DE602004010525T2

DE602004010525T2 - Verfahren zur herstellung von ummantelten magnetischen teilchen

Info

Publication number: DE602004010525T2
Application number: DE200460010525
Authority: DE
Inventors: Geir Fonnum; Nini Kjus HOFSLÖKKEN; Elin Aksnes; Lars Kilaas; Per Stenstad; Ruth Schmid; Jon Olav BJÖRGUM; Tom-Nils Nilsen; Arvid Trygve Berge
Original assignee: Invitrogen Dynal AS
Current assignee: Life Technologies AS
Priority date: 2003-07-17
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2024-04-29
Also published as: AU2010214744A1; US20050147822A1; US7160707B2; ES2300768T3; CN1849512A; AU2004264038B2; US20050014001A1; AU2010214744B2; JP2007527454A; CA2532711A1; US6986913B2; CN102746529A; EP1649284B1; CN102746529B; CA2532711C; CN1849512B; ATE380343T1; US8038987B2; NO20060406L; NO341653B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Herstellung von beschichteten, magnetischen Polymerpartikeln.
Magnetische Polymerpartikel sind in verschiedenen medizinischen und biochemischen Gebieten von allgemeinem Nutzen, zum Beispiel als Transportvehikel für den Transport von pharmazeutischen Produkten, für Diagnosezwecke, zur Trennung und für Synthesezwecke. Solche Partikel können diese Funktionen auf Grund ihrer magnetischen Eigenschaften ausüben. In diagnostischen Assay-Anwendungen ermöglicht beispielsweise das Anwenden eines magnetischen Felds bei einer Probe, die einen an magnetische Polymerpartikel gebundenen Analyt enthält, das Isolieren des Analyts ohne den Einsatz von Zentrifugation oder Filtration; und in therapeutischen Anwendungen kann das Anwenden eines magnetischen Felds beim Patienten beispielsweise dazu dienen, Wirkstoff-tragende, magnetische Polymerpartikel zu einer gewünschten Stelle im Körper zu leiten.
Magnetisch bedeutet hierin, dass die Polymerpartikel superparamagnetische Kristalle enthalten. Somit können die magnetischen Polymerpartikel magnetisch verschoben, jedoch nicht permanent magnetisiert werden. Viele Verfahren für die Herstellung von magnetischen Polymerpartikeln sind bekannt, wobei eine große Anzahl dieser Verfahren das Herstellen von Maghemit- oder Magnetit-enthaltenden Polymerpartikeln aus im Vorhinein gebildeten magnetischen Eisenoxiden, z. B. Magnetit, umfasst. Manche der beteiligten Verfahren werden in US-A-4,654,267 beschrieben (Ugelstad).
Somit spricht US-A-4,654,267 eine Anzahl an Einschränkungen mit Bezug auf die vorhergehenden Verfahren an; diese schließen Schwierigkeiten bezüglich des Erhaltens von magnetischen Partikeln von ähnlicher Größe und/oder von homogenen oder gleichmäßigen magnetischen Eigenschaften ebenso wie ein allgemeineres Problem bezüglich der Schwierigkeit des Einbaus von magnetischem Material im Inneren der Hohlräume von porigen Polymerpartikeln ein.
Auf Grund der anfänglich stattfindenden Ablagerung auf der Oberfläche oder in großen offenen Hohlräumen war folglich das Leaching von magnetischen Partikeln, das zu einer verkürzten Lebenszeit bei magnetischen Polymerpartikeln in den Anwendungen, in denen sie eingesetzt werden, führt, problematisch.
Um diese Nachteile zu überwinden wurde in US-A-4,654,267 ein vorbereitendes Verfahren vorgeschlagen dank dessen, in seiner einfachsten Form, porige Polymerpartikel mit Lösungen von Eisenverbindungen imprägniert wurden, woraufhin das Eisen zum Beispiel durch Erhöhen des pH-Werts ausgefällt wurde. Die ausgefällten Eisenverbindungen können dann durch Erwärmen in superparamagnetische Eisenoxidkristalle umgewandelt werden.
Zur Erzeugung von porigen, magnetischen Polymerpartikeln, bei denen magnetisches Material innerhalb der Polymerporen abgelagert ist, wird in US-A-4,654,267 die Verwendung von porigen Polymerpartikeln mit funktionalen Gruppen auf der Oberfläche vorgeschlagen, die dazu dienen, die Eisenionen in die Polymerpartikel zu ziehen. Diese funktionalen Gruppen könnten entweder von der Verwendung von funktionalisierten Co-Monomeren bei der Herstellung des Polymers oder von einer Behandlung des Polymers nach der Polymerisation mit dem Zweck, die funktionalen Gruppen, z. B. durch Koppeln an oder Transformation von bestehenden Gruppen auf der Polymeroberfläche, einzuführen, herrühren.
Während die in US-A-4,654,267 offenbarte Verbindung zum Teil das Problem der Herstellung von magnetischen Polymerpartikeln, die mehr homogene, magnetische Eigenschaften aufweisen, teilweise löst, bleibt jedoch das Problem des Leachings der superparamagnetischen Kristalle aus den Polymerpartikeln bestehen.
WO 89/04373 offenbart auf magnetische Strahlung ansprechende Polymerpartikel, die mit einer polymeren Schutzschicht, vorzugsweise aus Polystyrol, beschichtet sind, um das Metalloxid vor Ablösen zu schützen.
Überraschenderweise wurde nun herausgefunden, dass dieses Problem für Partikel einer gewissen Größe gelöst werden kann und magnetische Partikel mit besonders geeigneten Oberflächencharakteristika können durch Reaktion von Oberflächen-funktionalisierten, magnetischen Polymerpartikeln mit einer Kombination aus Polyisocyanat/Diol zur Herstellung eine „beschichteten", magnetischen Polymerpartikels hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren für die Herstellung von beschichteten Polymerpartikeln, die superparamagnetische Kristalle enthalten vor, wobei das Verfahren umfasst, dass porige, Oberflächen-funktionalisierte Polymerpartikel, die superparamagnetische Kristalle enthalten und einen Durchmesser von 0,5 bis 1,8 μm, z. B. 0,75 bis 1,2 μm, insbesondere ungefähr 1 μm, aufweisen, mit wenigstens einem Polyisocyanat, z. B. Diisocyanat und wenigstens einem Diol, vorzugsweise wenigstens Zwei Diolen, zur Reaktion gebracht werden.
Bevorzugte Diole sind Polyethylenglykole oder haben die Formel HO((CHCH₂)_mO)_nH (wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 15, z. B. 2 bis 10, bevorzugt 2 bis 4, ist und m eine ganze Zahl von 2 bis 6, bevorzugt 2 bis 3, insbesondere bevorzugt 2 ist). Wenn nur ein Diol verwendet wird, handelt es sich dabei vorzugsweise um ein Polyethylenglykol, z. B. Polyethylenglycol 300, 400, 500 oder 600.
Bei den porigen Polymerpartikeln, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kann es sich um jeden beliebigen porigen Polymer mit funktionalisierter Oberfläche handeln, z. B. wie in US-A-4,654,267 beschrieben.
Bei der Oberflächen-Funktionalität des Polymers handelt es sich vorzugsweise um eine Gruppe, die optional mit Aktivierung in der Lage ist, mit einem Polyisocyanat zu reagieren, um das Polyisocyanat kovalent an die Oberfläche zu binden. Insbesondere bevorzugt ist die Oberfläche Amin-funktionalisiert.
Das Polymer besteht vorzugsweise aus Kombinationen aus Vinyl-Polymeren, z. B. Styrolen, Acrylaten und/oder Methacrylaten. Das polymere Material kann optional quervernetzt sein, zum Beispiel durch Einschluss von Quervernetzern, zum Beispiel als Co-Monomere, z. B. Divinylbenzol (DVB) oder Ethylenglycoldimethacrylat. Partikel, die DVB umfassen, sind bevorzugt.
Geeignete Mengen an benötigten Quervernetzern (z. B. Comonomeren) sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polymer um ein quervernetztes Styrol-Polymer (z. B. ein Styrol-Divinylbenzol-Polymer, dessen Oberfläche durch Verwendung einer Stickstoffgruppe enthaltend ein Comonomer, z. B. Nitro-Styrol und anschließende Reduktion funktionalisiert sein kann) oder ein quervernetztes (Meth)acryl-Polymer, dessen Oberfläche durch Verwendung einer einen Comonomer (z. B. Glycidylmethycrylat) enthaltenden Epoxygruppe und anschließender Aminierung (z. B. durch Reaktion mit Ethylendiamin) funktionalisiert sein kann.
