとも一方に高摩擦部材１８、１９を設けたので、容器本体１１に対して蓋体１２が摺動することはなく、このことにより容器本体１１内の培養液１が外方へ流出するが防止される。

次に細胞培養容器１０を図４（ａ）（ｂ）に示す遠心分離機２０に設置する。

図４（ａ）（ｂ）に示すように、遠心分離機２０は回動軸２１と、回動軸２１に固定されたアーム２２と、アーム２２の先端に揺動軸２４を介して揺動可能に取付けられたバスケット２３とを有している。

そして細胞培養容器１０を遠心分離機２０のバスケット２３上に設置し（図４（ａ）参照）、次に回動軸２１を回動させる（図４（ｂ）参照）。

この場合、アーム２２の先端に揺動軸２４を介して取付けられたバスケット２３が上方へ持上げられ、回動軸２１の回動に伴なって細胞培養容器１０に対して、容器本体１１の内底面１１ｂ方向に向かう遠心力が働く。

容器本体１１の内底面１１ａ側へ遠心力が働くことにより、培養液１中の細胞２間が接着して組織を形成し、内底面１１ａにシート状の生体組織３が堆積する。

このようにしてシート状の生体組織３が他の培養液１と分離される（図３（ｂ）参照）。

次に細胞培養容器１０に対して遠心力を付与する工程について更に述べる。

細胞培養容器１０に収容された培養液１に内底面１１ａ方向への遠心力を作用させることにより、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する。遠心力により細胞２が内底面１１ａの形状に応じて内底面１１ａに密着した状態で、細胞２同士が接着し、所望の形状の組織が形成される。

図４（ａ）（ｂ）に示す遠心分離機２０から付与される遠心力の大きさは、細胞２の機能に悪影響を与えることなく組織の形成が可能な範囲で適宜選択することができる。例えば２Ｇ〜１４４０Ｇが好ましく、２Ｇ〜７２０Ｇがより好ましい。

ここで「細胞間接着が形成される条件」とは細胞が活動して細胞同士が接着できる条件を指す。培養する細胞の種類に応じて変動するが、例えば温度条件は２０〜４０℃が好ましく、雰囲気ガス条件としては二酸化炭素濃度が３〜５％であることが好ましく、培養時間としては０．５〜２４時間が好ましい。本発明の有利な特徴の一つは培養時間を短くすることができ、細胞へのダメージを小さくすることができる点にある。培養時間は後述する細胞外マトリクスを別途調製し添加する実施形態では短縮することが可能あり、培養時間を０．５〜３時間とすることができるため好ましい。細胞外マトリクスを添加しない実施形態では、培養時間を１〜２４時間とすることができる。

本実施の形態では培養容器を所望の雰囲気ガス（二酸化炭素濃度５％）で満たされたインキュベータ内で数分間放置したのち、雰囲気ガスが変化しないように培養容器に蓋をして完全に密閉した状態で加重培養を行なう。しかしながらこれには限定されず、例えば雰囲気ガスおよび温度が制御されたインキュベータ内であれば培養容器を完全に密閉せずに開放した状態で加重培養を行うこともできる。

遠心力を付与して細胞培養を行なう場合、細胞間接着が形成されれば十分であり、細胞数を増殖により増やすことは必須ではない。培養液中における細胞数を適宜調節することにより、作製される組織の厚さ（すなわち組織の厚さ方向の細胞積層数）を制御することが可能である。このように細胞培養工程において細胞の増殖を行う必要がないため、比較的短時間で組織を得ることができる。また組織の厚さ、形状を自在に調節することができる。

また本実施の形態の細胞培養容器を用いた細胞培養方法によれば、細胞が高密度化された組織を得ることが可能となる。細胞が高密度化された組織は移植用途に好ましい。

次に遠心力を付与する工程の終了後に、得られた生体組織３を細胞培養容器１０の内底面１１ａから剥離し回収する（図３（ｃ）参照）。例えばピペッティング操作などの物理的な操作よって細胞を剥離することができる。細胞培養容器１０の内底面１１ａが細胞非接着性表面であればこの操作は容易であり短時間の培養で組織の作製及び剥離回収が可能である。細胞培養容器１０の内底面１１ａが刺激応答性高分子などの、細胞非接着性に変化する表面である場合には、細胞非接着性となるような環境（例えば下限臨界温度以下の温度）において剥離操作を行う。

