DE602005001348T2

DE602005001348T2 - Verfahren zur Herstellung von Disulfidbindungen bei zyklischen Peptiden

Info

Publication number: DE602005001348T2
Application number: DE602005001348T
Authority: DE
Inventors: Silvana Cappelletti; Olivia Starace; Paola Annoni; Massimo Pinori
Original assignee: Chemi SpA
Current assignee: Chemi SpA
Priority date: 2004-04-26
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2025-04-22
Also published as: EP1591449A1; DE602005001348D1; ES2286762T3; US20050239695A1; ITMI20040812A1; JP2005325109A; EP1591449B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung in Peptid- oder Peptid-nachahmenden Molekülen.
Stand der Technik
Viele biologisch wirksame Peptide, welche bei der Behandlung verschiedener Krankheiten nützlich sind, sind bekannt dafür, dass sie Disulfidbindungen (1,2) enthalten. Viele von diesen sind bereits als Pharmazeutika registriert, während andere noch immer im Entwicklungsstadium sind; einige bedeutende Beispiele von Peptiden mit Disulfidbindungen sind unten aufgeführt: Octreotid:
Vapreotid:
Eptifibatid:
Somatostatin:
Oxytocin:
Verfahren, welche herkömmlicherweise für die Bildung von Disulfidbindungen verwendet werden, machen Gebrauch von linearen Precursoren, welche Cystein oder andere, SH-Gruppen in freier Form enthaltende Derivate enthalten, welche mittels verschiedener Oxidationsmittel einem oxidativen Verfahren unterworfen werden. Diese oxidativen Verfahren wurden in der Literatur (3, 4) eingehend beschrieben.
Der Hauptnachteil der oxidativen Verfahren ist das Inkontaktbringen des Peptidmoleküls mit Oxidationsmitteln, was die Bildung von Verunreinigungen zur Folge haben kann, mit daraus folgenden geringen Verfahrensausbeuten und Schwierigkeiten bei der Reinigung. Diese Behandlungen können ferner zur teilweisen Desaktivierung des Peptids vom Standpunkt der biologischen Wirksamkeit her führen.
Andere Nachteile, besonders für die Zwecke der industriellen Herstellung, entstehen aus dem Umstand, dass einige dieser Verfahren, ob in der Schätzungsphase oder in der Oxidationsphase der -SH Gruppe, Reaktanden wie z.B. Schwermetalle, Jod, Kaliumferricyanid, etc. verwenden, welche entsprechende Beseitigungsverfahren zur Folge haben.
Ein nichtoxidatives Verfahren zur Cyclisierung von Peptiden wurde in (5) beschrieben. Der grundsätzliche Nachteil dieses Verfahrens, welches von der Anwesenheit einer vorgebildeten -S-S-Alkylgruppe Gebrauch macht, liegt in der Notwendigkeit der entsprechenden Beseitigung der toxischen Gase (Alkylmercaptane), welche durch die Reaktion freigesetzt werden.
Es ist auch bekannt (6), dass die -S-Sulfonatgruppe (Bunte-Salz) mit den -SH-Gruppen reagiert, um Disulfidbindungen zu bilden; ferner wurde in diesen in der Literatur bekannten Fällen die -S-Sulfonatgruppe durch oxidative Sulfitolyse von Cysteinresten in die Peptidmoleküle eingeführt, und diese Strategie kann nicht auf die Herstellung von cyclischen Peptiden angewendet werden, welche die gleichzeitige Anwesenheit einer -S-Sulfonatgruppe und einer freien -SH-Gruppe in demselben Molekül voraussetzt.
Die Möglichkeit des Einführens von vorgebildeten -S-Sulfonatgruppen während der Synthese von Peptidmolekülen wurde beschrieben (8). Wir haben nun herausgefunden, und dies ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass die zweite -SH-Gruppe in freier Form, welche zur Bildung der intramolekularen Disulfidbindung notwendig ist, in Gegenwart der -S-Sulfonatgruppe durch selektives Entfernen einer Schutzgruppe vom Trityl-Typ oder zumindest vom säureempfindlichen Typ unter geeigneten sauren Bedingungen erhalten werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Syntheseverfahren zur Cyclisierung von Peptid- oder Peptid-nachahmenden Molekülen mittels der Bildung von intramolekularen Disulfidbindungen bereit, welches einfach und nicht oxidativ ist; wobei das Verfahren umfasst:

