DE60224257T2

DE60224257T2 - Retinolderivate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE60224257T2
Application number: DE60224257T
Authority: DE
Inventors: Young-Soy Dongshin Apt. 3-1008 747 ROH; Soo-Jong Lotte Apt. 135-1001 UM; Min-Sook Kwangjin Mokwha Apt. 5-312 JEONG; Joo-Dong Hyundae Apt. 722-1101 LEE; Hee-Chang Mokdong Apt. 523-204 913 RYOO; Jeong-Kuan Sangil Apt. 101-107 343-1 SON; Hyo-Jung Daerim Apt. 11-713 64-20 KIM; Hyuk Kunyung Apt. 201-701 1875-5 KIM; Sung-Won Jung; Hye-Sook Han; Si-Ho Songcheon Jukong Apt. 115-120 PARK; Seong-Ho Pyungwha Jukong Apt. 103-2 KIM
Original assignee: Enprani Co Ltd
Current assignee: Enprani Co Ltd
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2002-01-15
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2022-01-16
Also published as: US7173062B2; US20040062781A1; DE60224257D1; ATE381920T1; JP4028800B2; EP1351919A4; EP1351919A1; KR20020061167A; KR100503631B1; JP2004523525A; WO2002057212A1; EP1351919B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Retinylretionat der folgenden Formel (1):
in einer kosmetischen Zusammensetzung, die die Verbindung der Formel (1) als einen aktiven Bestandteil umfasst.
Stand der Technik
Das Phänomen des Alterns wird gravierender, da die Menschen älter werden. Insbesondere im Fall der Haut ist die Veränderung deutlich. Die Hauptphänomene des Alters der Haut sind die Zunahme von Falten, der Dicke, der Unelastizität, der Trockenheit, der Rauhigkeit, Flecken etc., die dahingehend verstanden werden, dass sie mit der Sonnenexposition über einen langen Zeitraum verbunden sind. Solche Phänomene durch das Sonnenlicht werden als Photoalterung bezeichnet und durch Änderungen der Epidermis und Dermis aufgrund des Sonnenlichts verursacht.
Es wurde berichtet, dass die Photoalterung der Haut verhindert werden kann, wenn eine Creme, die Tretionin (all-trans Retinolsäure), Retinol und Derivate davon, AHA etc. enthält, auf die Haut aufgetragen werden, wie es z. B. in B. A. Gilchrist et al., „Treatment of photodamage with tropical tretionin: An overview", JOURNAL OF THE AMERICAN ACADEMY OF DERMATOLOGY, Bd. 36, Nr. 3, März 1997, Seiten S27–S36, und Kang et al. „Phhotoaging therapy with topical tretinoin: an evidence-based alnalysis" JOURNAL OF THE AMERICAN ACADEMY OF DERMATOLOGY, Bd. 39, Nr. 2, August 1998, Seiten S55–S61) beschrieben wurde. Da jedoch Tretinoin fettlöslich ist, besitzt es nur eine geringe Absorptionsfähigkeit und ist auch im lebenden Körper instabil, reizt die Haut und kann einige Nebeneffekte, wie Hauttrockenheit, Wunden, Kratzen etc. verursachen, während der Latenzperiode. Es gibt daher viele Probleme bei der Verwendung von Tretionin als Hauptkomponente für Arzneimittel und Kosmetika (vgl. USP 4,677,120 ). Auf der anderen Seite kann Vitamin A, Retinol, kaum verwendet werden, da es durch Licht, Sauerstoff, Wärme, Lipidperoxidation oder Wasser instabil wird. Daher müssen, wenn Retinol verwendet wird, zusätzliche Kosten für die Stabilisierung durch Antioxidantien, wie BHT, Di-α-Tocopherol, BHA, Ascorbinsäure, Tocoperhyllinolat etc. oder durch die Übernahme einiger Mittel, wie Liposome oder Kapeseln zur Verhinderung äußerer Effekte gezahlt werden (vgl. USP 6,221,927 und 5,744,148 ). Wegen der vorstehenden erklärten Gründe wurden Derivate davon mit verbesserter Stabilität entwickelt. Jedoch sind die bisher entwickelten Derivate noch immer so instabil, wenn sie Licht ausgesetzt werden, dass sie von einer kristallinen Substanz in eine viskose in kurzer Zeit umgewandelt und unter Farbänderung und Bildung von Peroxiden zersetzt werden. Im Ergebnis können toxische Substanzen gebildet werden, die zu unerwünschten Nebenwirkungen führen können, die deren Verwendung beschränken (vgl. USP 6,183,774 ). Inzwischen wurde berichtet, dass AHAs eine hervorragende Stabilität für Vitamin A aufweisen und die Kollagen-Synthese erleichtern. Die Mechanismen einer solchen Wirkung wurden jedoch noch nicht genau herausgefunden, und somit wird es wegen einer Hautirritation, die pH-abhängig ist, eingeschränkt verwendet (vgl. USP 6,143,309 , USP 6,022,896 und USP 5,962,015 ).
Deshalb ist es dringend erforderlich, ein Material zu entwickeln, das nicht nur die gleiche Aktivität für die Verhinderung des Hautalterung wie Vitamin A, sondern auch die nicht-reizende Eigenschaft und Stabilität aufweist ( USP 6,180,670 und USP 5,863,942 ).
Beschreibung der Erfindung
Als Ergebnis haben die Erfinder ein neues Retinylretionat der obigen Formel (1) durch Kondensieren von Vitamin A (Retinol) und Retinolsäure entwickelt, von denen jedes selbst einen guten Effekt als Antifalten-Mittel aufweist, und dann die Erfindung vervollständigt. Die Verbindung der Formel (1), die in der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde, wurde dahingehend identifiziert, dass sie eine bessere chemische Stabilität, geringere Eigenschaften der Hautreizung und eine höhere Hautregenerationsaktivität als das frühere Retinol oder Retinolsäure aufweist.
Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Retinylretionat der Formel (1) bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Kosmetische Zusammensetzung zur Verhinderung der Hautalterung bereitzustellen, die die Verbindung der Formel (1) als aktiven Bestandteil enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Zelltoxizität der Verbindung der Formel (1) gemäß der Erfindung dar, verglichen mit den Referenzmaterialien Retinolsäure, Retinol, Retinolpalmitat, Retinolsäure ethoxyliertes Retinamid und Retinolanhydrid.
2 stellt die Rate der Zunahme der Kollagensynthese durch die Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung dar, verglichen mit der Referenzmaterialien Retinolsäure, Retinol, Retinolpalmitat, Retinolsäure polyethoxyliertes Retinamid und Retinolanhydrid (hier bedeutet R-OR das Retinylretionat der Formel (1) der vorliegenden Erfindung; R-A bedeutet Retinolsäure; R-A-PEG bedeutet Retinolsäure polyethoxyliertes Retinamid; R-OH bedeutet Retinol; R-OH-Pal bedeutet Retinolpalmitat und ROR bedeutet Retinolanhydrid der Formel (2b)).
Beste Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Retinylretionate der folgenden Formel (1):
Das 13-trans-Retinylretionat der Formel (1) der vorliegenden Erfindung reizt die Haut nicht, zeigt eine verbesserte Aktivität für die Kollagensynthese und weist auch eine hohe Stabilität gegenüber Licht (UV-Licht) oder Wärme (hohe Temperatur von 40°C oder mehr) auf.
Die Verbindung der Formel (1) kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass

(a) eine Verbindung der folgenden Formel (2a):
mit einer Verbindung der folgenden Formel (3a)
in einem Lösungsmittel und in Gegenwart eines Kondensationsmittels und eines Katalysators umgesetzt wird,
(b) eine Verbindung der folgenden Formel (2b):
mit der Verbindung der Formel (3a) in einem Lösungsmittel und in Gegenwart eines organischen Aminkatalysators umgesetzt wird, oder
(c) eine Verbindung der folgenden Formel (2c):
in der X für ein Halogen, p-Tololsulfonyl oder Methansulfonyl steht, mit der Verbindung der Formel (3a) in einem Lösungsmittel in Gegenwart eines organischen Aminkatalysators umgesetzt wird.

Die vorstehenden Verfahren werden detaillierter nachfolgend beschrieben.
Das Kondensationsmittel in Verfahren (a) ist N,N-Carbonyldiimidazol (CDI), N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Ethylchlorformat, und der Katalysator, der zur Erleichterung der Kondensationsreaktion verwendet wird, ist vorzugsweise N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT). Ferner können als Reaktionslösungsmittel wasserfreie organische Lösungsmittel bevorzugt verwendet werden, wie eines oder mehrere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dichlormethan, Benzol, Toluol, Tetrahydrofuran und Diethylether. Die Reaktion wird dann typischerweise unter einer Stickstoffatmosphäre, unter der Bedingung, dass Licht und Feuchtigkeit abgehalten werden, und der Bedingung, dass gekühlt bis erwärmt wird, durchgeführt.
In den Verfahren (b) und (c) können als organische Aminkatalysatoren vorzugsweise die in der Kondensationsreaktion des Verfahrens (a) und Pyridin oder Triethylamin genannt werden. Die Arten der benutzbaren Lösungsmittel und Reaktionsbedingungen sind die gleichen, wie sie für das Verfahren (a) erläutert wurden.
Jedoch sind die Arten der Basen, des Kondensationsmittels, Katalysators und Lösungsmittels, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, nicht auf die vorstehend veranschaulichten beschränkt, sondern jedes kann verwendet werden, das die Reaktion nicht negativ beeinflusst und üblicherweise auf dem Gebiet bekannt ist, zu dem die vorliegende Erfindung gehört. Weiterhin kann die Verbindung der Formel (1), die durch die vorstehend erläuterten Verfahren hergestellt wurde, durch herkömmliche Trenn- oder Reinigungsverfahren, wie Umkristallisation oder Säulenchromatographie, weiter gereinigt werden.
Die Verbindung der Formel (3a), die als Ausgangsmaterial in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann leicht aus einer Verbindung der Formel (3b):
unter Bezugnahme auf ein bekanntes Verfahren (vgl. US-Patent 5,863,942 ; J. Am. Chem. Soc., 94, 8613 (1972)) hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (2b) ist ein nützliches Intermediat zur Herstellung der Verbindung der Formel (1) und kann auch als aktiver Bestandteil für die kosmetische Zusammensetzung zur Verminderung der Hautalterung verwendet werden, da es selbst einen Effekt hinsichtlich der Verminderung der Hautalterung zeigt.
Wie vorstehend erklärt wurde reizt die Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung die Haut nicht und zeigt eine verbesserte Aktivität hinsichtlich der Kollagensynthese sowie eine hervorragende Stabilität gegenüber Licht (UV-Licht) oder Wärme (hohe Temperatur von 40°C oder mehr). Somit kann sie wirksam als funktionelles Material in Kosmetika zur Verminderung der Hautalterung oder für Arzneimittel für die Behandlung oder Vorbeugung von Hautproblemen eingesetzt werden, einschließlich Akne, Psoriasis etc. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine kosmetische Zusammensetzung bereit, die einer Verbindung der Formel (1) als aktiven Bestanteil umfasst.
Insbesondere kann die Verbindung der Formel (1) zum Zweck der Verhinderung oder Verbesserung der Hautalterung verwendet werden, einschließlich Falten, Flecken etc. die durch Hautkrebs oder Hautprobleme, wie Akne, Psoriasis etc. verursacht werden. Da insbesondere die Verbindung der Formel (1) eine niedrige effektive Konzentration aufweist, kann sie den Effekt bei einer niedrigen Konzentration maximieren. Weiterhin zeigt sie eine hervorragende Stabilität gegenüber der Haut aufgrund einer extrem geringen Zelltoxizität, und sie hat die Charakterisik, dass sie vorteilhaft als Additive für Kosmetika und Arzneimittel aufgrund der Photostabilität und der Phasenstabilität unter schweren und fördernder Bedingungen verwendet wird.