以上のように本実施の形態によれば、容器本体１１内に上方開口１１ｂから培養液１を注入した後、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆う。この場合、容器本体１１の上端１１ｄおよび蓋体１２の裏面のうち少なくとも一方に高摩擦部材１８、１９を設けたので、容器本体１１に対して蓋体１２が摺動することはない。このことにより容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により確実に覆うことができ、細胞培養容器１０を遠心分離機１２のバスケット２３上に設置し、細胞培養容器１０に対して内底面１１ａ側へ向う遠心力を作用させながら細胞培養する場合において、容器本体１１内の培養液１が外方へ流出してしまうことはない。

次に第１の実施の形態の変形例について、図５により説明する。

図５に示す変形例において、容器本体１１の側壁外面に外ねじ１３が設けられ、蓋体１２の側壁１２の内面に容器本体１１の外ねじ１２に係合する内ねじ１４が設けられている。このうち外ねじ１３は容器本体固定手段となり、内ねじ１４は蓋体固定手段となる。

図５に示す変形例において、他の構成は図１乃至図４に示す実施の形態と略同一である。図５において図１乃至図４に示す実施の形態と同一部材には、同一符号を付して詳細な説明は省略する。

図５において、容器本体１１内に上方開口１１ｂから細胞２を含有する培養液を収納し、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体により覆う。次に蓋体１２を回動させて外ねじ１３と内ねじ１４を係合させることにより、容器蓋体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により密閉することができる。この場合、容器本体１１の上端１１ｄにはリング状の高摩擦部材１８が設けられ、蓋体１２の裏面１２ｃにはリング状の高摩擦部材１９が設けられ、これら高摩擦部材１８、１９は互いに当接して密封パッキン部材として機能し、かつ容器本体１１に対して蓋体１２の摺動を防止する機能を果たす。

第２の実施の形態
以下、図６および図７により本発明の第２の実施の形態について説明する。図６および図７に示す第２の実施の形態は、容器本体１１に設けられた容器本体固定手段と蓋体１２に設けられた蓋体固定手段の構成が異なるのみであり、他の構成は図１乃至図５に示す第１の実施の形態と略同一である。

図６および図７に示す実施の形態において、図１乃至図４に示す第１の実施の形態と同一部分については同一符号を付して詳細な説明は省略する。

図６（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、蓋体１２の側壁内面に、容器本体１１側へ突出する突起（蓋体固定手段）１６が設けられ、容器本体１１の側壁外面に突起１６が入り込むガイド溝（容器本体固定手段）１７が形成されている。また容器本体１１と蓋体１２はいずれもポリスチレン等の合成樹脂からなる。

ここで、図６（ａ）は容器本体１１と蓋体１２を示す断面図であり、図６（ｂ）は容器本体１１の側壁外面を示す図であり、図６（ｃ）は蓋体１２の側壁内面を示す図である。

図６（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、容器本体１１の側壁外面に設けられたガイド溝１７は、縦方向に延びる縦方向溝１７ａと、縦方向溝１７ａの下端から水平方向に延びる横方向溝１７ｂとを有し、横方向溝１７ｂには突起１６を係止する幅細部１７ｃが形成されている。

図６（ａ）（ｂ）（ｃ）において、容器本体１１内に上方開口１１ｂから培養液１が注入され、その後容器本体１１の上方開口１１ｂが蓋体１２により覆われる。次に蓋体１２の側壁内面に設けられた突起１６をガイド溝１７の縦方向溝１７ａ内に嵌合させる。さらに蓋体１２を容器本体１１側へ押込み、突起１６が縦方向溝１７ａの下端に達した際、蓋体１２を回動させる。このことにより突起１６が横方向溝１７ｂ内に入り、突起１６が幅細部１７ｃを乗り越えて横方向溝１７ｂの先端に達する。