Die superparamagnetischen Kristalle in den Polymerpartikeln, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können aus einem beliebigen Material bestehen, das in Form von superparamagnetischen Kristallen in den porigen Polymerpartikeln abgeschieden werden kann. Magnetische Eisenoxide, z. B. Magnetit oder Maghemit sind bevorzugt, allerdings können die Kristalle, falls gewünscht, aus gemischten Metaloxiden oder anderen magnetischen Materialien bestehen. Die Gesamtmenge an vorhandenem, kristallinem, magnetischem Material beträgt im Allgemeinen mehr als 1%, vorzugsweise mehr als 3%, wünschenswerterweise mehr als oder genau 5% (Gewichtsprozent, z. B. bis zu 40 Gew.%). Der Prozentsatz wird auf Basis des Gewichts von Fe (oder, im Falle von anderen magnetischen Materialien als Eisenoxiden, einem entsprechendem Metall) berechnet, basierend auf dem Gesamt-Trockengewicht der beschichteten Partikel.
Polymerpartikel gemäß der vorliegenden Erfindung haben Größen in einem allgemeinen Bereich von 0,5 bis 1,8 μm, z. B. 0,75 bis 1,2 μm, vorzugsweise 0,9 bis 1,1 μm.
Typischerweise haben die verwendeten porigen Partikel einen Oberflächenbereich von wenigstens 15 m²/g (gemessen mittels BET-Stickstoffadsorptions-Methode) und bevorzugter wenigstens 30 m²/g, z. B. bis zu 700 m²/g, wenn auf einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 2,7 μm (d. h. Multiplikation der Oberflächenfläche mit 2,7/MD, worin MD für den mittleren Durchmesser in Mikrometern steht) korrigiert wird. Ähnlich bemessen beträgt das Volumen der Partikelporen vorzugsweise wenigstens 0,1 ml/g.
Typischerweise sind die Polymerpartikel kugelförmig und im Wesentlichen monodispers bevor sie beschichtet werden und vorzugsweise verbleiben sie auch nach Beschichtung im Wesentlichen kugelförmig und monodispers.
Im Wesentlichen monodispers bedeutet, dass für eine Vielzahl an Partikeln (z. B. wenigstens 100, bevorzugter wenigstens 1000) die Partikel einen Variationskoeffizienten (VarK) von weniger als 20%, zum Beispiel weniger als 15%, bevorzugt weniger als 12%, bevorzugter weniger als 11%, noch bevorzugter weniger als 10% und insbesondere bevorzugt nicht mehr als ungefähr 8%, z. B. 2 bis 5%, aufweisen. Der VarK wird in Prozent gemäß der folgenden Gleichung bestimmt
worin Mittelwert für den mittleren Partikeldurchmesser und Standardabweichung für die Standardabweichung in der Partikelgröße steht. Bevorzugt wird der VarK mit dem Hauptmodus berechnet, d. h. durch Anpassen einer monomodalen Verteilungskurve an die detektierte Verteilung der Partikelgröße. Somit können manche Partikel, deren Größe unterhalb oder oberhalb der Größe, die in diesem Modus erkannt wird, liegt, bei der Berechnung unberücksichtigt bleiben, die zum Beispiel auf ungefähr 90% der Gesamtpartikelanzahl (d. h. von detektierbaren Partikel) basiert. Ein solches Bestimmen des VarK kann auf einem Coulter LS 130 Partikelgrößenanalysator durchgeführt werden.
Von besonderem Nutzen sind in der vorliegenden Erfindung Polymerpartikel wie in WO 99/19375 (Dyno Industrier ASA), WO 00/61648 (Dyno Specialty Polymers AS) offenbart, die zum Teil aus Aminostyrol, wie in WO 01/70825 offenbart, hergestellt werden.
Alternativ kann im Gegensatz zu der Offenbarung von WO 01/70825 das Funktionalisieren des polymeren Materials nach dem Polymerisieren beispielsweise durch Nitrierung und anschließende Reduktion der dadurch gebildeten Stickstoffgruppen zu Amin-Seitengruppen oder durch direkte Aminierung, zum Beispiel durch Behandlung mit Aminoethanol, erfolgen. Als weitere Alternativen können durch das hinreichend bekannte Zweischritt-Quellverfahren nach Ugelstad hergestellte Polymerpartikel und die in WO 00/61647 (Dyno) offenbarten Verbesserungen daran verwendet werden. Ebenfalls Verwendung finden hier Polymerpartikel, die durch die in WO 99/19375 and WO 00/61648 offenbarten Verfahren hergestellt wurden. Porige, gemäß den in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren hergestellte Polymerpartikel können magnetische Partikel, die mittels standardmäßiger Techniken, z. B. wie oben beschrieben, in ihren Poren abgelagert werden, aufweisen. Als eine weitere Möglichkeit können porige Polymerpartikel aus Nitrostyrol und DVB hergestellt und magnetisches Material wie in US-A-4,654,267 gelehrt eingebracht werden. Von all diesen Verfahren ist die Verwendung von Aminostyrol, insbesondere 4-Aminostyrol als Monomer oder Comonomer in der Herstellung von Amino-tragenden Polymermaterial bevorzugt. Durch die Verwendung dieses Monomers oder Comonomers können Nitrierungs- und Reduktionsreaktionen nach Polymerisation vermieden werden. Darüber hinaus ermöglicht die vorhersehbare Natur (Homogenität) der durch dieses Verfahren erzielten Beschichtung, dass eine verlässlichere Beschichtung aufgebracht wird.
Durch Reaktion der porigen magnetischen Polymerpartikel mit den Polyisocyanaten wird ein Polymer innerhalb der Poren der Polymerpartikel erzeugt, das im Wesentlichen dazu dient, diese Poren zu blockieren, indem es die superparamagnetischen Kristalle innerhalb der Polymerpartikel einkapselt. Die daraus resultierenden „beschichteten" Partikel weisen dann eine mit Bezug auf das porige Ausgangsmaterial reduzierte Porosität auf. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die superparamagnetischen Kristalle anscheinend die Polymerisation katalysieren, so dass sich die Beschichtung vorzugsweise in deren Nähe ausbildet.
Ebenso können, falls erwünscht, weitere Materialien in die porigen Partikel imprägniert werden, und zwar entweder vor der beschichtenden Polymerisationsreaktion oder nach der beschichtenden Polymerisation, aber bevor beschichtendes Quervernetzen von Polymeren stattfindet. Typischerweise handelt es sich bei solchen zusätzlichen Materialien um Strahlungssender oder Strahlungsabsorber, wie z. B. Chromophore, Fluorophore oder radioaktiv markierte Materialien.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das beschichtende Polymer aus einem oder mehr als einem (z. B. 1, 2 oder 3) Polyisocyanat und einem oder mehr als einem (z. B. 2, 3 oder 4) Diol gebildet. Vorzugsweise sollte ein Polyisocyanat, z. B. ein Diisocyanat, verwendet werden. Alternativ kann auch eine Mischung aus eng verwandten Polyisocyanaten verwendet werden (z. B. Desmodur).
Typische Polyisocyanate, die verwendet werden können, schließen Methylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat, 2,4-Toluoldiisocyanat (2,4-TDI) (und Isomere oder Mischungen davon), Isophorondiisocyanat (IPDI), 4,4'-Oxybis(phenylisocyanat), 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat (MDI), Mischungen von MDI und Oligomeren basierend auf MDI (z. B. Desmodur VL), 2,4-Diphenyldiisocyanat, Methylen-biscyclohexyl-diisocyanate (H₁₂MDI), Phenylendiisocyanat (p-PDI), trans-Cyclohexan-1,4-diisocyanat (CHDI), 1,6-Diisocyanathexan (DICH), 1,5-Diisocyanat-Naphthalen (NDI), para-Tetramethylxylylendiisocyanat (p-TMXDI) oder Meta-Tetramethylxylylendiisocyanat (m-TMXDI) ein.
Ein besonders bevorzugtes Isocyanat ist MDI oder sind Polyisocyanate, die darauf basieren (z. B. Desmodur). Desmodur umfasst MDI und Oligomere davon, die MDI mit Resten von CH₂-Phenylisocyanat umfassen. Bei Desmodur handelt es sich somit um eine Mischung aus verschiedenen Polyisocyanaten, die von MDI abgeleitet werden. Eine mögliche Struktur kann wie folgt sein:
4,4-Methylen-bis(phenylisocyanat): 40–50%
4,4-Methylen-bis(phenylisocyanat) + Benzylisocyanat: 20–25%
4,4-Methylen-bis(phenylisocyanat) + 2 Benzylisocyanat: 10%
4,4-Methylen-bis(phenylisocyanat) + 3 Benzylisocyanat: 2%
(In einer derartigen Reaktion enthält das Produkt auch einen gewissen Anteil des 2-Isomers). Die Verbindung wird von Shell unter dem Markennamen Caradate und von Huntsman unter dem Markennamen Hylene und Rubinate vertrieben.