Experimente, die die physiologische Aktivität der Verbindung der Formel (1) zeigen, können wie folgt durchgeführt werden. Die Zelltoxizität der Verbindung der Formel (1) wird bei Konzentrationen im Bereich von 10^–6 bis 10^–3% (Gew./Vol.) unter Verwendung normaler humaner Fibroplasten (Newborn) untersucht, und die hautschädigenden Eigenschaft wird durch ein Testpflaster für die Haut eines normalen Erwachsenen untersucht. Weiterhin wird der Effekt der Zunahme der Kollagensynthese in einer humanen Fibroplastenzelle gemessen, um den Zellregenerationseffekt der Verbindung der Formel (1) gemessen, die Photostabilität wird durch Messen des ¹H NMR der Verbindung der Formel (1) nachdem die Verbindung mit UV-Licht (356 nm) in bestimmten Zeitintervallen bestrahlt wurde bestimmt, und die thermische Stabilität wird durch Quantifizieren der Menge bei 40°C identifiziert (Experimente 1 bis 5).
Als Ergebnis der obigen Experimente wurde die Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung als weniger toxisch gegenüber Zellen als Retinol, Retinolsäure oder andere Retinolderivate bestimmt, von denen jedes als kommerziell verfügbarer Bestandteil für Arzneimittel und Kosmetika für die Verhinderung der Hautalterung, als stabiler gegenüber der humanen Haut als die anderen Retinolanaloga, als effektiv zur Erhöhung der Kollagensynthese bei geringen Konzentrationen und als langfristig stabil gegenüber Licht oder Wärme, anders als die früheren Retinolderivate, identifiziert. Es wurde somit bestätigt, dass die Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft und herkömmlich als eine aktiver Bestandteil für Arzneimittel und Kosmetika in einer solchen Form wie Cremes, Lotionen, Essenzen, Salben, Gele etc. zur Verhinderung der Hautalterung eingesetzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird genauer in den folgenden Beispielen und Experimenten erklärt werden. Es soll jedoch verstanden werden, dass die folgenden Beispiele und Experimente dazu gedacht sind, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, aber in keiner Weise den Schutzbereich zu beschränken.
Herstellung 1: Herstellung des Retinols der Formel (3a)
Kaliumcarbonat (1,52 g, 0,011 mol) wurde zu Retinolacetat (1,20 g, 0,0036 mol, Roche Co.) gegeben, das in absolutm Methanol (30 ml) aufgelöst war, und das Gemisch wurde langsam während 7 Stunden bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre und unter Bedingungen des Licht- und Feuchtikeitsausschlusses gerührt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Silicagel 60 für cc part, Merk Co., Maschengröße 270–400, Hexan/Ethylacetat = 4/1 Vol/Vol), um 1,01 g (Ausbeute 96%) der schwach gelben Titelverbindung zu ergeben.
Beispiel 1: Herstellung von Retinylretionat der Formel (1)
Retinolsäure (1,26 g, 0,0042 mol, BASF Co.), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,87 g, 0,0042 mol) und eine katalytische Menge Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden zu Retinol (1,00 g, 0,0035 mol), die in wasserfreiem Dichlormethan (50 ml) gelöst waren, bei 0°C zugegeben. Die Reaktionslösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und während 12 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre und unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluss erwärmt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie (Silicagel 60 für cc part Merk Co. Maschengröße 270–400, Hexan/Diethylether = 19/1 Vol/Vol) gereinigt, um 1,55 g (Ausbeute 78%) der schwach gelben Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.03 (dd, 1H, J = 26.4 Hz, 11.4 Hz, C₂₀H), 6.67 (dd, 1H, J = 26.4 Hz, 11.4 Hz, C₁₁H), 6.34 (d, 2H, J = 2.1 Hz, C₁₉H, C₁₂H), 6.29 (d, 2H, J = 2.1 Hz, C₇H, C₂₄H), 6.18 (d, 2H, J = 9.9 Hz, C₂₃H, C₈H), 6.12 (d, 2H, J = 10.2 Hz, C₁₀H, C₂₁H), 5.82 (s, 1H, C₁₇H), 5.69 (t, 1H, J = 7.2 Hz, C₁₄H), 4.81 (d, 2H, J = 6.9 Hz, C₁₅H₂), 2.39 (s, 3H, C₁₈CH₃), 2.05 (t, 4H, J = 5.1 Hz, C₄H₂, C₂₇H₂), 2.03 (s, 3H, C₁₃CH₃), 1.99 (s, 3H, C₂₂CH₃), 1.94 (s, 3H, C₉CH₃), 1.74 (s, 6H, C₅CH₃, C₂₆CH₃), 1.65 (m, 4H, C₃H₂, C₂₈H₂), 1.50 (m, 4H, C₂H₂, C₂₉H₂), 1.06 (s, 12H, Cl(CH₃)₂, C₃₀(CH₃)₂)
Herstellung 2: Herstellung von Retinolanhydrid der Formel (2b)
