DE69735995T2

DE69735995T2 - Oligoepitop-peptid des prostata-spezifischen antigens

Info

Publication number: DE69735995T2
Application number: DE69735995T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Potomac SCHLOM; Kwong-yok Bethesda TSANG; Sam Rockville ZAREMBA
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Office of Technology Transfer
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Office of Technology Transfer
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: US6946133B1; US20110091498A1; US20090263425A1; AU2535997A; US8178508B2; WO1997035021A3; US7547773B2; ATE328091T1; EP0888456A2; US20070098691A1; ES2262176T3; DE69735995D1; US7871986B2; US20050196806A1; WO1997035021A2; EP0888456B1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Erzeugung zellulärer und humoraler Immunantworten auf ein Prostata-spezifisches Antigen (PSA) von Säugern. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung ein Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-Oligo-Epitop-Peptid verwendbar zur Erzeugung PSA-spezifischer T-Lymphozyten zur Verhinderung oder Behandlung von Prostatakrebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prostatakrebs ist der am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Männern und ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod (Carter et al., 1990; Armbruster et al., 1993). Wenn in einem frühen Stadium nachgewiesen, ist Prostatakrebs potentiell heilbar. Eine Mehrheit der Fälle wird jedoch zu späteren Stadien diagnostiziert, wenn eine Metastasierung des Primärtumors bereits erfolgt ist (Wang et al., 1982). Sogar die Frühdiagnose ist problematisch, weil nicht alle Individuen, die in diesen Tests positiv getestet werden, Krebs entwickeln. Aktuelle Heilmethoden für Prostatakrebs beinhalten vollständige Prostatektomie, Strahlentherapie oder Hormontherapie. Keine systemische Therapie hat in Fällen von Hormonunempfindlichkeitskrankheit die Überlebensrate deutlich verbessert. Mit chirurgischem Eingriff wird eine vollständige Beseitigung des Tumors nicht immer erreicht und das beobachtete Wiederauftreten des Krebses (12-68%) ist abhängig von dem anfänglichen klinischen Tumorstadium (Zietman et al., 1993). Folglich sind alternative Verfahren der Behandlung einschließlich Prophylaxe und Prävention wünschenswert.
Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ist ein 240 Aminosäuren umfassendes Mitglied der glandulären Kallikrein-Genfamilie (Wang et al., 1982; Wang et al., 1979; Bilhartz et al., 1991). PSA ist eine Serinprotease, die von normalem Prostatagewebe produziert und ausschließlich von den Epithelzellen, die prostatische Acini und Kanäle auskleiden, sekretiert wird (Wang et al., 1982; Wang et al., 1979; Lilja et al., 1993). Prostata-spezifisches Antigen kann auf niedrigem Niveau in den Seren von gesunden Männern ohne klinische Anzeichen von Prostatakrebs gefunden werden. Während neoplastischer Zustände jedoch steigen zirkulierende Mengen dieses Antigens dramatisch, korrelierend mit dem klinischen Stadium der Krankheit (Schellhammer et al., 1993; Huang et al., 1993; Kleer et al., 1993; Oesterling et al., 1991). Prostata-spezifisches Antigen ist heutzutage der am häufigsten verwendete Marker für Prostatakrebs. Die Gewebespezifität dieses Antigens macht aus PSA ein potentielles Zielantigen für aktive spezifische Immuntherapie (Armbruster et al., 1993; Brawer et al., 1989), insbesondere bei Patienten, die eine vollständige Prostatektomie durchlaufen haben, bei denen das einzige PSA-exprimierende Gewebe im Körper in metastatischen Ablagerungen sein sollte. Jüngere Studien, die in vitro-Immunisierung verwendeten, haben die Bildung von PSA-spezifischen CD4- und CD8-Zellen gezeigt (Peace et al., 1994; Correale et al., 1995). Obwohl schwache natürliche Killerzellantworten gelegentlich bei Prostatakrebspatienten dokumentiert wurden (Choe et al., 1987), hatten Versuche, eine in vivo-Immunantwort zu erzeugen, jedoch nur begrenzten Erfolg. Beispielsweise zeigten einige Versuche, Patienten mit Prostata-Adenokarzinomazellen vermengt mit Bacillus Calmette-Gurein (BCG) aktiv zu immunisieren, wenig oder keinen therapeutischen Nutzen (Donovan et al., 1990). Die Fähigkeit, eine Immunantwort als Ergebnis einer Exposition mit PSA in vivo auszulösen, wäre extrem nützlich.
Der Vakziniavirus wurde in der weltweiten Ausrottung von Pocken verwendet. Für diesen Virus wurde gezeigt, dass er eine breite Palette an inserierten Genen einschließlich einiger Tumor-assoziierter Gene wie p97, HER2/neu, p53 und ETA exprimiert (Paoletti et al., 1993). Andere Pockenviren, die als nützlich für die Expression multipler Gene vorgeschlagen wurden, umfassen Avipox wie z.B. Hühnerpocken. Cytokine, die von rekombinanten Vakziniaviren exprimiert werden, umfassen IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, TNF-α und IFN-γ (Paoletti et al., 1993). Rekombinante Pockenviren, z.B. Vakziniaviren, werden für die Verwendung in der Krebstherapie in Betracht gezogen, weil in Tiermodellen gezeigt wurde, dass die Co-Präsentation eines schwachen Immunogens mit den hoch-immunogenen Poxvirusproteinen eine starke Immunantwort gegen das inserierte Genprodukt hervorrufen kann (Kaufman et al., 1991, Paoletti et al., 1993; Kantor et al., 1992a; Kantor et al., 1992b; Irvine et al., 1993; Moss et al., 1993). Ein rekombinantes Vakziniavirus, das das menschliche Gen des karzinoembryonischen Antigens enthält, hat kürzlich die klinische Phase I in Krebspatienten, ohne Hinweise auf Toxizität, die anders war als die, die mit Wildtyppockenimpfstoff beobachtet wurde (Kantor et al., 1992b), abgeschlossen.
Derzeit beinhalten Modelle für die Evaluation von Prostatatherapeutika den Hund (McEntee et al., 1987) und die Dunning-Ratte (Isaacs et al., 1986); jedoch ist keins dieser Modelle praktikabel für die Studie von PSA-rekombinanten Vakzinen aufgrund der sehr geringen Homologie von Ratten- und Hund-PSA zu humanem PSA (Karr et al., 1995; Schroder et al., 1982). Im Gegensatz dazu ist die Prostatadrüse des Rhesusaffen strukturell und funktionell ähnlich zu der menschlichen Prostata (Wakui et al., 1992). Auf der molekularen Ebene besteht eine 94%ige Homologie zwischen entweder der Aminosäure- oder der Nukleinsäuresequenz von Rhesus-PSA (Gauther et al., 1993) und den Sequenzen von menschlichem Prostata-spezifischen Antigen (Karr et al., 1995; Lundwall et al., 1987). Demnach ist humanes PSA im Wesentlichen ein Autoantigen im Rhesusaffen. Der Rhesusaffe kann dementsprechend als Modell für autologe Anti-PSA-Immunreaktionen dienen.
Da PSA eine extensive Homologie mit Mitgliedern der Kallikrein-Genfamilie, die in normalem Gewebe exprimiert werden, teilt, ist es wichtig, Minimalepitoppeptide zu verwenden, um unerwünschte Kreuzreaktivität zu vermeiden. Diese Epitope wurden wegen ihrer Divergenz zu Mitgliedern der Kallikrein-Genfamilie ausgesucht.
Die in US-Seriennr. 08/500,306 offenbarten Studien haben gezeigt, dass zwei PSA-Epitop-Peptide (PSA-1 und PSA-3), 10-mere, ausgesucht, um humanen HLA-Klasse I-A2-Motiven zu entsprechen, CTL-Antworten sowohl in normalen Spendern als auch in Patienten mit Prostatakrebs hervorrufen können (Correale et al., 1995). Die Erfindung offenbart den Vorteil von PSA-Oligo-Epitop-Peptiden, die mehr als ein PSA-Epitop-Peptid umfassen, bei der Erzeugung PSA-spezifischer zellulärer Immunantworten.
Ross et al., 1993 beschreiben die adaptive Immuntherapie von Hormon-refraktorischem Stadium D2-Prostatakrebs unter Verwendung von ex vivo-aktivierten autologen T-Zellen.
Kurkela et al., 1995 beschreiben die Expression von aktivem, sekretiertem humanem Prostata-spezifischem Antigen durch rekombinante Baculovirus-infizierte Insektenzellen.
Bridon und Dowell, 1995 betrifft einen strukturellen Vergleich von Prostata-spezifischem Antigen und menschlichem glandulärem Kallikrein mittels molekularem Modelling.
EP 0 652 014 beschreibt die Behandlung von Prostatahypertrophie durch Antikörper, die spezifisch gegen humanes PSA reaktiv sind.
WO 95/04548 betrifft ein Prostatakrebsvakzin, das fähig ist, eine Immunantwort gegen Prostatatumore auszulösen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid, das Wiederholungseinheiten von mehr als einem isolierten Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Peptid-Analoga davon umfasst, wobei das Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid etwa 8 bis etwa 12 aufeinander folgende Aminosäuren von mehr als einer Aminosäuresequenz FLTPKKLQCV (SEQ ID NO:1), VISNDVCAQV (SEQ ID NO:2), QVHPQKVTK (SEQ ID NO:3), FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEQ ID NO:4) oder KLQCVDLHV (SEQ ID NO:9) umfasst, wobei die mehr als ein isolierten Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptide oder Peptidanaloga davon direkt miteinander über eine Aminosäurelinkersequenz verbunden sind; und wobei das isolierte Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP) eine Prostata-spezifische Antigenimmunantwort in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp erzeugt, wobei die Immunantwort mindestens die Erzeugung von PSA-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten umfasst.
In einer ersten Ausführungsform bindet jedes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid das gleiche oder verschiedene HLA-Klasse I-Molekültypen.
In einer anderen Ausführungsform, nach Spaltung von PSA-OP zur Herstellung von PSA-OP-Spaltfragmenten, binden die PSA-OP-Spaltfragmente an einen oder mehrere HLA-Klasse I-Molekültypen.
In einer weiteren Ausführungsform werden die PSA-OP-Spaltfragmente durch mindestens eine Protease hergestellt.
In einer weiteren Ausführungsform binden die PSA-OP-Spaltfragmente an einen oder mehrere HLA-Klasse I-Molekültypen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 und HLA-B53.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid ein erstes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA1): FLTPKKLQCV (SEQ ID NO:1) oder ein Analogon davon und ein zweites Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA3): VISNDVCAQV (SEQ ID NO:2) oder ein Analogon davon.
In einer weiteren Ausführungsform sind PSA1 und PSA3 direkt durch eine Linkeraminosäuresequenz verbunden, wobei die Linkersequenz etwa 1 bis etwa 10 Aminosäuren umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid weiterhin ein drittes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Analogon, das mit dem zweiten Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Analogon verbunden ist.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid:
oder ein Peptidanalogon davon.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid eine Substitution von Valin oder Tyrosin an einer oder mehreren Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 148, 149, 160 und 161, oder eine Substitution von Tyrosin an Position 154, oder das Analogon besteht aus einer Aminosäuredeletion an einer oder mehreren Positionen in SEQ ID NO:4, wobei die Positionen für eine Deletion ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 151, 152 und 153.
In noch einer anderen Ausführungsform besteht die Linker-Aminosäuresequenz aus Asp-Leu-His.
Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid, das mehr als ein Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Analogon davon umfasst, die direkt durch eine Peptidbindung oder eine Linkeraminosäuresequenz von 1 bis 10 Aminosäuren miteinander verbunden sind, wobei das PSA-OP eine Prostata-spezifische Antwort erzeugt und ein erstes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA1); FLTPKKLQCV (SEQ ID NO:1) oder ein erstes Analogon davon, wobei das erste Analogon eine Substitution von Valin anstelle von Glutamin, Cystein oder Glutamin und Cystein aufweist, und ein zweites Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA3); VISNDVCAQV (SEQ ID NO:2) oder ein zweites Analogon davon, wobei das zweite Analogon eine Substitution von Valin anstelle von Cystein oder eine Substitution von Tyrosin anstelle von dem ersten Valin aufweist, und gegebenenfalls ein drittes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop mit der Aminosäuresequenz QVHPQKVTK (SEQ ID NO:3) umfasst.
Der dritte Aspekt der Erfindung betrifft ein Prostata-Oligo-Epitop-Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, basierend auf:
wobei Valin für einen Aminosäurerest an einer oder mehreren Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Position 148, Position 149, Position 160 und Position 161 substituiert ist, oder wobei mindestens eine der Aminosäuren an Position 151, 152 oder 153 deletiert ist und wobei das PSA-OP eine Prostata-spezifische Antigenimmunantwort in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp erzeugt.
Der vierte Aspekt der Erfindung betrifft ein Prostata-Oligo-Epitop-Peptid bestehend aus der Aminosäuresequenz:
Eine weitere Ausführungsform betrifft eine Zusammensetzung, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid und mindestens ein HLA-Klasse I-Molekül oder eine Zelle, die mindestens ein HLA-Klasse I-Molekül exprimiert, umfasst.
Eine andere Ausführungsform betrifft eine Zusammensetzung, wobei das HLA-Klasse I-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 und HLA-B53.
Eine weitere Ausführungsform betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Träger oder Exzipienzträger umfasst.
Die Zusammensetzung kann weiterhin ein Adjuvanz, Liposomen, Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-12, Interferon, Tumornekrosefaktor, GM-CSF, Cyclophosphamin oder eine Kombination davon umfassen; oder kann weiterhin ein Helferpeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Influenzapeptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A und Poly-L-Lysin umfassen.
Eine andere Ausführungsform betrifft eine isolierte Prostata-spezifisches Antigen-DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfasst, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kodiert.
Eine andere Ausführungsform betrifft eine isolierte Prostata-spezifisches Antigen-DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfasst, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kodiert.
Eine andere Ausführungsform betrifft ein Plasmid oder einen Virusvektor, das/der die Prostata-spezifisches Antigen-DNA-Sequenz umfasst, oder einen Virusvektor, der die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:14 umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Vektor ein E. coli-Plasmid, ein Listeria-Vektor, ein Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Suipoxvirus, Vakziniavirus, Baculovirus, humanes Adenovirus, SV40 oder Rinderpapillom.
In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Wirtszelle das Plasmid oder den Virusvektor, wobei die Wirtszelle das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid exprimiert.
In einer weiteren Ausführungsform bindet die Wirtszelle Spaltfragmente des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids, welche weiterhin durch eine Protease produziert werden können.
In einer anderen Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle zusätzlich einen HLA-Klasse I-Molekültyp, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68, und HLA-B53, oder die Wirtszelle exprimiert HLA-A2 oder HLA-A3 oder HLA-A2 und HLA-A3.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle oder eine dendritische Zelle.
Eine andere Ausführungsform betrifft ein rekombinantes Virus, das ein Virus umfasst, in welches eine isolierte Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-DNA-Sequenz, die für ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kodiert, inseriert ist, wobei das rekombinante Virus die Expression des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids oder von Fragmenten davon in einer Wirtszelle bewirkt.
Eine weitere Ausführungsform betrifft das rekombinante Virus, das ein Virus umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Cap ripoxvirus, Suipoxvirus, Vakziniavirus, Baculovirus, DNA-Plasmid, humanes Adenovirus, SV40 und Rinderpapillom, wobei das rekombinante Virus die Expression des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids oder von Fragmenten davon auf der Oberfläche von Wirtszellen bewirkt, die damit infiziert sind, und die infizierten Wirtszellen eine Immunantwort gegen PSA, Zellen, die PSA exprimieren, Zellen, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid exprimieren, oder Zellen, die Spaltfragmente des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids binden, erzeugen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das rekombinante Virus weiterhin eine DNA-Sequenz, die ein immunverstärkendes Molekül kodiert, wobei das Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Influenzapeptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A und Poly-L-Lysin.
Eine andere Ausführungsform betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das rekombinante Virus und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Träger, oder Exzipienzträger und gegebenenfalls Modifizierungsmittel für eine biologische Antwort umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-12 (IL-12), Interferon, Tumornekrosefaktor (TNF), Granulozyten-Monozytenkolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF), Cyclophosphamid oder Kombinationen davon.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung des rekombinanten Virus zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulation des Immunsystems eines Säugers gegen Prostata-spezifisches Antigen zum Zwecke der Vermeidung von Etablierung und Wachstum von PSA-positiven Karzinomzellen.
In einer anderen Ausführungsform ist das rekombinante Virus ein Vakziniavirus des NYC-Stamms oder v-WR-Stamms, das mit einem attenuierten humanen Vakziniavirusstamm rekombiniert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform ist das rekombinante Virus mit einem Adjuvanz oder einem Modifizierungsmittel für eine biologische Antwort kombiniert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-12, Interferon, Tumornekrosefaktor (TNF), (GM-CSF) und Cyclophosphamid.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung oder Abtötung PSA-positiver Tumorzellen, wobei das Verfahren umfasst:

A) Erzeugen PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten in vitro durch Stimulation von Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen, wobei die Menge zur Erzeugung PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten wirksam ist; und
B) adoptiver Transfer der PSA-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten allein oder in Kombination mit dem Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid in einen Säuger in einer Menge, die ausreicht, die PSA-positiven Tumorzellen zu inhibieren oder abzutöten.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung oder Abtötung PSA-positiver Tumorzellen in einem Säuger, wobei das Verfahren umfasst:

A) Erzeugen PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten in vitro durch Verabreichen einer wirksamen Menge des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids allein oder in Kombination mit einem Adjuvanz oder Liposomen, und
B) die so erzeugten PSA-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten hemmen oder töten PSA-positive Tumorzellen in dem Säuger.