横方向溝１７ｂ内の突起１６は幅細部１７ｃにより係止されるため、蓋体１２を容器本体１１に対して堅固に取付けることができる。

この場合、容器本体１１の上端１１ｄにはリング状の高摩擦部材１８が設けられ、蓋体１２の裏面１２ｃにはリング状の高摩擦部材１９が設けられ、これら高摩擦部材１８、１９は互いに当接して密封パッキン部材として機能する。

また高摩擦部材１８、１９は互いに当接して容器本体１１に対する蓋体１２の摺動を防止する機能を果たす。

この場合、高摩擦部材１８、１９はシリコーンゴムからなっている。

あるいは図７（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、蓋体１２の側壁内面に容器本体１１側へ突出する突起１６（蓋体固定手段）を設けるとともに、容器本体１１の側壁外面に突起１６が入り込むガイド溝（容器本体固定手段）１７を設けてもよい。

ここで、図７（ａ）は容器本体１１と蓋体１２を示す断面図であり、図７（ｂ）は容器本体１１の側壁外面を示す図であり、図７（ｃ）は蓋体１２の側壁内面を示す図である。

図７（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、容器本体１１の側壁外面に設けられたガイド溝１７は、縦方向に延びる縦方向溝１７ａを有し、縦方向溝１７ａの下方部には突起１６を係止する幅軸部１７ｃが形成されている。

図７（ａ）（ｂ）（ｃ）において、容器本体１１内に上方開口１１ｂから培養液１を注入した後、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆う。次に蓋体１２の側壁内面に設けられた突起１６をガイド溝１７の縦方向溝１７ａ内に嵌合させる。さらに蓋体１２を容器本体１１側へ押込む。このことにより突起１６が幅細部１７ｃを乗り越えて縦方向溝１７ａの下端に達する。

縦方向溝１７ａ内の突起１６は幅細部１７ｃにより係止されるため、蓋体１２を容器本体１１に対して堅固に取付けることができる。

この場合、容器本体１１の上端１１ｄにはリング状の高摩擦部材１８が設けられ、蓋体１２の裏面１２ｃにはリング状の高摩擦部材１９が設けられ、これら高摩擦部材１８、１９は互いに当接して密封パッキン部材として機能する。

また高摩擦部材１８、１９は互いに当接して容器本体１１に対する蓋体１２の摺動を防止する機能を果たす。

この場合、高摩擦部材１８、１９はシリコーンゴムからなっている。

第３の実施の形態
以下、図８および図９により本発明の第３の実施の形態について説明する。

細胞培養容器３０は、図８（ａ）（ｂ）に示すように、複数の液収納部３１Ａと、液収納部３１Ａ間を連結する連結プレート３１Ｂとを有する容器本体３１と、容器本体３１に装着されるとともに上板３２ａと側壁３２ｂとを有する蓋本体３２とを備え、容器本体３１はプレート状の容器本体からなる。また容器本体３１および蓋体３２はいずれもポリスチレン等の合成樹脂からなる。

ここで図８（ａ）は細胞培養容器を示す断面図であり、図８（ｂ）は細胞培養容器を示す斜視図である。

図８（ａ）（ｂ）に示すように、容器本体３１の各液収納部３１Ａは内底面３１ａと内側面３１ｃとを有し、上方に上方開口３１ｂが形成されている。また容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂは蓋体３２により覆われている。

また、蓋体３２の下方部には、内方へ突出する環状突部（蓋体固定手段）３３が設けられ、この蓋体３２の環状突部３３は容器本体３１の下方溝（容器本体固定手段）３５ａに係合して容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定するようになっている。

図８（ａ）（ｂ）において、容器本体３１の各液収納部３１Ａ内に上方開口３１ａから細胞２を含む培養液１が注入される（図３（ａ）参照）。その後、容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂが蓋体３２により覆われる。

次に蓋体３２が容器本体３１側へ押込まれ、蓋体３２の環状突起３３が容器本体３１の下方溝３５ａに係合して、容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定することができる。

この場合、容器本体３１の上端３１ｄには環状の高摩擦部材３８が設けられ、蓋体３２の上板３２ａの裏面３２ｃには環状の高摩擦部材３９が設けられ、これら高摩擦部材３８、３９は互いに当接して密封パッキン部材として機能する。