(a) Herstellung eines linearen Precursors, der eine -S-Sulfonatgruppe und eine geschützte -SH-Gruppe mit säureempfindlichem Schutz enthält;
(b) selektive Freisetzung der -SH-Gruppe in einem wasserfreien, sauren Medium und in der Gegenwart von geeigneten Carbokationenfängern;
(c) Cyclisierung, um den teilweise entschützten linearen Precursor bei einem pH von zwischen 5 und 9 zu lösen.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch auf irgendeine lineare Peptid- oder Peptid-nachahmende Verbindung angewendet werden, welche mindestens zwei Cysteine oder andere Reste mit -SH-Gruppen in der Seitenkette enthält. Das eine erste -SH-Gruppe (normal ein Cystein) enthaltende Aminosäurederivat wird zuerst mit einer Schutzgruppe geschützt, welche im Hinblick auf die S-Sulfonatgruppe selektiv entfernt werden kann; die Schutzgruppen und die zugehörigen Verwendungsbedingungen sind im Fachgebiet gut bekannt und sind beschrieben, zum Beispiel in (7), welches hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist; bevorzugt werden sie aus der Gruppe aus 4-Methoxytrityl (Mmt), 2,4,6-Trimethoxybenzyl (Tmob), 4,4',4''-Trimethoxytrityl (TmTr), Trityl (Trt), wobei Trityl (Trt) die besonders bevorzugte Schutzgruppe ist. Die eine Verbleibende der beiden SH-Gruppen, welche dann verwendet wird, um die Disulfidbindung zu bilden, wird dann mit der S-Sulfonatgruppe geschützt; derartige S-Sulfonatgruppen und die zugehörigen Anwendungsverfahren sind im Fachgebiet ebenfalls bekannt und werden zum Beispiel in (8) beschrieben, welches hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
In der Praxis wird das zu cyclisierende Peptid unter Verwendung von Aminosäurederivaten, die bereits geschützte -SH-Gruppen (im Fall von sowohl der säureempfindlichen Schätzung als auch der Sulfonatgruppe) enthalten, chemisch synthetisiert, um mögliche Selektivitätsprobleme zu vermeiden.
Der nachfolgende Schritt schließt dann die selektive Enternung der ersten säureempfindlichen Schutzgruppe ein; auf diese Weise wird ein Peptid erhalten, welches eine freie -SH-Gruppe und eine durch eine S-Sulfonatgruppe geschützte -SH-Gruppe umfasst. Allerdings weisen aus dem Stand der Technik bekannte Bedingungen zur Entfernung der obengenannten Schutzgruppe eine Reihe von Nachteilen auf; zum Beispiel kann das fehlerhafte Entblocken der Schutzgruppe die Polypeptidkette schädigen und besonders auch den durch die Sulfonatgruppe geschützten zweiten -SH-Rest entblocken.
Einer der kennzeichnenden Gegenstände der vorliegenden Erfindung ist daher der, dass spezifische Reaktionsbedingungen gefunden wurden, welche im Hinblick auf die durch die Sulfonatgruppe geschützte SH-Gruppe ein selektives Entblocken der ersten SH-Gruppe erlauben.
Nach einem bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird die selektive Freisetzung der -SH-Gruppe in einem wasserfreien, aprotischen, unpolaren organischen Lösungsmittel in Gegenwart von wasserfreier Trifluoressigsäure und einem geeigneten Carbokationenfänger, wie etwa Triisopropylsilan durchgeführt. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe Trityl und die Entblockungsreaktion wird in der Gegenwart einer Mischung aus Trifluoressigsäure und Triisopropylsilan in Volumenverhältnissen von zwischen 90:10 und 99:1, noch weiter bevorzugt in einem Verhältnis von etwa 95:5 durchgeführt.
Die Reaktionsbedingungen sind mit der Anwesenheit weiterer Fänger, die in der Lage sind, Carbokationen zu fangen, wie z.B. Anisol, Tryptophan-Derivate wie z.B. Tryptophanmethyl ester (H-Trp-OMe), und/oder Phenol vereinbar; die Fänger werden in Mengen von zwischen 1 und 3, bevorzugt etwa 2 Äquivalenten bezogen auf das zu cyclisierende Peptid verwendet; Phenol erwies sich als der Beste von diesen.
Das wasserfreie, aprotische, unpolare Lösungsmittel wird schließlich unter Dichlormethan, Chloroform, Dichlorethan, Trichlorethylen und/oder Tetrachlorethylen ausgewählt, wobei Dichlormethan besonders bevorzugt ist. Dieses Lösungsmittel wird bevorzugt in einer Menge von zwischen 25 und 10 Litern, weiter bevorzugt zwischen 20 und 15 Litern pro Mol zu cyclisierendem Peptid verwendet. Das bevorzugte Verhältnis zwischen Solvens und Trifluoressigsäure beträgt ungefähr 2,2:1 pro Volumen.
Einfaches Lösen des eine freie -SH-Gruppe und eine durch eine S-Sulfonatgruppe geschützte -SH-Gruppe umfassenden Peptids bei einem pH zwischen 5 und 9 führt durch Verdrängung der S-Sulfonatgruppe spontan zur Bildung der Disulfidbindung, ohne dass es andere Recktanten bedarf.
Wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt wurden die zeitbezogenen prozentualen Umsätze, Reaktionszeiten und Reinheit bei verschiedenen pH-Werten untersucht, um den pH-Bereich zu bestimmen, innerhalb welchem die Cyclisierung durchzuführen ist. Der optimale pH erwies sich zwischen 5 und 9, und insbesondere ist der verwendete pH pH=8,3.