In einer anderen Ausführungsform ist das Adjuvanz, das in dem Verfahren verwendet wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RIBI Detox, QS21, Alaun und unvollständigem Freundschem Adjuvanz.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop in einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort gegenüber Prostata-spezifischem Antigen in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp verwendet, wobei das Verfahren umfasst:
Verabreichen einer wirksamen Menge des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids allein oder in Kombination mit einem Adjuvanz oder Peptid-gepulsten Antigen-präsentierenden Zellen, wobei die Menge ausreichend ist, um eine PSA- spezifische Immunantwort in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp zu erzeugen.
In einer anderen Ausführungsform wird das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation des Immunsystems eines Säugers gegenüber Prostata-spezifischem Antigen zum Zwecke der Vermeidung von Etablierung und Wachstum PSA-positiver Karzinomzellen verwendet.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Western-Blot von PSA aus rV-PSA-infizierten BSC-40-Zellen. Spuren 2-4 sind Extrakte von Überstandsflüssigkeit von Zellen, die mit rV-PSA bei einer MOI von 1 über Nacht infiziert wurden, während Spuren 7-9 Extrakte der entsprechenden infizierten Zellen sind. Spuren 1 und 6 sind Überstandsextrakte und Zellextrakte von V-Wyeth-infizierten Zellen. Der Blot wurde unter Verwendung eines spezifischen MAb für humanes PSA entwickelt. Dieser Blot veranschaulicht, dass mit rV-PSA infizierte Zellen das 33 kD-PSA-Protein authentisch exprimieren und sekretieren.
2A, 2B und 2C zeigen die Manifestation der rV-PSA-Immunisierung. In 2A wurde die Fläche der Läsionen 7 Tage nach jeder Impfung von Rhesusaffen mit entweder V-Wyeth (offene Kreise) oder rV-PSA (geschlossene Kreise) gemessen. In 2B wurde die Dauer der Läsion als Zeit bis zum Verschwinden des Schorfs überwacht. In 2C wurde das Ausmaß der Lymphknotenschwellung aufgenommen und charakterisiert als sehr geschwollen (3+), d.h. mehr als zwei Achselknoten geschwollen, geschwollen (2+), d.h. einer oder zwei Knoten leicht tastbar, marginal geschwollen (1+), d.h. ein Knoten war kaum tastbar, oder nicht geschwollen (0), 7 Tage nach Impfung mit Vakziniavirus. Jedes Symbol entspricht einem Affen.
3 zeigt die Aminosäuresequenz eines Prostata-spezifischen Antigen-Oligo-Epitop-Peptids.
4 zeigt die Nukleinsäuresequenz, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kodiert.
5 zeigt die Nukleinsäuresequenz eines Inserts (zwischen der Kpn I-Stelle und der Xho I-Stelle), das in ein rekombinantes Vakzinia kloniert ist, das die Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid (PSA AA490-594), ein endoplasmatisches Retikulum-Transportsignal (E3/19K-Signal), und ein universales T-Helfer-Epitop-Peptid, Tetanustoxoid CD4-Epitop (TT CD4-Epitop) kodiert. Das 5'→3'-Insert hat die SEQ ID NO:14. Das komplementäre 3'→5'-Insert hat die SEQ ID NO:15.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-Oligo-Epitop-Peptid. Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid ist charakterisiert durch seine Fähigkeit eine zelluläre Immunantwort spezifisch gegen PSA oder einen Teil davon und gegen Zellen, die PSA oder einen Teil davon exprimieren oder binden, in einem Säugetierwirt auszulösen.
Im Allgemeinen werden Tumor-assoziierte Antigenproteine, wie das PSA-Protein, durch intrazelluläre Proteasen zu kleinen Epitop-Peptiden prozessiert, die dann fest gebunden in einer Spalte auf dem HLA-Klasse I-Molekül zur Zelloberfläche transportiert werden. T-Zellen erkennen diese kleinen Epitop-Peptide nur, wenn sie innerhalb dieser Spalte auf der Zielzelle gebunden sind. Die Klasse I-Moleküle des großen Histokompatibilitätskomplexes (MHC) werden auf den Oberflächen von Zellen einschließlich Tumorzellen gefunden und sind die Eigenmoleküle, die zusammen mit Antigen durch cytotoxische T-Zellen erkannt werden.
Wie hierin offenbart, binden kurze PSA-Epitop-Peptide, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von etwa 9-10 Aminosäuren, direkt innerhalb der Spalte eines HLA-Klasse I-Moleküls ohne intrazelluläres Prozessieren. Zwei solche PSA-Epitop-Peptide, PSA-1 und PSA-3, werden von einem spezifischen HLA-Klasse I-Molekültyp, d.h. HLA-Klasse I-A2, gebunden. Jedes dieser individuellen PSA-Epitop-Peptide löst PSA-spezifische cytotoxische T-Zellen aus, die PSA⁺ HLA-Klasse I-A2-Zielzellen lysieren.
Aufgrund von Polymorphismen innerhalb der Peptidbindespalte von Klasse I-Molekülen gibt es jedoch zwischen Individuen Variationen in der Fähigkeit ihrer Klasse I-Molekültypen, Antigene zu binden. Während demnach 9-mer- und 10-mer-PSA- Epitop-Peptide zur Erzeugung cytotoxischer T-Lymphozyten in Individuen mit einem HLA-Klasse I-A2-Typs wirksam sind, können dieselben 9-mer- und 10-mer-PSA-Epitop-Peptide nicht wirksam sein oder können weniger wirksam sein, cytotoxische T-Lymphozyten in Individuen mit verschiedenen Interaktionen von HLA-Peptidkomplexen mit verschiedenen T-Zellrezeptormolekülen, die zwischen Individuen unterschiedlich sein können, zu erzeugen.
Das erfindungsgemäße Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid und Analoga davon, das mehr als ein miteinander verbundenes 8- bis 12-mer-PSA-Epitop-Peptid umfasst, hat den Vorteil, zelluläre Immunantworten in Individuen mit verschiedenen HLA-Klasse I-Molekültypen oder Allelen hervorzurufen. Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid wird von extrazellulären Proteasen oder anderen Mechanismen prozessiert, die den resultierenden PSA-Epitop-Peptid-Spaltfragmenten eine Bindung an die Spalte von dem gleichen oder mehreren verschiedenen HLA-Klasse I-Molekültypen erlauben.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid ist demnach im Gegensatz zu kürzeren individuellen PSA-Epitop-Peptiden von etwa 8- bis 12-mer Länge für einen breiten Ausschnitt der menschlichen Population mit unterschiedlichen HLA-Klasse I-Molekültypen und unterschiedlichen T-Zellrezeptorinteraktionen mit HLA-Klasse I-Peptidkomplexen immunogen.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid umfasst Peptidsequenzen, die dem Konsensusmotiv für mindestens einen HLA-Klasse I-Molekültyp entsprechen, und beinhaltet vorzugsweise Peptidsequenzen, die dem Konsensusmotiv von mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültypen entsprechen.
In einer Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid mehr als eine 8- bis 12-mer-PSA-Epitop-Peptidsequenz, die dem Konsensusmotiv für eine oder mehrere der HLA-Klasse I-Molekültypen entspricht, einschließlich aber nicht begrenzt auf HLA-A1, HLA-A2, A3, A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, Aw68 und B53.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid PSA-Peptidsequenzen, die dem Konsensusmotiv für HLA-A2 und HLA-A3 entsprechen. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid PSA-Peptidsequenzen, die dem Konsen susmotiv für HLA-A2, A.3, A11 und B53 entsprechen. HLA-Klasse I-Molekültyp HLA-A3 ist in 26 und 17% von nordamerikanischen Kaukasiern bzw. Schwarzen vorhanden. HLA-Klasse I-Molekültyp HLA-A11 ist in 40% der asiatischen Bevölkerung vorhanden und HLA-53 ist in 22% der Schwarzen vorhanden. Folglich ist das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid nützlich zur Erzeugung einer zellulären Immunantwort gegen PSA in einem breiten Ausschnitt der menschlichen Bevölkerung mit unterschiedlichen HLA-Klasse I-Molekültypen.
Individuelle 9-mer- und 10-mer-Aminosäure-PSA-Epitop-Peptide sind fähig, cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) in vitro zu erzeugen, und fähig, Zielzellen für eine Lyse durch PSA-spezifische CTLs zu pulsen. Modellierungsstudien haben gezeigt, dass die individuellen 9-mer- oder 10-mer-PSA-Epitop-Peptide in die Furche eines einzelnen Klasse I-HLA-Moleküls, A2, hineinpassen. Die vorliegende Erfindung, verschiedene Kombinationen von 8- bis 12-mer-PSA-Epitop-Peptiden zu verknüpfen, ermöglicht die Verwendung von einem Immunogen anstelle von zwei oder mehr separaten Immunogenen, da das Oligo-Epitop-Peptid effizient von Proteasen an der Antigen-präsentierenden Zelloberfläche oder Zielzelloberfläche prozessiert wird, oder durch andere Mechanismen prozessiert wird, um geeignete kleinere PSA-Epitop-Peptid-Spaltfragmente zu bilden, die mit dem gleichen Klasse I-Molekültyp oder mit einer Vielzahl von Klasse I-Molekültypen interagieren oder daran binden, was zu der Erzeugung einer PSA-spezifischen zellulären Antwort in der Mehrheit der menschlichen Bevölkerung führt.
Das PSA-Oligo-Epitop-Peptid oder Analoga davon erzeugen cytotoxische T-Lymphozyten, die Zielzellen, welche PSA exprimieren oder gebunden haben, und Zielzellen, welche ein, vorzugsweise mehr als ein, 8- bis 12-mer-PSA-Epitop-Peptid exprimieren oder gebunden haben, inhibieren oder lysieren. Zusätzlich können Zielzellen, die von den cytotoxischen T-Lymphozyten inhibiert oder lysiert werden, einen HLA-Klasse I-Molekültyp oder eine Vielzahl von HLA-Klasse I-Molekültypen besitzen.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid, Analogon oder funktionelle Äquivalent davon umfasst mehr als ein 8- bis 12-mer-PSA-Epitop-Peptid, das mindestens einem menschlichen HLA-Klasse I-Molekültyp, vorzugsweise mehr als einem menschlichen HLA-Klasse I-Molekültyp entspricht. Ein erstes PSA-Epitop-Peptid, das einem menschlichen HLA-Klasse I-Molekültyp entspricht, ist mit einem zweiten PSA-Epitop-Peptid verbunden, das einem menschlichen HLA-Klasse I-Molekültyp entspricht. Das erste und zweite Epitop-Peptid können direkt miteinander verbunden sein oder gegebenenfalls mittels einer kurzen Aminosäurelinkersequenz miteinander verbunden sein. Die Peptide sind durch Peptidbindungen miteinander verbunden.
Die individuellen PSA-Epitop-Peptide, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid umfassen, können jeweils in der Anzahl der Aminosäuren variieren, umfassen aber typischerweise ungefähr 8 bis ungefähr 12 Aminosäuren, vorzugsweise ungefähr 9 bis ungefähr 10 Aminosäuren. In einer Ausführungsform umfassen das erste und zweite PSA-Epitop-Peptid jeweils ungefähr 10 Aminosäuren.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kann wiederholende Einheiten des individuellen PSA-Epitop-Peptids oder Kombinationen sich wiederholender Einheiten umfassen. Die Gesamtanzahl von sich wiederholenden Einheiten der individuellen PSA-Epitop-Peptide oder Kombinationen von PSA-Epitop-Peptiden in dem Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kann zwischen ungefähr 6 bis ungefähr 8 sein.
Falls verwendet, umfasst die Aminosäurelinkersequenz zur Verknüpfung der 8- bis 12-mer-PSA-Epitop-Peptide ungefähr 1 bis ungefähr 10 Aminosäuren, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 5 Aminosäuren. In einer Ausführungsform umfasst der Linker ungefähr drei Aminosäuren. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Linkersequenz Asp-His-Leu. Die Aminosäurelinkersequenz ist durch proteolytische Aktivität spaltbar.
In einer Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid ein oder mehrere PSA1-Peptide mit SEQ ID NO:1 oder Analoga davon und ein oder mehrere PSA2-Peptide mit SEQ ID NO:2 oder Analoga davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid ein PSA1-Peptid und ein PSA2-Peptid, die miteinander verbunden sind.
Zusätzlich umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid ein oder mehrere zusätzliche PSA-Epitop-Peptide, die mit dem zweiten PSA-Epitop-Peptid verbunden sind. In einer Ausführungsform umfasst ein drittes PSA-Peptid eine Aminosäuresequenz, die mit der Sequenz am Carboxyterminus des zweiten PSA-Epitop-Peptids überlappt. Die Sequenzüberlappung kann ein bis drei Aminosäuren betragen. In einer Ausführungsform ist die Überlappung zwei Aminosäuren. In einer besonderen Ausführungsform umfasst ein drittes PSA-Epitop-Peptid QVHPQKVTK (SEQ ID NO:3), in welchem die Sequenzüberlappung QV ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Oligo-Epitop-Peptid die Aminosäuresequenz: FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEQ ID NO:4) und Analoga und Varianten davon. In einer Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid Analoga mit Substitutionen einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Valin an einer oder mehreren Positionen an Aminosäurerestpositionen 148, 149, 160 und/oder 161. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Prostata-spezifische Antigen Analoga mit Deletionen einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Deletionen einer oder mehrerer Aminosäuren an Positionen 151, 152 und 153.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kann durch rekombinante DNA-Techniken, durch chemische Peptidsynthese oder durch entsprechende Proteasespaltung des isolierten, natürlichen PSA erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid oder Analoga davon können zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Verwendung als ein Immunogen in einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen oder Primaten, formuliert werden. Die Zusammensetzung kann ferner eine oder mehrere andere Bestandteile zur Steigerung der Immunantwort enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Modifizierungsmittel biologischer Antworten wie Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-12, Interferon, Tumornekrosefaktor, GM-CSF und Cyclophosphamid. Die Zusammensetzung kann ebenfalls mindestens ein HLA-Klasse I-Molekül oder eine Zelle, die mindestens ein HLA-Klasse I-Molekül exprimiert, in Kombination mit einem oder mehreren Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptiden oder Analoga davon enthalten.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid wird für die Herstellung eines Medikaments verwendet, das einem Säuger in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, eine PSA-spezifische zelluläre Immunantwort zu erzeugen. Die Wirksamkeit des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids als Immunogen kann durch in vivo- oder in vitro-Parameter, wie in der Fachwelt bekannt, bestimmt werden. Diese Parameter beinhalten in nicht begrenzender Weise Antigen-spezifi sche Cytotoxizitätsassays, Regression von PSA⁺-Tumoren, Hemmung von PSA⁺-Krebszellen, Produktion von Cytokinen und ähnliches.
Das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kann in einer Dosis von etwa 0,5 mg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht des Säugers verabreicht werden. Mehrere Dosen können über einen Zeitraum von Wochen wie angezeigt bereitgestellt werden. Das Medikament, das von dem PSA-OP oder Analoga davon hergestellt wurde, kann allein oder in Kombination mit Adjuvanzien, Liposomen, Cytokinen, Modifizierungsmitteln biologischer Antworten oder anderen Reagenzien, die bekannt sind, die Immunantworten zu verstärken, verabreicht werden.
Das PSA-OP kann ebenfalls an andere Helferpeptide oder an größere Trägermoleküle konjugiert sein, um die Immunogenität des Peptids zu erhöhen. Diese Moleküle beinhalten in nicht begrenzender Weise Influenzapeptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid-CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A, Poly-L-Lysin und dergleichen.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Erzeugung PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten in vivo oder in vitro durch die Stimulation von Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge eines Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen zusammen mit einem HLA-Klasse I-Molekül zur Erzeugung PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten bereit. Die Quellen von Lymphozyten schließen in nicht begrenzender Weise periphere Blutlymphozyten, Tumor-infiltrierende Lymphozyten, Lymphknoten und dergleichen ein.
Die Erfindung umfasst eine DNA-Sequenz und ein Analogon und eine Variante davon, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid oder Analogon davon kodiert. In einer Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz:
und Analoga und Varianten davon.
In den Umfang der Erfindung eingeschlossen sind Substitutionen und Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz, unter der Bedingung, dass die Modifikationen in einem funktionell äquivalenten PSA-OP-Peptid oder einem Peptid mit erhöhter Immunogenität resultieren. In einer Ausführungsform ist eine DNA-Sequenz substituiert mit den entsprechenden Nukleinsäuren, die Analoga des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids kodieren, basierend auf der Degeneration der Codons, wie der Fachwelt bekannt. Andere Substitutionen in der DNA-Sequenz beinhalten in nicht begrenzender Weise Valin an einer oder mehreren Positionen an Aminosäurerest-Position 148, 149, 160 und/oder 161.
Die Erfindung umfasst ferner Vektoren und Plasmide, die eine DNA-Sequenz, ein Analogon, oder eine Variante davon, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kodiert, umfassen. Die Vektoren können ferner eine oder mehrere DNA-Sequenzen umfassen, die für Helferpeptide oder (ein) großes) Trägermoleküle) kodieren, um die Immunogenität des PSA-OP zu erhöhen. Diese zusätzlichen DNA-Sequenzen kodieren Moleküle, die in nicht limitierender Weise Influenzapeptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid-CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A, Poly-L-Lysin und dergleichen beinhalten. In einer Ausführungsform umfasst der Vektor des Weiteren ein Tetanustoxoid-CD4-Epitop.