Vorzugsweise sollten zwei Diole verwendet werden. Die Diole werden vorzugsweise in einem Molverhältnis von 0,5:1 bis 1:0,5 verwendet, bevorzugter von 0,8:1 bis 1:0,8, wenn zwei Diole verwendet werden. Vorzugsweise wird keines der Diole in Mengen, die 90% mol der Diolmischung übersteigen, verwendet.
Bevorzugte Diole schließen Diethylenglykol, Tetraethylenglykol und Polyethylenglykole, z. B. PEG 300, 400 oder 600, ein. Eine bevorzugte Diol-Kombination besteht aus Diethylenglykol und Tetraethylenglykol.
Während der Beschichtungsreaktion, an der das Polyisocyanat beteiligt ist, ist es bevorzugt, wenn in einem ersten Stadium das Polyisocyanat im Überschuss vorhanden ist (z. B. im Bezug auf ein beliebiges Diol). Die Verwendung von ausschließlich Polyisocyanat in diesem Schritt des Beschichtungsverfahrens fällt in den Schutzumfang der Erfindung. Es wird angenommen, dass dadurch das Risiko eines möglichen Gelierens während der Reaktion minimiert wird. Wenn ein hoher Überschuss an Polyisocyanat in einer anfänglichen Beschichtungsreaktion verwendet wird kann es notwendig sein, in einem zweiten Stadium die beschichteten Partikel mit weiterem Diol/weiteren Diolen (z. B. einem wie oben beschriebenen Diol) zur Reaktion zu bringen, um eine Reaktion mit beliebigen nicht reagierten Isocyanatgruppen zu erzielen. Wenn in der anfänglichen Beschichtungsreaktion ausschließlich Polyisocyanat verwendet wird, ist es wesentlich, dass das daraus entstehende Partikel anschließend mit mindestens einem Diol umgesetzt wird.
In einer solchen Ausführungsform ist ein solches Diol vorzugsweise ein Polyethylenglykol. Die lange Kette des PEG-Diols ermöglicht die Bildung eines großen Linkers zwischen der beschichtenden Oberfläche des Partikels und erleichtert somit die Reaktion mit Affinitätsliganden wie Streptavidin.
Es fällt somit in den Schutzumfang der Erfindung, die Partikel mit Polyisocyanat und anschließend mit Diol, d. h. in einem schrittweisen Verfahren, umzusetzen, um eine Beschichtung zu erzielen.
Deshalb kann die Beschichtungsreaktion typischerweise durch Imprägnieren der porigen, magnetischen Polymerpartikel mit dem Polyisocyanat und Diol(en) ausgeführt werden, z. B. durch Verwenden einer Lösung derselben (z. B. in einem organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Diglym) oder durch Mischen einer Dispersion der porigen Partikel in einem organischen Lösungsmittel mit einer flüssigen Diol-/Polyisocyanatmischung. Ultraschall kann verwendet werden, um die Imprägnierung zu verbessern und die Reaktion kann durch Erhöhen der Temperatur, z. B. auf 50–100°C, beschleunigt werden. Jedes beliebige Lösungsmittel kann durch Anwenden eines subambientalen Drucks extrahiert werden.
Im Allgemeinen erfordern die Verwendungen, in denen magnetische Polymerpartikel eingesetzt werden, z. B. ihre Verwendung als Diagnosemittel, einen geeigneten Grad an Elektrophilie, so dass sie angemessen an Kopplungsreaktionen und anderen Reaktionen in den in biologischen Medien vorherrschenden wässrigen Systemen mitwirken können.
Während die allgemeine Polarität der Beschichtungen wünschenswerterweise elektrophil ist, können gewisse Beschichtungen, die hydrophobe Gruppen enthalten, so inkorporiert sein, dass sie den Grad an Elektrophilie auf den gewünschten Wert anpassen. Auf diese Weise ermöglicht die Erfindung das Vorsehen von nützlichen Diagnosemitteln und anderen Mitteln, die einen breiten Bereich an Polaritäten abdecken.
Wenn erwünscht, können in dem erfindungsgemäßen Erfahren die Oberflächen der beschichteten Polymerpartikel weiter funktionalisiert werden, z. B. durch Kopplung eines Wirkstoffmoleküls, einem Reporter-Label (z. B. einem Chromophor, Fluorophor, Enzym oder einem radioaktiven Label) oder einem Liganden (z. B. einem Antikörper oder Antikörperfragment, einem Metallionen-Komplexbildner, einem Element eines spezifischen Paares von Bindungspartnern (z. B. Biotin oder Streptavidin), einem Oligopeptid, einem Oligonukleotid oder einem Oligosaccharid).
Eine solche Kopplung kann direkt oder indirekt erfolgen (und kann so die Verwendung eines Kopplungsmittels zur Bildung einer Verbindung zwischen dem Partikel und der an dieses gekoppelten Verbindung einschließen oder auch nicht einschließen) und kann biologisch abbaubar oder nicht biologisch abbaubar sein. Biologisch abbaubare Kopplungen können erwünscht sein, falls die magnetischen Polymerpartikel für die gezielte Freisetzung einer aktiven Verbindung verwendet werden sollen. Demgemäß können die Seitengruppen der Beschichtung nach erfolgter Beschichtung so manipuliert werden, dass sie eine geeignete Funktionalität zur Verfügung stellen (z. B. Epoxy-, Hydroxy-, Amino-Funktionalitäten, etc.), um solche Substanzen zu binden.
Das funktionalisierte, beschichtete, magnetische Partikel kann an einen Affinitätsliganden, dessen Typ auf Grund seiner Affinität für einen bestimmten Analyten ausgewählt wird, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit in einer Probe festgestellt werden soll, gebunden sein. Das Affinitätsmolekül kann deshalb ein beliebiges Molekül umfassen, das an eine magnetische Sonde gebunden werden kann, die wiederum ebenfalls in der Lage ist, einen bestimmten Analyten spezifisch zu erkennen. Affinitätsliganden schließen deshalb monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Proteine, Oligopeptide, Polysaccharide, Zucker, Peptide, für Peptide kodierende Nukleinsäuremoleküle, Antigene, Medikamente und andere Liganden ein. Beispiele für geeignete Affinitätsliganden sind in der veröffentlichten Literatur erhältlich und sind hinlänglich bekannt. Die Verwendung weiterer Bindungspartner, sekundärer Affinitätsliganden und verbindender Gruppen, die routinemäßig im Stand der Technik beinhaltet ist, wird hierin nicht weiter diskutiert, obwohl zu beachten ist, dass die Verwendung solcher Spezies mit den erfindungsgemäßen Partikeln möglich ist, sofern dies erwünscht ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung von Partikeln der Erfindung bei Synthesen, Extraktionen oder Assays vor, vor allem bei der Detektion von Nukleinsäure.
Wie oben erwähnt, kann die Natur der externen, an die Partikel gekoppelten Substanzen auf Basis ihrer Fähigkeit, an bestimmte Zielmaterialien zu binden, ausgewählt werden. Die Detektion von Nukleinsäure beinhaltet im Allgemeinen die Behandlung einer Probe, von der angenommen wird, dass sie Zielnukleinsäuren enthält, mit Sonden, wobei eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die spezifisch die Sequenz der Zielnukleinsäuren erkennt, z. B. mit dieser hybridisiert, so dass der Affinitätsligand für die Nukleinsäure und die Zielnukleinsäuren gemeinsam eine Hybridisierungsschicht bilden. Geeignete funktionalisierte Partikel der Erfindung sind idealerweise für die Detektion von Nukleinsäure geeignet.
Biotinylierte, einzelsträngige Oligonukleotidsonden, die an Streptavidinkügelchen gebunden sind, können verwendet werden, um Sequenz-spezifische DNA zu isolieren. Die biotinylierten Sonden werden durch Mischen der geeigneten Menge an Kügelchen mit einem Überschuss an biotinylierter Sonde an die Kügelchen gebunden. Die Kügelchen/Sonde werden/wird dann mit der DNA-Probe in einem Hybridisierungspuffer, z. B. SSPE oder SSC, unter für die Länge und Sequenz der Sonde und DNA geeigneten Bedingungen inkubiert. Der Überschuss und die unerwünschte DNA werden unter Ausnutzung der magnetischen Eigenschaften der Kügelchen abgewaschen. Die gewonnene DNA kann durch PCR, etc., detektiert/quantifiziert werden.
