DE202009007250U1

DE202009007250U1 - Feldveränderungsmittel zur Erzeugung komplementärer Lichtintensitätsmuster

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Publication number: DE202009007250U1
Application number: DE202009007250U
Authority: DE
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2009-11-26
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: WO2010133678A1; JP5598772B2; EP2433342B1; EP2433342A1; US8586945B2; US20120104279A1; JP2012527634A

Abstract

Optische Anordnung mit Feldveränderungsmittel, mit mindestens einer Lichtquelle, mit mindestens zwei Strahlen mindestens zweier Wellenlängen und/oder Polarisationen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Strahlen gemeinsam durch ein Feld veränderndes Mittel so prägbar sind, dass mindestens zwei der Strahlen bei Fokussierung im Wesentlichen komplementäre Intensitätsverteilungen aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches Element und dessen Anordnung in einem Mikroskop. Das Element und seine Anordnung erlauben es, die Felder mindestens zweier Strahlen verschiedener Wellenlängen und/oder Polarisationen gezielt so zu beeinflussen, dass mindestens einer der Strahlen im Fokus des Mikroskops mindestens eine Intensitätsnullstelle enthält und ein anderer dort nicht.
Aufgabenstellung:
Im Folgenden wird ohne Einschränkung der Allgemeinheit die erfinderische Anordnung der Klarheit wegen am Beispiel des STED Mikroskops erläutert. Die erfindungsgemäße Anordnung kann jedoch in jeder nullstellenbasierten Anwendung, wie z. B. einer das RESOLFT Prinzip (Hell, Stefan W. (2007): "Far-Field Optical Nanoscopy". Science 316, 1153–1158) nutzenden Anordnung oder auch andere Anwendungen, wie z. B. optische Fallen etc. mit den beschriebenen Vorteilen genutzt werden.
Bei Fluoreszenzmessungen insbesondere auch in der Fluoreszenzmikroskopie wird ein Fluoreszenzmolekül mit einem Anregungslicht angeregt. Die Anregungsenergie wird wenige Nanosekunden (ns) später vom Molekül mit etwas längerer Wellenlänge wieder abgegeben.
Beim hoch auflösenden STED (Stimulated Emission Microscopy) (siehe auch WO 001995021393 A2 ) Verfahren wird ein zweiter Strahl dem Anregungsstrahl so überlagert, dass dieser die angeregten Fluoreszenzmoleküle durch Stimulation in der Grundzustand zurück befördert, bevor diese spontan ein Fluoreszenzphoton aussenden. Die Strahlform dieses zweiten Strahls, im Folgenden STED-Strahl genannt, ist dabei typischer Weise so gewählt, dass er eine Nullstelle im oder nahe des Maximums des Anregungsstrahls aufweist. Die Strahlen weisen also im Fokus ein im Wesentlichen komplementäres Intensitätsmuster auf. Beim Abbilden können somit nur noch die Fluoreszenzmoleküle beitragen, die räumlich genau in einer Nullstelle des zweiten Strahles liegen. Die effektive Größe des Abbildungspunktes kann so um ein Vielfaches kleiner als im regulären beugungsbegrenzten Mikroskop gemacht werden, was zu weit höheren Auflösungen führt als es das Abbe'sche Beugungslimit erlaubt.
STED-Mikroskope basieren in der Regel auf konfokalen Laserscannern. Der diesbezügliche Stand der Technik dieser Mikroskope ist in fast allen technischen Aspekten sehr gut in der Literatur beschrieben, zusammenfassend insbesondere bei James B. Pawley: „Handbook of Biological Confocal Microscopy" 3rd Edition, Springerverlag, ISBN 10. 0-387-25921-X, ISBN 13: 987-0387-25921-5, und somit dem Fachmann bekannt und wird im Folgenden vorausgesetzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es hier eine robustere, justierfreundlichere und kostengünstigere Anordnung mittels chromatischer Phasenplatten oder exakter nachfolgend auch als Feldveränderungsmittel bezeichnet, zu ermöglichen. Diese letztere Verallgemeinerung ist im Rahmen dieser Erfindung wichtig und notwendig, da die Wellenfront selbst, also die Phasenverteilung und auch die Polarisationsrichtungsverteilung des Lichtfeldes zur Intensitätsmusterformung im Objektraum beitragen und genutzt werden können und sollen.