Von besonderem Interesse sind rekombinante virale Vektoren, die eine DNA-Sequenz, ein Analogon oder eine Variante davon umfassen, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid oder Analoga davon kodiert. In einer Ausführungsform umfasst der rekombinante virale Vektor ferner ein Tetanustoxoid-CD4-Epitop. In einer besonderen Ausführungsform ist der rekombinante virale Vektor ein rekombinantes Vakzinia, das eine DNA-Sequenz, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid kodiert, eine DNA-Sequenz, die ein endoplasmatisches Retikulum-Transportsignal kodiert, und eine DNA-Sequenz, die ein Tetanustoxoid-CD4-Epitop kodiert, umfasst, wie in 5 abgebildet.
Wirtszellen, welche die DNA exprimieren können, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid oder Analoga davon kodiert, getragen von Vektoren oder Plasmiden, sind prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen und beinhalten in nicht begrenzender Weise E. coli, Listeria, Bacillus species, COS-Zellen, CV-1, Verozellen, BSC-40-Zellen, HuTk143-Zellen, Hühnerembryofibroblasten, prostatische Zellen, Tumorzellen, Antigen-präsentierende Zellen und dergleichen. Wenn die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, wie eine dendritische Zelle, ein Monozyt, eine Makrophage und dergleichen oder eine Zielzelle ist, sollte die Wirtszelle zusätzlich mindestens ein MHC-Klasse I-Molekül exprimieren. Das MHC-Klasse I-Molekül kann von einem endogenen Gen oder einem der Wirtszelle zugefügten exogenen Gen exprimiert werden.
Wir haben eine PSA-spezifische Immunantwort in dem Rhesusaffenmodell durch die Platzierung des PSA-Gens in einen rekombinanten viralen Vektor, d.h. einen Pockenvektor wie das Vakziniavirus, induziert.
Zusätzlich kann eine Immunantwort gegen PSA dadurch erzeugt werden, dass der Wirt anfangs mit einer ausreichenden Menge von PSA oder einem cytotoxischen T-Zell-hervorrufenden Epitop davon in Kontakt gebracht wird, um eine Immunantwort zu stimulieren, und in periodischen Intervallen danach der Wirt mit zusätzlichem PSA in Kontakt gebracht wird. Das zusätzliche PSA oder ein cytotoxisches T-Zellen-erzeugendes Fragment davon kann unter Verwendung eines Pockenvirusvektors hinzugegeben werden.
Ein DNA-Fragment, das für den offenen Leserahmen des humanen PSA kodiert, kann beispielsweise von Gesamt-RNA aus der menschlichen metastatischen Prostata-Adenokarzinomzelllinie LNCAP.FGC (CRL 1740, American Type Cell Culture (ATCC), Rockville, MD) durch reverse Transkriptase-PCR unter Verwendung der PSA-spezifischen Oligonukleotidprimer 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTACCACCTGCA 3' (SEQ ID NO:16), 5' TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3' (SEQ ID NO:17) erhalten werden. Die Nukleotidsequenz der PSA-cDNA wurde publiziert (Lundwall et al., 1987).
Rekombinantes, humanes PSA kann unter Verwendung eines Baculovirusexpressionssystems gemäß des Verfahrens von Bei et al., J. Clin. Lab. Anal., 9:261-268 (1995), erhalten werden.
Viraler Vektor
Standardtechniken zur Herstellung rekombinanter DNA-Viren, die eine heterologe DNA-Sequenz enthalten, die für das Karzinom-selbst-assoziierte Antigen oder cytotoxische T-Zellen-hervorrufende Epitop kodiert, sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. homologe Rekombination zwischen den viralen DNA-Sequenzen, die die DNA-Sequenz in einem Donorplasmid flankieren, und homologen Sequenzen, die im parentalen Virus vorhanden sind (Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982)). Zum Beispiel können rekombinante virale Vektoren wie ein Pockenvirusvektor zur Verabreichung des Gens verwendet werden. Der Vektor kann beispielsweise durch in der Fachwelt bekannte Schritte konstruiert werden, z.B. analog zu den Verfahren zur Herstellung synthetischer Rekombinanten des Hühnerpockenvirus, wie in der US-PS 5,093,258 beschrieben. Andere Techniken beinhalten die Verwendung einer nur einmal vorhandenen Restriktionsendonukleaseschnittstelle, die natürlich vorkommt oder künstlich in den parentalen viralen Vektor eingefügt wurde, um die heterologe DNA zu inserieren.
Pockenviren, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, beinhalten Orthopox-, Suipox-, Avipox- und Capripoxvirus.
Orthopox beinhaltet Vakzinia-, Ektromelia- und Waschbärpocken. Der bevorzugte Orthopox ist Vakzinia.
Avipox beinhaltet Hühnerpocken, Kanarienpocken und Taubenpocken. Der bevorzugte Avipox ist Hühnerpocken.
Capripox beinhaltet Ziegenpocken und Schafspocken.
Ein bevorzugter Suipox ist Schweinepocken.
Andere virale Vektoren, die verwendet werden können, beinhalten andere DNA-Viren wie Herpesvirus und Adenoviren und RNA-Viren wie Retroviren und Polio.
Beispielsweise kann die in das Virus zu inserierende DNA-Gensequenz in ein Donorplasmid, z.B. ein E. coli-Plasmidkonstrukt, eingefügt werden, in welches DNA eingefügt wurde, die homolog zu einem Abschnitt einer DNA wie die der Insertionsstelle des Pockenvirus, in die die DNA eingefügt werden soll, ist. Getrennt davon wird die zu inserierende DNA-Gensequenz mit einem Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verbindung ist dergestalt im Plasmidkonstrukt positioniert, dass die Promotor-Gen-Verbindung an beiden Enden durch DNA flankiert ist, die homolog zu einer DNA-Sequenz ist, die eine Region der Pocken-DNA flankiert, welche die gewünschte Insertionsregion ist. Bei einem parentalen viralen Pockenvektor wird ein Pockenpromotor verwendet. Das resultierende Plasmidkonstrukt wird dann durch Wachstum innerhalb E. coli-Bakterien amplifiziert und isoliert. Vorzugsweise enthält das Plasmid ebenfalls einen Replikationsursprung wie den E. coli-Replikationsursprung und einen Marker wie ein Antibiotikaresistenzgen zur Selektion und Propagierung in E. coli.
Zweitens wird das isolierte Plasmid, das die zu inserierende DNA-Gensequenz enthält, in eine Zellkultur, z.B. Hühnerembryofibroblasten, zusammen mit dem parentalen Virus, z.B. Pockenvirus, transfiziert. Rekombination zwischen homologer Pocken-DNA in dem Plasmid und dem entsprechenden viralen Genom resultiert in einem rekombinanten Pockenvirus, das durch die Anwesenheit des Promotorgenkonstrukts in seinem Genom an einer Stelle, die die Viruslebensfähigkeit nicht beeinträchtigt, modifiziert ist.
Wie oben erwähnt, ist das Gen in dem Virus in eine Region inseriert (Insertionsregion), die die Viruslebensfähigkeit des resultierenden rekombinanten Virus nicht beeinflusst. Der Fachmann kann solche Regionen in einem Virus leicht identifizieren, beispielsweise durch zufälliges Testen von Virus-DNA-Segmenten auf Regionen, die Rekombinantenbildung erlauben, ohne die Viruslebensfähigkeit der Rekombinanten ernsthaft zu beeinträchtigen. Eine Region, die leicht verwendet werden kann und in vielen Viren vorhanden ist, ist das Tymidinkinase-(TK)-Gen. Beispielsweise wurde das TK-Gen in allen untersuchten Poxvirusgenomen gefunden [Leporipoxvirus: Upton et al., J. Virology, 60:920 (1986) (Shope-Fibroma-Virus); Capripoxvirus: Gershon et al., J. Gen. Virol., 70:525 (1989) (Kenya-Schaf-1); Orthopoxvirus: Weir et al., J. Virol., 46:530 (1983) (Vakzinia); Esposito et al., Virology, 135:561 (1984) (Affenpocken und Variolavirus); Hruby et al., PNAS, 80:3411 (1983) (Vakzinia); Kilpatrick et al., Virology, 143:399 (1985) (Yaba-Affentumorvirus); Avipoxvirus: Binns et al., J. Gen. Virol. 69:1275 (1988) (Hühnerpocken); Boyle et al., Virology, 156:355 (1987) (Hühnerpocken); Schnitzlein et al., J. Virological Methods, 20:341 (1988) (Hühnerpocken, Wachtelpocken); Entomopox: Lytvyn et al., J. Gen. Virol., 73:3235-3240 (1992)].
Zusätzlich zu der TK-Region beinhalten andere Insertionsregionen in Vakzinia z.B. das HindIII-M-Fragment.
Zusätzlich zu der TK-Region beinhalten andere Insertionsregionen in Hühnerpocken z.B. das BamHI-J-Fragment [Jenkins et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 7:991-998 (1991)], das EcoRI-HindIII-Fragment, EcoRV-HindIII-Fragment, BamHI-Fragment und das HindIII-Fragment, die in der EPA-Anmeldung Nr. 0 308 220 A1 beschrieben sind. [Calvert et al., J. of Virol., 67:3069-3076 (1993); Taylor et al., Vaccine 6:497-503 (1988); Spehner et al. (1990) und Boursnell et al., J. of Gen. Virol. 71:621-628 (1990)].
In Schweinepocken beinhalten die bevorzugten Insertionsstellen die Thymidinkinase-Genregion.
Zusätzlich zu der Anforderung, dass das Gen in eine Insertionsregion zu inserieren ist, erfordert eine erfolgreiche Expression des inserierten Gens durch das modifizierte Pockenvirus die Anwesenheit eines Promotors, der operativ mit dem gewünschten Gen, d.h. in der passenden Anordnungsbeziehung mit dem inserierten Gen, verbunden ist. Der Promotor muss dergestalt platziert werden, dass er stromaufwärts vom zu exprimierenden Gen lokalisiert ist. Promotoren sind in der Fachwelt gut bekannt und können leicht in Abhängigkeit des Wirts und des Zelltyps, den man anvisiert, ausgesucht werden. Beispielsweise sollten in Pockenviren poxvirale Promotoren wie der Vakzinia 7.5k, 40K oder Hühnerpockenpromotoren wie FPV C1A verwendet werden. Verstärkerelemente können ebenfalls in Kombination benutzt werden, um den Expressionslevel zu erhöhen. Weiterhin ist die Verwendung von induzierbaren Promotoren, die ebenfalls der Fachwelt wohlbekannt sind, in einigen Ausführungsformen bevorzugt.
Eine spezifische Immunantwort gegen PSA kann durch Verabreichung von etwa 10⁵-10⁹ pfu des rekombinanten Pockenvirus, konstruiert wie oben diskutiert, an einen Wirt erzeugt werden, mehr bevorzugt verwendet man 10⁷ pfu. Der bevorzugte Wirt ist ein Mensch. Mindestens ein Intervall danach, das vorzugsweise ein bis drei Monate später ist, wird die Immunantwort durch Verabreichung zusätzlichen Antigens an den Wirt verstärkt. Mehr bevorzugt gibt es mindestens eine zweite Auffrischimpfung („boost"), vorzugsweise ein bis drei Monate nach der ersten Auffrischimpfung. Das Antigen kann unter Verwendung desselben Pockenvirusvektors verabreicht werden. Das Antigen kann vorzugsweise unter Verwendung eines zweiten Pockenvirusvektors von einer unterschiedlichen Pockengattung verabreicht werden, oder kann direkt unter Verwendung von z.B. einem Adjuvanz oder Liposom verabreicht werden. Cytokine, z.B. IL-2, IL-6, IL-12 oder co-stimulatorische Moleküle, z.B. B7.1, B7.2, können als biologische Adjuvanzien verwendet werden und können systemisch an den Wirt verabreicht werden oder über Insertion der für die Moleküle kodierenden Gene in den rekombinanten Pockenvektor co-verabreicht werden.
Adjuvanzien beinhalten z.B. RIBI Detox (Ribi Immunochemical), QS21 und unvollständiges Freundsches Adjuvanz.
Erzeugung cytotoxischer T-Zellen
Cytotoxische T-Zellen, die spezifisch für PSA sind, können von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) etabliert werden, die von einem Wirt, der wie oben diskutiert immunisiert wurde, erhalten wurden. PBMC können beispielsweise unter Verwendung eines Lymphozytenseparationsmedium-Gradienten (Organon Teknika, Durham, NC, USA) abgetrennt werden wie zuvor beschrieben [Boyum et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21:77-80 (1968)]. Gewaschene PBMC werden in einem Vollmedium resuspendiert, z.B. RPMI 1640 (GIBCO) ergänzt mit 10% humanem Mischplasma AB-Serum (Pel-Freeze Clinical System, Brown Dear, WI, USA), 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (GIBCO). PBMC mit einer Konzentration von etwa 2 × 10⁵ Zellen in Vollmedium in einem Volumen von z.B. 100 μl werden in jedes Well einer 96-Well-Flachbodenassayplatte (Costar, Cam bridge, MA, USA) gegeben. Das Antigen oder Peptide werden zu den Kulturen in einer Endkonzentration von etwa 50 μg/ml hinzugegeben und bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthält, für 5 Tage inkubiert. Nach Entfernung der Peptid-enthaltenden Medien werden die Kulturen nach 5 Tagen mit frischem humanem IL-2 (10 U/ml) versorgt und mit IL-2-enthaltendem Medium alle drei Tage wieder aufgefrischt. Primärkulturen werden mit demselben Peptid (50 μg/ml) an Tag 16 re-stimuliert. 5 × 10⁵ bestrahlte (4000 rad) autologe PBMC werden in einem Volumen von etwa 50 μl Vollmedium als Antigen-präsentierende Zellen (APC) zugegeben. Etwa fünf Tage später werden die Kulturen mit humanem IL-2-enthaltendem Medium versorgt wie zuvor beschrieben. Zellen werden für 5 Tage bei Intervallen von 16 Tagen re-stimuliert.
Epitopkartierung
Die erfindungsgemäßen cytotoxischen T-Zellen können verwendet werden, um das Epitop des PSA zu ermitteln, das eine cytotoxische T-Zelle auslöst. Beispielsweise kann man das PSA in eine Vielzahl von Peptidfragmenten schneiden. Alternativ können die Fragmente chemisch synthetisiert werden. Cytotoxische T-Zellen können anschließend ausplattiert werden und unterschiedliche Fragmente in unterschiedliche Wells gegeben werden. Nur die T-Zellen, die eine der vorausgewählten Peptidfragmente als ein Epitop erkennen, werden weiter expandieren, und dadurch eine leichte Identifikation erlauben.
Diese Fragmente können dann anstelle des ganzen Proteins verwendet werden, um cytotoxische T-Zellen auszulösen. Zusätzlich kann man andere Fragmente herstellen, die das Epitop enthalten, um seine Fähigkeit zum Auslösen einer cytotoxischen T-Zell-Antwort zu erhöhen. Modifikationen dieser Fragmente sind in der Fachwelt gut bekannt und beinhalten die Verwendung von Konjugaten, spezifischen Aminosäureresten wie Cystine, etc.
Arzneimittelassay
Die cytotoxische T-Zelle kann ebenfalls verwendet werden, um nach Verbindungen zu screenen, die die Fähigkeit des Antigens, eine cytotoxische T-Zell-Antwort zu erzeugen, verstärken. Zum Beispiel können cytotoxische T-Zellen mit einem ausgesuchten Epitop z.B. in einer Mikrotiterplatte inkubiert werden. Die zu testende Verbindung, z.B. ein Arzneimittel, wird dann in das Well gegeben und das Wachstum der T-Zellen wird gemessen. T-Zell-Expansion zeigt an, dass die Testverbindung die T-Zell-Antwort verstärkt. Solche Verbindungen können weiter evaluiert werden.
Therapie
Die cytotoxische T-Zelle kann kultiviert werden, um ihre Anzahl zu amplifizieren, und dann durch eine Vielzahl von Mitteln in den Wirt zurückinjiziert werden. Im Allgemeinen werden zwischen 1 × 10⁵ und 2 × 10¹¹ cytotoxische T-Zellen pro Infusion in beispielsweise einer bis drei Infusionen von 200 bis 250 ml jeweils über einen Zeitraum von 30 bis 60 Minuten verabreicht. Nach Abschluss der Infusionen kann der Patient mit rekombinantem Interleukin-2 mit einer Dosis von 720000 IU pro Kilogramm Körpergewicht intravenös alle 8 Stunden behandelt werden; einige Dosen können ausgelassen werden, abhängig von der Toleranz des Patienten gegenüber dem Arzneimittel. Des Weiteren kann nach Infusion zusätzliches Antigen oder Fragmente, die (ein) T-Zell-auslösende(s) Epitop(e) enthalten, an den Patienten verabreicht werden, um die T-Zell-Anzahl weiter zu expandieren. Das Antigen oder Epitop kann mit einem Adjuvanz formuliert sein und/oder kann in einer liposomalen Formulierung vorliegen.
Die cytotoxischen T-Zellen können auch durch das Einfügen eines viralen Vektors modifiziert werden, der eine DNA enthält, die für TNF kodiert, und in den Wirt wiedereingefügt werden, in dem Bestreben, die Antitumoraktivität der Zellen zu verstärken. Andere Cytokine können ebenfalls verwendet werden.
Der rekombinante Vektor kann unter Verwendung jeglicher verträglicher Wege verabreicht werden, einschließlich z.B. Skarifizierung und Injektion, z.B. intradermal, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal.
Für parenterale Verabreichung werden die rekombinanten Vektoren typischerweise in einer sterilen wässrigen oder nicht-wässrigen Lösung, Suspension oder Emulsion zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie physiologische Kochsalzlösung injiziert.
REFERENZBEISPIEL 1
KONSTRUKTION DER VEKTOREN
Pockenviren
Eine Anzahl von Pockenviren wurde als lebende virale Vektoren zur Expression heterologer Proteine entwickelt (Cepko et al., Cell 37:1053-1062 (1984); Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626-4630 (1987); Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3896-3900 (1987); Panicali & Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931 (1982); Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982)). Typische Hühnerpocken- und Schweinepockenviren sind über das ATCC unter den Zugangsnummern VR-229 bzw. VR-363 erhältlich.
DNA-Vektoren für in vivo-Rekombination mit einem parentalen Virus
Gene, die für gewünschte Karzinom-assoziierte Antigene kodieren, werden in das Genom eines Pockenvirus dergestalt inseriert, dass ihnen ermöglicht wird, von dem Virus zusammen mit der Expression des normalen Komplements der parentalen Virusproteine exprimiert zu werden. Dies kann erreicht werden, indem zunächst ein DNA-Donorvektor für die in vivo-Rekombination mit einem Pockenvirus konstruiert wird.
Im Allgemeinen enthält der DNA-Donorvektor die folgenden Elemente:

(i) einen prokaryotischen Replikationsursprung, so dass der Vektor in einem prokaryotischen Wirt amplifiziert werden kann;
(ii) ein Gen, das für einen Marker kodiert, der die Selektion der prokaryotischen Wirtszellen, die den Vektor enthalten, erlaubt (z.B. ein Gen, das für eine Antibiotikaresistenz kodiert);
(iii) mindestens ein für ein gewünschtes Protein kodierendes Gen, das benachbart zu einem Promotor für die Transkription liegt, der fähig ist, die Expression des Gens zu steuern; und
(iv) das Konstrukt von Element (iii) flankierende DNA-Sequenzen, die homolog zu der Region des parentalen Virusge noms sind, worin die fremden Gene (oder das fremde Gen) inseriert werden.

Verfahren für die Konstruktion von Donorplasmiden zum Einbringen von mehreren fremden Genen in Pockenvirus sind in der WO 91/19803 beschrieben. Im Allgemeinen können alle DNA-Fragmente zur Konstruktion des Donorvektors, einschließlich Fragmente, die Promotoren zur Transkription enthalten, und Fragmente, die Sequenzen enthalten, die zu der Region des parentalen Virusgenoms, in das fremde Gene inseriert werden sollen, homolog sind, aus genomischer DNA oder klonierten DNA-Fragmenten erhalten werden. Die Donorplasmide können mono-, di- oder multivalent sein (d.h. sie können eine oder mehrere inserierte fremde Gensequenzen enthalten).
Der Donorvektor enthält vorzugsweise ein zusätzliches Gen, das für einen Marker kodiert, der eine Identifikation von rekombinanten Viren erlaubt, die die inserierte fremde DNA enthalten. Mehrere Typen von Markergenen können verwendet werden, um die Identifikation und Isolierung rekombinanter Viren zu erlauben. Diese beinhalten sowohl Gene, die für Antibiotika oder chemische Resistenz kodieren (siehe z.B. Syropoulos et al., J. Virol. 62:1046 (1988); Falkner und Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Franke et al., Mol. Cell. Biol. 5:1918 (1985)), als auch Gene wie das E. coli lacZ-Gen, die die Identifikation rekombinanter viraler Plaques mittels eines Farbassays erlauben (Panicali et al., Gene 47:193-199 (1986)).
Integration von Fremd-DNA-Sequenzen in das virale Genom und Isolation von Rekombinanten
Homologe Rekombination zwischen Donorplasmid-DNA und viraler DNA in einer infizierten Zelle führt zur Bildung von rekombinanten Viren, die die gewünschten Elemente enthalten. Geeignete Wirtszellen für in vivo-Rekombination sind im Allgemeinen eukaryotische Zellen, die von dem Virus infiziert und mit dem Plasmid-Vektor transfiziert werden können. Beispiele solcher Zellen, die für die Verwendung mit einem Pockenvirus geeignet sind, sind Hühnerembryofibroblasten, HuTK143- (humane) Zellen, und CV-1-, Vero- und BSC-40-(Affen-) Zellen. Infektion von Zellen mit Pockenvirus und Transfektion dieser Zellen mit Plasmid-Vektoren wird durch Standardtechniken erreicht (Panicali und Paoletti, US-PS 4,603,112, WO 89/03429).
Im Anschluss an die in vivo-Rekombination kann die rekombinante virale Vermehrung mittels einer von verschiedenen Techniken identifiziert werden. Falls der DNA-Donorvektor so konstruiert wurde, dass er Fremdgene in das Thymidinkinase (TK)-Gen des parentalen Virus inseriert, werden zum Beispiel Viren, die integrierte DNA enthalten, TK- sein und können auf dieser Basis selektiert werden (Mackette et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982)). Alternativ kann Co-Integration eines Marker-kodierenden Gens oder Indikatorgens mit dem Fremdgen (den Fremdgenen) von Interesse, wie vorstehend beschrieben, zur Identikation der rekombinanten Vermehrung verwendet werden. Ein bevorzugtes Indikatorgen ist das E. coli lacZ-Gen: rekombinante Viren, die β-Galactosidase exprimieren, können unter Verwendung eines chromogenen Substrats für das Enzym selektiert werden (Panicali et al., Gene 47:193 (1986)).
Charakterisierung der von rekombinanten Viren exprimierten viralen Antigene
Sobald ein rekombinantes Virus identifiziert wurde, kann eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden, um die Expression des Polypeptids, das durch das inserierte Gen kodiert wird, zu untersuchen. Diese Verfahren beinhalten „black plaque assay" (ein in situ Enzym-Immunoassay, der mit viralen Plaques ausgeführt wird), Western Blot-Analyse, Radioimmunpräzipitation (RIPA) und Enzymimmunassay (EIA).
Beispiel I
Erzeugung PSA-spezifischer Immunantwort
Material und Methoden
Rekombinanter Vakziniavirus
Ein 786 bp-DNA-Fragment, das den gesamten offenen Leserahmen des humanen Prostata-spezifischen Antigens kodiert, wurde mittels reverser Transkriptase-PCR (GeneAmp RNA PCR Kit, Perkin Elmer, Norwalk, CT) aus Gesamt-RNA amplifiziert, die aus der humanen metastatischen Prostata-Adenokarzinomzelllinie LNCAP.FGC (CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) extrahiert wurde. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die aus der PSA-kodierenden Sequenz abgeleitet wurde, erwies sich als nahezu identisch zu der publizierten Sequenz (Lundwall et al., 1987), und unterschied sich nur in einem Austausch von Asparagin zu Tyrosin an Position 220. Das PSA-DNA-Fragment, das die gesamte ko dierende Sequenz für PSA, 41 Nukleotide der 5'-untranslatierten Region und 520 Nukleotide der 3'-untranslatierten Region enthielt, wurde in die XbaI-Restriktionsendonukleasespaltstelle des Vakziniavirus-Transfervektors pT116 inseriert. Das resultierende Plasmid, pT 1001 genannt, enthält das PSA-Gen unter der Kontrolle des Vakziniavirus-40K-Promotors (Gritz et al., 1990) und das E. coli lacZ-Gen unter der Kontrolle des Hühnerpockenvirus-C1-Promotors (Jenkins et al., 1991). Die Fremdgene werden von DNA-Sequenzen aus der HindIII-M-Region des Vakziniagenoms flankiert. Ein Plaque-aufgereinigtes Isolat des Wyeth (New York City Board of Health)-Stamms von Vakzinia wurde als das parentale Virus bei der Konstruktion des rekombinanten Vakziniavirus verwendet. Die Erzeugung von rekombinantem Vakziniavirus wurde durch homologe Rekombination zwischen Vakziniasequenzen in dem Wyeth-Vakziniagenom und den entsprechenden Sequenzen in pT1001 in Vakzinia-infizierten RK₁₃-Zellen (CCL 37, ATCC), die mit pT1001 transfiziert worden waren, erreicht. Andere Zelllinien zur Erzeugung der Rekombinanten beinhalten in nicht limitierender Weise CV-1 und Vero. Rekombinantes Virus wurde mittels eines chromogenen Assays identifiziert, der mit viralen Plaques in situ ausgeführt wurde und der die Expression des lacZ-Genprodukts in Anwesenheit von halogeniertem Indolyl-beta-D-Galactosid (Bluo-gal) detektiert, wie zuvor beschrieben (Panicali et al., 1986). Geeignete blaue rekombinante Viren wurden durch vier Runden Plaque-Aufreinigung aufgereinigt. Virusstammkulturen wurden durch Klären von infizierten RK₁₃-Zelllysaten gefolgt von einer Zentrifugation durch ein 36%-Sucrosekissen präpariert.
Charakterisierung von rekombinantem Virus
Southern-Analyse der DNA-Rekombination
Das rekombinante Vakziniagenom wurde durch virale DNA-Extraktion, Restriktionsendonukleaseverdau mit HindIII und Southern-Blotting wie zuvor beschrieben analysiert (Kaufman et al., 1991).
Western Analyse der Proteinexpression
Konfluente BSC-40-Zellen wurden entweder mit parentalem Wildtypvakziniavirus (bezeichnet als V-Wyeth) oder rekombinantem Vakziniavirus-PSA (bezeichnet als rV-PSA) bei einer MOI von 1 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium, das 2% fetales Rinderserum enthält, infiziert. Nach einer Übernachtinfektion wurde das Medium von den Zellen entfernt und ein Aliquot wurde Methanol-präzipitiert, um auf die Anwesenheit von sekretiertem PSA zu testen. Die infizierten Zellen wurden in hypotonischem Lysepuffer (150 mM NaCl, 0,05% EDTA, 10 mM KCl, 1 mM PMSF) lysiert und dann Ultraschall-behandelt. Zelllysate und Kulturmedien wurden auf einem 10%igen SDS-Acrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose geblottet und der Blot wurde mit einem PSA-spezifischen Kaninchenantikörper (P0798, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und anschließend mit Phosphatase-gelabeltem Antikaninchen-Sekundärantikörper aus Ziege (AP, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) inkubiert und gemäß den Vorschriften des Herstellers entwickelt.
Erzeugung von B-Zelllinien
Autologe B-lymphoblastoide Zelllinien (BLCL) aus Affen wurden durch die Infektion von 1 × 10⁵ frisch isolierten PBMCs in 100 ml RPMI 1640, ergänzt mit L-Glutamin, Gentamicin und 10% FCS (Biofluids, Rockville, MD), mit 100 ml Überstand von S594-Zellen (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. M.D. Miller, Harvard Medical School, New England Regional Primate Research Center, Southborough, MA), der das Pavianherpesvirus Herpes papio enthält, in einer 96-Well-Flachbodenplatte (Costar, Cambridge, MA) etabliert. Im Anschluss an die Transformation wurden die Zellen expandiert und die Medien einmal wöchentlich gewechselt.
Immunisierung von Affen
Zwölf jugendliche männliche Rhesusaffen (Macaca mulatta) im Alter von 1 bis 2 Jahren wurden drei Impfgruppen zu jeweils vier Tieren zugeordnet. Ein Tier aus jeder Gruppe wurde prostatektomiert. Die Tiere wurden dreimal an den Tagen 1, 29 und 57 immunisiert. Dosen von entweder 1 × 10⁷ oder 1 × 10⁸ PFU von rV-PSA wurden an vier Tiere durch Hautskarifizierung verabreicht. V-Wyeth (1 × 10⁸ PFU) wurde an vier Tiere zur Kontrolle verabreicht. Die Tiere wurden im Toxicology Research Laboratory, University of Illinois in Chicago (TRL/UIC) gemäß den Richtlinien des „National Cancer Institute Animal Care and Use Committee" und dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Department of Health and Human Services Publication NIH 85-23, überarbeitet 1985 durch das FDA Center for Biologics Evaluation and Research Office of Biological Product Review, Abteilung für Produkt qualitätskontrolle, Pathologie- und Primatologielabor, Bethesda, MD) untergebracht und gepflegt.
Toxikologie
Ärztliche Untersuchungen wurden an Ketamin- (Ketamine^® HCl, 10 mg/kg 1.M.) sedierten Tieren durchgeführt. Rektaltemperaturen und Gewichte wurden für jeden Affen auf wöchentlicher Basis aufgenommen. Die Impfstelle wurde beobachtet und Erytheme und Schwellungen wurden per Tastzirkel gemessen. Jedes Tier wurde auf regionale Lymphadenopathie, Hepatomegalie und Splenomegalie untersucht. Jegliche anderen großen Abnormalitäten wurden ebenfalls aufgezeichnet.
Blut wurde durch Venenpunktion von der Oberschenkelvene Ketamin-sedierter Tiere vor und nach jeder Immunisierung erhalten. Ein komplettes Blutbild, differenzielle Leber- und Nierenwertbestimmung wurde an jedem Affen durch TRL/UIC durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit normalen Primatenwerten verglichen (Kantor et al., 1992b). Zirkulierende Level von PSA vor und nach Immunisierung wurden mittels Radioimmunassay (Tandem^TM, Hybritech, San Diego, CA) analysiert.
Messung von Antikörpertitern
Vor jeder Immunisierung und zwei Wochen nach jeder Immunisierung wurde Anti-PSA-Antikörper mittels ELISA quantifiziert. Mikrotiterplatten wurden mit aufgereinigtem PSA (100 ng/Well, Calbiochem, La Jolla, CA), Ovalbumin (100 ng/Well, Sigma) oder 1 × 10⁷ PFU/Well UV-inaktivierten V-Wyeth in PBS beschichtet. Die Platten wurden mit 2% BSA in PBS blockiert, getrocknet und bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Die Platten wurden mit 1:5 verdünntem Serum sowie einem monoklonalen Antikörper für PSA (DAKO M750, Dänemark) als eine Standardkontrolle für 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Platten wurden einige Male mit PBS, das 1% BSA enthielt, gewaschen und bei 37°C 45 Minuten mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Mensch-IgG- oder -IgM-schwere Kette-spezifischem Antiserum (1:8000) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) inkubiert, und die Antikörper wurden mittels HRP-Substratsystem (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) gemäß den Vorschriften des Herstellers detektiert. Die Absorption eines jeden Wells wurde bei 405 nm unter Verwendung eines Bio-Tek EL310-Microplate-ELISA-Readers (Winooski, VT) ausgelesen.
Lymphoproliferativer Assay
Autologe Affen-BLCL wurden bei einer Dichte von 3 × 10⁶ Zellen/Well in 24-Well-Platten mit 160 mg/Well aufgereinigtem PSA (Fitzgerald, Concord, MA) oder 160 mg/Well Ovalbumin (Sigma) bei 37°C für 24 Stunden ausplattiert. Zellen wurden dann γ-bestrahlt (14000 rad), geerntet, gewaschen und bei einer Endkonzentration von 1 × 10⁷/ml suspendiert. Frische Affen-PBMCs von heparinisiertem Blut, 6 Wochen bis 7 Monate nach der letzten Immunisierung, wurden auf Lymphozytenseparationsmedium (Organon Teknika, West Chester, PA) isoliert. Lymphoproliferative Reaktionen wurden durch Co-Kultivierung von 1,5 × 10⁵ Zellen mit 5 × 10⁵ Zellen/Well autologen BLCL in 0,2 ml RMPI 1640 ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalen Kälberserum in 96-Well-Platten mit flachem Boden (Costar) für fünf Tage evaluiert. PBMCs wurden mit 2 × 10⁷ PFU/ml UV-bestrahlten V-Wyeth als Erinnerungsantigen oder 2 mg/ml Con-A als Positivkontrollen kultiviert. Zellen wurden für die letzten 12-18 Stunden der Inkubation mit 1 mCi/Well [³H]Thymidin (New England Nuclear, Wilmington, DE) markiert und mit einem PHD-Zellernter (Cambridge Technology, Cambridge, MA) geerntet. Die eingebaute Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung (LS 6000IC; Beckman, Duarte, CA) gemessen. Die Ergebnisse von dreifach ausgeführten Wells wurden gemittelt und sind als Mittelwert ± SEM angezeigt.