In der Tabelle bezeichnet 8SH die lineare Zwischenstufe, während Octriotid ein Beispiel für ein cyclisiertes Peptid mit einer Disulfidbrücke ist. Tabelle 1

	30'		90'		150'
pH	8SH (HPLC A%)	Octreotid (HPLC A%)	8SH (HPLC A%)	Octreotid (HPLC A%)	8SH (HPLC A%)	Octreotid (HPLC A%)
pH=3	75,9	7,4	73,8	10,3	69,9	14,5
pH=5,6	15,3	71,4	4,4	78,2	4,0	77,4
pH=6,9	3,0	79,3	2,7	79,0	2,5	79,0
pH=8,3	1,7	81,5	1,5	81,3	1,4	82,1
pH=9,2	1,5	84,1	0,7	84,2	0,7	84,2

Tabelle 2

pH	Reaktionsende	8SH (HPLC A%)	Octreotid (HPLC A% )	andere Verunreinigungen >0,5% (A%)
pH=3,0	72h	3,6	76,4	13
pH=5,6	24h	3,5	78,6	12,7
pH=6,9	24h	2	80,8	11
pH=8,3	24h	1,2	81,9	10,9
pH=9,2	24h	0,4	88,8	7,6

Die Verwendung eines pHs von weniger als 5 führt zu langsamen Reaktionszeiten, einer unvollständigen Reaktion und geringer Reinheit. Die Verwendung eines pHs von größer als 9 sollte aufgrund von möglichen Racemisierungsreaktionen mit der Bildung von schwierig zu identifizierenden Diastereomeren vermieden werden, welche typisch für Peptide mit basischem pH (9, 10) sind. Die Verwendung eines pHs von größer als 9 sollte ebenfalls aufgrund möglicher Disproportionierungsreaktionen vermieden werden, welche die Disulfidbrücken dazu bringen würden, zu brechen, was zur möglichen Bildung von Dimeren oder Oligomeren (11) führen würde.
Folglich wird die Bildung der Disulfidbrücken bevorzugt bei einem pH von zwischen 7 und 9, noch weiter bevorzugt zwischen 8 und 8,5 durchgeführt.
Das Reaktionsmittel ist bevorzugt eine Mischung aus Pufferlösung/aprotischem organischem Lösungsmittel bei einem geeigneten pH: der Puffer wird unter Verwendung von Salzen, wie Natrium- oder Kaliumphosphaten oder Ammoniumacetaten, bevorzugt Natriumphosphat hergestellt; das aprotische, polare organische Lösungsmittel wird aus der Gruppe aus Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, weiter bevorzugt Acetonitril ausgewählt. Das aprotische, polare organische Lösungsmittel liegt bevorzugt in einer Menge von 0,5-1,5 Volumina pro Volumen des wässrigen Puffers, noch weiter bevorzugt in einer Menge von 0,8-1,2 Volumina pro Volumen des wässrigen Puffers vor.
Die Reaktion wird außerdem bevorzugt bei einer Temperatur von zwischen 0 und 50°C, noch weiter bevorzugt bei einer Temperatur von zwischen 15 und 30°C durchgeführt; die Zeit, die benötigt wird, um die Cyclisierung durchzuführen beträgt normalerweise zwischen 5 Minuten und 24 Stunden, bevorzugt zwischen 5 und 60 Minuten.