Biotinylierte, doppelsträngige DNA-Fragmente, die an Streptavidinkügelchen gebunden sind, können zur Isolierung von DNA-Sequenz-spezifischen Bindungsproteinen verwendet werden. Die biotinylierte DNA wird durch Mischen der geeigneten Menge an Kügelchen mit einem Überschuss an biotinylierten DNA-Fragmenten an die Kügelchen gebunden. Die Kügelchen/DNA werden/wird dann mit der Proteinprobe in einem Hybridisierungspuffer unter für das zu untersuchende Protein geeigneten Bedingungen untersucht. Der Überschuss und das unerwünschte Protein werden unter Ausnutzung der magnetischen Eigenschaften der Kügelchen abgewaschen. Das gewonnene Protein kann aus der Sonde für weiterführende Anwendungen und Detektion eluiert werden (durch hohe Salzkonzentration, niedrige Salzkonzentration, Wärme, niedrigen pH-Wert, etc.).
Bei dem Zielmaterial kann es sich optional um ein Material von biologischem oder synthetischem Ursprung, z. B. ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen, zum Beispiel einschließlich Antikörper, Aminosäuren, Proteine, Peptide, Polypeptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Hormone, Lymphokine, Metaboliten, Antigene, Haptene, Lektine, Avidin, Streptavidin, Toxine, Gifte, Umweltschadstoffe, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysaccharide, Glykoproteine, Glykolipide, Nukleotide, Oligonukleotide, Nukleinsäure und derivatisierte Nukleinsäuren, DNA, RNA, natürliche oder synthetische Wirkstoffe, Rezeptoren, Viruspartikel, bakteriell Partikel, Viruskomponenten, Zellen, zelluläre Komponenten, natürliche oder synthetische Lipidvesikel, Polymermembranen, Polymerdienste und Partikel und Glass- und Plastikoberflächen.
Wenn die Kügelchen der Erfindung in Immunoassays verwendet werden sollten, wurde überraschend gefunden, dass Tosylierung der Partikel nach Beschichtung Partikel ergibt, die verbesserte Leistungsfähigkeit in Immunoassays aufweisen. Somit können in einer bevorzugten Ausführungsform Partikel, die eine Beschichtung tragen, tosyliert werden, z. B. durch Reaktion der Partikel mit Tosylchlorid in Anwesenheit einer Base. Die daraus resultierenden tosylierten, beschichteten Partikel sind neu und stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Mit Tosyl soll eine Toluol-4-sulphonyl-Gruppe gemeint sein.
Des Weiteren können solche tosylierten Spezies einfach mit Affinitätsliganden, z. B. Streptavidin, umgesetzt werden, um noch weitere neue Partikel zu bilden.
Somit sieht die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt beschichtete Polymerpartikel vor, die superparamagnetische Kristalle tragen und eine Beschichtung aufweisen, die aus wenigstens einem Polyisocyanat und wenigstens einem Diol, das anschließend z. B. durch Reaktion mit Tosylchlorid, tosyliert wird, gebildet ist, und anschließend optional mit einem Affinitätsliganden, z. B. Streptavidin umgesetzt wird.
Des Weiteren wurde überraschenderweise gefunden, dass Partikel der hierin beanspruchten Durchmesser eine deutlich gesteigerte Bindungskapazität verglichen mit größeren Kügelchen, z. B. Kügelchen von einer Größe von 3 μm aufweisen. Es wird vorgesehen, dass die Bindungskapazität der beanspruchten Kügelchen über 200% größer ist, als die von größeren Kügelchen, was die Verwendung von beträchtlich geringeren Mengen an Partikeln in einem Assayverfahren ermöglicht.
Die Kügelchen der Erfindung sind deshalb in Adsorptions-/Desorptionsverfahren analog zu den Mechanismen bei Reversed Phase Chromatographie oder hydrophober Interaktionschromatographie geeignet. Reversed Phase Chromatographie ist eine Trennungstechnik, die eine hydrophobe Adsorptions-Interaktion zwischen einem gelösten Molekül (z. B. einem Protein) und einem immobilisierten hydrophoben Liganden (z. B. der Oberfläche von Kügelchen) verwendet. Diese Interaktion ist üblicherweise so stark, dass sie in Lösungen von ionischer Stärke auftreten kann und durch Verwendung eines organischen Lösungsmittels (z. B. Acetonitril) unterbrochen werden kann. Reversed Phase Chromatographie kann verwendet werden, um komplexe Proteinproben zu fraktionieren und Proteinproben zu entsalzen. RPC wird üblicherweise unter Verwendung einer mit einer soliden Phase beladenen Säule durchgeführt. Die Kügelchen der Erfindung ermöglichen, dass die Technik ohne eine Säule, ohne Probenverdünnung und automatisiert mit hohen Durchsatz durchgeführt werden kann.
Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist eine Trennungstechnik, die eine hydrophobe Adsorptions-Interaktion zwischen einem gelösten Molekül (z. B. einem Protein) und einem immobilisierten, hydrophoben Liganden (z. B. der Oberfläche von Kügelchen) verwendet. Diese Interaktion ist geringer als die während der RPC verwendeten Interaktionen und muss durch hohe Salzkonzentrationen gefördert werden. Demzufolge können abnehmende Salzkonzentrationen verwendet werden, um diese Adsorptionsinteraktionen zu unterbrechen. HIC kann verwendet werden, um komplexe Proteinproben zu fraktionieren und Proteinproben zu entsalzen. HIC wird üblicherweise unter Verwendung einer mit einer soliden Phase beladenen Säule durchgeführt. Die Kügelchen der Erfindung ermöglichen, dass die Technik ohne eine Säule, ohne Probenverdünnung und automatisiert mit hohen Durchsatz durchgeführt werden kann.
Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele weiter beschrieben. Diese haben keinen einschränkenden Charakter sondern sollen lediglich exemplarisch für die Erfindung sein.
Beispiel 1:
Herstellung von Saatpartikeln mit einer Größe von 0,3 μm
1600 g Styrol wurden mit 2 l Natriumhydroxid (10 Gew.%) extrahiert, mit Wasser bis zum Erreichen eines pH-Werts von 7 gewaschen und dann für 10 Minuten mit Argon gespült. In einem 10 l Reaktor wurden 8000 g Wasser und 3,07 g Borax auf 80°C erhitzt und 100 g Wasser wurden zur Entfernung von Sauerstoff abgedampft. Dann wurden 19,97 g Natriumdecylsulfat in 200 ml gekochtes Wasser eingebracht und für 10 min gerührt. Anschließend wurde das gewaschene und im Wesentlichen sauerstofffreie Styrol eingebracht und es wurde für 15 Min. gerührt. Daraufhin wurden 4,80 g Kaliumperoxodisulfat in 200 g gekochtes Wasser eingebracht. Die Mischung wurde unter Argonatmosphäre für 13 Stunden bei 80°C gehalten. Eine monodisperse Suspension an Polymerpartikeln mit einem Partikeldurchmesser von 0,3 μm wurde gebildet.
Beispiel 2:
Herstellung von Poylstyrolpartikeln mit einer Größe von 1,0 μm
8860 g Wasser, 866 g DOP (Dioctanoylperoxid), 433 g Aceton und 51,96 g SDS wurden für 25 Minuten in einem zwei-Stadien Mauton Gaulin Homogenisator bei 400 kg/cm² im ersten Stadium und 100 kg/cm² im zweiten Stadium homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurden 5164 g der Emulsion mit einer Saatsuspension aus monodispersen Polystyrolpartikeln mit einem Durchmesser von 0,3 μm aus Beispiel 1 gemischt. 1891 g Saatsuspension enthaltend 297,8 g Polymerpartikel und 1593 g Wasser wurden verwendet.
Nach 24-stündigem Rühren bei 25°C wurden 6414 g der aktivierten Saatpartikelsuspension mit einer Emulsion enthaltend 103400 g Wasser, 131 g SDS (Natriumdodecylsulfat), 1556 g Polyvinylpyrrolidon K-30, 4157 g von 63,2%-igem Divinylbenzol, 1060 g Styrol und 11606 g Toluol (als Porogen) vermischt. Die Emulsion wurde für 25 Minuten bei 400 kg/cm² im ersten Stadium und 100 kg/cm² im zweiten Stadium homogenisiert.
Nach Quellen für einen Zeitraum von 2 Stunden bei 25°C wurden 46676 g Wasser in den Reaktor eingebracht und die Dispersion wurde 1 Stunde lang bei 60°C und 20 Stunden lang bei 70°C polymerisiert. Eine monodisperse Suspension mit einem Partikeldurchmesser von 1,0 μm wurde gebildet.
Die Partikel wurden mit Methanol und Butylacetat gewaschen und getrocknet. Bei der BET-Messung wurde bestimmt, dass die spezifische Oberflächenfläche 570 m²/g Trockensubstanz betrug.