また高摩擦部材３８、３９は互いに当接して容器本体３１に対する蓋体３２の摺動を防止する機能を果たす。

この場合、高摩擦部材３８、３９はシリコーンゴムからなっている。

培養液１が注入された細胞培養容器３０は、その後遠心分離機２０（図４（ａ）（ｂ））参照）に設置される。次に遠心分離機２０により細胞培養容器３０に対して遠心力が付与され、細胞培養が行なわれて、各液収納部３１Ａの内底面３１ａに生体組織３が堆積する（図３（ｂ）参照）。

この場合、各液収納部３１Ａの内底面３１ａは細胞非接着性であるか、または細胞非接着性に変化することが可能となっている。

このため各液収納部３１Ａの内底面３１ａに堆積した生体組織３をピペッティング操作により容易に剥離して回収することができる（図３（ｃ）参照）。

また細胞培養容器３０は、図９に示すように、複数の液収納部３１Ａと、液収納部３１Ａ間を連結する連結プレート３１Ｂとを有する容器本体３１と、容器本体３１に装着される蓋本体３２とを備え、容器本体３１はプレート状の容器本体からなっていてもよい。

ここで図９は細胞培養容器を示す断面図である。

図９に示すように、容器本体３１の各液収納部３１Ａは内底面３１ａと内側面３１ｃとを有し、上方に上方開口３１ｂが形成されている。また容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂは蓋体３２により覆われている。

また、蓋体３２の下端には、揺動軸３６ａを中心に揺動する揺動突起（蓋体固定手段）３６が設けられ、この蓋体３２の揺動突起３６は容器本体３１の下端（容器本体固定手段）３５ｂに係合して容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定するようになっている。

図８において、容器本体３１の各液収納部３１Ａ内に上方開口３１ｂから細胞２を含む培養液１が注入される（図３（ａ）参照）。その後、容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂが蓋体３２により覆われる。

次に蓋体３２が容器本体３１側へ押込まれ、その後蓋体３２の揺動突起３６が揺動軸３６ａを中心として揺動し、容器本体３１の下端３５ｂに係合する。このようにして容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定することができる。

この場合、容器本体３１の上端３１ｄには環状の高摩擦部材３８が設けられ、蓋体３２の上板３２ａの裏面３２ｃには環状の高摩擦部材３９が設けられ、これら高摩擦部材３８、３９は互いに当接して密封パッキン部材として機能する。

また高摩擦部材３８、３９は互いに当接して容器本体３１に対する蓋体３２の摺動を防止する機能を果たす。

この場合、高摩擦部材３８、３９はシリコーンゴムからなっている。

培養液１が注入された細胞培養容器３０は、その後遠心分離機２０（図４（ａ）（ｂ）参照）に設置される。次に遠心分離機２０により細胞培養容器３０に対して遠心力が付与され、細胞培養が行なわれて、各液収納部３１Ａの内底面３１ａに生体組織３が堆積する（図３（ｂ）参照）。

この場合、各液収納部３１Ａの内底面３１ａは細胞非接着性であるか、または細胞非接着性に変化することが可能となっている。

このため各液収納部３１Ａの内底面３１ａに堆積した生体組織３をピペッティング操作により容易に剥離して回収することができる（図３（ｃ）参照）。

第４の実施の形態
以下、図１０により本発明の第４の実施の形態について説明する。細胞培養容器４０は内底面４１ａと、内側面４１ｃと、上方開口４１ｂとを有する容器本体４１と、容器本体４１に装着されるとともに、上板４２ａと側壁４２ｂとを有する蓋体４２とを備え、容器本体４１はフラスコ状の容器本体からなる。

また容器本体４１の側壁外面には外ねじ４３が設けられ、蓋体４２の側壁内面には外ねじ４３に係合する内ねじ４４が設けられている。

このうち、容器本体４１および蓋体４２は、いずれもポリスチレン等の合成樹脂製となっている。

図１０において、容器本体４１内に上方開口４１ｂから細胞２を含む培養液１が注入される（図３（ａ）参照）。その後、容器本体４１の上方開口４１ｂが蓋体４２により覆われる。