Das resultierende Peptid kann dann isoliert werden und/oder weiterer Reinigung mit den Methoden, die normalerweise für die Reinigung von Peptiden (Phasenumkehr, Innenaustausch, etc.) verwendet werden, unterworfen werden; insbesondere kann es durch Präzipitieren, zum Beispiel durch Zugabe von Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethylether, n-Hexan oder n-Heptan zu dem wässrigen Puffer isoliert werden, wobei Methyl-tert-Butylether besonders bevorzugt ist. Der lineare Precursor kann in Lösung oder in Festphase, durch sequentielles Anbringen von Aminosäurederivaten oder durch Fragmente unter Verwendung von Verfahren, welche in der Peptidsynthese gut bekannt sind, welche Schutz für die Seitenketten bereitstellen, und anschließendes Schützen und Entschützen der terminalen Aminogruppe hergestellt werden. Die Carboxyl-Aktivierung ermöglicht es, aktive Ester, EDC, DCC oder andere typische Peptidsynthese-Verfahren (10) zu verwenden.
Das neue Cyclisierungsverfahren wurde bei der Synthese verschiedener cyclischer Peptide mit einer Disulfidbindung, wie Vapreotid, Eptifibatid und Octreotid verwendet. Schema 1 zeigt die Anwendung des Verfahrens zur Darstellung des Peptids Octreotid rein beispielhaft: Das Peptid wird durch Cyclisierung des linearen Precursors H-DPhe-Cys(SO₃Na)-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (8SH) erhalten. Die folgenden Beispiele sind rein beispielhaft gegeben und schränken die Erfindung nicht ein.
Beispiel 1
Die Stabilität der Sulfonat-Schutzgruppe wurde unter Trityl-Entfernungsbedingungen unter Verwendung von Fmoc-Cys(SO₃Na)-ONa und Fmoc-Cys(Trt)-OH als Modellprodukte ausgewertet. Die zwei Produkte (100 mg von jedem) wurden separat in Dichlormethan (1 ml) suspendiert und Trifluoressigsäure (0,5 ml) und Triisopropylsilan (0,05 ml) wurden zugegeben. Die Bildung von Fmoc-Cys-OH (das Produkt wurde durch Entfernen der Schutzgruppen erhalten) wurde durch HPLC untersucht. Die Bildung von Fmoc-Cys-OH wurde unter Verwendung einer Vydac C18 (5 μm) (4,6 × 250)mm Säule ausgewertet.

Eluent A: H₂O/CH₃CN 90/10 mit 0,1% Trifluoressigsäure
Eluent B: CH₃CN mit 0,1% Trifluoressigsäure
Gradient: %B: 10-40 (20 Minuten), 80 (10 Minuten).
Retensionszeit von Fmoc-Cys(SO₃Na)-ONa = 16,9
Retensionszeit von Fmoc-Cys(Trt)-OH = 35,0
Retensionszeit von Fmoc-Cys-OH = 25,3

Fmoc-Cys-OH wurde mittels LC-MS nachgewiesen; [M+H]⁺ = 344

Reaktionszeit [min] Bildung von Fmoc-Cys-OH aus Fmoc-Cys(Trt)-OH (A%] Bildung von Fmoc-Cys-OH aus Fmoc-Cys(SO₃Na)-ONa (A%)

0 0,00 0,00

15 93,13 0,00

30 93,04 0,33

60 92,65 0,62
Nach 15 Minuten war die Entfernung des Trityls von Fmoc-Cys(Trt)-OH praktisch vollständig, während keine Entfernung der Schutzgruppe von Fmoc-Cys(SO₃Na)-ONa beobachtet wurde, abgesehen von einem kleinen Prozentsatz, und das nur ab 30 Minuten.
Beispiel 2
Das geschützte Oktapeptid [Boc-DPhe-Cys(SO₃Na)-Phe-DTrp-Lys(Boc)-Thr-Cys(Trt)-Thr-ol] (0,27 mol; 420 g) und Methylenchlorid (4,9 l) wurden in einen 50 Liter-Reaktor eingebracht. Phenol (0,54 mol; 50 g) und Trifluoressigsäure [TFA] (2,19 l) wurden zugegeben, und die Mischung wurde für 10 Minuten bei 23°C gerührt. Triisopropylsilan [TIS] (1,2 mol; 247 ml) wurden zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde für 5 Minuten gerührt. Zum Schluss wurde Methyl-tert-Butylether (MTBE) (19,7 l) zugegeben, und die Mischung wurde mindestens 60 Minuten gerührt. Der Feststoff wurde herausgefiltert, mit MTBE (10,4 l) gewaschen und unter Vakuum bei 30°C mindestens 15 Stunden getrocknet.
Der erhaltene Feststoff [2TFA.H-DPhe-Cys(SO₃Na)-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol] wurde zusammen mit Acetonitril (39,1 l) in einen 100 Liter-Reaktor eingebracht, und das Gemisch wurde mindestens 5 Minuten bei 23°C gerührt.
Eine Phosphat-Pufferlösung, welche zuvor mit Stickstoff gespült wurde (39,1 l 0,2 molarer Puffer, hergestellt mit 1394 g Na₂HPO₄·2H₂O, 39,1 l H₂O, und durch Zugabe von H₃PO₄ auf pH=8,3 eingestellt), wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und das Gemisch wurde bei 23°C unter Stickstoff gerührt, bis sich die Disulfidbindung bildete. Das Reaktionsgemisch wurde mit Trifluoressigsäure (0,731 l) auf pH=3 angesäuert.
Die flüchtige Fraktion wurde unter Vakuum entfernt, dann wurde das NaCl (5,7 kg) und Tetrahydrofuran (12,6 l) eingebracht. Das Gemisch wurde gerührt, trennen gelassen, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Tetrahydrofuran (12,6 l) wieder in den Reaktor eingebracht. Das Gemisch wurde gerührt, trennen gelassen und die Phasen wurden getrennt. Die vereinigten organischen Phasen wurden unter einem Vakuum eingeengt, bis ein rührbarer Rest erhalten wurde. Der Rest wurde dreimal mit Isopropanol (29,7 l) resuspendiert, dann wurde Isopropanol (3,5 l) zugegeben. Nachdem die vollständige Entfernung des Wassers durch Karl Fischer Analyse nachgeprüft wurde, wurde das Salz herausgefiltert und mit Isopropanol (1,5 l) gewaschen. Die alkoholische Lösung (8,1 l) wurde bei 0°C tropfenweise zu einem Gemisch aus n-Hexan (60 l) und MTBE (19,9 l) zugegeben. Der Niederschlag wurde mindestens 15 Minuten gerührt. Das Produkt wurde herausgefiltert, mit n-Hexan (7,5 l) gewaschen, und unter einem Vakuum bei 30°C für mindestens 15 Stunden getrocknet.
418 g (0,30 mol) wurden erhalten. LOD: 10%
Das Produkt wurde mittels LC-MS nachgewiesen: [M+H]⁺ = 1019 und HPLC (Nachweis bezogen auf Standard).
Verwendete HPLC-Methode:

Säule: JUPITER 5 μm C18300A (4,6 × 250 mm)
Eluent: A = 10% ACN + 0,1% TFA; B = ACN + 0,1% TFA
Temperatur: 30°C
Flussgeschwindigkeit: 1 ml/min
Gradient: %B = 10-30 (30')-80(10')
Wellenlänge: 220 nm
Probe: 1 g/l (eingespritztes Volumen: 20 μl)

Bibliographische Quellenangaben

(1) Handbook of Biochemistry, Seiten C-164 bis C-188
(2) Brazeau, P., et al., Science, 179, 77, 1973
(3) Katsoyannis, P. G., The Chemistry of Polypeptides, Plenum Press, 1974, Seiten 60-85
(4) Kudryavtseva, E.V., Sidorova, M.V., Ovchinnikov, M.V., Bestpalova, Z.D. und Bushuev, V.N., Peptide Res., 49, 1997, 52-58
(5) US-3,929,758 , Lawrence et al., 30. Dezember 1975
(6) Schwartz, G. et al., Biochemistry, 15, 1976, 4071-4076
(7) Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, dritte Auflage, 6tes Kapitel, Wiley Intersience.
(8) Maugras, I., Gosteli, J., Rapp, E., Nyfeler, R., Int. J. Peptide Protein Res., 45, 1995, 152-156
(9) Williams, M.W., Young, G.T., J. Chem. Soc., 27, 1962, 3409
(10) The Peptides, Editors: E. Gross und J. Meienhofer; Academic Press, Band 1, 1979
(11) Andreu D., Albericio F., Solé N., Munson M., Ferrer M., Barany G., Methods in Molecular Biology: Peptide Synthesis Protocols; Band 35, Seite 117: herausgegeben von: M.W. Pennington und B.M. Dunn, 1994 Humana Press Inc., Totowa, NJ

Schema 1

Claims

Verfahren zur Cyclisierung von Peptid- oder Peptid-nachahmenden Molekülen, das umfasst: (a) Herstellung eines linearen Precursors, der eine S-Sulfonatgruppe und eine mit einer säureempfindlichen Schutzgruppe geschützten -SH Gruppe beinhaltet; (b) selektive Freisetzung der mit der säureempfindlichen Schutzgruppe geschützten -SH Gruppe in einem wasserfreien, aprotischen, unpolaren organischen Lösungsmittel in der Gegenwart von mindestens einem Carbokationen-Fänger bei einem pH von weniger als 3; (c) Lösen und anschließende Cyclisierung des partiell entschützten linearen Precursors bei einem pH zwischen 5 und 9.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die säureempfindliche Schutzgruppe unter 4-Methoxytrityl, S-2,4,6-Trimethoxybenzyl, S-4,4',4''-Trimethoxytrityl und Trityl ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe Trityl ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass Stufe (b) in der Gegenwart von Trifluoressigsäure ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbokationen-Fänger Triisopropylsilan ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe (b) in der Gegenwart einer Mischung aus Trifluoressigsäure und Triisopropylsilan ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trifluoressigsäure und das Triisopropylsilan in Volumenverhältnissen von zwischen 90:10 und 99:1 vorliegen.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Trifluoressigsäure und das Triisopropylsilan in Volumenverhältnissen von ungefähr 95:5 vorliegen.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es in der Gegenwart von Anisol, Tryptophanderivaten wie Tryptophanmethylester, und/oder Phenol ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Anisol, Tryptophanderivate und/oder Phenol in Mengen zwischen 1 und 3, vorzugsweise 2 Äquivalenten bezüglich des linearen Presursors vorliegen.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie, aprotische, unpolare organische Lösungsmittel, das in Stufe (b) verwendet wird, unter Dichlormethan, Chloroform, Dichlorethan, Trichlorethylen und/oder Tetrachlorethylen, vorzugsweise Dichlormethan, ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel in einer Menge von zwischen 25 und 10 Litern, vorzugsweise zwischen 20 und 15 Litern pro Mol linearen Precursors vorliegt.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass Stufe (c) bei einem pH zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 8 und 8,5 ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel der Stufe (c) eine Mischung eines aprotischen, polaren organischen Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das aprotische, polare organische Lösungsmittel unter Acetonitril, Tetrahydrofuran und/oder Aceton ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrige Puffer ein Puffer ist, der auf Natrium- und/oder Kaliumphosphat oder auf Ammoniumacetaten basiert.
Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das aprotische, polare organische Lösungsmittel in einer Menge von 0,5-1,5 Volumeneinheiten pro Volumen des wässrigen Puffers vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das aprotische, polare organische Lösungsmittel in einer Menge von 0,8-1,2 Volumeneinheiten pro Volumen des wässrigen Puffers vorliegt.
Verfahren gemäß Ansprüchen 13-18, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur zwischen 0 und 50 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 15 und 30 °C ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 13-19, dadurch gekennzeichnet, dass es für einen Zeitraum zwischen 5 Minuten und 24 Stunden, vorzugsweise zwischen 5 und 60 Minuten ausgeführt wird.