Retinolsäure (1,00 g, 0,0033 mol, BASF Co.), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,75 g, 0,0036 mol) und eine katalytische Menge von Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden zu Retinolsäure (1,00 g, 0,0033 mol, BASF Co.), die in wasserfreiem Dichlormethan (50 ml) gelöst waren, bei 0°C zugegeben. Die Reaktionslösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und während 3 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre und unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluss erwärmt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie (Silicagel 60 für cc part Merk Co. Maschengröße 270–400, Hexan/Diethylether = 19/1 Vol/Vol) gereinigt, um 1,58 g (Ausbeute 82%) der schwach gelben Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.10 (dd, 2H, J = 13.4 Hz, 11.4 Hz, C₁₁H, C₂₀H), 6.32 (d, 2H, J = 16.2 Hz, C₁₉H, C₁₂H), 6.31 (d, 2H, J = 14.7 Hz, C₁₀H, C₂₁H), 6.18 (d, 2H, J = 0.1 Hz, C₂₃H, C₈H), 6.13 (d, 2H, J = 4.5 Hz, C₇H, C₂₄H), 5.78 (s, 2H, C₁₇H, C₁₄H), 2.40 (s, 6H, C₁₈CH₃, C₁₃CH₃), 2.04 (m, 4H, C₄H₂, C₂₇H₂), 2.02 (s, 6H, C₂₂CH₃, C₉CH₃), 1.72 (s, 6H, C₅CH₃, C₂₆CH₃), 1.62 (m, 4H, C₃H₂, C₂₈H₂), 1.47 (m, 4H, C₂H₂, C₂₉H₂) 1.03 (s, 12H, C₁(CH₃)₂, C₃₀(CH₃)₂)
Beispiel 2: Herstellung von Retinylretionat der Formel (1)
Retinolanhydrid (1,00 g, 0,0017 mol), und Triethylamin (0,31 g, 0,0021 mol) wurden zu Retinol (0,60 g, 0,0021 mol), die in wasserfreiem Dichlormethan (30 ml) gelöst waren, bei 0°C zugegeben. Die Reaktionslösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und während 5 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre und unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluss erwärmt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie (Silicagel 60 für cc part Merk Co. Maschengröße 270–400, Hexan/Diethylether = 9/1 Vol/Vol) gereinigt, um 0,91 g (Ausbeute 92%) der schwach gelben Titelverbindung zu ergeben. Die ¹H-NMR-Daten waren die gleichen wie die des Beispiels 1.
Beispiel 3: Herstellung des Retinylretionats der Formel (1)
Retinolsäure (1,00 g, 0,0033 mol) wurden in wasserfreiem Toluol (10 ml) aufgelöst und Phosphortrichlorid (PCl₃) (0,46 g, 0,0033 mol) wurden tropfenweise dazu gegeben. Das Gemisch wurde während 15 Stunden bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre und unter Ausschluss von Licht und Feuchtigkeit gerührt. Die so erhaltene Retinolchloridlösung wurde tropfenweise zusammen mit dem in Herstellung 1 hergestellten Retinol (0,95 g, 0,0033 mol) und Triethylamin (0,61 g, 0,0041 mol) zu wasserfreiem Methylenchlorid (30 ml) während 20 Minuten bei 0°C zugegeben. Die Reaktionslösung wurde dann während 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde zu einer gesättigten wässrigen Natriumchlorid-Lösung (30 ml) zugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatografie (Silicagel 60 für cc part, Merk Co., Maschengröße 270–400, Hexan/Diethylether = 9/1 Vol/Vol) gereinigt, um 1,54 g (Ausbeute 82%) der schwach gelben Titelverbindung zu ergeben. Die ¹H-NMR-Daten dieser Verbindung waren die gleichen wie die in Beispiel 1.
Experiment 1: Zelltoxizitätstest
Um die primäre Stabilität als Material für Arzneimittel und Kosmetika zu untersuchen, wurde die Zelltoxizität von Retinylretionat der Formel (1) nach der MTT-Methode bestimmt (vgl. Mossman T., Rapid colorimetric assay for cellular growth & amp; survival: applification to proliferation & amp; cytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods 65, 55–63, 1983), wobei normale Fibroplasten (Newborn) verwendet wurden und die Ergebnisse in 1 dargestellt sind.
Wie den Ergebnissen der 1 entnommen werden kann, zeigt die Verbindung der Formel (1) der vorliegenden Erfindung eine ähnliche Zelltoxizität gegenüber Retinolpalmitat, aber sie weist einer geringere Intrazelltoxizität als Retinol, Retinolsäure oder Derivate davon auf.
Experiment 2: Test bezüglich der hautreizende Eigenschaft
Um die Hautreizung der Verbindung der Formel (1) zu untersuchen, wurde ein Pflastertest für die Haut normaler Erwachsener durchgeführt. Als Träger wurde Caprylcaprylictriglycerid oder die herkömmliche O/W-Formulierung verwendet, und zwanzig (20) Erwachsene wurden pro Gruppe für 24 Stunden getestet.
Die herkömmliche O/W-Formulierung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.