Stand der Technik/Lösung alt:
Die Wellenfront des STED-Strahls wird im STED-Mikroskop typischer Weise mit Hilfe von Phasenplatten geformt (siehe z. B. US 7355789 von Leica Microsystems CMS GmbH) Hier kommen derzeit verschiedenste bedampfte oder geätzte Mikrostrukturen wie z. B. Vortex Phasenplatten VPP-1 von RPC Photonics (New York, USA) zum Einsatz. Um die Wellenfront dynamisch gestalten zu können, wurden auch SLMs (Spatial Light Modulator) eingesetzt.
Die Eigenschaften der Phasenplatte selbst und deren Lage im System haben einen erheblichen Einfluss auf die Systemkomplexität und Leistungsfähigkeit des STED Mikroskops.
Gewöhnlich werden diese Phasenplatten in oder nahe der Pupillenebene oder einer Abbildung derselben platziert.
Anregungs- und STED-Strahl werden in herkömmlichen Systemen zunächst als getrennte Strahlen geführt. Der Anregungs- und STED-Strahl werden dann, nachdem der STED-Strahl durch die Phaseplatte modifiziert ist, mit geeigneten Strahlteilern vereinigt und dem Mikroskop zugeführt.
Durch die getrennte Strahlführung und Vereinigung sind empfindliche Justagen notwendig, da die Justage der Strahlen deutlich genauer als deren Beugungsbreite erfolgen muss.
Erfindung/Lösung neu:
Erfindungsgemäß wird das neue Feldveränderungsmittel von beiden bereits überlagerten Strahlen durchsetzt. Dabei ist es notwendig, dass die Veränderung des Feldes der Strahlen durch die optischen Eigenschaften des Feldveränderungsmittels bei den Nutzwellenlängen in der jeweils gewünschten Weise geschieht.
Ein erstes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel stellen zwei sich berührende planparallele transparente Platten dar, die einen geringen Dickenunterschied aufweisen und wenige mm dick sind. Der Unterschied der Dicke ist genau so gewählt, dass die optische Weglänge des Anregungsstrahls gerade ein ganzes Vielfaches dessen Wellenlänge beträgt, während die optische Weglänge für den STED Strahl gerade eine halbe Wellenlänge plus ein Vielfaches der STED-Wellenlänge beträgt. Solche Platten sind mit verschiedensten gängigen Techniken herstellbar, wie z. B. polieren, ätzen, aufdampfen, prägen etc..
Durchsetzen nun die Strahlen beide Platten genau je zur Hälfte, dann Überlagern sich die Strahlen beider Segmente beim Anregungsstrahl genau konstruktiv und bilden in der Probe fokussiert einen beugungsbegrenzten Intensitätsfleck mit einem zentralen Maximum. Beim STED-Strahl hingegen interferieren die beiden Teilstrahlen destruktiv und bilden im Zentrum des beugungsbegrenzten Spots eine linienförmige Nullstelle aus. Im STED Mikroskop tragen in diesem Falle nur noch die Fluoreszenzmoleküle zur Abbildung bei, die im innersten Bereich der dunklen Linie liegen.
Für den komplementären Charakter der im Fokus gebildeten Intensitätsmuster sind die verschiedenen Wellenlängen, die Dickenunterschiede und die Brechzahl/Dispersion des Glases entscheidend.
Diesen gewünschten Effekt erreicht man auch, wenn man zwei gleich dicke, sich seitlich berührende Platten leicht gegeneinander um wenige Grad oder nur Bruchteile eines Grads verkippt (siehe auch Zeichnung 2). Wenn man nun das Paar von Platten wiederum relativ zu den Lichtstrahlen leicht verkippt um wenige oder Bruchteile eines Grads, so kann man den gewünschten Phasenunterschied der beiden Strahlhälften für beliebige Wellenlängen über die Kippwinkel beliebig einstellen. Wegen der Dispersion ist es möglich auch eine bestimmte Phasenbeziehung für verschiedene Strahlen einzustellen und so durch Verkippung der Platten die für STED gewünschte Strahlformung gezielt einstellbar vorzunehmen.