Ergebnisse
Erzeugung und Charakterisierung von rekombinantem Virus
Das für den offenen Leserahmen von humanem PSA kodierende cDNA-Fragment wurde durch reverse Transkriptase-PCR unter Verwendung der PSA-spezifischen Oligonukleotidprimer 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTACCACCTGCA 3' (SEQ ID NO:16), 5' TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3' (SEQ ID NO:17) erhalten und in den Vakziniavirustransfervektor pT106 ligiert. Dieser Vektor enthält einen starken Vakziniavirus-Früh/Spätpromotor (P40 bezeichnet) stromaufwärts der multiplen Klonierungsstelle, um die Synthese des inserierten Genprodukts anzutreiben. Die Ligation und Orientierung des PSA-DNA-Fragments sowie die Promotorposition wurden durch PCR und Sequenzierung verifiziert. Das chimäre Vektorkonstrukt wurde in die Vakzinvirusgenom-HindIII-M-Stelle durch homologe Rekombination wie zuvor beschrieben (Kaufman et al., (1991)) inseriert und durch Southern-Analyse mit ³²P-radioaktivmarkierter DNA, die mit PSA-Sequenzen und Vakzi niasequenzen in der HindIII-M-Region übereinstimmt, bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die gesamte cDNA-Sequenz von PSA in dem Vakziniavirusklon erwies sich als nahezu identisch zu den publizierten Sequenzen (Lundwall et al., 1987).
Expression rekombinanten Proteins wurde durch Western Blot-Analyse von Überstandsflüssigkeiten und Proteinextrakten aus rV-PSA-infizierten BSC-40-Zellen bestätigt. Diese Zellen werden routinemäßig für die Evaluierung von rekombinanten Vakziniaprodukten verwendet (Moss et al., 1993). Inkubation von Zellüberstandblots von rV-PSA-infizierten Zellen mit Kaninchen-Anti-PSA-Antikörper zeigte ein einzelnes immunreaktives Polypeptid von ungefähr 33000 Da (1, Spuren 2-4). Inkubation von Proteinextraktblots von rV-PSA-infizierten Zellen zeigte gleichermaßen eine einzelne Bande des gleichen Molekulargewichts (1, Spuren 7-9). Dies ist konsistent mit der vorhergesagten Größe des PSA-Moleküls (Armbruster et al., 1993; Wang et al., 1982). Zellüberstandsblots (Spur 1) oder Proteinextraktblots (Spur 6) von Zellen, die mit dem parentalen Stamm V-Wyeth infiziert worden waren, blieben negativ in Bezug auf die Expression von PSA. Diese Ergebnisse zeigen folglich, dass ein rekombinantes Vakziniavirus das humane PSA-Genprodukt zuverlässig exprimieren kann.
Rhesusaffenmodell
Die Prostatadrüse des Rhesusaffen ist strukturell und funktionell der humanen Prostata ähnlich (Wakui et al., 1992). Auf der molekularen Ebene besteht eine 94%ige Homologie zwischen sowohl den Aminosäure- als auch der Nukleinsäuresequenzen von Rhesus-PSA (Gauthier et al., 1993) und humanem Prostata-spezifischem Antigen (Kerr et al., 1995; Lundwall et al., 1987). Humanes PSA ist im Wesentlichen ein Autoantigen in dem Rhesusaffen.
Versuchsaufbau
Tabelle 1 skizziert das bei der Immunisierung von 12 Rhesusaffen mit entweder rV-PSA oder der Kontrolle V-Wyeth durch Hautskarifizierung verwendete Protokoll. Drei Gruppen von vier Tieren wurden entweder mit rV-PSA bei 1 × 10⁷ PFU/Dosis, rV-PSA bei 1 × 10⁸ PFU/Dosis oder V-Wyeth bei 10⁸ PFU/Dosis dreimal bei vierwöchigen Intervallen immunisiert. Diese Dosen wurden ausgewählt, um die maximal tolerierte Dosis zur Sicherheit festzustellen, sowie gleichfalls maximale humorale und zellvermittelte Antworten auf PSA zu erhalten.
Die Rhesusaffen wurden in drei Gruppen aufgeteilt: hochdosiertes V-Wyeth, niedrigdosiertes rV-PSA und hochdosiertes rV-PSA. Ein Tier in jeder Gruppe wurde chirurgisch prostatektomiert, um die Parallele zu zwei Situationen im Anbetracht der potentiellen Therapie in Menschen zu schaffen: (a) Prostata intakt mit primärer und/oder metastatischer Erkrankung; oder (b) prostatektomierte Patienten mit metastatischen Prostatakrebsablagerungen. Das Vorhandensein einer intakten Prostatadrüse könnte als eine denkbare Antigen "senke" dienen, wodurch entweder eine Anergie durch Antigenpersistenz induziert wird oder immunologische Wirkungen durch die Absonderung reaktiver Zellen oder Antikörper maskiert werden.
Physische Konsequenz der Immunisierung
Die Fläche der von rV-PSA oder V-Wyeth induzierten Läsionen wurde sieben Tage nach jeder Inokulation analysiert. Im Allgemeinen wurde nach der ersten Inokulation eine größere Induration beobachtet verglichen zu der zweiten Inokulation (2A). Nach der dritten Inokulation gab es keine Schwellung der Vakzinierungsstelle. Die Dauer der jeder Immunisierung folgenden Läsion war kürzer nach jeder Inokulation (2B). Eine der Vakzination folgende regionale Lymphknotenschwellung war in den meisten Affen nach der ersten Immunisierung größer verglichen zur zweiten oder dritten Immunisierung (2C). Im Allgemeinen wurden keine Unterschiede bei diesen Parametern bezüglich der Verwendung von rV-PSA oder V-Wyeth beobachtet. Affen, die V-Wyeth erhielten, wurden mit solchen, die rV-PSA erhielten, in Bezug auf körperlich bedingte Symptome verglichen. Leichte Temperaturerhöhungen wurden bei allen Tieren im Anschluss an die Vakzinierung beobachtet. Es gab keine Anzeichen von Gewichtsverlust, Hepatomegalie oder Splenomegalie in irgendeinem der Tiere und es gab keine Unterschiede zwischen V-Wyeth- oder rV-PSA-behandelten Tieren (Daten nicht gezeigt). Tiere wurden untersucht auf Blutstatus, Differentialblutbild und Leber- und Nierenwerte. Der Blutstatus blieb während der Studie sowohl in V-Wyeth- als auch in rV-PSA-immunisierten Tieren innerhalb normaler Grenzen (Tabelle 2). Leber- und Nierenfunktionen wurden vor der Immunisierung und 12 Wochen nach der ersten Immunisierung bestimmt (Tabelle 3). Analysierte Parameter beinhalteten alkalische Phosphatase-, Blutharnstoff-Stickstoff-, Alaninaminotransferase-, Aspartataminotransferase-, Laktatdehydrogenase- und Kreatin- und Kreatinkinaselevel. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Tieren, die V-Wyeth oder rV-PSA erhielten. Es gab kein detektierbares PSA im Kreislauf irgendeines dieser Affen nach irgendeiner Immunisierung (Detektionsgrenze war 0,1 ng/ml). Zu diesem Zeitpunkt, d.h. 54 Wochen nach allen Immunisierungen, wurden keine Toxizitäten in Affen aus irgendeiner der Gruppen einschließlich denen, die prostatektomiert wurden, beobachtet.
PSA-spezifische humorale Antworten
Wie in Tabelle 1 angezeigt, wurde Affen 1-4 V-Wyeth verabreicht, während Affen 5-12 rV-PSA verabreicht wurde. Seren von jedem dieser Affen wurden mittels ELISA auf Immunreaktivität gegenüber PSA oder UV-inaktiviertem V-Wyeth und Ovalbumin als Kontrollantigen analysiert. Seren, die von Affen vor der Vakzinierung erhalten wurden, waren negativ für die Reaktivität auf PSA (Tabelle 4, PI). Fünfzehn Tage im Anschluss an die primäre Immunisierung entwickelten Affen in sowohl der 1 × 10⁸- als auch der 1 × 10⁷-Dosis rV-PSA-Gruppe niedrige Titer an PSA-spezifischen IgM-Antikörpern (Titer wurden bei einer 1:5-Serumverdünnung bestimmt). Obwohl andere Antikörperisotypen untersucht wurden (IgG, IgA, IgM), war nur IgM während des Beobachtungszeitraums von 270 Tagen durch rV-PSA induziert. Die Antikörpertiter nahmen über die vier Wochen vor der nächsten Inokulation ab. Vor der zweiten Vakzinierung an Tag 29 verblieben drei von vier Tieren in der 1 × 10⁷ rV-PSA-Gruppe positiv für PSA-Antikörper, während 4 von 4 Tieren in der 1 × 10⁸ rV-PSA-Gruppe positiv blieben. Anti-PSA-Antikörpertiter stiegen nach der zweiten Vakzinierung an Tag 29 an, blieben aber nach der dritten Vakzinierung an Tag 57 gleich. 270 Tage nach der primären Immunisierung waren alle Tiere für PSA-IgM-Antikörper negativ. Affen blieben während des gesamten Beobachtungszeitraums für PSA-spezifischen IgG negativ (Daten nicht gezeigt). Es gab keine Korrelation zwischen rV-PSA-Dosis und Anti-PSA-IgM-Titer, noch gab es irgendeinen sichtbaren Effekt der Prostatektomie. Alle Affenseren waren zu allen Zeitpunkten negativ für IgG oder IgM gegen Ovalbumin; als eine Positivkontrolle jedoch war der IgG-Titer gegen Vakziniavirus in allen drei Behandlungsgruppen bereits 29 Tage nach der primären Immunisierung größer als 1:2000 (Daten nicht gezeigt).
Im Allgemeinen ist das Vakziniavirus ein schwaches Humanpathogen (Paoletti et al., 1993). Im Anschluss an die Vakzinierung sind lokale Erytheme, Induration, schwaches Fieber und regionale Lymphadenopathie üblich. Der Virus repliziert sich in den Epidermiszellen der Haut und der Virus ist üblicherweise innerhalb von 14 Tagen verschwunden. Alle Affen, ob ihnen V-Wyeth oder rV-PSA verabreicht wurde, zeigten die üblichen schwachen körperlich bedingten Symptome einer Vakziniavirusinfektion (2). Es gab kein Anzeichen von irgendwelchen nachteiligen Aus wirkungen wie durch Änderungen des Blutbilds, differenziellen Blutbilds, der Leber- und Nierenwerte angezeigt (Tabellen 2-3). Die Affen erschienen über die 54 Wochen der Beobachtung gesund, ohne jegliche physische Zeichen von Vergiftung.
Obwohl das rV-PSA-Konstrukt unfähig war, eine Anti-PSA-IgG-Antwort auszulösen, wurden PSA-spezifische IgM-Antworten in allen rV-PSA-immunisierten Affen unabhängig vom Dosislevel festgestellt (Tabelle 4). Diese Antikörperantworten besaßen einen niedrigen Titer, waren kurzlebig und konnten nicht verstärkt werden, was eine Induktion einer Primärantwort, aber keine Induktion von Gedächtnis-B-Zellen oder Affinitätsreifung anzeigt.
PSA-spezifischer lymphoproliferativer Assay
PSA-spezifische T-Zellantworten in Affen, die mit rV-PSA oder V-Wyeth immunisiert wurden, wurden unter Verwendung eines lymphoproliferativen Assays analysiert. Wie in Tabelle 5 zu sehen, antworteten die PBMCs von allen analysierten Affen unabhängig davon, ob sie rV-PSA oder V-Wyeth erhalten hatten, sowohl auf das Lymphozytenmitogen Konkanavalin-A als auch auf das Erinnerungsantigen UV-inaktivierter V-Wyeth. Unterschiedliche Antworten auf PSA versus Medium allein oder Ovalbumin wurden in einem Tier (Nummer 6) in der 1 × 10⁷ PFU rV-PSA-Gruppe beobachtet. Alle PBMCs von Tieren in der 1 × 10⁸ PFU rV-PSA-Gruppe antworten jedoch auf PSA in diesem Assay. Dieses Experiment wurde fünfmal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt und die Daten, die in Tabelle 5 gezeigt sind, sind von PBMCs, die aus Affen 270 Tage nach der primären Immunisierung isoliert wurden. Keine Unterschiede in PSA-spezifischen T-Zellantworten wurden in den prostatektomierten Affen beobachtet.
Um die zellvermittelten Antworten auf die Verabreichung von rV-PSA zu untersuchen, wurden lymphoproliferative Assays unter Verwendung von PBMCs von Tieren, die das rekombinante Vakzin erhielten, durchgeführt. Einer von vier Affen, die die niedrigere Dosis von rV-PSA (1 × 10⁷ PFU) erhielten und vier von vier, die die höhere Dosis (1 × 10⁸ PFU) erhielten, behielten spezifische T-Zellantworten auf PSA-Protein bis zu 270 Tage im Anschluss an die primäre Immunisierung, wie von dem lymphoproliferativen Assay angezeigt, bei (Tabelle 5). Prostatektomie schien weder auf die humoralen noch auf die zellulären Antworten von Affen, die rV-PSA erhielt, eine Wirkung aufzuweisen. Anzeichen auf PSA-spezifische T-Zellantworten in Affen, denen reife Antikörperisotypen fehlen, könnten durch zwei verschiedene Ereignisse im Anschluss an die Vakzinierung mit rV-PSA begründet sein: Ein T-Zell-unabhängiges Ereignis, das zu einer IgM-Produktion führt, und ein T-Zell-abhängiges Ereignis, das zu spezifischen lymphoproliferativen Antworten führt.
Tabelle I Inokulationsprotokoll von Rhesusaffen mit dem PSA-rekombinanten und Wildtyp-Vakziniavirus
Beispiel II
Identifikation von potentiellen Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-spezifischen T-Zell-Epitopen
Da die gesamte Aminosäuresequenz von humanem PSA bekannt ist und humane Klasse I-HLA A2-Konsensusmotive beschrieben wurden, wurden Studien unternommen, um eine Reihe von Peptiden zu identifizieren, die potentiell Klasse I A2-Moleküle binden würden. A2 wurde gewählt, da es das am weitesten verbreitete HLA-Klasse I-Molekül ist, und in ungefähr 50% der nordamerikanischen Kaukasier und 34% der Afroamerikaner vertreten ist. Die Peptidsequenz von PSA wurde daher auf Übereinstimmungen mit den Konsensusmotiven für HLA A2-bindende Peptide untersucht. Peptide wurden nur dann ausgewählt, wenn ihre Sequenz hinreichend von dem PSA-verwandten menschlichen glandulären Kallikrein (HGK)-Gen und Pankreas-Kallikrein-Antigen (PKA)-Sequenzen verschieden war.
Die Aminosäuresequenz von menschlichem PSA wurde unter Verwendung eines Vorhersagealgorithmuses abgesucht, der eine Suche für Ankerreste mit numerischen Zuordnungen zu allen Resten an allen Positionen kombiniert. Der T2-Zellbindungsassay wurde anschließend verwendet, um zu bestimmen, welche Peptide humane HLA A2-Moleküle banden. Wie man in Tabelle 6 sehen kann, wurden PSA-Peptide 141-150, 154-163 und 146-154 als positiv in diesem Assay verzeichnet (Nijman, H. W. et al., Eur. J. Immunol. 23:1215-1219, 1993). Tabelle 7 zeigt die Aminosäuresequenz dieser Peptide und vergleicht sie mit den entsprechenden Sequenzen von HGK und PKA.
Tabelle 6 PSA-Peptidbindungsassay