Beispiel 3:
Nitrierung
Eine Mischung aus 9920 g 95%-iger Schwefelsäure und 3020 g 65%-iger Salpetersäure wurde auf 10°C gekühlt und dann wurden 400 g trockene, porige, quervernetzte Polystyrolpartikel in einer Größe von 1,0 μm aus Beispiel 2 eingebracht. Die Temperatur wurde für einen Zeitraum von 1 Stunde 30 Minuten auf 30°C erhöht. In die Suspension wurden 60 l Eis und Wasser eingebracht. Die Partikel wurden mit Wasser und Methanol bei Filtrierung gewaschen. Die daraus resultierenden Partikeln enthielten Stickstoff in einer Menge von 9,0 Gew.%.
Beispiel 4:
Einschluss von Eisen
2579 g FeSO₄·7H₂O und 3,2 g MnSO₄·H₂O wurden zu einer Suspension aus 4144 g nitrierten, porigen Partikeln aus Beispiel 3 enthaltend 450 g an Partikeln und 3694 g Wasser hinzugefügt. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. 3285 g von 25%-igem NH₃ in Wasser wurden hinzugefügt. Die Temperatur wurde für einen Zeitraum von 2 Stunden auf 60°C erhöht. Die Suspension wurde gekühlt und die Partikel wurden mit Wasser bei Zentrifugation gewaschen. Nach der Reinigung wurden die Partikel in Methanol überführt. Die Analyse der Partikel zeigte einen Gehalt an 330 mg Fe/g TS (Trockensubstanz) und 0,9 mg Mn/g TS.
Beispiel 5 (nur für Referenzzwecke)
Beschichtung
133 g Methanolsuspension enthaltend 13,3 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) enthielten, wurden fünf Mal mit 93 g Diglym gewaschen. Die Trockensubstanz von Partikeln in Diglym wurde auf 15 Gew.% eingestellt und Glycidol (3,07 g), 1,4-Butandioldiglycidylether (Araldit DY-026, 8,06 g) und Glycidylmethacrylat (5,68 g) wurden zu den Partikeln hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann sechs Mal mit 70 g Methanol und vier Mal mit 80 g Isopropanol gewaschen.
Beispiel 6:
Funktionalisierung mit Carbonsäuregruppen
Zu 1806 g einer Suspension der wie in Beispiel 5 hergestellten Partikel (425 g) in Isopropanol wurden Methanol (774 g), Acrylsäure (514 g) und 2,2'-Azoisobutyronitril (23,4 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 73–75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann sechs Mal mit 2338 g Methanol und einmal mit 3018 g 0,15 M NaOH gewaschen. Der Partikelgehalt (auf Trockensubstanzbasis) wurde auf 12 Gew.% eingestellt und die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 3,5 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden drei Mal mit 3188 g Wasser und fünf Mal mit 3188 g 0,01 M NaOH gewaschen.
Zu 47 g einer Suspension aus den in Schritt (A) hergestellten Partikeln (13,3 g) in Isopropanol wurden Methanol (24 g), Acrylsäure (9,64 g) und 2,2'-Azoisobutyronitril (0,41 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 73–75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann sechs Mal mit 73 g Methanol und einmal mit 94 g 0,15 M NaOH gewaschen. Die Trockensubstanz der Mischung aus Partikeln und 0,15 M NaOH wurde auf 12 Gew.% eingestellt und die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 3,5 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden drei Mal mit 99 g Wasser und fünf Mal mit 99 g 0,01 M NaOH gewaschen.
Beispiel 7:
Funktionalisierung von Carbonsäuregruppen zu N-Hydroxysuccinimidester
50 g einer Suspension aus 5,0 g der Partikel aus Beispiel 6 wurden durch Waschen mit 0,1 M Essigsäure (3 × 50 ml) angesäuert. Die angesäuerten Partikel (die einen Carbonsäuregehalt von 0,5 mmol/g TS aufwiesen) wurden dann mit Aceton (4 × 50 ml) gewaschen und auf einem Magnet konzentriert. Zusätzliches Aceton wurde bis zum Erreichen einer Suspension von insgesamt 35,6 g hinzugefügt. Anschließend wurden N-Hydroxysuccinimid (2,90 g, 25 mmol) und Diisopropylcarbodiimid (3,16 g, 25 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt. Anschließend wurden die Partikel mit Aceton (5 × 50 ml) gewaschen.
Beispiel 8:
Immobilisierung von Streptavidin

1. 20 mg mit Carbonsäure funktionalisierte Kügelchen aus Beispiel 6 wurden in 1 ml 0,01 M NaOH dispergiert.
2. Die Kügelchen wurden auf einem Magnet getrennt und der Überstand entsorgt.
3. Die Kügelchen wurden drei Mal mit 1 ml 30 mM 2-Morpholin-Ethansulfonsäure (MES), pH 6,1, gewaschen.
4. 1,8 mg Streptavidin aufgelöst in 900 μl 30 mM MES, pH 6,1, wurden zu den Kügelchen hinzugefügt.
5. Die Kügelchen und Streptavidin wurden auf einer Mischvorrichtung bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert.
6. 3 mg 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), aufgelöst in 75 μl kaltem, destilliertem Wasser, wurden hinzugefügt.
7. Die Mischung wurde auf einer Mischvorrichtung bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert.
8. Die Kügelchen wurden drei Mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, mit 0,01 Vol.% Tween 20 gewaschen, um überschüssiges Streptavidin und EDC zu entfernen.
9. Die Kügelchen wurden in PBS, pH 7,4, mit 0 1%-igem Tween 20 resuspendiert.

Die Menge an Streptavidin wurde unter Verwendung von Tracermengen von mit ¹²⁵I markiertem Streptavidin während der Beschichtung gemessen. Die relative Menge an mit ¹²⁵I markiertem Streptavidin gibt die Menge von auf die Oberfläche beschichtetem Streptavidin an.
Die Bindungskapazität für freies Biotin wurde durch Hinzufügen eines Überschuss an mit ¹⁴C markiertem Biotin zu den mit Streptavidin beschichteten Kügelchen bestimmt. Überschüssiges Biotin wurde abgewaschen und die Menge an ¹⁴C-Biotin wurde unter Verwendung eines Beta-Szintillationszählers gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Menge an Streptavidinbeschichtung 68 μg pro mg Kügelchen betrug, und die Bindungskapazität für freies Biotin lag bei 3100 pmol freiem Biotin pro mg Kügelchen.
Beispiel 9:
Schritt A
Zu 40,0 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) in 200 g Diglym enthielten, wurden 100 g 1,4-Butandioldiglycidylether und 100 g Glycidol hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei 250 min^–1 20 Stunden lang bei 90°C gerührt. Die Partikel wurden dann fünf Mal mit 400 ml Methanol und vier Mal mit 400 ml deionisiertem Wasser gewaschen.
Schritt B
Zu 72 g einer wässrigen Suspension der wie in Schritt A hergestellten Partikel (Partikelgehalt 10 Gew.%) wurden 119 g Natriumhydroxid langsam hinzugefügt. 169,2 g Allylglycidylether wurden anschließend hinzugefügt. Nach Rühren bei 250 min^–1 für 18 Stunden bei 60°C wurden die Partikel fünf Mal mit 1400 ml Methanol gewaschen.
Beispiel 10:
Zu 10 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) in 40 g Diglym enthielten, wurden 16,7 g Allylglycidylether, 16,8 g 1,4-Butandioldiglycidolether und 16,8 g Glycidol hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei 300 min^–1 bei 90°C 20 Stunden lang gerührt. Anschließend wurden die Partikel fünf Mal mit 100 ml Methanol gewaschen.
Beispiel 11:
Zu 78 g Diglymsuspension aus 13 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) enthielten, wurden Desmodur VL (35,83 g), Diethylenglykol (2,82 g) und Tetraethylenglykol (4,84 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 21 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Diethylenglykol (47,04 g), Tetraethylenglykol (80,45 g) und 1,4-Diazobicyclo[2.2.2]octan (1,29 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 2 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 12:
22 g einer Methanolsuspension von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden fünf Mal mit 14 g Diglym gewaschen. Die Trockensubstanz von Partikeln in Diglym wurde auf 16 Gew.% eingestellt und Araldit DY-026 (1,4-Butandioldiglycidylether) (26 g) und Glycidol (26 g) wurden zu den Partikeln hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 90°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann 5 Mal mit 80 g Methanol und vier Mal mit 45 g Diglym gewaschen.
Zu 18 g der Diglymsuspension aus Partikeln wurden Methacrylanhydrid (15 g) und Pyridin (0,4 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann fünf Mal mit 90 g Methanol und drei Mal mit 60 g Isopropanol gewaschen.
Beispiel 13 (nur für Referenzzwecke)
Zu 124,45 g einer Diglymsuspension aus 20 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurde 2,2-Bis[4-(glycidyloxy)phenyl]propan (Bisphenol A Diglycidylether, Araldit LY-564) (42 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 60°C erhitzt und für 2 Stunden gerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Suspension wurde drei Mal mit Diglym gewaschen und die Trockensubstanz auf 12% eingestellt.
Glycidol (4,58 g), Araldit DY-026 (1,4-Butandioldiglycidylether) (12,1 g) and Glycidylmethacrylat (8,57 g) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 21 Stunden lang gerührt. Die Partikelsuspension wurde gekühlt und anschließend wurden die Partikel sechs Mal mit 100 g Methanol und vier Mal mit 100 g Isopropanol gewaschen.
Beispiel 14:
Zu 516 g einer Wassersuspension aus 51,6 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (375 g) enthielten, wurde Natriumhydroxid (144,89 g) als Feststoff hinzugefügt, die Mischung wurde gerührt und die Temperatur wurde während dem Hinzufügen unterhalb von 42°C gehalten. Allylglycidylether (206,4 g) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde auf 60°C erhitzt und 18 Stunden lang gerührt. Die Partikelsuspension wurde gekühlt und die Partikel wurden vier Mal mit 1500 g Methanol gewaschen.
Beispiel 15:
90 g einer Methanolsuspension aus 15 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden drei Mal mit 60 g Diglym gewaschen und 2,2-Bis[4-(glycidyloxy)phenyl]propan (Bisphenol A Diglycidylether, Araldit LY-564) (70,40 g) und 1,4-Butandioldiglycidylether (Araldit DY-026) (4,61 g) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 95°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und drei Mal mit 100 g Methanol gewaschen.
Beispiel 16:
Zu 23,48 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden 2,2-Bis[4-(glycidyloxy)phenyl]propan (Bisphenol A Diglycidylether, Araldit LY-564) (23,47 g) und Polyethylenglykoldiglycidylether Mw^~ 300 (3,07 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 95°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und vier Mal mit 40 g Methanol gewaschen.
Beispiel 17:
Zu 24,46 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden 2,2-Bis[4-(glycidyloxy)phenyl]propan (Bisphenol A Diglycidylether, Araldit LY-564) (23,54 g) und Polyethylenglykoldiglycidylether Mw^~ 500 (15,28 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 95°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und anschließend fünf Mal mit 40 g Methanol gewaschen.
Beispiel 18:
Zu 26,82 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden 2,2-Bis[4-(glycidyloxy)phenyl]propan (Bisphenol A Diglycidylether, Araldit LY-564) (46,93 g) und Glycerolpropoxylattriglycidylether (69,98 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 95°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und anschließend fünf Mal mit 40 g Methanol gewaschen.
Beispiel 19:
Immobilisierung von Streptavidin
20 mg beschichtete Kügelchen aus Beispiel 17 wurden in 1 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,4, dispergiert. Die Kügelchen wurden auf einem Magnet getrennt und der Überstand entsorgt. Dieser Vorgang wurde zwei Mal wiederholt. 1 mg Streptavidin, aufgelöst in 900 μl 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,4, wurde zu den Kügelchen hinzugefügt. Die Kügelchen und Streptavidin wurden auf einer Mischvorrichtung bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von 20 Stunden inkubiert. Die Kügelchen wurden drei Mal mit PBS, pH 7,4, mit 0,1%-igem BSA gewaschen.
Die Bindungskapazität für freies Biotin wurde wie in Beispiel 20 beschrieben gemessen und lag bei 1900 pmol freiem Biotin pro mg Kügelchen.
Beispiel 20:
Bindungskapazität für biotinylierte DNA-Moleküle

1. Plasmid-DNA-Fragmente aus 1090, 526, 217 Basenpaaren wurden biotinyliert und durch PCR mit Europium markiert.
2. Der Überschuss an Biotin und Europium-Markierungen wurde durch kommerzielle PCR Reinigungstechniken entfernt und die markierte DNA durch optische Dichte bei 260 nm und Time Resolved Fluoreszenz quantifiziert.
3. Mit Streptavidin beschichtete Kügelchen (Beispiel 8) wurden einmal in 2-fach konzentriertem Bindungspuffer (2 M NaCl, 20 mM Tris HCl, 0,2 M EDTA, pH 7,5) gewaschen.
4. 5 μg der gewaschenen Kügelchen wurden in 100 μl Bindungspuffer in jedem Well einer 96-Well-Platte resuspendiert.
5. Ein Überschuss an DNA (0,55 pmol von 1090 bp, 1,1 pmol von 526 bp und 2,2 pmol von 217 bp), verdünnt in 100 μl Wasser, wurde zu den Kügelchen hinzugefügt und unter leichtem Schütteln 15–30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
6. Die Platte wurde dann auf dem Magnet platziert und der Überstand entfernt.
7. Der Komplex aus Kügelchen und DNA wurde 3 Mal mit 200 μl Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,01%-iger Tween 20) gewaschen.
8. Die Komplexe aus Kügelchen und DNA wurden in 200 μl DELFIA Enhancement-Lösung resuspendiert und inkubiert, vor Lichteinfall geschützt, und zwar unter Schütteln bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
9. Die Platte wurde auf dem Magnet platziert und die Enhancement-Lösung wurde in eine FluorNunc 96-Well-Platte überführt und das Europiumsignal durch Time Resolved Fluoreszenz (Wallac Victor Plattenlesegerät) gemessen und in Zerfällen pro Sekunde (counts per second, cps) angegeben.
10. Die an die Kügelchen gebundene DNA wurde aus dem Prozentsatz von an die Kügelchen gebundenen cps, hinzugefügt in 0,55, 1,1 und 2,2 pmol DNA, berechnet.

Die Bindungskapazität der Kügelchen lag ungefähr bei 200 pmol/mg für das Fragment aus 217 bp, 80–100 pmol/mg für das Fragment aus 526 bp und 35–45 pmol/mg für das Fragment aus 1090 bp.
Beispiel 21:
Zu 23,8 g Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g), Diethylenglykol (1,45 g), Tetraethylenglykol (2,48 g) und Diglym (36,2 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Polyethylenglykol Mw^~ 300 (68,24 g), Tetraethylenglykol (41,30 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,68 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 22:
Immobilisierung von Immunoglobulin
20 mg beschichtete Kügelchen aus Beispiel 21 wurden in 1 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 9,0, dispergiert. Die Kügelchen wurden auf einem Magnet getrennt und der Überstand entsorgt. Dieser Vorgang wurde zwei Mal wiederholt. 1 mg Maus lgG1 anti-humanes Alpha-Fetoprotein, aufgelöst in 900 μl 0,1 M Boratpuffer, pH 9,0, wurde zu den Kügelchen hinzugefügt. Die Kügelchen und Antikörper wurden auf einer Mischvorrichtung bei Raumtemperatur für 20 Stunden inkubiert. Die Kügelchen wurden drei Mal mit PBS, pH 7,4, mit 0,1%-igem BSA gewaschen.
Die Menge von an die Kügelchen gebundenem Antikörper wurde unter Verwendung von Tracermengen von mit ¹²⁵I markiertem Antikörper während der Beschichtung gemessen. Die relative Menge an markiertem Antikörper, gebunden an die Kügelchen, gibt die Gesamtmenge an immobilisiertem Antikörper an. Die Menge an auf den Kügelchen immobilisiertem Protein betrug 22 μg Antikörper pro mg Kügelchen.
Die Bindung von Alpha-Fetoprotein an den immobilisierten Antikörper wurde durch Hinzufügen von Verdünnungen von Nabelschnurblut gemessen und durch Verwendung eines zweiten, mit Eu³⁺ markiertem Maus lgG anti-humanem Alpha-Fetoprotein detektiert. Der markierten Antikörper wurden mit Time Resolved Fluoreszenzspektroskopie detektiert. Mit steigender Konzentration zeigte eine Standardkurven-Verdünnung des Nabelschnurbluts erhöhtes Signal.
Beispiel 23:
Zu 26,82 g Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g), Polyethylenglykol Mw^~ 600 (15,84 g) und Diglym (33,20 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Polyethylenglykol Mw^~ 600 (263,82 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,66 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 24:
Funktionalisierung mit Carbonsäuregruppen
Zu 15,87 g g einer Suspension der wie in Beispiel 5 hergestellten Partikel (2,5 g) in Isopropanol wurde Acrylsäure (1,84 g), Acrylamid (1,79 g), Methanol (5,95 g) und 2,2'-Azoisobutyronitril (0,28 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden anschließend vier Mal mit 20 g Isopropanol und 4 Mal mit 25 g 0,15 M NaOH gewaschen.
Beispiel 25:
Funktionalisierung mit Carbonsäuregruppen
Zu 8,44 g einer Suspension der wie in Beispiel 5 hergestellten Partikel (1 g) in Wasser wurden Acrylsäure (0,37 g), Allylglycidylether (1,34 g), Dimethylsulfoxid (0,91 g) und 2,2'-Azoisobutyronitril (0,06 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden anschließend vier Mal mit 10 g Isopropanol und 4 Mal mit 10 g 0,15 M NaOH gewaschen.
Beispiel 26:
Zu 3,9 g einer Diglymsuspension aus 2,7 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Hexamethylendiisocyanat (2,5 g), Diethylenglykol (0,5 g) und Tetraethylenglykol (1,0 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Diethylenglykol (2,65 g), Tetraethylenglykol (4,66 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,07 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 95°C erhitzt und 2–3 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und anschließend vier Mal mit 20 g Aceton gewaschen.
Beispiel 27:
Zu 23,8 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g), Diethylenglykol (1,45 g), Tetraethylenglykol (2,48 g) und Diglym (36,2 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Polyethylenglykol Mw^~ 400 (90,03 g), Tetraethylenglykol (41,20 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,68 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 28:
Zu 23,8 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g), Diethylenglykol (1,45 g), Tetraethylenglykol (2,48 g) und Diglym (36,2 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Polyethylenglykol Mw^~ 600 (135 g), Tetraethylenglykol (41,30 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,66 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 29:
Zu 23,8 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g), Diethylenglykol (1,45 g), Tetraethylenglykol (2,48 g) und Diglym (36,2 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt.
Eine Mischung aus Ethylenglykol (27,29 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,66 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 30:
Zu 26,82 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g) und Ethylenglykol (1,64 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Eine Mischung aus Ethylenglykol (27,29 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,66 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 31:
Aktivierung mit Tosylgruppen
Zu 17,1 g einer Acetonsuspension aus 4 g aus Beispiel 30 wurden Tosylchlorid (16 g) und Pyridin (7,85 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 25°C erhitzt und 17 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann drei Mal mit 50 ml Aceton, einmal mit 50 ml einer Mischung aus 80 Gew.% Aceton in Wasser, einmal mit 50 ml einer Mischung aus 60 Gew.% Aceton in Wasser, einmal mit 50 ml einer Mischung aus 30 Gew.% Aceton in Wasser und drei Mal mit 50 ml Wasser gewaschen.
Beispiel 32:
Immunoassay für Alpha-Fetoprotein
50 μg von mit Immunoglobulin beschichteten Kügelchen aus Beispiel 22 wurden zu 100 μl Verdünnungen von Nabelschnurblut hinzugefügt und der Gehalt an Alpha-Fetoprotein konnte während der Inkubation für einen Zeitraum von 15 Minuten binden. Überschüssiges Nabelschnurblut wurde abgewaschen. Zu diesem Komplex wurde ein zweites Maus lgG anti-human Alpha-Fetoprotein, markiert mit EU³⁺, zur Detektion hinzugefügt. Nach Inkubation und Entfernung von überschüssigem Antikörper wurde die Menge an markiertem Antikörper mit Time Resolved Fluoreszenzspektroskopie detektiert. Mit steigender Konzentration zeigte eine Standardkurven-Verdünnung des Nabelschnurbluts mit bekannter Menge an Alpha-Fetoprotein erhöhtes Signal. Durch Verwendung dieser Standardkurve konnte die Menge an Alpha-Fetoprotein in Proben bestimmt werden.
Beispiel 33:
Immunoassay für Myoglobulin
Kügelchen, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 22 beschichtet wurden, allerdings mit Maus lgG anti-humanem Myoglobulin, wurden verwendet, um den Gehalt an Myoglobulin in humanen Citratplasmaproben auf einem Liaison Immunoassay-Gerät zu analysieren. Kügelchen und Proben (10 μl) wurden für 10 Minuten inkubiert und überschüssige Probe abgewaschen. Detektionsantikörper, konjugiert mit einem Acridinorange-Ester, wurde hinzugefügt. Nach der Inkubation für 10 Minuten wurde überschüssiger Detektionsantikörper abgewaschen und das chemilumineszente Signal wurde entwickelt und im Lumineszenzlesegerät im Liaison-Gerät detektiert.
Beispiel 34:
Immunoassay für D-Dimer
Kügelchen, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 22 beschichtet wurden, allerdings mit Maus lgG anti-humanem D-Dimer, wurden verwendet, um den Gehalt an Myoglobulin in humanen Citratplasmaproben auf einem Liaison Immunoassay-Gerät zu analysieren. Kügelchen und Proben (10 μl) wurden für 10 Minuten inkubiert und überschüssige Probe abgewaschen. Detektionsantikörper, konjugiert mit einem Acridinorange-Ester, wurde hinzugefügt. Nach der Inkubation für 10 Minuten wurde überschüssiger Detektionsantikörper abgewaschen und das chemilumineszente Signal wurde entwickelt und im Lumineszenzlesegerät im Liaison-Gerät detektiert.
Beispiel 35:
Immunoassay für intaktes PTH
Kügelchen, die wie in Beispiel 19 mit Streptavidin beschichtet wurden, wurden verwendet, um den Gehalt an intaktem PTH in Proben von humanem EDTA-Plasma auf einem Liaison Immunoassay-Gerät zu analysieren. 150 μl EDTA-Plasma wurden mit biotinyliertem, polyklonalem Ziegenantikörper, der gegen intaktes PTH gezüchtet wurde, und einem mit Acridin-Ester konjugierten, polyklonalen Ziegenantikörper, der auf gleiche Weise gezüchtet wurde, inkubiert, um einen Immunkomplex zu erhalten. Die mit Streptavidin beschichteten Kügelchen wurden zu dem Immunkomplex hinzugefügt und inkubiert, um Bindung des Biotins an das immobilisierte Streptavidin zu ermöglichen. Die Kügelchen wurden gewaschen und das chemilumineszente Signal entwickelt und in dem Lumineszenzlesegerät im Liason-Instrument gemessen.
Beispiel 36:
22 g einer Methanolsuspension von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden fünf Mal mit 14 g Diglym gewaschen. Die Trockensubstanz von Partikeln in Diglym wurde auf 16 Gew.% eingestellt und Glycidylmethacrylat (50 g) und Eisen-(III)-Chlorid (0,62 g) wurden zu den Partikeln hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 75°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden dann sechs Mal mit 14 g Methanol und vier Mal mit 13 g Isopropanol gewaschen.
Beispiel 37:
Zu 26,82 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurden Desmodur VL (18,34 g) und Diglym (33,20 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Eine Mischung aus Polyethylenglykol Mw^~ 600 (236,82 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,66 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Diglym und vier Mal mit 100 g Aceton gewaschen.
Beispiel 38:
Zu 10,74 g einer Diglymsuspension aus 2 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurde Glycidol (6,84 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 90°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und acht Mal mit 17 g Methanol und vier Mal mit 17 g Wasser gewaschen.
Beispiel 39:
Zu 14,52 g einer Diglymsuspension aus 2,50 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) (analog zu Beispiel 4 hergestellt) enthielten, wurde 2,2-Bis[4-(glycidyloxy)phenyl]propan (Bisphenol A Diglycidylether, Araldit LY-564) (13,03 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 95°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 17 g Diglym und fünf Mal mit 17 g Methanol gewaschen.
Beispiel 40:
Bindungskapazität für biotinylierte Protein-Moleküle

1. 5 μg der Streptavidinkügelchen (Bsp. 19) wurden einmal in DELFIA Assay-Puffer gewaschen und mit einem Überschuss an biotinyliertem Antikörper, markiert mit Europium³⁺, in einer 96-Well-Platte gemischt.
2. Die Inkubation mit Mischen bei Raumtemperatur erfolgte für 20 Minuten, um eine Bindung des Antikörpers an die Kügelchen zu ermöglichen.
3. Die Platte wurde auf dem Magnet platziert und der Überstand entfernt.
4. Der Komplex aus Kügelchen und Antikörper wurde dann 3 Mal mit 200 μl DELFIA Waschpuffer gewaschen.
5. Die Komplexe aus Kügelchen und Antikörper wurden in 200 μl DELFIA Enhancement-Lösung resuspendiert und inkubiert, vor Lichteinfall geschützt, und zwar unter Schütteln bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
6. Die Platte wurde auf dem Magnet platziert und die Enhancement-Lösung wurde in eine FluorNunc 96-Well-Platte überführt und das Europiumsignal wurde durch Time Resolved Fluoreszenz (Wallac Victor Plattenlesegerät) gemessen und in Zerfällen pro Sekunde (counts per second, cps) angegeben.
7. Die Menge von an die Kügelchen gebundenem Antikörper wurde anhand des Prozentsatzes an hinzugefügten, an die Kügelchen gebundenen cps, berechnet.