次に蓋体４２が容器本体４１に対して回動し、容器本体４１の外ねじ４３に蓋体４２の内ねじ４４が係合して、容器本体４１に対して蓋体４２を堅固に固定することができる。

この場合、容器本体４１の上端４１ｄには環状の高摩擦部材４８が設けられ、蓋体４２の上板４２ａの裏面４２ｃには環状の高摩擦部材４９が設けられ、これら高摩擦部材４８、４９は互いに当接して密封パッキン部材として機能する。

また高摩擦部材４８、４９は互いに当接して容器本体４１に対する蓋体４２の摺動を防止する機能を果たす。

この場合、高摩擦部材４８、４９はシリコーンゴムからなっている。

培養液１が注入された細胞培養容器４０は、その後遠心分離機２０（図４（ａ）（ｂ））参照）に設置される。次に遠心分離機２０により細胞培養容器４０に対して遠心力が付与され、細胞培養が行なわれて、容器本体４１の内底面４１ａに生体組織３が堆積する（図３（ｂ）参照）。

この場合、容器本体４１の内底面４１ａは細胞非接着性であるか、または細胞非接着性に変化することが可能となっている。

このため容器本体４１の内底面４１ａに堆積した生体組織３をピペッティング操作により容易に剥離して回収することができる（図３（ｃ）参照）。

１０ 細胞培養容器
１１ 容器本体
１１ａ 内底面
１１ｂ 上方開口
１１ｃ 内側面
１２ 蓋体
１３ 外ねじ
１４ 内ねじ
１６ 突起
１７ ガイド溝
１７ａ 縦方向溝
１７ｂ 横方向溝
１７ｃ 幅細部
１８ 高摩擦部材
１９ 高摩擦部材
２０ 遠心分離機
３０ 細胞培養容器
３１ 容器本体
３１Ａ 液収納部
３１Ｂ 連結プレート
３１ａ 内底面
３１ｂ 上方開口
３１ｃ 内側面
３２ 蓋体
３３ 環状突部
３５ａ 蓋体の溝
３５ｂ 蓋体の下端
３６ 揺動突起
３８ 高摩擦部材
３９ 高摩擦部材
４０ 細胞培養容器
４１ 容器本体
４１ａ 内底面
４１ｂ 上方開口
４１ｃ 内側面
４２ 蓋体
４３ 外ねじ
４４ 内ねじ
４８ 高摩擦部材
４９ 高摩擦部材

Claims (10)

1. 細胞を含有する培養液を収納し、内底面方向へ遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行ない、細胞間を接着させて組織を形成して内底面に生体組織を堆積させる細胞培養容器において、
   細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有するとともに、上方開口を有する容器本体と、
   容器本体の上方開口を覆う蓋体とを備え、
   容器本体の上端および蓋体の裏面は互いに当接し、容器本体の上端および蓋体の裏面のいずれか一方に、容器本体の上端と蓋体の裏面との間の摩擦係数を高める高摩擦部材を設けたことを特徴とする細胞培養容器。
2. 容器本体および蓋体は合成樹脂製となっており、高摩擦部材はシリコーンゴムからなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
3. 高摩擦部材は環状に形成されて、密封パッキン部材として機能することを特徴とする請求項１または２のいずれか記載の細胞培養容器。
4. 容器本体に容器本体固定手段が設けられ、蓋体に容器本体固定手段に係合する蓋体固定手段が設けられていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか記載の細胞培養容器。
5. 容器本体固定手段および蓋体固定手段の一方は内ねじからなり、他方は外ねじからなることを特徴とする請求項４記載の細胞培養容器。
6. 蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込むガイド溝からなることを特徴とする請求項４記載の細胞培養容器。
7. ガイド溝には突起を係止する幅細部が設けられていることを特徴とする請求項６記載の細胞培養容器。
8. 蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込む溝からなることを特徴とする請求項４記載の細胞培養容器。
9. 蓋体固定手段は揺動突起からなり、容器本体固定手段は揺動突起に係合する容器本体の下端からなることを特徴とする請求項４記載の細胞培養容器。
10. 容器本体固定手段と蓋体固定手段は、互いに係合して容器本体内の培養液の放出を防止するとともに、容器本体内部と外部雰囲気とを連通可能とすることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか記載の細胞培養容器。

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