Peptide wurden bei einer Konzentration von 50 μg/ml verwendet.
^a Mittlere Kanalfluoreszenzintensität.
CIRA2-Zelllinie wurde als Positivkontrolle für Anti-A2-Färbung verwendet [(241,15)].

Tabelle 7 PSA-Peptidaminosäuresequenz
BEISPIEL III
Etablierung humaner T-Zelllinien die cytolytisch für menschliche PSA-exprimierende Tumorzellen sind
PBMC von normalen gesunden Spendern, die das HLA A2-Klasse I-Alle1 exprimieren, wurden in einer Bestrebung verwendet, herauszufinden, ob PSA-spezifische Peptide für Menschen immunogen sind. Peptide 141-150 und 154-163 wurden in dieser Studie verwendet. Die verwendete Methodologie zur Etablierung dieser Zelllinien beinhaltet Pulsieren von PBMC mit Peptid und IL-2 wie zuvor beschrieben (Tsang, K.Y. et al., 1995, J. Natl. Cancer Inst., Vol. 87(13):982-90 und in US-Anmeldung Seriennummer 08/396,385). T-Zelllinien konnten von 5/6 normalen Spendern unter Verwendung des PSA-Peptids 141-150 und von 6/6 normalen Spendern unter Verwendung des PSA-Peptids 154-163 etabliert werden. Darüber hinaus wurden PBMC von zwei Prostatakrebspatienten erhalten. T-Zelllinien wurden von diesen PBMC-Kulturen unter Verwendung des Peptids 154-163 etabliert.
Einige dieser T-Zelllinien wurden phänotypisiert. Wie in Tabelle 8 zu sehen, enthält eine Zelllinie, T-866 bezeichnet (T-Donor A), die durch Pulsieren mit Peptid 141-150 erhalten wurde, nennenswerte Mengen von CD4+/CD8+ doppelt positiven Zellen und eine andere Zelllinie, T-1538 bezeichnet (T-Donor B), erhalten durch Pulsieren mit Peptid 154-163, zeigt einen ähnlichen Phänotyp.
Vier der T-Zelllinien, die von drei verschiedenen Individuen abgeleitet wurden, wurden dann auf ihre Fähigkeit menschliche Zellen zu lysieren untersucht (Tabelle 9). Wie in Tabelle 9 zu sehen, war die als T-866 bezeichnete T-Zelllinie, die von Peptid 141-150 abgeleitet war, fähig T2-Zellen zu lysieren, wenn sie mit dem entsprechenden Peptid (141-150) gepulst wurde. Keine Lyse wurde bei Verwendung der PSA-negativen humanen Colon-Krebszelllinie COLO-205 beobachtet, während 80% Lyse bei Verwendung der LNCAP-PSA-exprimierenden humanen Prostatakrebszelllinie (ATCC CRL-1740) beobachtet wurde. Wenn das NK-Ziel K562 verwendet wurde, welches nicht-spezifische Lyse aufgrund von NK-Zellaktivität misst, wurde nur 23% Lyse erhalten. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung einer anderen T-Zelllinie beobachtet, die vom gleichen Patient erhalten wurde und die durch Pulsen mit PSA-Peptid 154-163 abgeleitet wurde. Zwei zusätzliche T-Zelllinien, die vom Peptid 154-163 abgeleitet wurden, wurden ebenfalls analysiert. Eine war von einem normalen Spender (T-1538) und eine war von einem Prostatakrebspatienten (T-PC2; T-Donor C) abgeleitet. Wie man in Tabelle 9 sehen kann, wurde unter Verwendung beider dieser T-Zelllinien eine verstärkte Lyse beobachtet, wenn die T2-Zelllinie mit dem 154-163-Peptid gepulst wurde, und verstärkte Lyse wurde beobachtet, wenn die PSA-exprimierende Prostata-spezifische Zelllinie LNCAP verwendet wurde, verglichen zu COLO-205 oder K562. Diese Studien zeigen, dass T-Zelllinien unter Verwendung der Peptide und Protokolle, die hier entwickelt wurden, etabliert werden können, die die Fähigkeit besitzen, PSA-exprimierende humane Prostatakarzinomzellen zu lysieren.
Tabelle 8 Durchflusscytometrieanalyse von PSA-Peptid-spezifischen T-Zellen

Ergebnisse sind dargestellt in % positiver Zellen.

Tabelle 9 Cytotoxische Wirkungen von PSA-Peptid-spezifischen T-Zellen

^a Prozent von ¹¹¹In-spezifischer Freisetzung
24 Stunden Cytotoxizitätsassay (E:T-Verhältnis, 25:1)
^b p<0,01 signifikant

BEISPIEL IV
Konstruktion und Charakterisierung von Prostata-spezifisches Antigen Oligo-Epitop-Peptid
Zwei 10-mer-PSA-Peptide (PSA1 und PSA3), die ausgewählt wurden, humanen HLA-Klasse I-A2-Motiven zu entsprechen, lösten PSA-spezifische CTL-Antworten sowohl in normalen Spendern als auch in Patienten mit Prostatakrebs aus. Ein längeres PSA-Peptid (30-mer), bezeichnet als Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP), das die kürzeren PSA-1 und PSA-3-Peptidsequenzen umfasst, wurde auf die Fähigkeit, PSA-spezifische cytotoxische T-Zellaktivität zu vermitteln, untersucht (Tabelle 10).
Tabelle 10 Sequenz des 30 Aminosäure-PSA-Peptids
Material und Methoden
Peptidsynthese
PSA-OP wurde auf einem Applied Biosystems Modell 432A-Peptidsynthesizer synthetisiert. Er arbeitet in einem 25 μmol-Maßstab und verwendet f-moc-Chemie und Feedbacküberwachung, um die Kopplung von jeder aufeinanderfolgenden Aminosäure an die wachsende Kette zu überwachen. Das fertige Peptid wird vom Syntheseharz durch Trifluoressigsäure und Thioanisol/Ethandithiol als Radikalfänger abgespalten. Saure Salze werden mit tert-Butylmethylether extrahiert und das Peptid wird aus Wasser lyophilisiert, um ungefähr 64 mg Pulver zu ergeben. Das Pulver ist bei 2 mg/ml in 1% DMSO löslich und steril filtrierte Aliquots zeigen einen einzelnen scharfen Peak auf C 18-Umkehrphasen-HPLC.
Zellkulturen
Prostatakarzinomzelllinien LNCAP und DU-145 [HLA-A2+] wurden von American Type Culture Collection (Rockville, MD) gekauft. Die Kulturen waren mykoplasmenfrei und wurden in Vollmedium, Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium bzw. RPMI1640-Medium (Life Technologies Inc., GIBCO BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μ/ml Streptomycin (Life Technologies, Inc.), erhalten. Die 174CEM.T2-Zelllinie (T2) (Transportdeletionsmutante) ist in Anderson et al., 1993, beschrieben. Die CIR-A2-Zelllinie ist in Storkus et al., 1987, beschrieben. T2-Zellen und CIRA2-Zellen wurden in Iscove's modifiziertem Dulbecco's Vollmedium (IMDM) bzw. RPMI1640 Vollmedium erhalten.
Erzeugung von T-Zelllinien
Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus heparinisiertem Blut gesunder HLA-A2-Spender mittels eines Lymphozyten-Separationsmediumsgradienten (Organon Technika, Durham, NC) erhalten. Die mononukleäre Zellfraktion wurde dreimal gewaschen und PBMCs wurden in Vollmedium: AIM V (Life Technologies, Inc.), ergänzt mit 5% humanem AB-Serum (Valley Biomedical, Winchester, VA), 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (GIBCO), resuspendiert. Zellen (2 × 10⁵) in Vollmedium in einem Volumen von 100 μl wurden in jedes Well einer 96-Well-Flachbodenassayplatte (Corning, Costar Corp., Cam bridge, MA) gegeben. Peptide wurden in einer Endkonzentration von 50 μl/ml zu den Kulturen gegeben. Die Kulturen wurden 5 Tage bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen des Peptid-enthaltenden Mediums wurden die Kulturen dann mit humanem IL-2 (Cetus) (20 U/ml) 11 Tage mit einer Wiederauffrischung des IL-2-enthaltenden Mediums alle 3 Tage versorgt. Die Inkubationszeit von 5 Tagen mit Peptid und 11 Tagen mit IL-2 bildet einen Zyklus. Primärkulturen wurden mit dem gleichen Peptid (50 μg/ml) an Tag 1 eines jeden Zykluses re-stimuliert. Bestrahlte (4000 rad) autologe PBMCs (1 × 10⁶) wurden in einem Volumen von 100 μl in Vollmedium (AIM-V) zugegeben und als Antigen-präsentierende Zellen verwendet.
Cytotoxizitätsassays
Verschiedene Zielzellen wurden mit 50 μCi von ¹¹¹In-Oxychinolin (Medi-Physics Inc., Arlington, IL) 15 Minuten bei Raumtemperatur markiert. Zielzellen (0,2 × 10⁴) in 100 μl Vollmedium (siehe nachstehend) wurden in jedes der 96 Wells in Flachbodenassayplatten (Corning Costar Corp.) gegeben. Die markierten Ziele wurden mit Peptiden mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml 60 Minuten bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert, bevor Effektorzellen hinzugegeben wurden. Effektorzellen wurden in 100 μl Vollmedium ergänzt mit 5% gepooltem humanem AB-Serum suspendiert und zu Zielzellen gegeben. Die Platten wurden bei 37°C 16 Stunden inkubiert. Überstände wurden für γ-Zählung mittels Harvester-Frames (Skatron, Inc., Sterling, VA) geerntet. Bestimmungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und Standardabweichungen wurden berechnet. Alle Experimente wurden dreimal durchgeführt.
Spezifische Lyse wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
Spontane Freisetzung wurde von Wells bestimmt, in die 100 μl Vollmedium anstelle von Effektorzellen hinzugegeben wurden. Insgesamt freisetzbare Radioaktivität wurde nach Behandlung der Zielzellen mit 2,5% Triton X-100 erhalten.
Experimente unter Verwendung von Protease-Inhibitoren wurden unter Verwendung von CIR-A2-Zellen als Zielzellen durchgeführt, die mit 100 μg/ml PSA-OP 3 Stunden gepulst wurden. Peptid-gepulste Zielzellen wurden mit Protease-Inhibitoren inkubiert. Verwendete Protease-Inhibitoren waren E64, Carboxypeptidase-Inhi bitor, Plummers Inhibitor und Captopril (Inhibitor des Angiotensin-umwandelnden Enzyms) mit verschiedenen Konzentrationen (10^–5, 10^–6, 10^–7 M). CTL-Aktivität wurde mit dem vorstehend beschriebenen CTL-Assay bestimmt.
Grenzwertverdünnungsanalyse
Grenzwertverdünnungs-Assays wurden für die Bestimmung von Vorläuferhäufigkeiten für PSA-1, PSA-3 und PSA-OP verwendet. Verschiedene Anzahlen von PBMCs wurden in 96-Well-Flachbodenplatten (Corning Costar) mit 1 × 10⁴ autologen PBMC ausgesät, die mit 4000 rad bestrahlt und mit 50 μg/ml PSA-Peptid inkubiert worden waren. Zellen wurden in Vollmedium wie zuvor beschrieben kultiviert. Mindestens 48 Kulturen wurden für jede Verdünnung angesetzt. Kulturen wurden 5 Tage bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert und dann mit frischem Medium, das humanes IL-2 enthielt, 11 Tage mit einer Wiederauffrischung des IL-2-enthaltenden Mediums alle 72 Stunden versorgt, wie nachstehend für die CTL-Erzeugung gezeigt. Nach zwei Stimulationszyklen wurde die spezifische cytotoxische Aktivität für jedes einzelne Well gegen CIR-A2-Zielzellen mit oder ohne Inkubation mit Peptid getestet. Cytotoxizitätsassays waren ähnlich zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren. Die unmarkierten K562-Zellen wurden in die Mikrowells gegeben, die Responderzellen enthielten. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wurden Zielzellen in jedes Well gegeben und für 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Vorläuferhäufigkeiten wurden mit X²-Minimierung berechnet.
Flusscytometrie
Einzelfarbflusscytometrieanalyse: 1 × 10⁶ Zellen wurden dreimal mit kalter Ca²⁺- und Mg²⁺-freier Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gewaschen und dann eine Stunde mit 1 μg monoklonalem Antikörper (MAb) gegen CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, HLA-Klasse II (HLA-DR) (Becton Dickinson, San Jose, CA), HLA Klasse I (W6/32) (Seratec, Sussex, England) und MOPC-21 (Cappel/Organon Teknika Corp., West Chester, PA) in einem Volumen von 100 μl PBS, das 1% Rinderserumalbumin enthielt, gefärbt. Die Zellen wurden dann dreimal mit kaltem DPBS gewaschen und für eine weitere Stunde in Anwesenheit einer 1:100-Verdünnung (Volumen von 100 μl PBS, das 1% Rinderserumalbumin enthält) von Fluorescein-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin (Ig) (Kirkeggard und Perry Labs, Gaitheresburg, MD) inkubiert. Die Zellen wurden erneut dreimal mit DPBS gewaschen und in DPBS bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Zel len wurden sofort unter Verwendung eines Becton Dickinson FACScan, ausgestattet mit einem blauen Laser mit einer Exzitation von 15 nW bei 488 nm, analysiert. Daten von 10000 lebenden Zellen wurden gesammelt und zur Errechnung der Ergebnisse verwendet.
Zweifarbflusscytometrieanalyse: Das Verfahren für die Zweifarbflusscytometrieanalyse war ähnlich zu dem, das für die Einzelfarbanalyse verwendet wurde, mit den folgenden Abweichungen. Die verwendeten MAbs waren Anti-CD4-Fluoresceinkonjugate, Anti-CD8-Phycoerythrinkonjugate, Anti-IgG1-Fluoresceinkonjugate und Anti-IgG2a-Phycoerythrinkonjugate (Becton Dickinson). Färbung erfolgte gleichzeitig für eine Stunde, worauf die Zellen dreimal gewaschen, wie vorstehend resuspendiert und sofort unter Verwendung eines Becton Dickinson FACSort, ausgestattet mit einem blauen Laser mit einer Exzitation von 15 nW bei 488 nm, und dem Lysis II-Programm analysiert wurden.
Peptidbindung an HLA-A2
Bindung von PSA-1- und PSA-3- und PSA-OP-Peptiden an die HLA-A2-Moleküle wurde durch Hochregulation der Expression dieser Moleküle auf der Zelloberfläche von T2-Zellen wie durch Flusscytometrie gezeigt evaluiert. 1 × 10⁶ Zellen in serumfreiem IMDM wurden mit Peptiden bei einer Konzentration von 50 μg/ml in 24 Well-Kulturplatten bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Flusscytometrie auf Peptidbindung wurde unter Verwendung von T2-Zellen und Einzelfarbanalyse durchgeführt. Nachdem Zellen dreimal in DPBS wie vorstehend gewaschen worden waren, wurden sie eine Stunde mit HLA-A2-spezifischen MAb A2,69 (One lambda, Inc., Canoga Park, CA), unter Verwendung von 10 μl einer 1X-Arbeitsverdünnung pro 10⁶ Zellen inkubiert. MOPC-21 (Cappel/Organon Teknika Corp.) wurde als Isotypenkontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen und mit einer 1:100-Verdünnung von Fluorescein (FITC)-gelabeltem Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) inkubiert. Die Analyse wurde unter Verwendung des FACScan wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Zellen wurden während der ganzen Zellpräparation und Färbung auf Eis gehalten, sofern nicht anders angegeben.
HLA-Typisierung
Die HLA-Phänotypisierung von Spender A (HLA-A2,24; B27,35; C2,4; DR B1*0101, B1*1104; DQw B10501, B1*0301; DRw B3*0202) und Spender B (HLA-A2, 29; B7,44; Cw5-; DR13,-; DQw6,-; DRw52,-) wurde von der Blutbank des NIH an PBMC unter Verwendung eines antikörperabhängigen Standard-Mikrocytotoxizitätsassays und einer definierten Gruppe von Anti-HLA-Antiseren oder eines DNA-Assays durchgeführt. Die folgenden HLA-Phänotypen wurden für in dieser Studie verwendete gesunde Spender gefunden.
rV-PSA und rV-PSA-OP
Ein rekombinantes Vakziniavirus, das PSA exprimiert, (rV-PSA) wurde mit den in Hodge et al., 1995, beschriebenen Verfahren erzeugt. Das PSA-Gen wurde als ein komplementärer DNA (cDNA)-Klon von einer humanen Prostatakarzinomzell-cDNA-Bibliothek isoliert. Die PSA-cDNA wurde unter der Kontrolle des Vakzinia-40K-Promotors in die HindIII-M-Region des Genoms des attenuierten Wyeth-Stamm-Vakzinviruses inseriert.
Ein rekombinantes Vakziniavirus, das PSA-OP exprimiert, wurde mit der gleichen Methodologie (Hodge et al., 1995) hergestellt.
Vakziniavirusinfektion von Prostatakarzinomzellen
DU-145-Zielzellen bei einer Konzentration von 1 × 10⁷ pro ml in RPMI-1640-Vollmedium ergänzt mit 0,1% Rinderserumalbumin wurden mit einem gleichen Volumen Vakziniavirus (10 MOI) in dem gleichen Medium bei 37°C 1,5 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 10⁵ Zellen pro ml in Vollmedium mit 10% FBS in eine 24-Well-Kulturschale ausgesät und bei 37°C in 5% CO₂ 24 Stunden kultiviert. Vor ihrer Verwendung als Ziele in Cytotoxizitätsassayexperimenten wurde die bPSA-Produktion des rV-PSA-Vakziniavirus durch ein Radioimmunassaykit, erworben von Tandem Co., evaluiert.
Statistische Analyse
Statistische Analyse von Unterschieden zwischen Mittelwerten wurde mittels eines zweiseitigen gepaarten t-Tests durchgeführt.
Ergebnisse
Zwei T-Zelllinien von verschiedenen normalen Spendern wurden durch in vitro-Stimulation mit PSA-OP etabliert. Die T-Zelllinien waren phänotypisch CD4⁺, CD8⁺ oder CD4⁺/CD8⁺ und CD56^– wie in Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11 Durchflusscytometrische Analyse von Oberflächenmarkern auf T-Zelllinien

Ergebnisse sind ausgedrückt als Prozentwert fluoreszierender Zellen und (x/y) durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Zelle. Markerexpression wurde als negativ (neg) angesehen, wenn sie niedriger als 4% war. Ergebnisse sind als Prozentwert jeder T-Zelllinie, die mit mAbs reaktiv ist, ausgedrückt. Routinemäßig werden 2,0-4,0% der Zellen gefärbt, wenn sie entweder ohne Erst-MAbs oder mit einem Isotyp-verwandten Kontroll-MAb behandelt wurden.

Die humanen CTLs lysierten PSA-OP- sowie PSA-1- oder PSA-3-pulsierte CIR-A2-Zellen wie in Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12 CTL-Aktivität von PSA-OP-spezifischen T-Zelllinien

T/PSA-OP-2 lysierte spezifisch CIR-A2-Zellen, die mit PSA-OP-, PSA-1- und PSA-3-Peptiden gepulst wurden, während die T/PSA-OP-1-Zelllinie CIRA2 nur dann lysierte, wenn sie mit PSA-OP und PSA-3 gepulst wurden. CIRA2-Zellen wurden mit 50 μg/ml PSA-Peptid 3 Stunden gepulst, bevor sie mit ¹¹¹In markiert und als Ziel in einem 18 Stunden-CTL-Cytotoxizitätsassay verwendet wurden. Ergebnisse sind als % spezifische Freisetzung (SD) bei einem E:T-Verhältnis von 25:1 ausgedrückt.
* P<0,02

Die humanen CTLs lysierten ebenfalls PSA⁺ HLA-A2⁺ humane Prostatakrebszellen wie in Tabelle 13 gezeigt.
Tabelle 13 CTL-Aktivität PSA-OP-spezifischer T-Zelllinien gegen HLA-A2001+, PSA produzierende humane Prostatakarzinomzellen

Etablierte CTLs von Spendern 1 & 2 lysieren LNCAP-Prostatakarzinomzellen. 10⁶ LNCAP-Zellen wurden mit ¹¹¹In markiert und als Ziele in einem 18 Stunden-CTL-Cytotoxizitätsassay verwendet.
Ergebnisse sind hier als % spezifische Freisetzung (SD) dargestellt. P<0,016.

Die HLA-A2⁺-DU-145-Prostatakarzinomzelllinie wurde mit Vakziniavirus, das mit dem PSA-Gen oder dem PSA-OP-Gen modifiziert worden war, infiziert. Die mit dem rV-PSA-Vakziniavirus infizierten DU-145-Zellen exprimierten PSA wie in Tabelle 14 gezeigt.
Tabelle 14 PSA-Produktion von DU-145 infiziert mit Wildtyp und rV-PSA-Vakziniavirus

PSA-Produktion der DU-145-Zellen nach rV-PSA-Vakziniavirusinfektion.
DU-145 wurden mit Wildtyp oder rV-PSA-Vakziniavirus (10 MOI) für 4 und 24 Stunden inkubiert, bevor der Überstand geerntet und auf PSA-Produktion mittels IRMA-Detektion-PSA-Kit (Tandem) evaluiert wurde. LNCAP-Prostatakrebskarzinomzellen wurden als Positivkontrollen verwendet, da sie bekanntermaßen große Mengen von PSA in 24 Stunden produzieren. Ergebnisse sind als pg/ml (SD) pro 10⁶ Zellen ausgedrückt.

Die Fähigkeit der humanen PSA-OP-spezifischen T-Lymphozytenzelllinien, die rV-PSA- oder rV-PSA-OP-Vakziniavirus-infizierten DU-145-Prostatazellen zu lysieren, wurde bestimmt. Wie Tabelle 15 zeigt, lysierten die humanen T-Zelllinien rV-PSA-infizierte Ziele sowie rV-PSA-OP-infizierte Ziele.
Tabelle 15 CTL-Aktivität PSA-OP-spezifischer T-Zelllinien gegen die HLA-A2001 + DU-145-Prostatazelllinie, infiziert mit Vakziniavirus, modifiziert mit PSA-Gen und PSA-OP-Minigen

Etablierte CTLs lysierten DU-145-Prostatakrebszellen nach Infektion mit rV-PSA- und rV-PSA-OP-Vakziniavirus. DU-145-Zellen wurden mit Wildtyp- oder das PSA-Gen oder PSA-OP-Minigen tragendem Vakziniavirus (10 MOI) für 24 Stunden inkubiert, bevor sie markiert und mit Effektorzellen inkubiert wurden. Die Fähigkeit der rV-PSA-infizierten Zellen PSA zu produzieren wurde mittels eines Radioimmunassaykits von Tandem evaluiert. Ergebnisse sind hier als % spezifische Freisetzung (SD) ausgedrückt.
* P<0,05.

Die Fähigkeit von PSA-OP, direkt an ein HLA Klasse I-A2-Molekül zu binden, wurde bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle 16 zeigten, dass PSA-OP HLA-A2 nicht band, wie durch die fehlende Hochregulierung der A2-Expression auf 174 CEM-T2-Zellen angezeigt.
Tabelle 16 Bindung von PSA Peptiden an das HLA Klasse I A2001-Molekül

PSA-OP bindet nicht die HLA Klasse I A2001-Moleküle auf der T2-Zelloberfläche.
* vorhergesagte Bindung auf Basis von publizierten Motiven: Pos = positiv, Neg = negativ
# Reaktion von T2-Zellen mit Anti-HLA-A2-mAb, nachdem die Zellen für 24 Stunden mit Kontrollpeptiden und PSA-Peptiden (50 μg/ml/10⁶ Zellen) inkubiert worden waren. PSA [42-51] wurde als Negativkontrollpeptid angesehen, da es unfähig ist, HLA-Klasse I-A2 zu binden, während PSA-1, PSA-3, MTX [58-66] als Positivkontrolle angesehen wurden. Die Ergebnisse sind als relative Fluoreszenz (durchschnittliche Intensität) ausgedrückt und 100 wurde willkürlich als ein Grenzwert für Positivität ausgewählt.

Da gezeigt wurde, dass das 30-mer-PSA-OP-Peptid nicht direkt an HLA-Klasse I-A2-Moleküle bindet, aber cytotoxische T-Zellen stimulierte, PSA⁺-HLA-Klasse I-A2-Ziele zu lysieren, wurden Studien unternommen, um zu bestimmen, ob das 30-mer-PSA-OP-Peptid durch proteolytische Aktivität in kleinere Peptide gespalten wurde, um ihm die Interaktion mit HLA-Klasse I-A2-Molekülen zu ermöglichen.
Die Wirkungen von Protease-Inhibitoren auf CTL-vermitteltes Töten von CIR-A2-Zellen, die mit PSA-OP-Peptid gepulst waren, wurden bestimmt. Die in Tabelle 17 gezeigten Ergebnisse zeigen eine verringerte Cytotoxizität in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass das PSA-OP von Proteasen auf der Zelloberfläche der Zielzellen in kleinere Peptide gespalten wird, die wiederum mit HLA-A2-Molekülen interagieren und als Konsequenz spezifische CTL-Lyse von CIR-A2-Zielzellen induzieren.
Tabelle 17 Wirkungen von Protease-Inhibitoren auf CTL-vermitteltes Töten von CIR-A2-Zellen, die mit PSA-OP-Peptid gepulst waren

Extrazelluläre Carboxypeptidase-Inhibitoren (E64, Captopril und PCI) blockieren die Lyse von CIR-A2-Zellen, die mit PSA-OP-Peptid gepulst waren, durch etablierte CTLs.
Ergebnisse sind als % spezifische Freisetzung (+/– SD) bei 25:1 E:T-Verhältnis ausgedrückt.
* P<0,03.

Vorläuferhäufigkeits-(PF) Studien zeigten, dass PF für PSA-1 allein und PSA-3 allein von Spender zu Spender variierte. Im Gegensatz dazu war die PF für PSA-OP von Spender zu Spender erstaunlich ähnlich wie in Tabelle 18 gezeigt.
Tabelle 18 Vorläuferhäufigkeitsstudie

Für PSA-OP-, PSA-1- und PSA-3-Peptide spezifische CTL-Vorläufer sind in PBLs, die von männlichen HLA-A2001⁺-Spendern nach zwei Stimulationszyklen mit PSA-Peptiden isoliert wurden, vorhanden. Cytotoxische Effekte der Vorläufer wurden gegen CIRA2, die drei Stunden mit entsprechenden PSA-Peptiden in Anwesenheit von kaltem K562 (10000/Well) gepulst worden waren, evaluiert.