Jeder der wässrigen Teile Nr. 1–6 und der Ölteile Nr. 7–13, die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt sind, wurden auf 75–80°C erwärmt, bis sie gründlich aufgelöst sind. Der Ölteil wurde langsam zum wässrigen Teil zugegeben, und die Emulgierung erfolgte während 5 Minuten bei 75–80°C in einem Homomixer bei 3000 U/Min. Während der Emulgierung wurde das Gemisch mit dem Neutralisierungsmittel Nr. 14 neutralisiert. Nach der Emulgierung wurde das Gemisch gekühlt, das Retinylretinoat und die Duftstoffe Nr. 15–16 wurden bei 50–55°C zugegeben und dann wurde die zweite Emulgierung während 3 Minuten in einem Homomixer bei 3000 U/Min. durchgeführt. Das Gemisch wurde wieder auf 27–30°C gekühlt, um die Zusammensetzung der O/W-Formulierung zu erhalten. Tabelle 1

	Materialien	Menge
Wässriger Teil	1. Destilliertes Wasser	Bis 102
	2. Glycerin	5,00
	3. Butylenglycol	5,00
	4. Konservierungsmittel	q. s. („q. s")
	5. Carbomer („carbomer")	0,20
	6. Xynthangummi	0,05
Ölteil	7. Cetostearylalkohol	1,0
	8. Selbstemulgierbares Monostearinsäureglycerinn	1,0
	9. Monostearinsäuresorbitan (1)	0,5
	10. Glycerylmonostearat (POE40) (2)	1,0
	11. Flüssiges Paraffin	4,0
	12. Squalan	4,0
	13. Cetyloctanoat	6,0
Neutralisierungsmittel	14. Triethanolamin	0,2
Additive	15. Retinylretinoat	0,3
Additive	16. Duftstoff	q. s

(1) Marke: Ar-60 (ICI, USA)
(2) Marke: My-52 (ICI, USA)

Von den experimentellen Ergebnissen wurde der Reizungsindex gemäß der folgenden Gleichung 1 berechnet, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt.
Gleichung 1

Reizungsindex = {Σ(Testwert × Zahl der Untersuchten entsprechend dem Testwert)/(Gesamte Untersuchten x maximaler Testwert) × 100Testwert +++ : 5, ++: 4, +: 3, +–: 2, –: 1

Der Grad der Reizung wurde nach den folgenden Standards bestimmt:
1,9 oder weniger: unbedeutende Reizung 2,0–2,9: schwache Reizung,
3,0–3,9: Moderate Reizung, 4,0 oder mehr: starke Reizung Tabelle 2 Ergebnisse des Hautreizungstest (geschlossener Pflastertest; 24 Stunden, 20 Erwachsene)

Probe	Reizungsindex	Grad der Reizung
C. C. T + Retinol (0,075%)	2,5	Unbedeutende Reizung
C. C. T + Retinylpalmitat (0,138%)	3,8	Moderate Reizung
C. C. T. + Retinylpalmitat (0,55%)	4,5	Starke Reizung
C. C. T. + Verbindung der Formel (1) (0,075%)	1,3	Unbedeutende Reizung
C. C. T. + Verbindung der Formel (1) (0,3%)	1,3	Unbedeutende Reizung
C. C. T. + Verbindung der Formel (1) (0,55%)	1,3	Unbedeutende Reizung
C. C. T.	2,5	Schwache Reizung
O/W-Formulierung	2,0	Schwache Schädigung
O/W-Formulierung + Verbindung der Formel (1) (0,3%)	2,0	Schwache Reizung