Die Bindungskapazität der Kügelchen lag bei ungefähr 8,0 μg biotinylierter Antikörper pro mg Kügelchen.
Beispiel 41:
Zu 30,1 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) enthielten, wurden Desmodur VL (13,8 g) und Diethylenglykol (2,08 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Eine Mischung aus Diethylenglykol (35 g) und 1,4-Diazobicyclo[2.2.2]octan (0,5 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 80 ml Diglym und fünf Mal mit 80 ml Aceton gewaschen.
Beispiel 42:
Zu 30,8 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) enthielten, wurde Desmodur VL (13,8 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Eine Mischung aus Diethylenglykol (35 g) und 1,4-Diazobicyclo[2.2.2]octan (0,5 g) wurde zu der Partikelsuspension hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 80 ml Diglym und fünf Mal mit 80 ml Aceton gewaschen.
Beispiel 43:
7,0 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (33 Gew.% Fe) enthielten, wurden auf 20 Gew.% Trockenmaterial in Diethylenglykoldimethylether eingestellt. 17,5 g Araldit Dy-026 und 17,5 g Glycidol wurden zu der Suspension hinzugefügt und die Mischung wurde für 20 Stunden auf 90°C erhitzt. Die Kügelchen wurden fünf Mal mit Methanol (200 ml) und fünf Mal mit Wasser (200 ml) gewaschen.
Beispiel 44:
Zu 80 g einer Suspension aus 8,0 g Kügelchen in Beispiel 43 wurden 22,5 g Natriumhydroxid und 32 g Allylglycidylether hinzugefügt. Die Kügelchen wurden gerührt und für 18 Stunden auf 60°C erhitzt und durch viermaliges Waschen mit 240 ml Methanol aufgearbeitet.
Beispiel 45:
Reversed Phase Chromatographie (RPC)
Die Kügelchen aus Beispielen 41, 42, 11, 15 und 30 wurden verwendet, um eine Proteinmischung, bestehend aus Conalbumin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, Alkoholdehydrogenase, Cytochrom C und Diaminoxidase, oder Zelllysate aus SW 480 Zellen zu fraktionieren. 1 mg der Kügelchen wurde zuvor gewaschen und in 10 μl eines RPC-Adsorptionspuffer (erhalten von Bruker Daltonics oder alternativ in 50 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M Ammoniumsulfat, 0,1%-ige Trifluoressigsäure) resuspendiert und mit 25 μg der Proteinmischung oder des Zelllysats für 1 Minute inkubiert. Nach der Adsorption wurden die Kügelchen drei Mal mit Waschpuffer (erhalten von Bruker Daltonics oder mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M Ammoniumsulfat, 0,1%-ige Trifluoressigsäure) gewaschen und die Proteine daraufhin unter Verwendung von Desorptionspuffern enthaltend ansteigende Konzentrationen an Acetonitril (0, 15, 30, 40 & 50%) in Fraktionen desorbiert.
Beispiel 46:
Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
Die Kügelchen aus Beispiel 44 wurden verwendet, um eine Proteinmischung bestehend aus Conalbumin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, Alkoholdehydrogenase, Cytochrom C und Diaminoxidase zu fraktionieren. 1 mg der Kügelchen wurde zuvor gewaschen und in Adsorptionspuffer resuspendiert (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8; 1 M Ammoniumsulfat) und mit 25 g der Proteinmischung für 1 Minute inkubiert. Nach der Adsorption wurden die Kügelchen drei Mal mit einem geeigneten Waschpuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M Ammoniumsulfat) gewaschen und die Proteine wurden daraufhin unter Verwendung von Desorptionspuffern enthaltend abnehmende Konzentrationen an Ammoniumsulfat (0,8; 0,6; 0,4; 0,2 & 0,0 M) in Fraktionen desorbiert.
Beispiel 47:
Zu 26,81 g einer Diglymsuspension aus 5 g von 1,0 μm großen Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikeln, deren Oberfläche durch Nitrierung und Reduktion funktionalisiert wurde und die superparamagnetisches Eisenoxid (46 Gew.% Fe) (375 g) enthielten, wurden Desmodur VL (18,39 g) und Diglym (33,50 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 20 Stunden lang gerührt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 100 g Dimethylformamid gewaschen und 2,2(Ethylendioxid)-diethylamin (74,4 g) und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (0,63 g) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde für zwei Stunden auf 80°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und vier Mal mit 100 g Dimethylformamid gewaschen. Zu 6,66 g dieser Dimethylformamidsuspension wurde 1,4-Butandioldiglycidylether (Araldit LY-026) (3,03 g) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 20 Stunden auf 70°C erhitzt. Die Partikel wurden gekühlt und drei Mal mit 17 g Dimethylformamid gewaschen.

Claims

Ein Verfahren für die Herstellung von beschichteten Polymerpartikeln, die superparamagnetische Kristalle enthalten, wobei das Verfahren umfasst, dass porige, Oberflächen-funktionalisierte, superparamagnetische Kristall-enthaltende Polymerpartikel mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,8 μm mit wenigstens einem Polyisocyanat und wenigstens einem Diol zur Reaktion gebracht werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei wenigstens zwei Diole eingesetzt werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei die Diole aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykolen und Diolen der Formel HO((CH₂)_mO)_nH (wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist und m eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist) ausgewählt werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die Diole Diethylenglykol und Tetraethylenglykol sind.
Ein Verfahren wie in Anspruch 2 oder 3 beansprucht, wobei eines der Diole Polyethylenglykol ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 bis 5 beansprucht, wobei das Polyisocyanat 4,4'-Methylen-bis(phenylisocyanat) oder ein Polyisocyanat, das 4,4'-Methylen-bis(phenylisocyanat) mit CH₂-Phenylisocyanatresten umfasst, ist.
Ein Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, wobei das Polyisocyanat ein Diisocyanat ist.
Ein Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, wobei die Partikel in einer ersten Stufe mit einer Mischung von Polyisocyanat und wenigstens einem Diol zur Reaktion gebracht werden, wobei das Polyisocyanat relativ zu dem Diol/den Diolen in einem molaren Überschuss vorliegt, und anschließend in einer zweiten Stufe mit wenigstens einem Diol zur Reaktion gebracht werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei zwei Diole in der ersten Stufe der Reaktion verwendet werden und ein Diol oder zwei Diole in der zweiten Stufe verwendet wird/werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei Diethylenglykol und Tetraethylenglykol in beiden Stufen der Reaktion verwendet werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 bis 7 beansprucht, wobei die Partikel in einer ersten Stufe in Abwesenheit von Diol mit Polyisocyanat zur Reaktion gebracht werden und in einer zweiten Stufe mit wenigstens einem Diol zur Reaktion gebracht werden.
Ein Prozess wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei ein Diol eingesetzt wird, und das Diol ein Polyethylenglykol ist.
Ein Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Partikel auch mit einem Reagens zur Quervernetzung von Polymeren zur Reaktion gebracht werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei das Mittel zur Quervernetzung Divinylbenzol ist.
Ein Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Partikel Amin-funktionalisiert sind.
Ein Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die porigen Oberflächen-funktionalisierten Polymerpartikel nitrierte und reduzierte Styrol-Divinylbenzol-Polymerpartikel sind.
Ein Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei der Durchmesser der Polymerpartikel zwischen 0,5 und 1,2 μm liegt.
Ein Verfahren wie in Anspruch 17 beansprucht, wobei der Durchmesser der Polymerpartikel 1 μm beträgt.
Ein Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 beansprucht, wobei das beschichtete Partikel anschließend tosyliert wird.
Ein Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Partikel im Anschluss an die Beschichtungsreaktion an ein Wirkstoffmolekül, eine Reportergruppe oder einen Liganden gekoppelt werden.
Ein Verfahren wie in Anspruch 20 beansprucht, wobei der Ligand ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Antikörperfragment, eine Nukleinsäure, ein Oligonukleotid, ein Protein, ein Oligopeptid, ein Polysaccharid, ein Zucker, ein Peptid, ein ein Peptid kodierendes Nukleinsäuremolekül, ein Antigen oder ein Wirkstoff ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei der Ligand Streptavidin ist.
Ein Partikel erhältlich nach dem Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 22 beansprucht.
Verwendung eines Produkts eines Verfahrens wie in einem der Ansprüche 1 bis 22 beansprucht in einem Assay.
Verwendung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei der Assay zur Detektion von Nukleinsäure dient oder ein Immunoassay ist.
Verwendung eines Produkts eines Prozesses wie in einem der Ansprüche 1 bis 22 beansprucht in auf hydrophoben Wechselwirkungen basierender Chromatographie oder in Reversed Phase Chromatographie.