PSA-OP als ein Immunogen bietet demnach eindeutige Vorteile gegenüber der Verwendung von PSA-1 alleine oder PSA-3 alleine beim Auslösen gleichmäßiger cytotoxischer T-Lymphozytenzahlen von Individuum zu Individuum. Darüber hinaus umfasst PSA-OP mehr als eine Epitop-Peptidsequenz, die dem Konsensusmotiv für eine Vielzahl von HLA-Klasse I-Molekültypen einschließlich HLA-A2, A3, A11, Aw68 und B53 entsprechen kann. HLA-A2 ist bei ungefähr 50% nordamerikanischer Kaukasier und 34% der Afroamerikaner vorhanden. HLA-A3 ist bei 26 und 17% der nordamerikanischen Kaukasier bzw. Afroamerikaner vorhanden. HLA-A11 ist bei 40% der asiatischen Bevölkerung vorhanden und HLA-B53 ist bei 22% der Afroamerikaner vorhanden. Folglich kann PSA-OP als ein Immunogen zur Auslösung PSA-spe zifischer Immunantworten in einem breiten Ausschnitt der menschlichen Bevölkerung nützlich sein.
Beispiel V
Dendritische Zellen infiziert mit rV-PSA-OP zur Erzeugung von (PSA spezifischen cytotoxischen T-Zelllinien
Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ist eine Serinprotease und Mitglied der Kallikrein-Genfamilie. PSA, exprimiert in einer Mehrheit der Prostatakrebsfälle, ist ein potentielles Ziel für spezifische Immuntherapie. Die vorstehend offenbarten Studien haben gezeigt, dass drei Peptide (PSA-1: FLPTKKLQCV, PSA-3: VISNDVCAQV und PSA-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP): FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK) sowohl in normalen Spendern als auch in Patienten mit Prostatakrebs CTL-Antworten auslösen können. Die Fähigkeit dendritischer Zellen (DCs), die mit rV-PSA (rekombinantes PSA-Vakziniakonstrukt) oder rV-PSA-OP (rekombinantes PSA-OP-Vakziniakonstrukt) infiziert sind, die in vitro-Bildung autologer PSA-spezifischer CTLs zu fördern, wurde untersucht. Dendritische Zellen wurden von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) durch Kultivierung in vitro für 5-7 Tage in Medium, das GM-CSF und IL-4 enthielt, expandiert. Zwei cytotoxische T-Zelllinien wurden von einem normalen HLA-A2-Spender in drei in vitro-Stimulationszyklen (IVS) (im Gegensatz zu 6 bis 7 IVS, wenn autologe PBMCs als Antigen-präsentierende Zellen verwendet wurden) etabliert. Die Spezifität dieser T-Zelllinien wurde durch Cytotoxizitätsassays unter Verwendung von PSA-Peptid-gepulsten CIR-A2-Zellen, CIR-A2-Zellen, die mit rV-PSA oder rV-PSA-OP infiziert waren, sowie LNCAP-Zellen bestimmt. Sie lysierten PSA-1-, PSA-3- oder PSA-OP-gepulste CIR-A2-Zellen und PSA-positive, HLA-A2-positive Prostatakrebszellen. Diese CTLs lysierten ebenfalls rV-PSA- und rV-PSA-OP-infizierte Zielzellen. Die Spezifität der Lyse wurde durch die Unfähigkeit der CTL, PSA-negative Karzinomziele zu lysieren, die Blockade der Lyse mit Anti-HLA-A2-Antikörpern und die Unfähigkeit des kalten K562-Ziels, die Lyse zu inhibieren, definiert. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal (a) die Fähigkeit, CTL-Antwort auf definierte PSA-Epitope unter Verwendung von rV-PSA- und rV-PSA-OP-infizierten DCs zu erzeugen; (b) die Fähigkeit von LNCAP-Zellen, PSA endogen zu prozessieren, um Peptid im Zusammenhang mit dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) für CTL-Lyse zu präsentieren; und (c) die Fähigkeit von DCs, rV-PSA und rV-PSA-OP endogen zu prozessieren, um spezifische PSA-Peptide im Zusammenhang mit MHC für T-Zell-vermittelte Lyse zu präsentieren.
Beispiel VI
Prozessierung und Präsentation von PSA-OP von sowohl HLA-A2+ als auch HLA-A3+-Konsensusmotiven
Das humane HLA-Klasse I-A2-Konsensusmotiv ist in etwa 50% der US-Bevölkerung repräsentiert. Das HLA-Klasse I-A3 repräsentiert weitere 25% der Bevölkerung. Ein PSA-Peptid, das beide dieser HLA-Klasse I-Motive anvisiert, bietet ein einzigartiges immuntherapeutisches Werkzeug.
Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigten die Nützlichkeit des PSA-OP-Peptids bei der Etablierung cytotoxischer T-Zelllinien von HLA-A2+-Spendern.
Die beiliegende Tabelle zeigt die Sequenzdaten für Antigen-spezifische PSA-Peptide, PSA-1, PSA-3, PSA-9 und das PSA-OP-Peptid (das alle der kürzeren Peptidsequenzen enthält). Die PSA-1- und PSA-3-Peptide sind Klasse I-A2-restringiert, während das PSA-9-Peptid Klasse I-A3-restringiert ist. PSA-Peptide, PSA-9 und PSA-OP wurden verwendet, um CTL-Linien von zwei HLA-A3+-Spendern zu etablieren. Diese Ziellinien lysierten HLA-A3+-Zielzellen.
Tabelle 19 Oligo-Epitop-Peptid von PSA
Demnach wurde für das PSA-OP-Peptid, ein 30-mer-Peptid, gezeigt, dass es prozessiert und im Zusammenhang mit sowohl HLA-A2+- als auch HLA-A3+-Konsensusmotiven präsentiert wird, um PSA-Antigen-spezifische CTL zu erzeugen. Daher hat das PSA-OP-Peptid das Potential in ungefähr 75% der Bevölkerung zur Peptid-basierten spezifischen Immuntherapie von Prostatakrebs verwendet zu werden.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid, das Wiederholungseinheiten von mehr als einem isolierten Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Peptid-Analoga davon umfasst, wobei das Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Peptid-Analogon etwa 8 bis etwa 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren von mehr als einer Aminosäuresequenz FLTPKKLQCV (SEQ ID NO:1), VISNDVCAQV (SEQ ID NO:2), QVHPQKVTK (SEQ ID NO:3), FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEQ ID NO:4) oder KLQCVDLHV (SEQ ID NO:9) umfasst, wobei die mehr als einen isolierten Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptide oder Peptid-Analoga davon direkt miteinander über eine Aminosäurelinkersequenz verbunden sind und wobei das isolierte Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP) eine Prostata-spezifisches Antigen-Immunreaktion in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA Klasse I-Molekültyp erzeugt, wobei die Immunreaktion mindestens die Erzeugung von PSA-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten umfasst.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 1, wobei jedes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid die gleichen oder verschiedene HLA Klasse I-Molekültypen bindet.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 1, wobei nach Spaltung von PSA-OP, um PSA-OP-Spaltungsfragmente zu erzeugen, die PSA-OP-Spaltungsfragmente an einen oder mehrere HLA-Klasse I-Molekültypen binden.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 3, wobei die PSA-OP-Spaltungsfragmente durch mindestens eine Protease erzeugt werden.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP) gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die PSA-OP-Spaltungsfragmente an einen oder mehrere HLA-Klasse I-Molekültypen binden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 und HLA-B53.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, das ein erstes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA1): FLTPKKLQCV (SEQ ID NO:1) oder ein Analogon davon und ein zweites Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA3): VISNDVCAQV (SEQ ID NO:2) oder ein Analogon davon umfasst.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 6, wobei PSA1 und PSA3 direkt miteinander durch eine Linker-Aminosäuresequenz verbunden sind, wobei die Linkersequenz etwa 1 bis etwa 10 Aminosäuren umfasst.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 6, das ferner ein drittes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Analogon davon umfasst, das mit dem zweiten Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Analogon verbunden ist.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend:
oder ein Analogon davon.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 9, das eine Substitution von Valin oder Tyrosin an einer oder mehreren Positionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 148, 149, 160, 161, oder eine Substitution von Tyrosin an Position 154 umfasst, oder wobei das Analogon aus einer Aminosäuredeletion an einer oder mehreren Positionen in SEQ ID NO:4 besteht, wobei die Positionen für eine Deletion ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 151, 152 und 153.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 7, wobei die Linker-Aminosäuresequenz aus Asp-Leu-His besteht.
Isoliertes Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid, das mehr als ein Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid oder Peptid-Analogon davon umfasst, die direkt durch eine Peptidbindung oder durch eine Linker-Aminosäuresequenz von 1 bis 10 Aminosäuren miteinander verbunden sind, wobei das PSA-OP eine Prostata-spezifische Reaktion erzeugt und ein erstes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA1): FLTPKKLQCV (SEQ ID NO:1) oder ein erstes Analogon davon, wobei das erste Analogon eine Substitution von Valin anstelle von Glutamin, Cystein oder Glutamin und Cystein aufweist, und ein zweites Prostata-spezifisches Antigen-Epitop-Peptid (PSA3): VISNDVCAQV (SEQ ID NO:2) oder ein zweites Analogon davon, wobei das zweite Analogon eine Substitution von Valin anstelle von Cystein oder eine Substitution von Tyrosin anstelle des ersten Valins aufweist, und gegebenenfalls ein drittes Prostata-spezifisches Antigen-Epitop mit der Aminosäuresequenz QVHPQKVTK (SEQ ID NO:3) umfasst.
Prostata-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP), das eine Aminosäuresequenz auf der Basis von:
umfasst, wobei Valin anstelle eines Aminosäurerests an einer oder mehreren Positionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Position 148, Position 149, Position 160 und Position 161, substituiert ist, oder mindestens eine der Aminosäuren an den Positionen 151, 152 oder 153 deletiert ist und wobei das PSA-OP eine Prostata-spezifisches Antigen-Immunreaktion in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp erzeugt.
Prostata-Oligo-Epitop-Peptid (PSA-OP), das aus der Aminosäuresequenz:
besteht.
Zusammensetzung, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 und mindestens ein HLA-Klasse I-Molekül oder eine Zelle, die mindestens ein HLA-Klasse I-Molekül exprimiert, umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das HLA-Klasse I-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 und HLA-B53.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Exzipienz umfasst.
Isolierte Prostata-spezifisches Antigen-DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 kodiert.
Isolierte Prostata-spezifisches Antigen-DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 6 kodiert.
Plasmid oder Virusvektor, das/der die Prostata-spezifisches Antigen-DNA-Sequenz gemäß Anspruch 18 oder 19 umfasst.
Virusvektor, der die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:14 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 20 oder 21, wobei der Vektor ein E. coli-Plasmid, ein Listeria-Vektor, ein Orthopox-Virus, Avipox-Virus, Capripox-Virus, Suipox-Virus, Vaccinia-Virus, Baculovirus, humanes Adenovirus, SV40 oder Rinderpapillom ist.
Wirtszelle, die ein Plasmid oder einen Virusvektor gemäß Anspruch 20, 21 oder 22 umfasst, wobei die Wirtszelle das Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid exprimiert.
Wirtszelle gemäß Anspruch 23, wobei die Wirtszelle Spaltungsfragmente des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids bindet.
Wirtszelle gemäß Anspruch 24, wobei die Spaltungsfragmente durch eine Protease erzeugt werden.
Zelle gemäß Anspruch 24, wobei die Wirtszelle ferner einen HLA-Klasse I-Molekültyp exprimiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 und HLA-B53.
Wirtszelle gemäß Anspruch 24, wobei die Wirtszelle HLA-A2 oder HLA-A3 oder HLA-A2 und HLA-A3 exprimiert.
Wirtszelle gemäß Anspruch 24, wobei die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 28, wobei die Wirtszelle eine dendritische Zelle ist.
Rekombinantes Virus, das ein Virus umfasst, in das eine isolierte Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-DNA-Sequenz, die für ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 kodiert, inseriert ist, wobei das rekombinante Virus die Expression des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids oder von Fragmenten davon in einer Wirtszelle bewirkt.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 30, das ein Virus umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Orthopox-Virus, Avipox-Virus, Capripox-Virus, Suipox-Virus, Vaccinia-Virus, Baculovirus, DNA-Plasmid, humanem Adenovirus, SV40 und Rinderpapillom, wobei das rekombinante Virus die Expression des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids oder von Fragmenten davon auf der Oberfläche von Wirtszellen bewirkt, die damit infiziert sind, und die infizierten Wirtszellen eine Immunreaktion gegen PSA, Zellen, die PSA exprimieren, Zellen, die ein Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid exprimieren, oder Zellen, die Spaltungsfragmente des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids binden, erzeugen.
Rekombinantes Virus nach Anspruch 30 oder 31, das ferner eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein immunverstärkendes Molekül kodiert, wobei das Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Influenza-Peptid, Tetanus-Toxoid, Tetanus-Toxoid-CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A und Poly-L-Lysin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das rekombinante Virus gemäß Anspruch 30, 31 oder 32 und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Exzipienz und gegebenenfalls ein biologisches Reaktions-Modifizierungsmittel umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-12 (IL-12), Interferon, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF), Cyclophosphamid und Kombinationen davon.
Verwendung des rekombinanten Virus gemäß Anspruch 30, 31 oder 32 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulierung des Immun systems eines Säugers gegen Prostata-spezifisches Antigen zum Zweck der Vermeidung des Etablierens und Wachstums von PSA-positiven Karzinomzellen.
Verwendung gemäß Anspruch 34, wobei das rekombinante Virus Vaccinia-Virus des NYC-Stamms oder v-WR-Stamms ist.
Verwendung gemäß Anspruch 35, wobei das Vaccinia-Virus mit einem attenuierten humanen Vaccinia-Virus-Stamm rekombiniert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 34, 35 oder 36, wobei das rekombinante Virus mit einem Adjuvanz oder einem biologischen Reaktions-Modifizierungsmittel kombiniert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-12, Interferon, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), (GM-CSF) und Cyclophosphamid.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 für eine Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen oder Abtöten PSA-positiver Tumorzellen, wobei das Verfahren umfasst: A) Erzeugen PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten in vitro durch Stimulieren von Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen, wobei die Menge wirksam zur Erzeugung PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten ist, und B) adoptiver Transfer der PSA-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten alleine oder in Kombination mit dem Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid in einen Säuger in einer Menge, die ausreichend ist, um die PSA-positiven Tumorzellen zu hemmen oder abzutöten.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen oder Abtöten PSA-positiver Tumorzellen in einem Säuger, wobei das Verfahren umfasst: A) Erzeugen PSA-spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten in vitro durch Verabreichen einer wirksamen Menge des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids alleine oder in Kombination mit einem Adjuvanz oder Liposomen und B) Hemmen oder Abtöten PSA-positiver Tumorzellen in dem Säuger durch die so erzeugten PSA-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß Anspruch 39, wobei das in dem Verfahren verwendete Adjuvanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus RIBI Detox, QS21, Alaun und unvollständigem Freund'schem Adjuvanz.
Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 für eine Verwendung in einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunreaktion gegenüber Prostata-spezifischem Antigen in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp, wobei das Verfahren umfasst: Verabreichen einer wirksamen Menge des Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids alleine oder in Kombination mit einem Adjuvanz oder Peptid-gepulsten, Antigen-präsentierenden Zellen, wobei die Menge ausreichend ist, um eine PSA-spezifische Immunreaktion in einer menschlichen Population mit mehr als einem HLA-Klasse I-Molekültyp zu erzeugen.
Verwendung eines Prostata-spezifisches Antigen-Oligo-Epitop-Peptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht zur Herstellung eines Medikaments für eine Stimulierung des Immunsystems eines Säugers gegen Prostata-spezifisches Antigen zum Zweck des Verhinderns eines Etablierens und Wachstums von PSA-positiven Karzinomzellen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, die ferner ein Adjuvanz, Liposomen, Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-12, Interferon, Tumor-Nekrose-Faktor, GM-CSF, Cyclophosphamid oder eine Kombination davon umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, die ferner ein Helferpeptid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Influenza-Peptid, Tetanus-Toxoid, Tetanus-Toxoid-CD4-Epitop, Pseudomonas-Exotoxin A und Poly-L-Lysin.