Eine weitere beispielhafte Möglichkeit ist es, statt einfacher transparenter Platten doppelbrechendes Material zu verwenden und damit geeignet segmentierte Platten auszubilden. In einem solchen Fall kann man zum Beispiel die chromatische Abhängigkeit der Polarisationsdrehung beim Durchgang durch die Plattensegmente ausnutzen, die für eine bestimmte Wellenlänge zum Beispiel einen Punkt und für eine andere gleichzeitig dort ein Nullstelle liefert. Bei Verwendung von Verzögerungsplatten höherer Ordnung zum Beispiel erhält man dafür eine besonders große chromatische Abhängigkeit.
Es ist jedoch auch möglich die gewünschte Feldveränderung achromatisch und nur polarisationsabhängig zu gestalten. In einem solchen Fall wird man eher achromatische Verzögerungsplatten verwenden und es bilden dann zum Beispiel die Strahlen verschiedener Polarisationen das gewünschte komplementäre Intensitätsmuster.
Zeichnung 3 zeigt beispielhaft ein paar der vielen möglichen Anordnungen.
Alle diese Anordnungen haben gemeinsam, dass sie von mehreren Strahlen gleichzeitig durchsetzbar sind und dabei die unterschiedlichen chromatischen und/oder Polarisationseigenschaften zum gewünschten komplementären Intensitätsmuster führen.
Die Feldveränderungsmittel sind typischer Weise in, oder nahe einer Pupillenebene der Abbildung angeordnet.
Besonders vorteilhaft ist es auch die Mittel unmittelbar hinter das Mikroskopobjektiv zu legen.
Ein Objektivhersteller könnte aber auch diese Mittel, analog zum Phasenkontrastring etwa, direkt in oder nahe der Pupille im Mikroskopobjektiv selbst unterbringen, was eine besonders hohe Systemrobustheit mit sich brächte.
Wie oder aus was diese Feldveränderungsmittel hergestellt sind, ist hier höchsten für die Qualität der Mittel, nicht jedoch für die prinzipielle erfinderische Anordnung bzw. Funktion relevant.
Durch geeignete Segmentierungen und zum Beispiel auch ringförmig sich unterscheidende Segmente, sind erfindungsgemäße Feldveränderungsmittel darstellbar, die nicht nur lateral die Auflösung steigern, sondern auch axial oder beides gleichzeitig.
Erfindungsgemäß wäre es auch geeignete Stapel von Feldveränderungsmittel zu verwenden.
Ebenso könnten dabei geeignet strukturierte, veränderliche Komponenten, wie z. B. Flüssigkristallanordnungen zum Einsatz kommen, die in ihren optischen Eigenschaften steuerbar sind. Diese könnten dabei ein programmierbares Raster oder geeignet segmentiert Elektroden aufweisen.
Es sind jedoch auch weitere elektrooptische, piezoelektrische oder auch mikromechanische Elemente denkbar, die in der erfinderischen Weise einsetzbar sind.
Nutzen/Vorteile:
Da die Stahlvereinigung nach den Feldveränderungsmitteln entfällt, ist die Systemjustage einfacher und robuster. Die Strahlüberlagerung kann komplett entfallen, wenn die Laserquelle selbst bereits die notwendigen Strahlen erzeugt. In anderen Fällen können die Laserstrahlen verschiedener Laser zum Beispiel gemeinsam in eine Lichtleitfaser gekoppelt werden, deren Ausgang dann die Lichtquelle für das STED Mikroskop darstellt. In einem solchen Fall wirken sich leichte Dejustagen der Strahlen vor der Faser lediglich auf die Intensitäten, nicht aber auf die Strahlgeometrie im STED System aus. Die Lichtquellen werden so zudem viel leichter austauschbar, etwa für einen Wellenlängenwechsel.
Die erfinderischen Elemente und deren Anordnung in den Strahlen ermöglicht ferner den heute einfachsten denkbaren Umbau eines Standardkonfokalmikroskops zu einem hoch auflösenden STED Mikroskop. Dazu muss lediglich ein ausreichend starker Laser in das Standardsystem parallel zu den anderen Lasern ge koppelt sein und die erfindungsgemäßen Feldveränderungsmittel hinter dem Objektiv zum Beispiel angeordnet werden. Bei den meisten Mikroskopen stehen dafür sogar zwei frei zugängliche Stellen zur Verfügung: 1.) Der Ort, an welchem gewöhnlich die Nomarskiprismen für den Interferenzkontrast zumeist austauschbar angeordnet sind, 2.) könnten die Feldveränderungsmittel an einem der meist mehreren verfügbar Positionen der Fluoreszenzfilterwürfel als „STED-Filterwürfel” in den Strahlengang sogar schaltbar eingebracht werden, ohne dass dazu Umbauten oder Veränderungen am Mikroskop selbst notwendig würden.
Beschreibung der Zeichnungen:
In Zeichnung 1 ist ein Beispiel einer einfachen komplementären Intensitätsverteilung dargestellt, die im STED Mikroskop z. B. genutzt wird und durch die erfinderische Anordnung in besonders vorteilhafter Weise erreicht wird. Die Fluoreszenzanregung geschieht hier mit einem beugungsbegrenzten punktförmigen Strahl, während der STED-Strahl ringförmig geformt ist. Es sind jedoch auch beliebige andere Muster wie z. B. ein linienförmiger Anregungsstrahl umschlossen von einem röhrenförmigen STED-Strahl, nebeneinander liegende Linien, Punktraster etc..
In der Zeichnung 2 ist eine bevorzugte Ausführungsform dargestellt. Sie stellt jedoch nur die erfinderische Grundanordnung dar. In der nachfolgenden Beschreibung wird ohne Einschränkung der Allgemeinheit auf ein STED-Mikroskop Bezug genommen. Sie ist jedoch auch, wie eingangs erwähnt, in beliebigen anderen optischen Systemen, wie etwa einer optische Falle nutzbar und insbesondere bei solchen, bei denen Lichtstrahlen zu komplementären Intensitätsmustern geformt werden müssen.
Eine Laserlichtquelle (1) mit mindestens zwei Strahlen (3) unterschiedlicher Wellenlänge und/oder unterschiedlicher Polarisation durchstrahlt die erfindungsgemäßen Feldveränderungsmittel (5) und wird auf das Objekt (7) mit Fokussiermitteln (6) fokussiert. Das im Objekt erzeugte Fluoreszenzlicht wird mit einem geeigneten Strahlteiler (4) in Richtung eines Detektors ausgekoppelt und nachgewiesen. Diese Auskopplung könnte dabei vor oder nach der Phasenplatte geschehen.
Die Skizze ist stark vereinfacht. Die für das erfinderische Prinzip nicht entscheidenden Komponenten, wie etwa das Mikroskop selbst, diverse Optiken, Strahlrastermechanismen, Filter etc. und deren Eigenschaften sind hier der klareren Dar stellung wegen nicht dargestellt und spielen für die erfinderische Anordnung selbst eine untergeordnete Rolle.
In der Zeichnung 3 sind Beispiele von erfinderischen Feldveränderungsmitteln dargestellt.
Es sind selbstverständlich viele weitere erfindungsgemäße Varianten denkbar.
Unter anderem kann die bereits beschriebene Phasenplatte aus zwei Segmenten (8) bestehen. Es ist klar, dass hier auch zur Berücksichtigung verschiedener Polarisationen die Strahlen beispielsweise mittels Polarisationstrahlteilerwürfel zunächst aufgeteilt und mit zueinander rotierten Platten verändert und wieder mit Polarisationstrahlteilerwürfel zusammengeführt werden können.
Bei den segmentierten Platten sind bei einer besonders einfachen Anordnung vier Segmente (9) aus sich berührenden λ/2 Platten jeweils um 45° zu einander gedreht angeordnet, sodass die Polarisation des ausgehenden Feldes abhängig von der Polarisation des Eingangsstrahls azimutal oder radial polarisiert ist. Verwendet man zudem Verzögerungsplatten höherer Ordnung, so bildet sich die Intensitätsnullstelle nur für einen bestimmten engen Wellenlängenbereich aus, während für andere Wellenlängen eine signifikante Intensität an der Nullstelle vorliegt.
Wählt man dagegen achromatische Verzögerungsplatten aus, so kann man über die Eingangspolarisation der verschiedenen Strahlen wählen, welcher davon Nullstellen und welcher Maxima im Fokus bildet.
Um auch axial einen STED Effekt zu erhalten, können zudem die Segmente in verschiedenen ringförmigen Zonen, mit verschiedenen optischen Eigenschaften ausgebildet werden (10). Der gleiche Effekt ist auch durch einen Stapel von getrennten Segment und/oder Ringplatten darstellbar.
Die Anzahl der genutzten Segmente oder Ringe selbst ist ab einer gewissen Segmentzahl nicht mehr entscheidend. Für beliebig viele Segmente/Ringe geht die Anordnung praktisch in ein kontinuierliches Feldveränderungsmittel über.
Die Segmente können dabei fest oder auch veränderbare optische Eigenschaften aufweisen. Auch Raster von programmierbaren Platten (11) sind dabei nutzbar.
Allen gemeinsam ist, dass mit diesen für bestimmte Wellenlängen und/oder Polarisationen jeweils komplementäre Intensitätsmuster erzeugbar sind, diese dabei gleichzeitig von verschiedenen Strahlen durchsetzt werden können und somit besonders einfache Implementierungen ermöglichen.
Mit einigen dieser Platten, wie z. B. das erste Beispiel [siehe (8)] in Zeichnung 3, lassen sich sogar Nullstellen für Strahlen beliebiger Wellenlängen wählen beziehungsweise einstellen.

1: Lichtquelle
2: Detektor
3: Lichtstrahlen
4: Strahlteiler
5: Wellenfrontveränderungsmittel
6: Fokussiermittel
7: Objekt
8: Wellenlängeneinstellbare 2-Segmentplatte
9: chromatische 4-Segmentverzögerungsplatte für azimutal/radial Polarisation
10: Segmentierte und zonierte Platte für 3-dimensional komplementäre Intensitätsmuster
11: Programmierbare Rasterplatte

Legenden der Zeichnungen:
Zeichnung 1: Intensitätsmuster, die zum Beispiel in der STED-Mikroskopie benötigt werden. Links: Intensitätsprofil des Anregungsstrahls; Mitte: Intensitätsprofil des STED-Strahls; Rechts: Profil der effektiven Abbildung.
Zeichnung 2: Skizze des Strahlenganges.
Zeichnung 3: Beispiele für erfindungsgemäß nutzbare Wellenfrontveränderungsmittel.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 001995021393 A2 [0004]
- US 7355789 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Hell, Stefan W. (2007): ”Far-Field Optical Nanoscopy”. Science 316, 1153–1158 [0002]
- James B. Pawley: „Handbook of Biological Confocal Microscopy” 3rd Edition, Springerverlag, ISBN 10. 0-387-25921-X, ISBN 13: 987-0387-25921-5 [0005]

Claims

Optische Anordnung mit Feldveränderungsmittel, mit mindestens einer Lichtquelle, mit mindestens zwei Strahlen mindestens zweier Wellenlängen und/oder Polarisationen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Strahlen gemeinsam durch ein Feld veränderndes Mittel so prägbar sind, dass mindestens zwei der Strahlen bei Fokussierung im Wesentlichen komplementäre Intensitätsverteilungen aufweisen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel aus mindestens zwei zueinander und zum Strahl verkippten Glasplatten besteht.
Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Platten zum einstellen der Wellenlängenabhängigkeit kippbar gefasst sind.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel aus mindestens einer segmentierten Anordnung optisch wirksamer Platten bestehen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Segmente sich in den Polarisationseigenschaften unterscheiden.
Anordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polarisationseigenschaften verschiedener Segmente wellenlängenabhängig ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die komplementären Intensitäten durch Wahl der Polarisationen der Strahlen einstellbar sind.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Segmente verschiedene Wellenlängeneigenschaften aufweisen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel ringförmige Zonen unterschiedlicher optischen Eigenschaften aufweisen
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Eigenschaften gezielt global oder die der einzelnen Elemente einstellbar bzw. programmierbar sind.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel rasterförmige programmierbare Strukturen aufweisen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Eigenschaften ortsabhängig einstellbar bzw. programmierbar sind.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel lateral komplementäre Intensitätsmuster erzeugen lassen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel axial komplementäre Intensitätsmuster erzeugen lassen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel dreidimensional komplementäre Intensitätsmuster erzeugen lassen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldveränderungsmittel komplementäre Raster von Intensitätsmuster erzeugen lassen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Feldveränderungsmittel unmittelbar hinter dem Mikroskopobjektiv angeordnet ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Feldveränderungsmittel in das Mikroskopobjektiv integriert ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Feldveränderungsmittel hintereinander die Strahlen verändern.