C. C. T = Caprylcapylictriglycerid

Den Ergebnissen der Tabelle 2 kann entnommen werden, dass die Verbindung der Formel (1) der vorliegenden Erfindung einen noch geringeren Grad der Reizung der Haut zeigt als die früheren Derivate, wie Retinol oder Retinolpalmitat.
Experiment 3: Kollagensynthesetest
Der Effekt der Kollagensynthese der Verbindung der Formel (1) wurde unter Verwendung von Retinol, Retinolsäure und Derivate davon als Vergleichsverbindungen untersucht, um ihre Nützlichkeit als Inhibitor für die Hautalterung zu bestätigen. Die Ergebnisse sind in der 2 dargestellt.
Das experimentelle Verfahren wird nachstehend erläutert.

Zellen: normale humane Fibroplasten (Newborn, Passage: 6)
Medium: DMEM, das 10% FBS enthält, → DMEM, das frei von FBS war, wurde verwendet, wenn die Zellen mit der Probe behandelt wurden.
Materialien: Retinolderivate etc.
Konzentration: Ein Konzentrationsbereich wurde für den Zelltoxizitätstest ausgewählt, bei dem die Proben keine Zelltoxizität zeigen => 0,000001%, 0,00001% (Gew./Vol.)
Verfahren: 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung wurden in eine Platte mit 6 Vertiefungen gegeben. Die Zellen wurden kultiviert, um etwa 79–80% Konfluenz zu erreichen. Die Zellen wurden mit den Testproben behandelt und während 2 Tagen inkubiert (FBS wurde nicht zu dem Medium gegeben, wenn die Zellen mit den Proben behandelt wurden). Nach 2 Tagen wurden das Zellmedium und die Zellen voneinander getrennt und entsprechend in einem Kühlschrank gelagert. Das Zellextrakt wurde der Proteinanalyse unterzogen (BCA Protein Assay Kit, PIERCE 23225) und das Medium wurde dann der Kollagenanalyse unterzogen.

Verfahren zur Herstellung des Zellextrakts:
Nachdem das Medium entfernt wurde, wurde eine kleine Menge PBS zugegeben. Die Zellen wurden mit einem Schaber abgeschabt. 1 N NaOH (100 μl) und destilliertes Wasser (400 μl) wurden zugegeben und das resultierende Gemisch lässt man über Nacht stehen. Dann wurde die Proteinanalyse durchgeführt.

Kollagenanalyse: Analysekit (Sircol Collagen Assay Kit – eine Farbe, die sich spezifisch mit löslichen Kollagen verbindet, wird verwendet)

Herstellung der Testprobe:

1) Leerreagenz (0,5 M Essigsäure oder Salz/Pufferlösung 100 μl)
2) Authentisches Kollagen
3) Testprobe 100 μl (Medium, das mit einer Probe behandelt wird, wird konzentriert – Centricon 10 von Amicon Co. wird verwendet)

1,0 ml des Sircol Farbstoff-Reagenz wurde in jedes Röhrchen eingebracht und während 30 Minuten gemischt. Das Gemisch wurde während 10 Minuten bei 5 000 g oder mehr zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. 1,0 ml Sircol Alkali-Reagenz wurde zugegeben, langsam gemischt und die Absorption bei 540 nm wurde gemessen. Die Proteinmenge wurde in den Wert der Kollagenanalyse umgerechnet (vgl. Mechanism of Aging and Development 73, 179–187, 1994).
Nach dem obigen Experiment wurde das Zunahmeverhältnis der Kollagensynthese der Testgruppe über die Kontrollgruppe, die nur mit DMEM behandelt wurde, der 2 entnommen. Wie aus der 2 gesehen werden kann, zeigen Retinolderivate, wie Retinolpalmitat, einen viel geringeren Effekt hinsichtlich der Kollagensynthese als Retinol, und die Retinolsäurederivate zeigen ebenfalls einen niedrigeren Effekt der Kollagensynthese als Retinolsäure. Im Gegensatz dazu wurde bestätigt, dass die Verbindung der Formel (1) der vorliegenden Erfindung einen hervorragenden Effekt für die Kollagensynthese bei niedriger Konzentration gegenüber Retinol oder Retinolsäure zeigt. Dies bedeutet, dass die Verbindung der Formel (1) einen zunehmenden Effekt von 41,29% bei einer Konzentration von 10^–6% (Gew./Vol.) zeigt, der etwa 10 mal so hoch ist, wie der Effekt von 4,94%, der von Retinol bei der gleichen Konzentration gezeigt wird.
Experiment 4: Photostabilitätstest
Um die Photostabilität der Verbindung der Formel (1) im Vergleich zu Retinol zu untersuchen, wurden 10 mg Probe mit UV-A-Licht (Wellenlnge 356 nm) unter Verwendung von Spectroline (Modell CM-10; Fluorescence analysis cabinet; Spectronics Corporation, Westburg, New York, USA) nach bestimmte Zeitintervallen bei Raumtemperatur untersucht. Die Ergebnisse wurden quantitativ durch NMR bestimmt und sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Ergebnisse der Photostabilität

Probe Nach 0 Stunden Nach 2 Stunden Nach 12 Stunden Nach 24 Stunden Nach 48 Stunden

Retinylretionat 4 4 3 3 3

Retinol 4 3 2 1 1

Retinolanhydrid (ROR) 4 3 2 2 2

Niveaus: 4 = Keine qualitative Änderung im ¹H-NMR-Spektrum
3 = Unbedeutendes Rauschen aber keine qualitative Änderung im ¹H-NMR-Spektrum
2 = Klares Rauschen und einige qualitative Änderungen im ¹H-NMR-Spektrum
1 = Qualitative Bestätigung ist im ¹H-NMR-Spektrum schwierig

Wie von den Ergebnissen der Tabelle 3 gesehen werden kann, ist das Retinylretinoat der vorliegenden Erfindung gegenüber UV-Licht mit langer Wellenlänge sehr stabil verglichen mit Retinol.
Experiment 5: Thermische Stabilitätstests
Um die thermische Stabilität der Verbindung der Formel (1) mit Retinol zu vergleichen, wurde die Phasenstabilität während 1 Monats in einem Thermohygrostat (Luftfeuchtigkeit 58%) bei Raumtemperatur, 40°C und 4°C durch quantitative HPLC-Analyse unter den folgenden Bedingungen untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 dargestellt.
<HPLC Bedingung>

1) Säule: Capcellpak UG 120 (5 μm, 4,6 mm·150 mm, Shiseido Japan)
2) Mobile Phase

Lösungsmittel A: Wasser mit 0,1% Essigsäure
Lösungsmittel B: Acetonitril mit 0,1% Essigsäure
Lösungsmittel C: Methanol mit 0,1% Essigsäure
Lösungsmittel D: Isopropylalkohol

Zeit (Minuten)	Lösungsmittel A	Lösungsmitttel B	Lösungsmittel C	Lösungsmittel D	Flussgeschwindigkeit (ml/min)
0	32	8	60	0	1,5
1	32	8	60	0	1,5
10	2	38	60	0	1,5
11	2	38	60	0	1,5
22	2	48	25	25	1,5
28	2	48	25	25	1,5
29	2	58	0	40	1,5
31	2	58	0	40	1,5
32	32	8	60	0	1,5
40	32	8	60	0	1,5

3) Detektor: UV (PDA 326 nm), Fluoreszenz: Ex: 326 nm, Em: 460 nm

	Retinol			Retinylretionat
	r. t („r. t.)	40°C	4°C	r. t	40°C	4°C
Anfänglicher Wert	100	100	100	100	100	100
Nach 1 Woche	74,27	56,08	100	92,77	74,46	100
Nach 2 Wochen	65,23	43,26	98,23	90,45	70,25	100
Nach 3 Wochen	52,23	34,51	95,52	89,21	68,23	99,65

Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, zeigt das Retinylretionat der Formel (1) der vorliegenden Erfindung eine bessere Stabilität als Retinol.
Experiment 6: Analyse der Aktivität hinsichtlich RAR (Retinolsäure-Rezeptor) oder RXR (Retinoid X-Rezeptor)
Der Effekt der Retinolderivate auf die Aktivität von RAR uns RXR wurde wie folgt untersucht.

Experimentelles Verfahren: Rekombinante Gene von DR5-tk-CAT oder DR1-tk-CAT, die DR1 oder DR5 als Responseelement für RAR/RXR, Thyminkinasepromotor und CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) enthalten, wurden in geeigneter Weise mit einer Plasmid-DNA kombiniert, die RAR α, β, γ exprimieren, und in HaCaT-Zelllinie, eine Hautkrebszelllinie, mit Lipofectamin (GibcoBRL) kotransfiziert. Dann wurden die Zellen mit DMEM/10% FBS-Medium für 1, Tag inkubiert, das Retinolderivat wurde in einer Konzentration von 1 μM zugegeben, und die Zellen wurden dann wieder für 1 Tag unter 5% CO₂ und bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Phsphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Proteine wurde aus jeder Zelle extrahiert, die Aktivität von β-Galaktosidas getestet und die Proteinmenge gemessen, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Weiterhin wurde der Grad der Transkription für RAR oder RXR durch CAT ELISA (Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Deutschland) analysiert.
Experimentelle Ergebnisse: Wie in der folgenden Tabelle 5 dargestellt ist, zeigt die Verbindung der Formel (1) der vorliegenden Erfindung eine spezifische Aktivität gegenüber RAR α unter den drei RAR in der gleichen Weise wie Retinol, und außerdem eine geringere Aktivität als Retinolsäure, aber eine höhere als Retinol gegenüber RAR β und RAR γ. Auf der anderen Seite zeigen Retinolderivate, wie Retinylsalicylat und Retinylacetylsalicylat eine niedrigere Aktivität gegenüber nur RAR α und keine Aktivität gegenüber RAR β und RAR γ.

Weiterhin zeigen Retinol und die obigen Retinolderivate keine Aktivität gegenüber RXR (α, β, γ), was durch den Retinoleffekt verursacht wird. Tabelle 6 Relative Aktivität gegenüber RAR/RXR

	Kontrolle	Retinol	Retinolsäure	Verbindung der Formel (1)	Retinylsalicylat	Retinylacetlysalicylat
RARα	1,0	27,5	37,0	22,5	3,2	2,5
RARβ	1,0	1,3	4,0	1,5	1,1	1,0
RARγ	1,0	0,9	3,0	1,1	1,0	1,0
RAR α, β, γ	1,0	1,0	9,5	1,0	1,0	1,1

Schlussfolgerung: Die Verbindung der Formel (1) der vorliegenden Erfindung stellt Zwischeneigenschaften von Retinol und Retinoläure dar, und somit weist sie eine relativ spezifische und hohe Aktivität gegenüber RAR α und eine niedrige Aktivität gegenüber RAR β und RAR γ auf.

Experiment 7: Inhibierung der Aktivität des AP-1-Proteins (Aktivierungsprotein-1)
AP-1 (das das c-Jun-Protein umfasst) ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von Kollagenasen induziert, was eine Hauptursache für Hautfalten ist. Wenn Retinolderivate eine inhibitorische Aktivität gegenüber AP-1 zeigen, ein Faktor, der Hautfalten induziert, dann können sie schließlich einen Effekt zur Verhinderung und Behandlung der Hautfalten bereitstellen. Somit wurden Studien darüber in einer ähnlichen Weise wie in Experiment 6 wie folgt durchgeführt.

Experimentelles Verfahren: CAT-Reporter (Coll-CAT) mit dem Kollagenasepromotor, wobei das AP-1-Responseelement (TRE) enthalten ist, wurde in eine HaCaT-Zelllinie transfiziert, eine Hautkrebszelllinie, wobei Liposome verwendet wurden. Dann wurde der Grad der Inhibierung gegenüber der Aktivität von AP-1 durch Retinolderivate mit einem CAT ELISA in ähnlicher Weise wie in Beispiel 6 gemessen. Weiterhinwurde der Effekt der Retinolderivate auf die Transkriptionsaktivität von c-Jun (ein Protein, das den Transfer von Krebs, Hautalterung und Entzündung induziert und aus homologen Isomeren oder heterologen Isomeren besteht), einem konstitutionellem Element von AP-1, untersucht, indem c-Jun- oder RAR α-Expressionsvektor cotransfiziert wurden.
Experimentelle Ergebnisse: Wie in der folgenden Tabelle 7 gezeigt ist, nimmt die Expression von Kollagenase, die Hautfalten induzieren, um 8,6 mal zu, wenn c-Jun in einer Zelle exprimiert wird. Wenn Zellen mit Retinol zusammen mit RAR α behandelt wurden, wurde die Expression der Kollagenasen um etwa 33% inhibiert. Retinolsäure inhibierte um etwa 64%.

Es wurde festgestellt, dass die Verbindung der Formel (1) um etwa 52% inhibierte, ein Zwischenwert der Obigen, wenn Zellen in der gleichen Weise behandelt wurden. Wie erwartet zeigten Retinylacetylsalicylat und Retinylsalicylat, von denen jedes keine Aktivität gegenüber RAR α zeigt, keinen Effekt auf die Aktivität von c-Jun. Tabelle 7 Relative Inhibierung gegenüber der Expression der Kollagenasen

Bedingung der Expression	Relative Inhibierung gegenüber der Expression der Kollagenase
	-	Retinol	Retinolsäure	Verbindung der Formel (1)	Retinylacetylsalicylat	Retinylsalicylat
-	1,0	0,8	0,6	0,7	1,0	1,0
c-Jun	8,6	7,3	5,4	6,7	8,5	8,7
c-Jun + RAR α	8,6	5,8	3,1	4,1	8,7	8,8

Schlussfolgerung: Die obigen experimentellen Ergebnisse über die Inhibierung der AP-1-Aktivität zeigen auch, dass die Verbindung der Formel (19 eine geringere inhibitorische Aktivität gegenüber c-Jun als Retinolsäure aufweist, aber eine höhere als die von Retinol, wie in Experiment 6.

Industrielle Anwendbarkeit
Die Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung kann für die Zwecke der Vorbeugung, Verbesserung oder Behandlung der Hautalterung einschließlich Falten, Flecken etc. verwendet werden, die durch Hautkrebs oder Hautprobleme, wie Akne, Psoriasis etc. verursacht werden. Da die Verbindung der Formel (1) eine geringe effektive Konzentration aufweist, kann sie insbesondere den Effekt bei geringer Konzentration maximieren. Weiterhin zeigt sie aufgrund der extrem geringen Zelltoxizität eine hervorragende Stabilität gegenüber der Haut, und sie weist Charakteristiken der vorteilhaft und herkömmlich verwendeten Additive für Kosmetika für die Verhinderung und Verbesserung der Hautalterung und Arzneimittel für die Behandlung der Hautprobleme auf, wie Akne, Psoriasis etc, da sie unter erschwerten und fördernden Bedingungen eine gute Stabilität aufweist.

Claims

Kosmetische Zusammensetzung zur Vorbeugung oder zur Verbesserung von Hautfalten, umfassend die Verbindung nach Formel (1) als aktiven Bestandteil: